CN1268975A - Dna聚合酶相关因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促进DNA聚合酶DNA合成活性的耐热性DNA聚合酶相关因子,具有与DNA聚合酶结合活性的耐热性DNA聚合酶相关因子及其制备方法,编码上述DNA聚合酶相关因子的基因,在上述DNA聚合酶相关因子存在下,用DNA聚合酶合成DNA的方法及其含有上述DNA聚合酶相关因子的试剂盒。通过利用本发明的DNA聚合酶相关因子,提供比以往优越的试管内DNA合成及DNA扩增体系。

Description

DNA聚合酶相关因子
技术领域
本发明涉及DNA聚合酶相关因子。具体而言，涉及用作基因工程学试剂的DNA聚合酶相关因子及其制备方法，以及编码该因子的基因。
技术背景
作为基因工程学所用的试剂，DNA聚合酶是一种有用的酶，它能广泛用于DNA碱基序列测定、DNA的标记、位点特异性突变导入等。另外，最近，随着聚合酶链式反应(PCR)法的开发，耐热性DNA聚合酶引起广泛关注，适于PCR方法的各种DNA聚合酶得到开发并已被商品化。
根据其氨基酸序列的同源性，现在已知的DNA聚合酶可分为4个家族，其中家族A(pol I型酶)和家族B(α型酶)占大多数。虽然各家族的DNA聚合酶具有大致相似的生化学特征，但详细比较时，针对不同的酶，底物特异性、底物类似物的摄取效率、引物延伸性延伸速度、DNA合成的方式、是否兼有核酸外切酶活性、温度、pH等最适反应条件及对抑制剂的敏感性等具有不同的性质。因此，从目前可以着手的DNA聚合酶中选择具有最佳适用性的酶使用。
超嗜热性古细菌激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)产生α型的DNA聚合酶，已经分离出其基因[核酸研究(Nucleic Acids Research)第21卷，239～265页(1993)]。
如同上述的pol I型酶、α型酶等一样，已知DNA聚合酶除仅由一种酶蛋白质表达其功能之外，还有由多个亚单位蛋白质构成的寡聚酶。另外还知道除具有DNA聚合酶作用的蛋白质外，有时还共存有调节其功能的蛋白质分子。
发明公开
本发明的目的是提供促进DNA聚合酶DNA合成活性的耐热性DNA聚合酶相关因子，以及具有与DNA聚合酶结合活性的耐热性DNA聚合酶相关因子。
本发明另一目的是提供本发明DNA聚合酶相关因子的基因。
本发明的其它目的是提供本发明DNA聚合酶相关因子的制备方法。
本发明的其它目的是提供在本发明DNA聚合酶相关因子存在的条件下，使用DNA聚合酶合成DNA的方法。
本发明的其它目的是提供含有本发明DNA聚合酶相关因子的试剂盒。
根据本发明，通过利用本发明的DNA聚合酶相关因子，可以提供比以往更优秀的试管内DNA合成及DNA扩增系统。
最近，本发明人激烈热球菌中发现了与目前已知的DNA聚合酶结构完全不同的新型DNA聚合酶(国际公开第97/24444号)。该DNA聚合酶由2种新型蛋白质形成复合体来表达DNA聚合酶活性。另外，该酶具有强3′→5′核酸外切酶活性和良好的引物延伸活性，例如，应用该酶进行PCR的时候，可扩增出20kb长的DNA片段。该来源于激烈热球菌的新型DNA聚合酶，至少有2种蛋白质是酶活性所必须的构成要素，但除此之外是否还存在该酶的结构蛋白质，或者是否还存在影响该酶活性的因子尚不清楚。
本发明人进行了大量研究，结果成功地分离出与上述来源于激烈热球菌的新型DNA聚合酶结合的蛋白质。并且克隆了其基因，使通过基因工程学方法来生产该蛋白质成为可能，并且发现该蛋白质可以促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性。
本发明的要点涉及
[1]促进DNA聚合酶之DNA合成活性的耐热性DNA聚合酶相关因子；
[2]另外还具有与DNA聚合酶结合活性的上述[1]的DNA聚合酶相关因子；
[3]上述[2]的DNA聚合酶相关因子，它含有序列表的序列号5或6中所示氨基酸序列的DNA聚合酶结构蛋白质，具有与DNA聚合酶结合的活性；
[4]上述[1]-[3]任一项中的DNA聚合酶相关因子，它含有选自序列表的序列号1、3、19、27、34、64、70及80中的至少一种氨基酸序列，或者含有该氨基酸序列中有1个以上的氨基酸发生置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列；
[5]编码DNA聚合酶相关因子的基因，该DNA聚合酶相关因子含有选自序列表的序列号1、3、19、27、34、64、70及80中的至少一种氨基酸序列，或者含有在该氨基酸序列中有1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的序列，对DNA聚合酶的DNA合成活性有促进作用；
[6]上述[5]的基因，它含有选自序列表序列号2、4、18、26、33、63、69及79的碱基序列，或者含有该碱基序列中1个以上的碱基发生了置换、缺失、添加或插入的序列；
[7]编码DNA聚合酶相关因子的基因，该DNA聚合酶相关因子能与上述[5]或[6]记载的基因进行杂交，且对DNA聚合酶的DNA合成活性有促进作用；
[8]DNA聚合酶相关因子的制备方法，其特征在于它包含如下工序：培养含有上述[5]～[7]中任一种基因的转化体，从该培养物中获取可促进DNA聚合酶DNA合成活性的耐热性DNA聚合酶相关因子；
[9]用DNA聚合酶合成DNA的方法，其特征在于在上述[1]～[4]中任一种DNA聚合酶相关因子存在的条件下合成DNA；
[10]上述[9]的DNA合成方法，它是在2种以上的DNA聚合酶相关因子存在的条件下合成DNA；
[11]上述[10]的DNA合成方法，在F7、PFU-RFC及PFU-RFCLS作为DNA聚合酶相关因子存在的条件下进行DNA合成的方法；
[12]上述[9]～[11]任一项中记载的DNA合成方法，其中DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶；
[13]通过PCR来实施的上述[12]中的DNA合成方法；
[14]试管内合成DNA所使用的试剂盒，它含有上述[1]～[4]任一项中记载的DNA聚合酶相关因子及DNA聚合酶；
[15]上述[14]的试剂盒，它还含有DNA合成反应所必需的试剂；
[16]上述[14]或[15]中的试剂盒，含有2种以上的DNA聚合酶相关因子；
[17]上述[16]的试剂盒，作为DNA聚合酶相关因子，它含有F7、PFU-RFC及PFU-RFCLS；
[18]上述[14]～[17]任一项的试剂盒，它含有的DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。
附图简述
图1表示从抗Pfu聚合酶抗体柱分离出的7种蛋白质(F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7)的SDS-PAGE图。按F1～F7的顺序，SDS-PAGE上的分子量大约为55kDa，24kDa，37kDa，19.5kDa，27kDa，64kDa，33kDa。
图2表示含有编码F1蛋白质基因的质粒pF1-4-10的插入DNA片段的限制性酶谱。
图3表示F1蛋白质的5′→3′核酸外切酶活性。
图4表示F1蛋白质的3′→5′核酸外切酶活性。
图5表示含有编码F2蛋白质基因的质粒pF2172Nh的插入DNA片段的限制性酶谱。
图6表示含有编码F7蛋白质基因的质粒pF7-1-8的插入DNA片段的限制性酶谱。
图7表示添加F7蛋白质时DNA聚合酶引物延伸活性的放射自显影图。
图8表示添加F7蛋白质时DNA聚合酶对较高分子的引物延伸反应物的引物延伸活性的放射自显影图。
图9表示含有编码PFU-RFC蛋白质基因的质粒pRFS254NdB的插入DNA片段的限制性酶谱。
图10表示从抗Pfu DNA聚合酶抗体柱分离出的蛋白质(F7)的SDS-PAGE结果。推定SDS-PAGE上F7的分子量大约为33kDa。
图11表示Pfu DNA聚合酶以及PFu DNA聚合酶与F7的混合物，进行凝胶过滤后，对所得洗脱液进行DNA聚合酶活性测定的结果。
图12是含有编码PFU-RFCLS蛋白质基因的质粒pRFLSNh的插入DNA片段的限制性酶谱。
图13表示激烈热球菌基因组DNA上编码F5蛋白质的基因周围的限制性酶谱。
图14表示从抗PFU-RFC抗体柱分离出的3种蛋白质(PFU-RFCLS、PFU-RFC、F7)的SDS-PAGE结果。
图15表示添加F7或RFC-N复合体时的DNA聚合酶活性。
图16表示含有编码PFU-RFCLS及PFU-RFC的基因的质粒pRFC10的插入DNA片段的限制性酶谱。
图17表示添加F7或F7和rRFC-M复合体时的DNA聚合酶活性。
实施本发明的最佳方式1.本发明的DNA聚合酶相关因子
本说明书中的“DNA聚合酶相关因子”是指与DNA聚合酶共存，由此影响DNA聚合酶功能的因子，具体而言，包括具有促进DNA聚合酶DNA合成活性作用的因子，具有与DNA聚合酶结合活性的因子，以及具有这两种活性的因子等。另外，本发明的DNA聚合酶相关因子为耐热性蛋白质，例如，可耐受80℃15分钟的热处理。因此，也可用于使用耐热性DNA聚合酶，在高温条件下进行的DNA合成反应中。
(a)促进DNA聚合酶DNA合成活性的DNA聚合酶相关因子。
作为促进DNA聚合酶DNA合成活性的DNA聚合酶相关因子只要能促进DNA聚合酶的DNA合成活性，没有特殊限定，例如含有全部或部分选自序列号1，3，19，27，34，64，70及80中的至少一种氨基酸序列的蛋白质，或者含有在这些序列中1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列，且具有促进DNA聚合酶的DNA合成活性这一作用的功能性同等物。本说明书中的“1个以上”指1个或数个或更多的个数。另外，“功能性同等物”指虽具有结构上的差异，但其功能和活性基本上同等，包含在本发明的DNA聚合酶相关因子的范围内。
作为本发明的DNA聚合酶相关因子促进其活性的DNA聚合酶，没有特殊限定，例如耐热性的DNA聚合酶，尤其是来源于超嗜热菌的DNA聚合酶。具体地讲，可例举来源于激烈热球菌的DNA聚合酶(后述的Pfu聚合酶C等)。如后面所述，Pfu聚合酶是含有具有序列表的序列号5和序列号6中所示氨基酸序列的DNA聚合酶结构蛋白质的酶。
另外，本发明的DNA聚合酶相关因子，虽然只促进特定DNA聚合酶活性的也可以，但优选能对不同来源的多种DNA聚合酶起促进活性的。
促进DNA聚合酶的DNA合成活性的活性促进测定方法，只要是DNA聚合酶的DNA合成活性测定中所常用的方法即可，无特殊限定。促进DNA合成活性的活性可这样测定，如在新合成的DNA链摄取标记核苷酸的活性测定时，通过比较添加该因子和不添加该因子时的活性不同，可对该因子的活性进行测定。另外还可通过单位时间内新合成的DNA链的链长和PCR中扩增产物的量进行确认。前面所讲DNA合成活性的测定方法可以采用(哈珀&出版社发行(ハ一パ一アンドロ一发行))，D.R.Davis编辑的《来自大肠杆菌的DNA聚合酶》(DNA polymerasefrom Escherichia coli)中第263-276页(C.C.Richardson著)记载的方法。
另外，本发明的DNA聚合酶相关因子，与单独使用相比，多个DNA聚合酶相关因子并用时，可能会使共存的DNA聚合酶发挥出更高的DNA聚合酶活性。
(b)具有与DNA聚合酶相结合活性的DNA聚合酶相关因子
作为具有与DNA聚合酶相结合活性的DNA聚合酶相关因子，只要具有与DNA聚合酶相结合的活性即可，无特殊限定。另外，本说明书中的“具有与DNA聚合酶相结合活性的DNA聚合酶相关因子”，除指具有与DNA聚合酶直接结合活性的物质外，还包含其它物质，如具有通过其它的DNA聚合酶相关因子介导与DNA聚合酶间接结合活性的物质。例如，含有全部或部分选自序列表的序列号1，3，19，27，34，64，70和80中的至少一种氨基酸序列的蛋白质，含有这些序列中1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列，且具有与DNA聚合酶相结合活性的功能性同等物。本说明书中“1个以上”指1个或数个或更多的个数。
作为本发明的DNA聚合酶相关因子结合的DNA聚合酶没有特殊限定，例如耐热性DNA聚合酶，尤其是超嗜热菌来源的DNA聚合酶。具体而言可推荐来源于激烈热球菌的DNA聚合酶(Pfu聚合酶C等)。对于Pfu聚合酶C，可与具有序列表的序列号5，序列号6所示氨基酸序列的DNA聚合酶结构蛋白质中的任一方或双方结合。
另外，本发明的DNA聚合酶相关因子，虽然与特定的DNA聚合酶相结合的也可以，但优选可与不同起源的多种DNA聚合酶相结合的。
作为与DNA聚合酶相结合的测定方法，可推荐将该因子与DNA聚合酶相混合，通过未变性凝胶电泳、凝胶过滤等检测分子量变化的方法，该因子将DNA聚合酶向固相载体吸附的检测方法。
另外，由序列表的序列号19所示氨基酸序列构成的DNA聚合酶相关因子，具有核酸外切酶活性。由此认为序列表中序列号19所示的氨基酸序列所构成的DNA聚合酶相关因子，是具有与DNA复制、DNA修复等DNA聚合酶作用相关功能的蛋白质。并且，作为上述DNA聚合酶相关因子的功能性同等物，含有序列表中序列号19所示的氨基酸序列的一部分，或者含有该序列中有1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的序列，具有与DNA聚合酶相结合的活性，且同样还具有核酸外切酶活性的蛋白质，也作为DNA聚合酶相关因子，属于本发明的范围内。本说明书中“1个以上”指1个或数个或更多的个数。
在本发明的DNA聚合酶相关因子的说明中，表示为“分别含有序列表中特定序列号所示氨基酸序列全部或一部分的蛋白质”，但这里的“含有的蛋白质”是指如下的蛋白质，也包含在本发明的范围内。即，用基因工程学方法生产蛋白质的时候，可屡次作为融合蛋白质进行表达。例如，为了增加目的蛋白质的表达量，可在N末端添加来源于其它蛋白质的N末端肽链，或者在目的蛋白质的N末端或C末端添加合适的肽链进行表达，通过使用与该肽链具有亲和性的载体，很容易地进行目的蛋白质的纯化。上述融合蛋白质也包含在本发明的范围内。2.编码本发明DNA聚合酶相关因子的基因
(a)编码本发明的DNA聚合酶相关因子的基因性质
编码本发明的DNA聚合酶相关因子的基因，是编码前面所讲的DNA聚合酶相关因子的DNA或RNA。具体而言，可推荐这样的基因，它所编码的DNA聚合酶相关因子含有选自序列表序列号1，3，19，27，34，64，70及80中的至少一种氨基酸序列的全部或一部分，或者含有这些序列中有1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列，还具有促进DNA聚合酶的DNA合成活性的活性，或与DNA聚合酶相结合的活性。具体而言，这样的基因所编码的DNA聚合酶相关因子含有选自序列表序列号2，4，18，26，33，63，69和79中的至少一种氨基酸序列的全部或其中一部分，或者含有这些序列中有1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列，具有促进DNA聚合酶的DNA合成活性的活性或具有与DNA聚合酶相结合的活性。本说明书中“1个以上”指1个或数个或更多的个数。再者本发明中还包括这样的基因，它所编码的DNA聚合酶相关因子也能与本发明的这些基因的DNA杂交，且具有促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的活性，或具有与DNA聚合酶相结合的活性。
本说明书中的“(与某种基因)杂交的基因”指由能与某基因的DNA进行杂交的DNA组成的基因，是具有与该基因类似的碱基序列的基因。具有与某基因类似的碱基序列的基因，与该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列，该蛋白质所具有的功能相类似的可能性高。基因碱基序列的相似性可通过检测两基因的DNA或其一部分序列能否在严格条件下形成杂交体(进行杂交)来加以判断，利用这种方法可获得编码与某基因编码的蛋白质具有同样功能的蛋白质的基因。也就是说，用本发明中得到的基因的DNA或其一部分作探针，通过应用众所周知的方法进行杂交，可得到具有与本发明的某基因相类似的碱基序列的本发明的其它基因。例如杂交可根据1989年冷泉港实验室发行，T.Maniatis等编著的《分子克隆：实验手册》第2版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual2nd ed.)所记载的方法进行。
这里所讲的“严格条件”是指不引起非特异性杂交的条件，具体而言，可推荐以下的条件。即，在含有0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400、0.01％变性鲑精DNA的6×SSC(1×SSC表示0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中将固定了DNA的膜。50℃，与标记DNA探针共温育12-20小时。温育之后，从0.5％SDS的2×SSC、37℃的条件开始洗涤，到SSC浓度为0.1×SSC，温度到达50℃的范围内进行变化来洗膜，直到固定的标记DNA探针的信号能与背景相区别为止。
另外，杂交中可用本发明的基因的碱基序列的一部分作引物的基因扩增法，例如可利用PCR法。PCR的条件可根据引物DNA或模板DNA的序列进行适宜的设定。这样所得的基因是否能编码具有目的功能的蛋白质，可利用适当的宿主和表达体系来表达该基因所编码的蛋白质，通过确认所得蛋白质的活性进行检测。
另外，作为人为制备本发明中的氨基酸序列或碱基序列中有1个以上的序列发生了置换、缺失、添加或插入了的氨基酸序列或碱基序列的方法，可推荐1989年，冷泉港实验室发行，T.Maniatis等编著的“分子克隆：实验手册》第2版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual2nd ed.)中记载的多种基因工程学方法，具体而言，可推荐位点特异的突变导入法、盒突变法等基因工程学方法。应用前述的部位特异性突变导入法可制备具有1个或数个置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列或碱基序列。另外，应用前述的盒突变法可制备出比用前述的部位特异性突变导入法得到的序列具有更大区域的缺失、添加或插入的氨基酸序列或碱基序列，若如此所得的变异体也具有功能上的同等性，则也包含于本发明的范围内。在基因工程学的蛋白质生产中，编码目的蛋白质的原来基因上使用的密码子在宿主中使用频度低的时候，蛋白质的表达量低。这种情况下，不改变编码的氨基酸序列而人为地将密码子变成在宿主中频繁使用的密码子，这样来达到高表达目的蛋白质的目的(例如，特公平7-102146号公报)。
(b)编码本发明的DNA聚合物相关因子的基因的克隆
以下详细说明对所得克隆的分析，其表达产物DNA聚合酶相关因子理化性质、功能的阐明。
如前所述，本发明的DNA聚合酶相关因子具有促进DNA聚合酶具有的DNA合成活性的作用，或具有与DNA聚合酶相结合的性质。因此，可以这些作用为指标来获取该因子。
作为获取本发明的DNA聚合酶相关因子时所应用的DNA聚合酶没有特殊限制，例如，可应用激烈热球菌生产的DNA聚合酶。作为激烈热球菌生产的DNA聚合酶，可应用来源于激烈热球菌DSM 3638株的含有具有序列表中序列号5和/或序列号6所示的氨基酸序列的DNA聚合酶构造蛋白质的酶。
另外，本说明书中为了与从同一激烈热球菌发现的α型DNA聚合酶[Pfu DNA聚合酶，核酸研究(Nucleic Acids Research)，第21卷，259～265页(1993)]相区别，将该酶记作Pfu聚合酶C。编码该酶的基因包含在质粒pFU 1001中，而将用该质粒转化的大肠杆菌JM 109的转化体命名为大肠杆菌JM 109/pFU 1001，按照布达佩斯的条约，于平成7年8月11日(原保藏日)保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-5579。由此，Pfu聚合酶C可通过培养该转化体，对所得培养物进行纯化而获得。该Pfu聚合酶C是含有具有序列表中序列号5和序列号6所示氨基酸序列的DNA聚合酶构成蛋白质的酶。
Pfu聚合酶C是具有以下性质的酶。
(A)以单链模板DNA的引物退火的复合体作底物测定聚合酶活性时，比以活性DNA作底物时的活性高。
(B)具有3′→5′核酸外切酶活性。
(C)以λ-DNA作模板在以下条件下进行聚合酶链式反应的时候，在不添加其它酶时可扩增出大约20kb的DNA片段。PCR的条件：
a)反应液组成：含有10mM Tris-HCl(pH9.2)，3.5mMMgCl2，75mM KCl，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各400μm，0.01％牛血清白蛋白，0.1％Triton X-100，5.0％ng/50μl λ-DNA，10pmole/50μl引物λ1(序列表中序列号58)及引物λ11(序列表中序列号59)，3.7单位/50μl DNA聚合酶。
b)反应条件：98℃10秒～68℃10分为1个循环，进行30个循环的PCR。
(D)由SDS-PAGE上大约相当于90,000道尔顿，140,000道尔顿的2种DNA聚合酶结构蛋白质组成。
获得本发明的DNA聚合酶相关因子的方法没有特殊限定，例如可这样获得：将上述的Pfu聚合酶C等DNA聚合酶固定到适宜的载体上，将之与含有DNA聚合酶相关因子的样品相混合，除去未与载体结合的物质后，溶出结合了的物质。可用众知的方法将DNA聚合酶固定到载体。另外也可制备DNA聚合酶的抗体，利用将之固定化的载体进行DNA聚合酶的固定化。例如，制备抗Pfu聚合酶C的抗体，应用该抗体，从激烈热球菌来源的样品，如激烈热球菌的细胞裂解液中获取本发明的DNA聚合酶相关因子的时候，若使用该抗体的固定化载体，由于样品中的Pfu聚合酶C与该抗体相结合，不必要额外再添加该Pfu聚合酶C，就可容易地纯化出DNA聚合酶相关因子。
作为获取本发明的DNA聚合酶相关因子所使用的样品，没有特殊限定，例如可应用来源于微生物的样品，具体而言，可应用来源于激烈热球菌SDM 3638的样品。该菌株可从德意志微生物保藏中心GmbH得到。在适当的增殖培养基上培养该菌株，将由培养物制备的细胞裂解液加样到填充了Pfu聚合酶C抗体固定化载体的柱子上，除Pfu聚合酶C之外，数种蛋白质吸附到柱上。可用如下所示的工序克隆出编码这些蛋白质的基团。
首先，应用众所周知的方法分离上述的蛋白质，测定其N末端的氨基酸序列，以此作参考制备合成寡核苷酸用作引物或探针。然后，以合成的寡核苷酸作引物，以激烈热球菌的基因组DNA作模板进行PCR，由此获得含有目的基因的DNA片段。PCR条件可进行适当设定。或者以上述的寡核苷酸作探针进行杂交，从激烈热球菌的基因组DNA获得含有目的基因的DNA片段。这种情况下可应用很适当的限制性酶消化了的激烈热球菌基因组DNA进行Southern杂交，应用该激烈热球菌基因组DNA的基因文库进行菌落杂交、噬斑杂交、点杂交等。
如此所得的DNA片段没有包括目的基因全长的时候，可参考所得DNA片段的碱基序列制作新的引物，再进行PCR，或者用所得DNA片段或其一部分作探针进行杂交，由此得到目的基因的全长。
上述的PCR和杂交操作没有特殊的限定，例如可参照1989年，冷泉港实验室出版，T.Maniatis等编著的“分子克隆：实验手册》第2版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.)进行。
当激烈热球菌DSM 3638的细胞裂解液与上述的抗Pfu聚合酶C抗体固定化载体混合的时候，除Pfu聚合酶C之外，还有7种蛋白质吸附到该载体上。本发明通过上述操作分离出了其中6种蛋白质的基因。这些蛋白质分别命名为F1，F2，F3，F4，F5和F7，是本发明的DNA聚合酶相关因子的具体例子。编码它们的基因的开读框的碱基序列分别示于序列表的序列号18，26，79，33，69及2中。另外，由这些碱基序列所推算的各蛋白质的氨基酸序列分别示于序列表的序列号19，27，80，34，70及1中。
将克隆的基因导入适当的宿主中，例如导入大肠杆菌中，可表达出到所编码的蛋白质。例如，将导入了编码上述F7基因的大肠杆菌JM 109的转化体命名为大肠杆菌JM 109/pF7-HH-18，依照布达佩斯条约，于平成9年6月3日(原保藏日)保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-6338。培养该转化体，可从培养物中获得F7。本发明中证明如此所得的F7除分离该蛋白质时所应用的Pfu聚合酶C之外，还可促进来源于激烈热球菌的α型聚合酶(Pfu DNA聚合酶)及来源于隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)的2种DNA聚合酶[细菌学杂志(J.Bacteriol)第177卷，第2164～2177页(1993)的活性。
另外证明上述的F1，F2，F3，F4和F5也分别促进Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶的活性。
将上述来源于激烈热球菌DSM 3638的蛋白质的氨基酸序列与已知的蛋白质的氨基酸序列进行比较的时候，发现F1与来源于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的单链DNA特异的核酸外切酶[科学(Science)，第269卷，第496～512页(1993)]间具有同源性。F3为来源于多枝支动菌(Mycoplana ramosa)的乙酰基多胺氨基水解酶[细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第178卷，第5781～5786页(1996)]及人的组蛋白脱酰基化酶[科学(Science)，第272卷，第408～411页(1996)]之间具有同源性。另外，F7和与真核生物DNA复制相关的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen：PCNA)[EMBO J.，第11卷，第5111～5120页(1995)；核酸研究(Nucleic Acids Research)第18卷，第1363～1381页(1990)；美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第84卷，第1575～1579页(1987)]之间具有同源性。未发现F2，F4及F5与已知的蛋白质间具有同源性。
具报道，PCNA与复制因子(RFC，RF-C)形成复合体，与DNA合成相关[生物化学，第68卷，第1542～1548页(1996)]。因此期望激烈热球菌中也有与RFC相当的蛋白质表达，与上述的F7一起关系到DNA合成反应。获得该蛋白质，例如通过与上述F7一起加入到DNA聚合酶反应体系中，得到DNA聚合酶活性更佳促进效果。可通过如下所示的工程来获得编码激烈热球菌的RFC同源体的基因。
古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)染色体DNA的全部碱基序列已经阐明[科学(Science)，第273卷，第1058～1073页(1996)]，该碱基序列中包含编码PCNA及RFC的同源蛋白质的基因。比较该菌株的RFC小亚基和大亚基的同源基因及已知的RFC小亚基基因编码的氨基酸序列[核酸研究(Nucleic Acids Research)，第21卷，第123页(1993)；核酸研究(Nucleic Acids Research)，第22卷，第1527～1535页(1994)]，检测其同源性高的氨基酸序列，以此作参考，可以制备合成寡核苷酸作为引物或探针，以获得编码RFC小亚基及大亚基的基因片段。接着使用该寡核苷酸，根据上述获得编码F1～F7的基因时的操作，可获得编码来源于激烈热球菌的RFC小亚基相同物PFC-RFC的基因及编码RFC大亚基相同物的PFU-RFCLS的基因。
测定如此所得的编码PFC-RFC的基因的碱基序列，将由至所编码的推算的氨基酸序列，与已知的RFC小亚基的氨基酸序列进行比较，结果证明该氨基酸序列中存在介内序列(intein)。
将介内序列对应的区域从该基因中除去，可获得在可能表达PFU-RFC的状态下所包含的基因。编码该基因中PFC-RFC区域的开放阅读框的碱基序列以及由该碱基序列所推算的PFU-RFC的氨基酸序列分别示于序列表的序列号4和3中。另外，PFU-RFCLS基因中的编码PFU-RFCLS的开放阅读框的碱基序列以及至所编码的蛋白质的氨基酸序列分别显示于序列表的序列号63和64中。这两种蛋白质也是本发明的DNA聚合酶相关因子的具体实例之一。
应用该基因可构建PFU-RFC表达时使用的质粒。这样的表达质粒有质粒pRFS254SNc，另外，将导入了该质粒的大肠杆菌JM 109的转化体命名为大肠杆菌JM 109/pRFS254SNc，于平成9年6月3日(原保藏日)，依照布达佩斯条约，保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-6339。培养该转化体，可从培养物中获得PFU-RFC。该PFU-RFC单独应用时可促进DNA聚合酶的活性，与上述F7联合应用时，与单独添加各蛋白质的情况相比，可以看到协同的促进效果。
另外，可制备同时导入了PFU-RFC基因和PFU-RFCLS基因的转化体，由此可表达PFU-RFC与PFU-RFCLS所形成的复合体(以下叫做holo-RFC。另外，特别将用基因工程学方法生产的holo-RFC记作rRFC-M复合体)。前面复合体能促进DNA聚合酶的活性，尤其与前面的F7并用的时候表现出高效。
前面所述的PFU-RFC及PFU-RFCLS与F7混合使用的时候，能更强的促进DNA聚合酶活性。这种情况下可将前面所述的holo-RFC(或rRFC-M复合体)与F7混合使用，也可应用前述的PFU-RFC、PFU-RFCLS及F7构成的复合体(RFC-N复合体)。
按照以上说明，本发明提供促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的DNA聚合酶相关因子及编码该因子的基因。利用该基因，可通过基因工程学方法生产该基因。再者，利用该基因可获得编码与本发明的DNA聚合酶相关因子具有同等功能的蛋白质的基因。
本发明的DNA聚合酶相关因子包括前述已知与DNA合成反应相关的蛋白质，例如与来自真核生物的PCNA、RFC等蛋白质间具有同源性的蛋白质。据报道，PCNA、RFC等蛋白质以形成复合体的方式，通过DNA聚合酶δ参与DNA合成反应[生物化学，第68卷，第1542～1548页(1996)]。但是，本发明所公开的DNA聚合酶相关因子不仅其复合体，即便在分别单独应用的时候也可促进DNA聚合酶的活性，另外，对与DNA聚合酶δ结构不同的DNA聚合酶也有效果。
可用于具有促进作用的、利用DNA聚合酶的各种各样的工程中，例如用于DNA碱基序列测定，DNA的标记，通过PCR进行的DNA扩增等。向DNA聚合酶的反应体系中加入本发明的DNA聚合酶相关因子后，尤其可见从引物开始的延伸DNA链的活性得以改善。另外，由于该因子具有高热稳定性，所以可用于PCR，尤其是期望扩增长链DNA的PCR。
再者，本发明的DNA聚合酶相关因子中具有与DNA聚合酶结合活性的因子，可在DNA聚合酶的检测、纯化等过程中使用。例如，在使用结合了本发明的DNA聚合酶相关因子的载体进行亲和层析的时候，可有效地纯化该因子结合的DNA聚合酶。3.本发明的DNA聚合酶相关因子的制备方法
本发明DNA聚合酶相关因子的制备方法的特征之一是含有这样的工序：培养含有本发明的基因的转化体，从培养物中采集具有促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性或具有与DNA聚合酶相结合活性的耐热性DNA聚合酶相关因子。
本发明的DNA聚合酶相关因子的制备方法中，可应用蛋白质纯化中所适用的普通方法。例如，可将编码本发明的DNA聚合酶相关因子的DNA连接到表达载体上，在表达载体启动子的控制下进行过量表达。或者将编码本发明的DNA聚合酶相关因子的DNA与惯用的编码谷胱甘肽还原酶、β-半乳糖苷酶等蛋白质的DNA或者与编码组氨酸标记(ヒスチジンタグ)的DNA连接，以融合蛋白的形式进行表达，这样可从保持本发明基因的转化体中容易地采集到该DNA聚合酶相关因子。可通过应用常用的镍柱等亲和层析色谱，容易地分离前面的融合蛋白质。通过常用的方法可从前面的融合蛋白质的谷胱甘肽还原酶、β-半乳糖苷酶等蛋白质分离到本发明的DNA聚合酶相关因子。
另外，与从激烈热球菌获得本发明的DNA聚合酶相关因子的方法相同，表达的本发明的DNA聚合酶相关因子可这样获得：将Pfu聚合酶C等DNA聚合酶固化到适当的载体上，将之与含有DNA聚合酶相关因子的样品相混合，除去未与载体相结合的物质之后，溶出结合的物质，即可获得。4.DNA的合成方法
本发明的合成方法的一大特征是：在前述本发明DNA聚合酶相关因子的存在下，应用DNA聚合酶合成DNA。本发明的DNA合成方法中，在本发明的DNA聚合酶相关因子的存在下，通过应用DNA聚合酶合成DNA，可扩增得到大约20kb的长链DNA。
本发明的DNA合成方法中所应用的DNA聚合酶相关因子可推荐F1，F2，F3，F4，F5，F7，PFU-RFC和PFU-RFCLS等。本发明的DNA合成方法中，上述的DNA聚合酶相关因子可单独应用或2种以上混合使用。例如，本发明的DNA合成方法中，通过应用F7，PFU-RFC和PFU-RFCLS 3种DNA聚合酶相关因子，可合成比以往DNA合成方法中所得到的DNA片段更长的DNA片段。本发明的DNA的合成方法中，前述的3种DNA聚合酶相关因子可各自单独混合使用，亦可将F7与PFU-RFC及PFU-RFCLS构成的holo-RFC(rRFC-M复合体)2种一起混合使用。再者，前面的3种DNA聚合酶相关因子也可以F7、PFU-RFC及PFU-RFCLS构成的复合体(RFC-N复合体)的形式应用。
本发明的DNA合成方法中所应用的DNA聚合酶，可应用以来源于大肠杆菌的Pol I等DNA聚合酶，来源于嗜热型栖热菌(Thermusthermophilus)的Tth DNA聚合酶，来源于水生型栖热菌(Thermusaquaticus)的Taq DNA聚合酶，来源于激烈热球菌的Pfu DNA聚合酶等为代表的耐热性DNA聚合酶。
另外，本发明的DNA合成方法中，可应用前述的DNA聚合酶通过PCR来合成DNA。
本发明的DNA合成方法中对本发明的DNA聚合酶相关因子存在的使用量没有特殊限定，为了发挥促进DNA聚合酶的合成活性的活性，可足量使用。5.含有本发明的DNA聚合酶相关因子的试剂盒
本发明的DNA聚合酶相关因子可用于使用DNA聚合酶的各种反应中。因此可将本发明的DNA聚合酶相关因子添加到用于试管内进行DNA合成反应的试剂盒中，如用双脱氧法测定DNA碱基序列的试剂盒，DNA标记用试剂盒，PCR试剂盒等，由此可改善这些试剂盒的性能。这样的试剂盒除含有DNA聚合酶和本发明的DNA聚合酶相关因子外，也可包含DNA聚合酶反应中所必要的其他试剂，如dNTP，MgCl2等。作为本发明的试剂盒中所包含的DNA聚合酶相关因子，可推荐F1，F2，F3，F4，F5，F7，PFU-RFC及PFU-RFCLS等。本发明的试剂盒中，前述的DNA聚合酶相关因子可单独或2种以上混合使用。优选应用F7，PFU-RFC及PFU-RFCLS 3种DNA聚合酶相关因子。前述的3种DNA聚合酶相关因子可各自单独混合使用，也可将F7与PFU-RFC及PFU-RFCLS构成的holo-RFC(rRFC-M复合体)2种一起混合使用，再者，前述的3种DNA聚合酶相关因子可以F7，PFU-RFC及PFU-RFCLS构成的复合体(RFC-N复合体)形式使用。另外，作为本发明的试剂盒中所包含的DNA聚合酶可应用以来源于大肠杆菌的Pol I等DNA聚合酶，来源于嗜热型栖热菌(Thermusthermophilus)的Tth DNA聚合酶，来源于水生型栖热菌(Thermusaquaticus)的Taq DNA聚合酶，来源于激烈热球菌的Pfu DNA聚合酶为代表的耐热性DNA聚合酶。本发明的试剂盒中优选含有耐热型DNA聚合酶。将本发明的试剂盒用于前述的DNA合成方法中，可更简便地合成高分子DNA。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例1(1)激烈热球菌基因组DNA的制备
激烈热球菌DSM 3638的培养如下进行。
将由1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％可溶性淀粉，3.5％Jamlin S·固态(Jamlin(ヅャマリン)研究室)，0.5％Jamlin S·液态(Jamlin研究室)，0.5％MgSO4，0.003％NaCl，0.001％FeSO4·7H2O，0.0001％CoSO4，0.0001％CaCl2·7H2O，0.0001％ZnSO4，0.0001％CuSO4·5H2O，0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppmH3BO3，0.1ppm Na2MoO4·2H2O，0.25ppm NiCl2·6H2O组成的培养基装入到2升的培养瓶中，120℃、灭菌20分钟后，吹入氮气，除去溶解的氧气后，将前述的菌种接种到所得培养基上，95℃，静置培养16小时。培养结束后离心收集菌体。
接着，将菌体悬浮到含有25％蔗糖的0.05M Tris-HCl(pH8.0)4ml中，向该悬液中加入8ml的溶菌酶[5mg/ml，0.25MTris-HCl(pH8.0)]，2ml的0.2M EDTA，20℃保温1小时后，加入24ml的SET溶液[150mM NaCl，1mM EDTA，20mMTris-HCl(pH8.0)]，再加入5％SDS 4ml，蛋白酶K(10mg/ml)400μl，37℃反应1小时。反应结束后，用酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备出大约3.2mg的基因组DNA。(2)粘粒DNA文库的制备
用Sau 3AI部分消化400μg激烈热球菌DSM 3638基因组DNA，通过密度梯度超速离心得到35～50kb大小的级分。接着用XbaI消化三链螺旋粘粒载体(Stratagene公司)1μg后，用碱性磷酸酶(宝酒造公司)脱磷酸化，再用BamHI消化后，与上面分离到的35～50kb的DNA 140μg混合，然后进行连接反应。应用所得反应液和ガイガ一パツク·gold(Stratagene公司)，通过体外包装法，将含有激烈热球菌基因组DNA片段的粘粒包装到λ噬菌体粒子中，制备粘粒文库。然后用该文库的一部分转入大肠杆菌DH 5αMCR(BRL公司)。从所得转化体中筛选出500个克隆，分别为粘粒克隆No.1～No.50，再从每个克隆制备粘粒DNA。从中筛选出数个，用限制性酶进行外消化，确认到其中插入了适当大小的片段。(3)Pfu聚合酶C基因的克隆
预制反应液中含有20mM Tris-HCl(pH7.7)，2mM MgCl2，2mM 2-巯基乙醇，0.2mg/ml活化DNA，各40μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，60nM[3H]-dTTP(Amersham公司)。将来源于上述粘粒DNA文库各克隆中的提取液1μl，每份5个克隆(5μl)加入到上述反应液45μl中，75℃反应15分钟后，从所得各反应物中每份吸取40μl到DE纸上，用5％Na2HPO4洗涤5次，用液闪仪测定DE纸上残留物的放射活性。5个克隆作为一组测定一次。发现有活性的组，再将5个克隆分成各单独1个克隆，进行再次测定。粘粒DNA文库中包含已知DNA聚合酶基因的，预先用该基因作探针进行杂交实验，由此判断为克隆No.57，154，162和363，除这些克隆以外，可得到含有DNA合成活性的克隆No.41，153，264，462和491 5个克隆。
对上述的5个克隆分离其粘粒，分别用BamHI消化，通过观测其电泳图发现彼此有几条带相同，尽管这5个克隆有所重叠，但可以预测其组成中含有稍微不同的部分。于是对克隆No.264及491的插入DNA片段作了限制性酶谱。以所得限制性酶谱为依据，从来源于克隆264或491的粘粒切出约10kb左右的各种DNA片段，亚克隆到pTV118N或pTV119N载体(宝酒造)中。对所得的保持重组质粒的转化体进行耐热性DNA聚合酶活性的测定，结果表明在约10kb的XbaI-XbaI片段中存在着产生强耐热性DNA聚合酶的基因。因此将该XbaI-XbaI片段重组到pTV118N载体上的部分命名为质粒pFU 1001，将用该质粒转化的大肠杆菌JM 109命名为大肠杆菌JM 109/pFU 1001(FERM BP-5579)。(4)Pfu聚合物C的DNA聚合酶结构蛋白质的分析
再次用XbaI从上述的质粒pFU 1001中切出含有DNA聚合酶基因的上述XbaI-XbaI片段，用DNA平端化试剂盒(宝酒造公司)，使其末端平端化后，与用SmaI消化新的pTV118N载体形成的开环部分连接，制备成用于制作缺损突变体的质粒，根据插入片段的方向性不同，分别命名为pFU 1002和pFU 1003。应用这些质粒，从所插入的DNA片段的两端开始依次造成缺失，由此制作缺损突变体。制作时可按Henikoff的方法(基因(gene)，第28卷，第351～359页)，应用Kilo-Sequence用的缺失试剂盒(宝酒造)。分别用PstI和XbaI作为3′突出型和5′突出型限制性酶。以所得的各种缺失突变体为模板，应用BcaBEST双脱氧测序试剂盒(宝酒造)，通过双脱氧法测定插入片段的碱基序列。分析所得的碱基序列，结果发现编码蛋白质的6个开放阅读框(ORF)。应用各种缺失突变体测定耐热性DNA聚合酶活性时，显示ORF3和ORF4的翻译产物在DNA聚合酶活性的表达中起到重要作用。序列表的序列号5、6分别表示ORF3和ORF4的氨基酸序列。也就是说，Pfu聚合酶C是一种这样的酶，它含有分别具有序列表的序列号5和6中氨基酸序列的2种DNA聚合酶组成蛋白质。实施例2(1)Pfu聚合酶C的制备
如下制备作为抗原的Pfu聚合酶C。在2升含有100μg 1ml氨苄青霉素的LB培养基(1.0％胰蛋白胨，0.3％酵母提取物，0.5％氯化钠，pH7.2)中培养大肠杆菌JM 109/pFU 1001。当培养液的浓度达0.6 A600时，加入终浓度为1mM的诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到37ml的超声缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，0.2mM 2-巯基乙醇，10％甘油，2mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中，置于超声破碎机上。将破碎液经1200rpm离心10分钟，所得上清80℃热处理15分钟。之后再经1200rpm离心10分钟，收集上清，得到33ml的热处理上清液。接着，以2升缓冲液A(50mM磷酸钙、pH6.5，2mM 2-巯基乙醇，10％甘油)作透析外液，将该溶液进行2小时的透析，共透析4次。将透析后的酶液32ml提供给用缓冲液A平衡过的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)，应用FPLC系统(Pharmacia公司)进行色谱分析。用0～500mM的NaCl直线浓度梯度进行洗脱。DNA聚合酶活性在340mM NaCl的浓度下被洗脱出。
收集活性部分，得到10ml酶溶液，用旋转浓缩仪Centripro CF 50(セントリフロ一CF-50)(グレ一スジャパン公司)浓缩该溶液后，用PD-10柱(Pharmacia公司)置换成含有150mM NaCl的缓冲液A，将所得3.5ml酶溶液提供给用同一缓冲液平衡过的HiTrapHeparin柱(Pharmacia公司)。用FPLC系统，用150～650mM NaCl直线浓度梯度进行洗脱，在400mM NaCl的浓度下洗脱出活性部分。用离心超滤仪Centricon-10(セントリコン-10)(Amicon公司)经超滤浓缩该活性部分5ml，将120μl的浓缩液提供给用含有75mM氯化钠、2mM 2-巯基乙醇的50mM磷酸钙缓冲液(pH6.5)平衡过的Superose 6凝胶过滤柱(Pharmacia公司)，用同一缓冲液进行洗脱，结果在保留时间为34.7分和38.3分钟的位置洗脱出DNA聚合酶活性。浓缩在38.3分钟的位置洗脱出的级分，将所得浓缩液作为抗原用于制备抗Pfu聚合酶C的多克隆抗体。
在上述Pfu聚合酶C的纯化中，按以下的方法测定酶活性。应用小牛胸腺DNA(ワ一ジントン公司)活化产物(活化DNA)作底物。DNA的活性及DNA聚合酶的活性测定按哈珀&朗出版社(ハ一パ一アンドロ一)发行，D.R.Davis编著的《来自大肠杆菌的DNA聚合酶》(DNApolymerase from Escehrichia coli)，第263-276页(C.C.Richardson著)记载的方法进行。向用于测定活性的样品5μl中加入45μl反应液[20mM Tris-HCl(pH7.7)，15mM MgCl2，2mM2-巯基乙醇，0.2mg/ml活化DNA，dATP、dCTP、dGTP及dTTP各40μM，60nM[3H]-dTTP(Amersham公司)]，75℃反应5分钟。将其中的40μl吸到DE纸(Whattaman公司)上，用5％Na2HPO4洗涤5次后，用液闪仪测定DE纸上残存的放射活性。根据上述的酶活性测定方法，把每30分钟将10nmol的[3H]-dTMP摄取到底物DNA中的酶量作为1个酶单位。(2)抗Pfu聚合酶C抗体的制备
用50mM磷酸钙、pH6.5，2mM 2-巯基乙醇，75mM NaCl稀释上述的Pfu聚合酶C标准品，使之达1mg/100μl，加入等量的氟氏完全佐剂，使之乳化。将之注射到兔子皮下，每次注射50μl，每隔3周，共注射4次。最后一次免疫10天后采全血，室温放置60分钟后，离心，得到含有抗Pfu聚合酶C多克隆抗体的抗血清60ml。向20ml抗血清中加入20ml饱和硫酸铵溶液，4℃45分钟缓慢搅拌后，离心。将所得沉淀悬浮到5ml的20mM磷酸钠缓冲液pH7.0中，用同一缓冲液2L作透析外液透析2小时，共透析3次。将透析后的溶液14ml提供给用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡过的蛋白A柱(Pharmacia公司)，经同一缓冲液洗涤后，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)进行洗脱。用1M Tris-HCl、pH9.0中和洗脱出的抗Pfu聚合酶C多克隆抗体，然后用旋转浓缩仪Centripro CF-50浓缩，用PD-10柱(Pharmacia公司)置换成偶联缓冲液(0.5M氯化钠，0.2M碳酸氢钠、pH8.3)，制备出含有抗Pfu聚合酶C抗体的溶液。(3)抗Pfu聚合酶C抗体柱的制作
用1mM盐酸6ml洗涤HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia公司)后，将上述的抗Pfu聚合酶C多克隆抗体溶液0.9ml(相当于含3.6mg的抗Pfu聚合酶C抗体)上柱。室温放置1小时后，用3ml的偶联缓冲液洗涤。接着，依次用6ml的封闭缓冲液(0.5M Tris-HCl pH8.3，0.5M氯化钠)；6ml的缓冲液B(0.1M醋酸钠pH4.0，0.5M氯化钠)，6ml的封闭缓冲液洗涤柱子，室温放置30分钟。再用6ml的缓冲液B，6ml的封闭缓冲液，6ml的缓冲液B洗涤柱子后，制备出用50mM Tris-HCl pH8.0平衡过的抗Pfu聚合酶C抗体柱。实施例3(1)用抗Pfu聚合酶C抗体柱纯化含有Pfu聚合酶C的复合体
与实施例1记载的方法相同，在2个培养瓶中将激烈热球菌DSM3638培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到34.7ml含有2mM PMSF的缓冲液C(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.1mM ATP)中，加到超声波破碎仪上。将破碎液12,000rpm离心10分钟，将所得上清46ml供给用缓冲液C平衡过的抗Pfu聚合酶C抗体柱。用缓冲液C洗涤柱子后，用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-盐酸、pH2.5，1mM ATP)洗脱含有Pfu聚合酶C的复合体。用1M Tris-HCl pH9.0中和洗脱液后，用旋转浓缩仪Centripro CF-50进行浓缩，作为Pfu聚合酶C复合体的浓缩液。(2)Pfu聚合酶C复合体的分析
将Pfu聚合酶C复合体的浓缩液进行SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺凝胶，使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、0.1％SDS，pH8.4的溶液作电泳缓冲液)，按以下的方法，用抗Pfu聚合酶C抗体对所得凝胶进行Western印迹。将SDS-PAGE后的胶浸到含40mMε-氨基-正己酸的封闭缓冲液1(25mM Tris-HCl，20％甲醇，pH9.4)中。接着将在封闭缓冲液2(0.3M Tris-HCl，20％甲醇，pH10.4)中浸泡过的纸、在25mM Tris-HCl，20％甲醇，pH10.4浸泡过的纸，在含有ε-氨基-正己酸酸的封闭缓冲液1中浸泡的PVDF膜，上述胶和在含40mMε-氨基-正己酸的封闭缓冲液1中浸泡过的纸逐层重叠到半干印迹转移装置(サイエンテイフイツク公司)上2mA/cm2封闭1小时。将该PVDF膜浸到含有0.01％硫柳汞的封闭液(ブロツクエ一ス)(雪印乳业株式会社)中，振荡10分钟后，将膜浸到用含有0.01％硫柳汞的封闭液(ブロツクエ一ス)稀释了1000倍的抗Pfu聚合酶C抗血清中。室温放置1小时后，用含有0.02％吐温20的TBS缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)洗涤，每次10分钟，洗涤3次，再用TBS缓冲液洗涤。然后将膜浸泡到用含有0.01％硫柳汞的封闭液(ブロツクエ一ス)稀释了5000倍的过氧化酶标记的抗兔IgG(Fc)抗体(オルガノンテク二カ公司)中。室温放置1小时后，用含有0.02％吐温20的TBS缓冲液洗PVDF膜，每次洗10分钟，洗3次，再用TBS缓冲液洗涤，将膜浸到柯尼卡免疫染色试剂HRP-100(柯尼卡公司)中进行显色。如图1所示，用考马斯亮兰-R-250对SDS-PAGE后的胶进行染色的结果与前述的Western印迹的结果表明上述的复合体中含有不与抗PFU聚合酶抗体反应的7种蛋白质(图1所示的F1～F7)。
因为考虑到不与抗Pfu聚合酶C抗体反应的带是借助于Pfu聚合酶C而吸附到柱上的蛋白质，所以用以下方法分析蛋白质的N端氨基酸序列。将实施例3(1)中所得的Pfu聚合酶C复合体的浓缩液进行与上面同样的SDS-PAGE，封阻到PVDF膜上。用考马斯亮兰-R-250对该膜进行染色后，切出目的带，以该膜的片段作样品，用G1000A蛋白质测序仪(ヒュ一レツトパツカ一ド公司)，末端根据自动Edman分解法测定目的蛋白质的N端氨基酸序列。结果如表1所示。另外，所得F1～F5及F7的N端氨基酸序列分别显示于序列表的序列号7～12中。
                                   表1
样品                                 N末端的氨基酸序列
F1                                   MDKEGFLNKVREAVDVVKLH
F2                                   MFTGKVLIPVKVLKKFENWN
F3                                   MIGSIFYSKKFNLHRPSEYH
F4                                   MKDYRPLLGAIKVKGDNVFS
F5                                   MDIEVLRRLLERELSSEH
F6                                   未能进行分析
F7                                   PFEIVFEGAKEFAQLID实施例4盒式DNA的制备
用EcoRI(宝酒造)完全消化实施例1中制备的激烈热球菌基因组DNA 10μg，将其中的500ng与50ng的EcoRI盒(宝酒造)混合后，进行连接。将连接反应液中经乙醇沉淀回收的DNA溶解到20μl的灭菌水中，将之作为EcoRI盒式DNA进行以下操作。
同前面的操作相同，分别制备添加了HindIII盒、XbaI盒、SaII盒、PstI盒和Sau3AI盒(全部为宝酒造)的盒式DNA。另外，在添加XbaI盒的时候，使用用XbaI和NheI 2套酶消化的基因组DNA，将所得DNA分别命名为XbaI盒式DNA及NheI/XbaI盒式DNA。在添加SalI盒的时候，使用用SalI及XhoI的2套酶消化的基因组DNA，将所得DNA分别命名为SalI盒式DNA及XhoI/SalI盒式DNA。在添加Sau3AI盒时，使用经BglII消化的基因组DNA，将所得DNA命名为BglII/Sau3AI盒式DNA。实施例5(1)含有F1基因的粘粒克隆的选择
在实施例3中所得F1 N末端氨基酸序列的基础上合成序列表序列号13及14中分别显示其氨基酸序列的引物F1-1和F1-2。以实施例4中制备的EcoRI盒式DNA 1μl作模板，应用各100pmol的F1-1和盒式引物C1(宝酒造)进行第1轮PCR，以其反应液1μl作模板，应用各100pmol的F1-2和盒式引物(宝酒造)进行第2轮的PCR。这2轮PCR中应用Pfu聚合酶(α型酶)(Stratagene公司)。反应液的组成及反应条件如下：20mM Tris-HCl、pH8.2，10mMKCl，20mM MgCl2，6mM(NH4)2SO4，0.2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP，1％Triton  X-100，0.1％BSA及2.3单位的Pfu DNA聚合酶(最终体积为100μl)，94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，第1轮PCR 30个循环，第2轮PCR为25个循环。以后的实施例中应用Pfu DNA聚合酶进行PCR时也应用相同组成的反应液。将扩增的大约550bp的DNA片段亚克隆到质粒载体pUC 119(宝酒造)中，测定其碱基序列。其后，以得到的序列为基础，合成其氨基酸序列分别显示于序列表序列号15和16中的引物F1S1和F1S2。应用F1S1和F1S2，以实施例1所示的粘粒DNA作模板进行PCR，筛选含有F1基因的粘粒克隆。用Takara PCR扩增试剂盒(宝酒造)，依照附带说明书进行PCR。结果证明在粘粒克隆No.22，46，61，133，178，180，210及317中含有F1基因。(2)F1基因的亚克隆
以实施例4中制备的HindIII盒式DNA 1μl作模板，用各200pmol的F1S1和盒式引物C2，或F1S2和盒式引物C2进行PCR。PCR中的酶用Pfu DNA聚合酶，反应液与实施例5(1)中的相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环，进行50个循环的反应。结果，用F1S2和盒式引物C2得到570 bp的DNA片段，但应用F1S1和盒式引物C2未见到DNA的扩增。由此可以猜想，HindIII位点在F1基因起始密码子的正上游，存在于从F1S1的退火位置开始，用PfuDNA聚合酶不能扩增的距离内。于是，从含有同基因的粘粒克隆中任意选出No.61，用HindIII进行消化，分离出约1.5kb以上的DNA片段，亚克隆到质粒载体pTV118N(宝酒造)。以所得各重组质粒作模板，用F1S1和F1S2作引物进行PCR，以检测有无F1基因，结果表明在大约2kb的HindIII片段中含有F1基因。将该DNA片段中的F1基因连接到pTV118N载体的lac启动子下游的质粒命名为pF1-4-10。另外，当对该质粒中所含插入DNA片段制作NcoI、EcoRI、BamHI、PstI、SacI和NdeI的限制性图谱时，得到如图2所示的结果。(3)含有F1基因的DNA片段碱基序列的测定
分别将质粒pF1-4-10及从该质粒中切出的NcoI-HindIII、EcoRI-EcoRI、BamHI-PstI、EcoRI-HindIII、HindIII-EcoRI及HindIII-BamHI片段亚克隆到质粒载体pTV119N(宝酒造)中，根据双脱氧法测定所得各质粒的插入DNA片段的碱基序列。综合这些结果得到的pF1-4-10插入DNA片段的碱基序列中的2009bp的序列在序列表的序列号17中显示。分析该碱基序列的结果发现包含F1 N末端氨基酸序列的开放阅读框。该序列显示于序列表的序列号18中，由该序列推算的F1翻译产物的氨基酸序列在序列表的序列号19中显示。当检索该氨基酸序列与已知的蛋白质氨基酸序列的同源性时发现，它与来源于流感嗜血杆菌属的单链DNA特异的核酸外切酶[科学(Science)，第269卷，第496～512页(1995)]间具有同源性。前半部分的同源性为23.2％，后半部分为24.3％。(4)F1表达质粒的构建
以实施例5(2)中的质粒pF1-4-10为模板，应用序列表的序列号20中显示其碱基序列的引物F1Nc及上述引物F1S2进行PCR。该PCR中应用Pfu DNA聚合酶，其反应液的组成与实施例5(1)相同。使用1ng的模板DNA及各20pmol的两引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，进行25个循环的反应。将扩增出的大约460bp的DNA片段与用NcoI和BglII(均为宝酒造)消化所得的片段、由BglII和HindIII消化上述质粒pF1-4-10所得的DNA片段一起整合到质粒载体pTV118N(宝酒造)的NcoI-HindIII位点间。将该质粒命名为pF1Nc-2。通过用双脱氧法确定碱基序列证实，该质粒插入的DNA片段中，用PCR扩增的区域未出现因PCR引起的突变。(5)纯化F1标准品的制备
在含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中培养实施例5(4)中得到的质粒pF1Nc-2转化大肠杆菌JM 109所得到的大肠杆菌JM 109/pF1Nc2，培养16小时。收集细菌后，用与实施例2(1)同样的方法，得到热处理上清液33ml。然后，将该溶液加到用缓冲液D(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巯基乙醇，10％甘油)平衡过的RESOURCE Q柱上(Pharmacia公司)，应用FPLC系统(Pharmacia公司)进行色谱分析。用0～500mM NaCl的直线浓度梯度进行洗脱。用340mM NaCl时洗脱出F1。
收集F1部分得到10ml的酶溶液，用旋转浓缩仪Centripro CF50浓缩后，用PD-10柱(Pharmacia公司)置换成缓冲液D，将3.5ml溶液提供给用同种缓冲液平衡过的HiTrap Blue柱(Pharmacia公司)。应用FPLC系统用缓冲液D洗涤柱子后，用含有2M氯化钠的缓冲液D洗脱出F1。将这一部分5ml用旋转浓缩仪Centricon 10浓缩后，将120μl的浓缩液提供给用含有2mM 2-巯基乙醇，75mM氯化钠的50mM Tris-HCl、pH8.0平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Pharmacia公司)。用同一缓冲液进行洗脱，结果在相当于大约49kD分子量的位置洗脱出F1。该分子量相当于F1以单体存在时的分子量。(6)核酸外切酶活性的测定
如下检测F1纯化标准品的5′→3′及3′→5′核酸外切酶活性。
首先用SspI(宝酒造)消化质粒载体pUC 119(宝酒造)，进行琼脂糖凝胶电泳，从胶中回收386bp的DNA片段，进行纯化。用[γ-32P]-ATP(Amersham)和聚核苷酸酶(宝酒造)标记该DNA片段的5′端，将所得的32P-标记的DNA片段用作5′→3′核酸外切酶活性的检测底物。另外，用Sau3AI(宝酒造)消化质粒载体pUC 119，同样回收所得的341bp的DNA片段进行纯化。再用[α-32P]-dCTP(Amersham)和Klenow片段(宝酒造)进行末端修饰反应，标记该DNA片段的3′末端，作为3′→5′核酸外切酶活性用的检测底物。用NICK柱(Pharmacia公司)进行凝胶过滤，以纯化上述2种标记DNA，用于以下的反应。
用HaeIII(宝酒造)完全消化这些标记的DNA片段2ng及λ-DNA(宝酒造)，制备含有所得消化产物12.5μg及上述F1纯化标准品10μl的反应液(200mM Tris-HCl、pH7.7，15mM MgCl2，2mM 2-巯基乙醇)，85℃反应2.5、5或7.5分钟后，用乙醇沉淀，沉淀出DNA。用液闪仪测定上清中存在的放射活性，由此求出因核酸外切酶活性造成的底物分解量。5′→3′核酸外切酶活性测定时加入50fmol的F1纯化标准品，3′→5′核酸外切酶活性测定时加入125pmol的F1纯化标准品。其结果分别显示于图3和图4中。
图3为5′→3′核酸外切酶活性的结果，图4为3′→5′核酸外切酶活性测定的结果。图中横轴为反应时间，纵轴表示上清中游离的放射活性占反应液全部包含的放射活性的比率。另外，图中黑点为本发明的F1纯化标准品的结果，白点为不加F1纯化标准品进行反应作为空白时所得的结果。如图中所示，本发明的F1纯化标准品具有5′→3′和3′→5′双向核酸外切酶活性。另外，上述结果提示5′→3′核酸外切酶活性比3′→5′核酸外切酶活性大约强500倍。实施例6(1)含有F2基因的粘粒克隆的选择
在实施例3所得F2 N末端氨基酸序列的基础上，合成序列表中序列号21和22中显示其碱基序列的引物F2-2及F2-3。以实施例4中制备的XbaI盒式DNA 1μl作模板，用100pmol的引物F2-2和20pmol的盒式引物C1进行第1轮PCR，再以其反应液1μl为模板，用100pmol的引物F2-3和20pmol的盒式引物C2进行第2轮PCR。这2轮PCR中使用Pfu聚合酶C。反应液的组成及反应条件如下：10mM Tris-HCl、pH9.2，75mM KCl，3.5mM MgCl2，各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，0.1％Triton X-100，0.01％BSA，和2.0单位的Pfu聚合酶C(终体积为100μl)，94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，第1轮进行30个循环，第2轮进行25个循环。将扩增的约250bp的DNA片段亚克隆到质粒载体pUC 119中，测定其DNA序列后，以所得序列为基础，合成其碱基序列显示于序列表的序列号23和24中的引物F2S3和F2S4。应用该引物，以实施例1中制备的粘粒DNA作模板进行PCR，选择含有F2基因的粘粒克隆。PCR中应用的酶为Pfu DNA聚合酶，应用各20pmol的引物，反应液与实施例5(1)相同，94℃(30秒)～55℃(3秒)～72℃(2分)为1个循环，进行25个循环的反应。结果表明No.172的粘粒克隆中含有F2基因。(2)F2基因的亚克隆
以实施例4的NheI/XbaI及XhoI/SalI盒式DNA各1μl作模板，应用各20pmol的F2S3和盒式引物C2或F2S4和盒式引物C2作为引物进行PCR。PCR中的酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环进行50个循环的反应。结果发现，用F2S3及盒式引物C2的引物对，扩增出分别针对NheI/XbaI和XhoI/SalI盒式DNA的大约700及1400bp的DNA片段，但用F2S3及盒式引物C2的引物对时未见到DNA的扩增。由此我们猜想，NheI和XhoI位点存在于从F2S4引物退火的位置开始用Pfu DNA聚合酶不能扩增的距离内。
于是，切出用NheI消化No.172所得的各种DNA片段，亚克隆到质粒载体pTV118N(宝酒造)中。以所得各重组质粒为模板，应用F2S3和F2S4作引物进行PCR，检测是否存在F2基因时证明约8kb的NheI片段中存在F2基因。于是将该NheI片段整合到pTV118N的质粒命名为质粒pF2172Nh。另外，当对该质粒中包含的插入DNA片段制作限制性酶谱时得到如图5所示的结果。
以图5中所示的限制性酶谱为基础，用HindIII消化质粒pF2172Nh，切出大约1.5kb的HindIII片段，亚克隆到质粒载体pTV118N中。检测重组质粒中F2基因的插入方向，均在载体的lac启动子的反方向插入。将此质粒命名为pF2172H16。检测用该质粒转化大肠杆菌JM 109而得到的大肠杆菌JM 109/pF2172H16的F2表达情况，发现并不高表达。于是，为了将F2基因连接到载体的正方向，用HindIII和EcoRI消化pF2172H16，将切出的HindIII-EcoRI片段连接到质粒载体pTV119Nd(将宝酒造公司的质粒载体pTV119N的NcoI位点变成NdeI)中。将所得重组质粒命名为pF2172HE11，将该质粒转化的大肠杆菌JM 109命名为大肠杆菌JM 109/pF2172HE11。(3)F2标准品的制备
在含有1mM IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中培养实施例6(2)中得到的大肠杆菌JM 109/pF2172HE11，培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到23.4ml的超声缓冲液中，用与实施例2(1)同样的方法得到19.5ml的热处理上清液。然后，把该溶液供给用缓冲液D平衡过的RESOURCE Q柱。
将过柱的F2部分22ml提供给用缓冲液D平衡过的RESOURCE S柱(Pharmacia公司)。用FPLC系统，用0～500mM NaCl直线浓度梯度进行洗脱，当用170mM NaCl的时候洗脱出F2部分。用离心超滤仪Centricon-10浓缩该部分，将所得到的75μl浓缩液提供给用含有2mM 2-巯基乙醇、75mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡过的Superdex 200柱凝胶过滤柱。用同一缓冲液进行洗脱，结果在大约120kDa或45kDa分子量的位置洗脱出F2。这一分子量是F2形成6聚体或2聚体时的分子量。(4)测定含有F2基因的DNA片段的碱基序列
用双脱氧法测定上述质粒pF2172HE11插入DNA片段的碱基序列。序列表的序列号25中显示了所得碱基序列中的957bp的序列。对该碱基序列进行分析的结果发现含有F2的N末端氨基酸序列的开放阅读框。该开放阅读框的碱基序列及由该碱基序列推算的F2翻译产物的氨基酸序列分别在序列表的序列号25、26中显示。对该氨基酸序列与已知的蛋白质的氨基酸序列间的同源性进行了检索，未发现具有同源性的蛋白质。实施例7(1)含有F4基因的粘粒克隆的选择
以实施例3中得到的F4 N末端氨基酸序列为基础合成序列表的序列号28及29中显示了其碱基序列的引物F4-1和F4-2。以实施例4的HindIII盒式DNA 1μl为模板，用100pmol的引物F4-1和20pmol的盒式引物C1进行第1次PCR，以其反应液1μl作模板，用F4-2和盒式引物C2进行第2次PCR。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)的相同，以94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，第1次进行30个循环的反应，第2次进行25个循环的反应。将由该反应扩增出的约1100bp的DNA片段亚克隆到质粒载体pUC 119中，用M4和RV引物(宝酒造)根据双脱氧法测定其碱基序列的一部分后，以所得序列为基础，合成序列表的序列号30及31中显示了其碱基序列的引物F4S1和F4S2。应用F4S1和F4S2引物，以实施例1中制备的粘粒DNA作模板进行PCR，选择出含有F4基因的粘粒克隆。PCR中的酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(1分)为1个循环进行30个循环的反应。结果表明粘粒克隆No.16，26，88，112，250，269，427和451中含有F4基因。(2)F4基因的亚克隆
以实施例4的XbaI盒式DNA 1μl为模板，应用各20pmol的F4S2和盒式引物C2进行PCR。PCR中酶用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环进行50个循环的反应。结果用F4S2和盒式引物C2扩增出约700bp的DNA片段。另外，以HindIII盒式DNA作模板，用F4-2和盒式引物C2，同样条件下进行PCR，扩增出大约1100bp的DNA片段。由此预计F4基因存在于大约1.6kb的XbaI-HindIII片段中。于是用XbaI和HindIII消化粘粒No.16，切出1.6kb左右的DNA片段，亚克隆到pTV 118N载体中。以所得各重组质粒为模板，应用F4S1和F4S2引物进行PCR，以此来检测有无F4基因。结果得到具有含F4基因的1.6kb XbaI-HindIII片段的质粒，将该质粒命名为pF4-1-4。另外对该质粒进行NcoI、EcoRI、BamHI、PstI、SacI和NdeI限制性酶消化时证明该质粒或插入DNA片段中没有这些酶的位点。(3)含有F4基因的DNA片段碱基序列的测定
用双脱氧法来测定上述质粒pF4-1-4的插入DNA片段的碱基序列。
序列表的序列号32中显示了所得碱基序列中的1012bp的序列。对该碱基序列进行分析的结果发现具有F4 N末端氨基酸序列的开放阅读框。序列表的序列号33和34中分别显示了该开放阅读框的碱基序列和由该碱基序列推算的F4翻译产物的氨基酸序列。对该氨基酸序列与已知蛋白质氨基酸序列的同源性进行了检索，未发现具有同源性的蛋白质。(4)F4表达质粒的构建
以实施例7(3)中的质粒pF4-1-4为模板，用序列表的序列号35中显示了其碱基序列的引物F4NNd和序列表的序列号36中显示了其碱基序列的引物F4CEc，应用Pfu DNA聚合酶和与实施例5(1)组成相同的反应液进行PCR。反应条件如下：使用1ng的模板DNA，各20pmol的2种引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，进行25个循环的反应。用NdeI和EcoRI(均为宝酒造公司)消化扩增的大约450bp的DNA片段，将所得DNA片段整合到上述质粒载体pTV119Nd的NdeI和EcoRI间，制作成质粒pF4Nd-6。再用双脱氧法确认该质粒中插入DNA片段的碱基序列，未发现因PCR而造成的变异。(5)纯化F4标准品的制备
在含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中培养用实施例7(4)中得到的质粒pF4Nd-6转化大肠杆菌JM 109而得到的转化体大肠杆菌JM 109/p4Nd-6，培养16个小时。收集细菌后，将菌体悬浮到33.4ml的超声缓冲液中，用与实施例2(1)同样的方法得到28ml热处理的上清液。然后将该溶液供给用缓冲液D平衡过的RESOURCEQ柱，用FPLC系统进行色谱分析。洗脱通过0～500mM NaCl直线浓度梯度进行。在325mM NaCl的浓度下洗脱出F4。
用PD-10柱子将收集到的F4级分的3ml溶液置换到含有150mMNaCl的缓冲液D中，将所得6.9ml溶液供给用同一缓冲液平衡过的HiTrap Heparin柱上，向通过柱子的7.2ml F4洗脱液中加入终浓度为1M的(NH4)2SO4。将该溶液提供给用含有1M(NH4)2SO4的缓冲液D平衡过的HiTrap Phenyl柱(Pharmacia公司)。应用FPLC系统分别用1M、0.5M(NH2)2SO4洗柱后，用缓冲液D洗脱出F4。用旋转浓缩仪Centricon-10浓缩该部分5ml，将所得76μl的浓缩液供给用含有2mM 2-巯基乙醇、75mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液、pH8.0平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱。用同一缓冲液进行洗脱，结果在分子量相当于39kDa的位置洗脱出F4。该分子量是F4形成2聚体或3聚体时的分子量。实施例8(1)含有F7基因的粘粒克隆的选择
以实施例3中得到的F7 N末端氨基酸序列为基础，合成序列表的序列号37和38中显示了其碱基序列的引物F7-1和F7-2。以实施例4中制备的1μl HindIII盒式DNA为模板，应用100pmol的F7-1和20pmol的盒式引物C1进行第1轮PCR，以其反应液1μl作模板，应用100pmol的引物F7-2和20pmol的盒式引物C2进行第2轮PCR。反应液的组成和反应条件与实施例6(1)相同。将扩增出的大约830bp的DNA片段亚克隆到质粒载体pUC 119中，测定其碱基序列后，以所得序列为基础合成序列表的序列号39和40中显示了其碱基序列的引物F7S1和F7S2。应用这些引物，以实施例1中的粘粒DNA为模板进行PCR，选择含有F7基因的粘粒克隆。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，反应以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环，进行30个循环。结果表明粘粒克隆No.15，96，114，167，277，348，386，400，419，456，457和484中含有F7基因。(2)F7基因的亚克隆
以实施例4中制备的HindIII盒式DNA 1μl作模板，用各20pmol的F7S2和盒式引物C2进行PCR。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环，进行30个循环的反应。结果扩增出大约900bp的片段。参照该结果以及实施例8(1)中用F7-2和盒式引物C2扩增的结果，可以推测F7基因存在于大约1.0kb的HindIII片段中。于是，用HindIII消化从含有同一基因的粘粒中任意选出的No.15，切出大约1.0kb的DNA片段，将之亚克隆到质粒载体pTV118N中。以所得各重组质粒为模板，用F7S1和F7S2作引物进行PCR，以此来检测有无F7基因时证实F7基因存在于1.0kb的HindIII片段中。将该DNA片段中的F7基因连接到pTV118N载体的lac启动子下游的质粒命名为pF7-HH-18，而将反方向连接的质粒命名为pF7-1-8。另外，对该质粒中所含插入DNA片段制作限制性酶谱时得到如图6所示的结果。(3)含有F7基因的DNA片段碱基序列的测定
将上述2种质粒及从这些质粒中切出的BamHI-HindIII、NdeI-HindIII、HindIII-NedI和HindIII-BamHI片段分别亚克隆到质粒载体pTV119Nd中，制备出这样的质粒，根据双脱氧法测定这些质粒插入部分的碱基序列。综合这些结果而得到的上述质粒插入DNA片段的碱基序列中989bp的序列显示于序列表的序列号41中。对该碱基序列进行分析的结果发现含有F7 N末端氨基酸序列的开放阅读框。该开放阅读框的碱基序列及由该序列而推算的F7翻译产物的氨基酸序列分别显示于序列表的序列号2和1中。对该氨基酸序列与已知蛋白质氨基酸序列的同源性进行了检索，发现与涉及真核生物DNA复制的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen：PCNA)[EMBO J.第11卷，第5111～5120页(1995)；核酸研究(Nucleic Acids Research)，第18卷，第261～265页(1990)；美国国家科学院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)，第84卷，第1575～1579页(1987)]之间具有同源性。与各文献中记载的蛋白质的同源性分别为24、28和24％。(4)纯化F7标准品的制备
用含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基培养用实施例8(2)中得到的质粒pF7-HH-18转化大肠杆菌JM 109而得到的大肠杆菌JM 109/pF7-HH-18，培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到45ml的超声缓冲液中，用与实施例2(1)同样的方法得到41.9ml的热处理上清液。然后，以2L的缓冲液A作外液对该溶液进行透析，每次2小时，共3次。将透析后的酶液36ml给用缓冲液A平衡过的RESOURCE Q柱上样，应用FPLC系统进行色谱分析。洗脱用0～500mM的NaCl直线浓度梯度进行。结果，用340mM的NaCl洗脱出F7。
用旋转浓缩仪Centripro-CF50浓缩收集到的F7的10ml溶液，用PD-10柱置换成含有1M(NH4)2SO4的缓冲液A，将所得3.3ml溶液供给用同一缓冲液平衡了的HiTrap Phenyl柱。应用FPLC系统，依次用1M和0.5M的(NH4)2SO4洗涤柱子后，用缓冲液A洗脱出F7。用离心超滤仪Centricon-10浓缩该部分4ml。将浓缩液供给用含有2mM 2-巯基乙醇，75mM NaCl的50mM磷酸钙缓冲液(pH6.5)平衡了的Superdex 200凝胶过滤柱。用同一缓冲液进行洗脱，结果在分子量相当于99kDa的位置洗脱出F7。该分子量是F7形成3聚体时的分子量。(5)F7对引物延伸反应的影响
为了检测F7对各种聚合酶的引物延伸反应的影响，在有无添加F7的情况下比较Pfu聚合酶C、Pfu DNA聚合酶(α型DNA聚合酶，Stratagene公司)以及来自隐蔽热网菌的Poc DNA聚合酶I和II[PocDNA聚合酶I和II，细菌学杂志(J.Bacteriol)第177卷，第2164～2177页(1995)l的活性。
DNA聚合酶活性的测定，参照实施例2(1)中记载的Pfu聚合酶C的活性测定方法进行。使用M13噬菌体单链DNA(M13mp18ssDNA，宝酒造)的45个碱基的合成寡核苷酸-HT引物退火产物(M13-HT引物)作为底物。序列表的序列号42中显示了HT引物的碱基序列。
也就是说，制备含有表2记载的DNA聚合酶和F7的终体积为50μl的反应液[20mM Tris-HCl、pH7.7，15mM MgCl2，2mM 2-巯基乙醇，0.01μg/μl M13-HT引物，各40μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，60nM[3H]-dTTP(Amersham公司)]，75℃反应5分钟。将反应液放置冰浴中停止反应后，将其中的40μl吸到DE纸(Whattman公司)上，用5％Na2HPO4洗涤5次后，用液闪仪测定DE纸上残存的放射活性。
如表2所示，可以看出对使用的所有DNA聚合酶来讲，F7的添加使DNA聚合酶的活性上升。
                         表2DNA聚合酶                              F7             酶活性
                                                  (cpm)空白1                                  -              61空白2                                  10pmol         35Pfu聚合酶C(25fmol)                     -              888Pfu聚合酶C(25fmol)                     5pmol          2897Pfu聚合酶C(25fmol)                     10pmol         3175Pfu DNA聚合酶(120fmol)                 -              907Pfu DNA聚合酶(120fmol)                 0.48pmol       1363Pfu DNA聚合酶(120fmol)                 4.8pmol        1637Poc DNA聚合酶I(74pmol)                 -              62Poc DNA聚合酶I(74pmol)                 10pmol         69Poc DNA聚合酶II(6.0pmol)               -              433Poc DNA聚合酶II(6.0pmol)               10pmol         1443注：表中的Pfu聚合酶C的量是由2种DNA聚合酶结构蛋白质各1分子组成蛋白质时的量，另外，F7的量是作为3聚体蛋白质时的量。
进一步对引物延伸活性进行了详细研究。用M13-HT引物作底物，用[γ-32P]-ATP(Amersham)和T4多核苷酸酶(宝酒造)标记引物的5′末端。
制备含有以下样品的1μl的样品液：①18fmol的Pfu聚合酶C，②18fmol的Pfu聚合酶C+2pmol的F7，③0.24pmol的Pfu DNA聚合酶，④0.24pmol的Pfu DNA聚合酶+0.78pmol的F7。向这些样品液中分别加入含0.01μl/μl 32P标记M13-HT引物的9μl反应液(20mM Tris-HCl(pH9.0)，15mM MgCl2，2mM 2-巯基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，75℃反应2.5分钟或5分钟。反应结束后，冰浴反应液停止反应，再加入1μl的200mM EDTA，5.5μl的反应终止液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯氰)，95℃进行5分钟的热变性处理。将该反应液中的1.6μl，用含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺进行电泳，然后进行放射自显影。所得放射自显影图显示于图7中。
图中“Pfu-C”及“Pfu”分别表示用Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶所得的结果，“2.5”和“5”分别表示反应时间(分)。另外，图中“-”和“+”分别表示用未添加F7和添加F7的反应液所得的结果。另外，图中两边的泳道是用[γ-32P]-ATP(Amersham公司)和T4多核苷酸酶(宝酒造)标记λ-EcoT14I消化产物(宝酒造)5′末端进行电泳的结果，用它来推算延伸产物的长度。
如图7中所示，未添加F7的时候，用Pfu聚合酶C，300～600bp碱基程度的DNA为主要延伸产物，与此相对，添加F7时，低链长的延伸产物减少，同时超过1000碱基的延伸产物的比率增加。另外，即便是Pfu DNA聚合酶，在添加F7时也可显著延伸延伸产物的链长。由此表明，F7可增大Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶双方的引物延伸速度。
为了分析更高分子的引物延伸反应物，将用32P标记的M13-HT引物作底物时的Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶的引物延伸反应物进行琼脂糖凝胶电泳分析。向上述的①～④的样品液各1μl中加入含终浓度0.01μg/μl的M13-HT引物的9μl反应液(20mM Tris-HCl、pH9.0，15mM MgCl2，2mM 2-巯基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，84nM[α-32P]-dCTP)，75℃反应2.5分钟。反应终了后，向冰浴的反应液中依次加入1.11μl的200mMEDTA，1.23μl的500mM NaOH，2.47μl的6倍浓度加样缓冲液(0.125％溴酚蓝，0.125％二甲苯氰，9％甘油)，将其中6μl进行0.5％琼脂糖凝胶电泳后，进行放射自显影。所得放射自显影如图8所示。
图中“Pfu-C”和“Pfu”分别表示用Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶所得的结果，图中“-”和“+”分别表示在F7不存在和存在的条件下所得的结果。再者，图中M道是与上述同样进行末端标记了的λ-EcoT14I消化物。如图8所示，用Pfu聚合酶C时，在F7不存在的条件下，在2.5kb附近见到延伸产物的弱信号，与此相对，在F7存在的条件下可看到M13ssDNA完整一周的7.3kb的信号。另外，用Pfu聚合酶时，F7存在的条件下，在2.7kb附近见到信号，而F7不存在时未见到信号。以上结果提示F7可提高两DNA聚合酶的延伸反应。实施例9(1)含有编码RFC小亚基同源体的基因的粘粒克隆的选择
检测詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的RFC小亚基的氨基酸序列[科学(Science)，第273卷，第1058～1073页(1996)]与来源于其它生物的RFC(RF-C)小亚基氨基酸序列的同源性，为了从它们间较保守区域的氨基酸序列寻找编码RFC小亚基的基因，合成引物RF-F1，RF-F3，RF-F4，RF-R1，RF-R2，RF-R3和RF-R4。序列表的序列号43～49中分别显示了这些引物的碱基序列。以激烈热球菌的基因组DNA作模板，联合应用这些引物进行PCR，寻找编码RFC小亚基的基因。该PCR中应用Pfu DNA聚合酶，应用0.25μg的模板DNA和各100pmol的引物，反应液的组成与实施例5(1)相同。用RF-F1和RF-R4进行第1轮PCR的时候，各应用1μl的反应液作模板，用RF-F4和RF-R4、或RF-F1和RF-R1进行第2轮PCR，另外用RF-F1和RF-R3进行第1轮PCR的时候，以各1μl的反应液作模板，用RF-F3和RF-R2进行第2轮PCR，分别得到约240bp、140bp和140bp的扩增DNA片段。将这些DNA片段分别亚克隆到质粒载体pUC 119中，测定其碱基序列后，参照所得序列，合成序列表的序列号50～54中分别显示了碱基序列的引物RF-S1，RF-S2，RF-S3，RF-S4和RF-S5。应用引物RF-S1和RF-S3，以实施例1中制备的粘粒DNA作模板进行PCR，选择认为含有编码RFC小亚基同源体基因的粘粒克隆。PCR中应用TaKaRa PCR扩增试剂盒，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，进行25个循环的反应。结果表明粘粒克隆No.254，310，313，377和458中包含目的基因(PFU-RFC基因)。(2)PFU-RFC基因的亚克隆
以实施例4中制备的XbaI和EcoRI盒式DNA 1μg为模板，应用100pmol的RF-S1和200pmol的盒式引物C2或100pmol的RF-S2和20pmol的盒式引物C2进行PCR。PCR时酶应用Pfu聚合酶C，反应液的组成与实施例6(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环，进行50个循环的反应。结果，用XbaI盒作模板的时候，用RF-S1和盒式引物C2扩增出大约2kb的DNA片段；以EcoRI盒作模板的时候，用RF-S2和盒式引物C2扩增出大约1.5kb的DNA片段。将这些DNA片段分别亚克隆到质粒载体pUC 119中，将所得重组质粒命名为pRFSXS1-26和pRFSES2-8。制作这些质粒的限制性酶谱，结果推测NdeI和BamHI位点不存在于PFU-RFC基因内。
分别用NdeI和BamHI消化上述(1)的5克隆的粘粒，观察其电泳带时发现在5kb附近有共同带。猜想PFU-RFC基因存在于该DNA片段中，切出来自克隆No.254的约5kb的NdeI-BamHI片段，亚克隆到上述的pTV 119Nd载体中。应用RF-S1和RF-S3引物对所得重组质粒转化的转化体进行PCR，以检测有无PFU-RFC基因，结果证明PFU-RFC基因存在于NdeI-BamHI片段。于是将该NdeI-BamHI片段整合到pTV119Nd载体的质粒命名为质粒pRFS254NdB。另外，对该质粒制作限制性酶谱，得到如图9所示的结果。
按照图9中所示的限制性酶谱，用以下的方法从pRFS254NdB中切出各片段，亚克隆到pTV118N载体(宝酒造)。首先，用XbaI和SacI消化pRFS254NdB得到大约500bp的DNA片段，用XbaI和NcoI消化得到大约2kb的DNA片段，用NcoI和BamHI消化得到约1.1kb的DNA片段，再将这些片段与用SacI和BamHI消化形成的开环pTV118N混合进行连接，构建重组质粒。将该质粒命名为pRFS254SXNB。(3)含有PFU-RFC基因的DNA片段碱基序列的测定
用双脱氧法测定实施例9(2)中所得质粒pRFS254NdB中所包含的插入DNA片段的碱基序列。序列表的序列号55中显示了所得碱基序列中的3620对碱基。推算由该碱基序列所编码的蛋白质的氨基酸序列，与已知RFC小亚基的序列进行比较，结果推测PFU-RFC的氨基酸序列中存在1个介在序列(intein)。该介在序列由序列表的序列号55中的721～2295号编码。(4)构建除去介在序列的PFU-RFC基因表达质粒
参照实施例9(3)中所得碱基序列和已知的RFC小亚基的氨基酸序列以及编码它们的基因的碱基序列，合成序列表的序列号56和57中显示了其碱基序列的引物RF-CBΔI和RF-CAΔI。使用这两个引物5′端磷酸化的产物，以上述的质粒pRFS254SXNB作模板进行反向PCR。反向PCR时，使用TaKaRa Ex Taq，按该酶使用说明书制备出100μl的反应液。向该反应液中加入15ng的质粒pRFS254SXNB和各20pmol的引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环，进行30个循环的反应。用DNA平端化试剂盒(宝酒造)将反向PCR中得到的扩增DNA片段平端化处理后，使自身连接构建质粒，将之命名为质粒pRFS254ISΔI。
再者，用XbaI和NcoI消化该质粒，分离出大约400bp的XbaI-NcoI片段，将该片段与从实施例9(2)中得到的质粒pRFS254NdB分离出的约500bp的XbaI-SacI片段、约1.1kb的NcoI-BamHI片段混合，亚克隆到质粒载体pTV118N的BamHI-SacI位点间。将所得重组质粒命名为pRFS254SNc，另外，将用该质粒转化的大肠杆菌JM 109命名为大肠杆菌JM 109/pRFS254SNc。证明该转化体高表达PFU-RFC。(5)不包含介在序列的编码PFU-RFC的基因碱基序列的测定
将来自实施例9(4)才得到的质粒pRFS254SXNB的约400bp的XbaI-NcoI片段亚克隆到质粒载体pTV118N载体中，通过测定该插入DNA片段的碱基序列来确认编码除去的介在序列区域部分的碱基序列。通过该结果和实施例9(3)的结果测定不含介在序列的编码PFU-RFC的基因的碱基序列。如此所得的不包含介在序列的编码PFU-RFC的开放阅读框的碱基序列和从该碱基序列推出的PFU-RFC的氨基酸序列分别显示于序列表的序列号4和3中。(6)纯化PFU-RFC标准品的制备
用2L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养实施例9(4)中得到的大肠杆菌JM 109/pRFS254SNc，培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到44.1ml的超声缓冲液中，用与实施例2(1)相同的方法得到35.2ml的热处理上清液。然后，将该溶液供给用缓冲液D平衡过的RFSOURCE Q柱，应用FPLC系统进行色谱分析。PFU-RFC通过RFSOURCE Q柱。
将通过柱子的PFU-RFC 35ml供给用缓冲液D平衡过的RESOURCE S柱(Pharmacia)。应用FPLC系统，用0～500mMNaCl直线浓度梯度进行洗脱，在170mM NaCl的时候洗脱出PFU-RFC部分，共2.9ml。用centricon-10进行浓缩，将所得105μl浓缩液供给用含有2mM 2-巯基乙醇、75mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液、pH8.0平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱。用同一缓冲液进行洗脱，结果在约150kDa分子量的位置洗脱出PFU-RFC。该分子量是PFU-RFC形成4聚体时的分子量。(7)PFU-RFC对引物延伸反应的影响
用与实施例8(5)同样的方法检测PFU-RFC和F7的存在对Pfu聚合酶C的引物延伸反应的影响。结果如表3所示。如表3所示，PFU-RFC能稍微促进Pfu聚合酶C的活性。还观察到同时添加F7和PFU-RFC时的活性促进作用是只加F7时的2倍以上。
                         表3Pfu聚合酶C         F7                  PFU-RFC        酶活性
                                                  (cpm)-                  -                   -              10090fmol             -                   -              36690fmol             9.6pmol             -              274390fmol             -                   356fmol        46390fmol             9.6pmol             356fmol        8740注：表中Pfu聚合酶C的量是由2个DNA聚合酶组成蛋白质各1分子构成蛋白质时的量，另外，F7、PFU-RFC的量分别是3聚体、4聚体蛋白质的量。实施例10(1)抗Pfu DNA聚合酶抗体的制备
应用离心超滤仪Centricon-10通过超滤浓缩12ml(30,000单位)克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)后，将所得0.1ml浓缩液供给用含2mM 2-巯基乙醇、75mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Pharmacia公司)。用同一缓冲液进行洗脱，在相当于大约76kDa分子量的位置洗脱出PfuDNA聚合酶，回收该部分。用离心超滤仪Centricon-10浓缩该部分0.8ml，以该浓缩液作抗原制备抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗体。用生理盐水稀释上述浓缩液，使Pfu DNA聚合酶的浓度达2mg/ml，向其中加入等量的氟氏完全佐剂使之乳化。把它注射到兔子皮下，每次250μl，每隔3周，共注射4次。最后一次免疫10天后采全血，将之室温放置60分钟后，离心，得到含抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗体的抗血清60ml。向该抗血清26ml中加入26ml的饱和硫酸铵，4℃1小时45分，缓慢搅拌后离心。将沉淀悬浮到5ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，在用同一缓冲液平衡过的PD-10柱(Pharmacia公司)上进行脱盐。将10ml该溶液供给用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡过的蛋白A柱(Pharmacia公司)，用同一缓冲液洗涤后，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱。用1M Tris-HCl、pH9.0中和洗脱出的含有抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗体的部分，然后用旋转浓缩仪Centripro-CF-50浓缩，用PD-10柱置换成偶联缓冲液(0.5M氯化钠，0.2M碳酸氢钠，pH8.3)，制备出含有抗Pfu DNA聚合酶抗体的溶液。(2)抗Pfu DNA聚合酶抗体柱的制备
用1mM盐酸6ml洗涤HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia公司)后，将上述的抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗体溶液0.9ml(含有相当于4.5mg的抗Pfu DNA聚合酶抗体)上柱。用与实施例2(3)同样的方法制备抗Pfu DNA聚合酶抗体柱。(3)用抗Pfu DNA聚合酶抗体柱验证Pfu DNA聚合酶与F7复合体的形成
用实施例1记载的相同方法培养激烈热球菌DSM 3638，得到每份培养液9L的菌体。将该菌体悬浮到33ml的含有2mM PMSF的缓冲液C(50mM Tris-HCl、pH8.0，1mM ATP)中，加到超声破碎仪上。将所得破碎液1200rpm离心10分钟，将所得44ml上清供给用缓冲液C平衡过的抗Pfu DNA聚合酶抗体柱。用含有0.1M NaCl的缓冲液C洗柱后，用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.8M尿素)洗脱出Pfu DNA聚合酶复合体，将该溶液作SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺胶，用25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4作电泳液)。依照常规方法用考马斯亮兰-R-250对电泳后的凝胶进行染色，结果如图10所示，除Pfu DNA聚合酶的带以外，检测出相当于上述F7位置的条带。
于是，将该洗脱液的浓缩液按上述同样方法进行SDS-PAGE，用与实施例3(2)同样的方法，用抗Pfu DNA聚合酶抗体对所得凝胶进行Western印迹。图10所示的SDS-PAGE结果和上述的Western印迹的结果证明相当于F7位置的条带是不与抗Pfu DNA聚合酶抗体起反应的蛋白质。
再用与实施例3(2)同样的方法分析条带中存在的蛋白质N末端的氨基酸序列，结果表明该蛋白质为F7。(4)用凝胶过滤层析验证Pfu DNA聚合酶与F7的复合体的形成
用PD-10柱，将实施例8(4)中得到的F7标准品1.2ml置换到含2mM 2-巯基乙醇、75mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液中后，用离心超滤仪Centricon-10浓缩成50μl。
将实施例10(1)记载的Pfu DNA聚合酶的0.1mM溶液，上述F7的0.1mM(以3聚体计算)溶液，和Pfu DNA聚合酶0.1mM与F70.1mM的混合物各10μl，从60℃到90℃加热30分钟。将加热处理过的各溶液供给用含有20mM 2-巯基乙醇、75mM氯化钠的50mMTris-HCl缓冲液，pH8.0平衡过的Superdex 200 PC 3.2/30凝胶过滤柱(Pharmacia公司)，用同一缓冲液进行洗脱。分别在相当于76kDa和约128kDa分子量的位置洗脱出Pfu DNA聚合酶和F7。与此相对，当为Pfu DNA聚合酶和F7混合物的时候，在相当于320kDa的主峰和相当于约128kDa的次峰洗脱出。将具有这2个峰的洗脱级分分别进行SDS-PAGE(12.3％聚丙烯酰胺胶，使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、0.1％SDS，pH8.4作电泳液)，在相当于大约320kDa的部分为Pfu DNA聚合酶和F7，但相当于大约180kDa的部分只含有F7。由此可证明Pfu DNA聚合酶和F7形成复合体。(5)Pfu DNA聚合酶-F7复合体的延伸活性
在实施例10(4)的凝胶过滤中得到了大约相当于76kDa的PfuDNA聚合酶和相当于320kDa的Pfu DNA聚合酶与F7的混合体，从所得洗脱液中各取20μl，按照以实施例8(5)中所示的非标记M13-HT引物作底物的活性测定方法，分别测定其引物延伸活性。同时用实施例2(1)记载的以活化DNA作底物的方法进行摄取活性的测定。结果如图11所示。检测两部分引物延伸活性对摄取活性的比值，约320kDa的部分为0.65，约76kDa的部分为0.29，由此表明通过与F7形成复合体促进了Pfu DNA聚合酶的引物延伸活性。实施例11(1)含有编码RFC大亚基同源体基因的粘粒克隆的选择
检测詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的RFC大亚基的氨基酸序列[科学(Science)，第273卷，第1058～1073页(1996)]与实施例9中记载的不含介在序列的PFU-RFC小亚基氨基酸序列间的同源性，参照它们之间较保守区域的氨基酸序列，合成用于寻找编码RFC大亚基基因的引物RFLS 15。序列表的序列号60中显示了引物RFLS 15的碱基序列。将该引物和与RFC两亚基蛋白质中存在的类似氨基酸序列相对应的上述引物RF-F1联合应用，以激烈热球菌的基因组DNA作模板进行PCR。该PCR中应用Pfu DNA聚合酶，0.23μg的模板DNA和各100pmol的引物，反应液的组成与实施例5(1)相同。从该PCR扩增出的2种DNA片段中分离出与预想的来自PFU-RFC小亚基基因的扩增产物大小不同的约630bp的扩增DNA片段。将该DNA片段亚克隆到质粒载体pUC 119中，测定其碱基序列后，参照所得碱基序列，合成序列表的序列号61和62中分别显示了其碱基序列的引物RFLS-S3和RFLS-S4。
应用这两个引物，以实施例1中制备的粘粒DNA为模板进行PCR，选择出认为含有编码RFC大亚基同源体基因的粘粒克隆。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，进行30个循环的反应。该结果表明粘粒克隆No.254,310，313，377和458中含有目的基因(PFU-RFCLS基因)。这些粘粒克隆的序号与含有上述PFU-RFC基因的粘粒克隆序号一致。于是检测序列表的序列号55中所示质粒pRFS254NdB的插入DNA片段的碱基序列，证明其编码的是位于PFU-RFC基因正下游的，从该序列的3109号开始的开放阅读框编码RFC大亚基的同源体(PFU-RFCLS)。但是，该质粒pRFS254NdB中不含有PFU-RFCLS基因的全长。(2)PFU-RFCLS基因的亚克隆
为了分离含有PFU-RFCLS基因全长的DNA片段，用NheI消化上述克隆No.254，切出所得各种DNA片段，亚克隆到质粒载体pTV118N(宝酒造)中。以所得各重组质粒为模板，应用RFLS-S3和RFLS-S4作引物进行PCR，以验证是否存在PFU-RFCLS基因时证明约1.1kb的NheI片段中存在RFLS基因。于是将该NheI片段整合到pTV118N中的质粒命名为质粒pRFLSNh。另外，对该质粒中包含的插入DNA片段制作了限制性酶谱，得到如图12所示的结果。
再通过双脱氧法测定该质粒中包含的插入DNA片段的碱基序列。将所得碱基序列中编码PFU-RFCLS的开放阅读框部分的碱基序列显示于序列表的序列号63中。另外，由该序列所推出的PFU-RFCLS的氨基酸序列显示于序列表的序列号64中。实施例12(1)含有F5基因的粘粒克隆的选择
以实施例3中得到的F5 N末端氨基酸序列为基础，合成序列表的序列号65和66中分别显示了其碱基序列的引物F5-1-1和F5-2。以实施例4中制备的PstI盒式DNA 1μl作模板，应用各100pmol的F5-1-1和盒式引物C1(宝酒造)进行第1轮PCR，以其反应液1μl为模板，应用各100pmol的F5-2和盒式引物C2(宝酒造)进行第2轮PCR。在第2轮PCR中应用TaKaRa PCR扩增试剂盒(宝酒造)，按照附带的说明书进行。将扩增出的大约900bp的DNA片段亚克隆到质粒载体pTV118N(宝酒造)。将所得质粒命名为pF5P2，测定其碱基序列。其后，以所得序列为基础，合成序列表的序列号67和68中分别显示了其碱基序列的引物F5S1和F5S2。应用所得的F5S1和F5S2，以实施例1中的粘粒DNA作模板进行PCR，选择含有F5基因的粘粒克隆。PCR中应用TaKaRa PCR扩增试剂盒按照附带的说明书进行。结果表明粘粒克隆No.15，96，114，167，277，348，386，400，419，456，457和484中含有F5基因。这些粘粒克隆的序号与含有F7基因的粘粒克隆相一致。于是检测序列表的序列号41中所示的碱基序列，证明该序列上，在F7基因下游892号以后包含F5基因的前半部分。(2)F5基因的亚克隆
为了亚克隆F5基因，应用实施例8中得到的质粒pF7-HH-18和上述引物pF5P2，制作F5基因周围的NcoI、BamHI、PstI、HindIII和NdeI(宝酒造)的限制性酶谱，得到如图13所示的结果。
以图13所示的限制性酶谱为基础，切出用NdeI消化粘粒克隆No.15而得到的大约900bp的片段，亚克隆到质粒载体pTV118Nd。将F5基因正向插入到lac启动子的重组质粒命名为pF5NNF-1。(3)含有F5基因的DNA片段碱基序列的测定
用双脱氧法测定上述质粒pF5NNF-1插入DNA片段的碱基序列。分析所得碱基序列的结果发现它所编码的蛋白质N末端氨基酸序列是与F5的一致的开放阅读框。该开放阅读框的碱基序列如序列表的序列号69所示，由该碱基序列推出的F5的氨基酸序列显示于序列表的序列号70中。对该氨基酸序列与已知蛋白质氨基酸序列的同源性进行了检索，未发现同源的蛋白质。(4)F5表达质粒的构建
以上述质粒pF5NNF-1为模板，应用序列表的序列号71和72中分别显示了其碱基序列的引物F5Nco和F5CBam，进行PCR。该PCR中应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同。使用1ng的模板DNA和各20pmol的两种引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环进行25个循环的反应。用NcoI和BamHI(均为宝酒造公司)消化扩增出的大约640bp的DNA片段，将所得片段与用NcoI和BamHI制备的开环pET15b(ノバジエン公司)连接。将该质粒命名为pF5NBPET。用双脱氧法确认该质粒中插入的DNA片段中PCR扩增区域的碱基序列，确证未因PCR而造成突变。
检测用质粒pF5NBPET转化的大肠杆菌HMS174(DE3)-大肠杆菌HMS174(DE3)/pF5NBPET中F5的表达情况，结果提示该转化体的培养物中有相当于F5分子量的蛋白质表达。实施例13(1)F3基因的亚克隆
以实施例3中得到的F3 N末端氨基酸序列为基础，合成序列表的序列号73和74中分别显示了其碱基序列的引物F3-1和F3-3-1。以实施例4的BglII/Sau3AI盒式DNA 1μl作模板，应用100pmol的引物F3-1和20pmol的盒式引物C1进行第1轮PCR，以其反应液1μl为模板，应用F3-3-1和盒式引物C2进行第2轮PCR。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，应用与实施例5(1)组成相同的反应液，反应以94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)为1个循环，第1轮进行30个循环，第2轮进行25个循环的反应。将该反应扩增出的大约500bp的DNA片段亚克隆到质粒载体pTV118N中，用M4和RV引物(宝酒造)通过双脱氧法测定其碱基序列的一部分后，以所得序列为基础合成序列表的序列号75，76，77和78中分别显示了其碱基序列的引物F3S1、F3S2、F3S3和F3S4。应用F3S1和F3S2引物，以实施例1中制备的粘粒DNA作模板进行PCR，寻找含有F3基因的粘粒克隆，结果未发现含有F3基因的粘粒克隆。于是应用F3S3或F3S4引物和引物C2，以实施例4的各种盒式DNA作模板进行PCR，绘制F3基因周围的限制性酶识别部位，结果推测在SalI位点和HindIII位点间的大约2.6kb的片段中存在F3基因。在该结果的基础上，用SalI和HindIII消化激烈热球菌的基因组DNA 4μg，取出2.6kb左右的DNA片段，将之亚克隆到pTV118N载体中。以所得的各重组质粒为模板，应用引物F3S4和引物RV-N(宝酒造)进行PCR，以此来检测有无F3基因。结果得到具有2.6kb SalI-HindIII片段的质粒，该片段中含有F3基因，将该质粒命名为pF3SH92。检测用该质粒转化大肠杆菌JM 109而得到的大肠杆菌JM 109/pF3SH92中F3的表达情况，结果证实有相当于F3分子量的蛋白质的表达。(2)含有F3基因的DNA片段碱基序列的测定
用双脱氧法测定上述质粒pF3SH92插入DNA片段的碱基序列。对所得碱基序列进行分析的结果发现它所编码的蛋白质N端氨基酸序列是与F3一致的开放阅读框。该开放阅读框的碱基序列和由该碱基序列推出的F3的氨基酸序列分别显示于序列表的序列号79和80中。对该氨基酸序列与已知蛋白质氨基酸序列的同源性进行检索，发现与来源于分支的枝动杆菌(Mycoplana ramosa)的乙酰基聚胺氨基水解酶[细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第178卷，第5781～5786页(1996)]，以及人的组蛋白脱乙酰基酶[科学(Science)，第272卷，第408～411页(1996)]间具有同源性。实施例14
以下的实施例中，市售酶的活性以各酶的表示为基础。另外，含有市售酶的反应液的制备，若无特殊说明，按各酶的说明书进行，或使用附带的反应缓冲液进行制备。应用GeneAmp PCR仪9600型(GeneAmpPCR System 9600，PE(珀金-埃尔默)公司)进行PCR。(1)抗PFU-RFC抗体的制备
用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巯基乙醇，75mMNaCl稀释实施例9(6)的PFU-RFC标准品至浓度为1mg/100μl，加入等量的氟氏完全佐剂使之乳化。将之注射到兔子皮下，每次50μl，每间隔3周，共注射4次。最后一次免疫10天后采全血，室温放置60分钟后，离心，得到含有抗PFU-RFC多克隆抗体的抗血清50ml。向20ml抗血清中加入20ml的饱和硫酸铵溶液，4℃45分钟缓慢搅拌后离心。将所得沉淀悬浮到50ml的20mM磷酸钠缓冲液、pH7.0中，以2L同一缓冲液作外液进行2小时的透析，共透析3次。将透析后的溶液14ml加入用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡过的蛋白A柱(Pharmacia公司)，用同一缓冲液洗涤后，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)进行洗脱。用1M Tris-HCl、pH9.0中和洗脱出的抗PFU-RFC抗体后，用旋转浓缩仪Centripro-CF-50进行浓缩，用PD-10柱(Pharmacia公司)置换成偶联缓冲液(0.5M氯化钠，0.2M碳酸氢钠、pH8.3)，制备成含有抗PFU-RFC抗体的溶液。(2)抗PFU-RFC抗体柱的制备
用1mM盐酸6ml洗涤HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia公司)后，将上述的抗PFU-RFC多克隆抗体溶液0.95ml(相当于含有3.8mg的抗PFU-RFC抗体)上样。以后按与实施例2(3)相同的方法制备抗PFU-RFC抗体柱。(3)用抗PFU-RFC抗体柱纯化含有PFU-RFC的复合体
用与实施例1相同的方法培养激烈热球菌DSM 3638，得到每份10L的培养液。将该菌体悬浮到含有2mM PMSF的缓冲液C(50mMTris-HCl、pH8.0，0.1mM ATP)33ml中，加到超声破碎仪上。将所得破碎液12000rpm离心10分钟，将所得上清39ml供给用含有0.1M NaCl的缓冲液C平衡过的抗PFU-RFC抗体柱。用含有0.1MNaCl的缓冲液C洗涤柱子后，85℃加热1小时，用含有0.1M NaCl的缓冲液C洗脱出PFU-RFC复合体。将该洗脱液进行SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺凝胶，用25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4作电泳液)，依照常规方法用考马斯亮蓝-R-250对电泳后的胶进行染色，结果除PFU-RFC的带以外，在相当于F7的33kDa的位置检测出1条带，在60kDa附近检测出2条带。
于是用与实施例3(2)同样的方法分析这3条带中存在的蛋白质的N末端氨基酸序列，如图14所示，相当于上述F7位置的蛋白质的N末端氨基酸序列与F7一致，60kDa附近的2种蛋白质的N末端氨基酸序列均与上述PFU-RFCLS N末端的氨基酸序列一致。
通过与这些蛋白质结合的考马斯亮蓝的量来对该洗脱液中包含的PFU-RFC、PFU-RFCLS、F7进行定量。将洗脱液进行SDS-PAGE(12.3％聚丙烯酰胺凝胶，使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、0.1％SDS、pH8.4作电泳液)，依照常规方法用考马斯亮蓝-R-230对电泳后的带进行染色，切出泳带后，用500μl的70％蚁酸提取考马斯亮蓝，测定630nm处的吸光度。以浓度已知的实施例8(4)中的F7标准品和实施例9(6)中的PFU-RFC标准品制成标准曲线，在此基础上可证明500μl洗脱液中含有208μg的PFU-RFC，55μg的PFU-RFCLS，51μg的F7蛋白质。以下将PFU-RFC、PFU-RFCLS和F7 3种蛋白质构成的复合体称作RFC-N复合体。(4)RFC-N复合体对引物延伸反应的影响
为了检测实施例14(3)中得到的RFC-N复合体对各种聚合酶的引物延伸反应的影响，比较添加RFC-N复合体时和只添加其构成成分F7时，Pfu聚合酶C、Pfu DNA聚合酶(α型DNA聚合酶，Stratagene)的活性。DNA聚合酶活性的测定，除使用50fmol的Pfu聚合酶C或Pfu DNA聚合酶外，用与实施例8(5)中记载的同一方法进行。DNA聚合酶活性的测定如实施例8(5)所示，使用M13噬菌体单链DNA(M13mp18ssDNA，宝酒造公司)的45个碱基的合成寡核苷酸HT引物退火时的产物(M13-HT引物)。序列表的序列号42中显示了HT引物的碱基序列。用Pfu DNA聚合酶时的结果如图15所示。F7和RFC-N复合体的添加量用反应液中所含F7、RFC-N复合体的摩尔数表示。如图15所示RFC-N复合体与单独F7相比能更好的提高Pfu DNA聚合酶活性。
再用实施例8(5)记载的方法检测引物延伸活性。按如下的组成制备测定时应用的反应液：①100fmol的F7，②0.05μl的RFC-N复合体(含有60fmol的F7)，③10fmol的Pfu聚合酶C，④10fmol的Pfu聚合酶C+100fmol的F7，⑤100fmol的Pfu聚合酶C+0.05μl的RFC-N复合体，⑥20fmol的F7，⑦0.02μl的RFC-N复合体(含24fmol的F7)，⑧10fmol的Pfu DNA聚合酶，⑨10fmol的PfuDNA聚合酶+20fmol的F7，⑩10fmol的Pfu DNA聚合酶+0.02μl的RFC-N复合体。分别向各种测定用反应液1μl中加入含有0.01μg/μl的32P标记的M13-HT引物的反应液9μl(20mM Tris-HCl(μH9.0)、15mM氯化镁，2mM 2-巯基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，75℃反应2.3分钟。反应终了后，冰冷反应液停止反应，再加入1μl的200mM EDTA、5μl的反应终止液(93％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯氰)，95℃进行5分钟的热变性处理。用含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶对该反应液中的1.6μl进行电泳后，进行放射自显影。
然后用实施例8(5)记载的方法分析较长链的引物延伸反应物。向上述①～⑩的样品液各1μl中加入含有终浓度为0.01μg/μl的M13-HT引物的9μl反应液(20mM Tris-HCl、pH9.0，0.15mM氯化镁，2mM 2-巯基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，84nM[α-32P]-dCTP)，75℃反应2.5分钟。反应终了后，向冰冷后的反应液中依次加入1.11μl的200mM EDTA，1.23μl的500mM NaOH，2.47μl的6倍浓度的加样缓冲液(0.125％溴酚蓝，0.125％二甲苯氰，9％甘油)将其中的6μl进行0.5％碱性琼脂糖凝胶电泳，之后进行放射自显影。
与单用F7相比，添加RFC-N复合体时均能增加Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶的长链延伸产物的量。
对于长链延伸产物的链长，无论是哪种聚合酶，用F7单独和RFC-N复合体可看到模板全长的7.2kb。实施例15 rRFC-M表达质粒的构建(1)构建能同时表达PFU-RFCLS和PFU-RFC的质粒。参照实施例11(2)中得到的碱基序列合成序列表的序列号81中显示了其碱基序列的引物RFLS-NdeN和序列号82中显示了其碱基序列的RFLS-S9。使用这两种引物，以上述的质粒pRFLSNh为模板进行PCR。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)的相同，添加10ng的质粒pRFLSNh和各20pmol的引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)为1个循环，进行30个循环的反应。用NdeI和PstI消化PCR中得到的扩增DNA片段，分离出大约920bp的NdeI-PstI片段，将该片段与实施例11(2)中从质粒pRFLSNh分离出的大约600bp的PstI-EcoRI片段、实施例9(4)中得到的从质粒pRFS254SNc分离出的约2kb的EcoRI-BamHI片段混合，亚克隆到质粒载体pTV119Nd的NdeI-BamHI位点间。将所得重组质粒命名为pRFC 10，另外将用该质粒转化的大肠杆菌JM 109命名为大肠杆菌JM 109/pRFC 10。证明前面的转化体高表达PFU-RFCLS和PFU-RFC。(2)编码PFU-RFCLS和PFU-RFC的基因碱基序列的测定
用双脱氧法测定实施例15(1)中得到的质粒pRFC 10中插入DNA片段中用PCR扩增出的区域的碱基序列，未发现因PCR造成的变异。由该结果和实施例9(3)和实施例11(2)的结果可测定出编码不含PFU-RFCLS和介在序列的PFU-RFCLS和介在序列的PFU-RFC的基因的碱基序列显示于序列表的序列83中，其限制性酶谱在图16中显示。实施例16 rRFC-M标准品的制备
将实施例15(1)中得到的大肠杆菌JM 109/pRFC 10在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH7.2)500ml×4中培养，该培养基中存在100μg/ml的氨苄青霉素、1mM的IPTG，在培养基中培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到35.9ml的超声波缓冲液(50mM Tris-HCl、pH8.0，2mM 2-巯基乙醇，10％甘油，2mM PMSF(苯甲基磺酰氧))中，加到超声破碎仪上。12000rpm离心10分钟，80℃进行15分钟的热处理。其后再度12000rpm离心10分钟，得到33.0ml的热处理酶液。然后将该溶液供给用缓冲液A(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巯基乙醇，10％甘油)平衡过的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)用FPLC系统(Pharmacia公司)进行色谱分析。洗脱通过0～500mM的氯化钠直线浓度梯度进行。
通过SDS-PAGE(12.5％聚丙乙烯酰胺凝胶，用25mMTris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4作电泳)分析洗脱液，结果PFU-RFCLS和PFU-RFC均在240mM氯化钠的浓度被洗脱出。如实施例9(6)所述，将从只表达PFU-RFC的菌体得到的洗脱液供给RESOURCE Q柱时，不吸附到RESOURCE Q柱上，但将从同时表达PFU-RFCLS和PFU-RFC的菌体得到的洗脱液供给RESOURCE Q柱时，它吸附到柱上。如上所述，在240mM氯化钠浓度下能同时洗脱出PFU-RFCLS和PFU-RFC。该结果提示这两种蛋白质形成了复合体。以下将该复合体称作rRFC-M复合体。
用旋转浓缩仪Centripro-CF50浓缩收集rRFC-M复合体部分而得到的4.8ml酶溶液，然后用PD-10柱(Pharmacia公司)置换到含有150mM氯化钠的缓冲液A中，将3.5ml溶液供给用含150mM氯化钠的缓冲液A平衡过的heparin柱(Pharmacia公司)。应用FPLC系统，用150mM→650mM氯化钠直线浓度梯度进行展开，在450mM氯化钠的时候洗脱出rRFC-M复合体部分。用离心超滤仪Centricon-10(Amicon公司)浓缩该部分洗脱液3.9ml，将115μl的浓缩液供给用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巯基乙基、75mM氯化钠平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Pharmacia公司)。用同一缓冲液进行洗脱，结果rRFC-M复合体的保留时间为26.3分钟。与同一条件下分子量标准参照物的洗脱位置进行比较，结果推算出rRFC-M复合体大约370kDa。
为了求出rRFC-M复合体中各亚基的构成比，再将前面约370kDa分子量的洗脱级分进行SDS-PAGE。
按照常规方法用考马斯亮兰-R-250对电泳后的凝胶染色，然后切出PFU-RFCLS和PFU-RFC的蛋白质带，用500μl的70％蚁酸抽提。测各抽提液630nm的吸光度，以实施例9(6)中制备的PFU-RFC制作出定量曲线，与之进行比较计算出各蛋白质量的摩尔数。
结果，PFU-RFCLS和PFU-RFC以1∶4的比例存在。如上所示用凝胶过滤算出的rRFC-M复合体的分子量约为370kDa，在此基础上我们认为rRFC-M复合体是由2分子的PFU-RFCLS和8分子的PFU-RFC形成的。于是，以前述的rRFC-M复合体为1个单位算出摩尔数。实施例17 F3表达质粒的构建
(1)以实施例13中制备的质粒pF3SH92作模板，应用序列表的序列号84中破.基序列显示的引物F3Nd和序列表的序列号76中碱基序列显示的引物F3S2进行PCR。PCR中酶应用Pfu DNA聚合酶，反应液的组成与实施例5(1)相同，添加1ng的质粒pF3SH92和各20pmol的引物，94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(1分)为1个循环进行30个循环的反应。用NdeI和PstI消化PCR的扩增DNA片段，分离出约0.5kb的NdeI-PstI片段，将该片段与从质粒pF3SH92分离出的大约1.1kb的PstI-EcoRI片段混合，亚克隆到质粒载体pTV119Nd的NdeI-EcoRI位点间。将如此得到的重组质粒命名为pF3-19。另外将用该质粒转化的大肠杆菌JM 109命名为大肠杆菌JM 109/pF3-19。证明该转化体高表达F3。(2)编码F3基因碱基序列的测定
用双脱氧法确认实施例17(1)中得到的质粒pF3-19中插入DNA片段中PCR扩增区域的碱基序列，确证未因PCR而造成变异。实施例18 纯化F3标准品的制备
在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2)500ml×4中，培养实施例17(1)中得到的大肠杆菌JM 109/pF3-19，培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到50ml超声缓冲液[50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巯基乙醇，10％甘油，2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)]中，加入超声破碎仪。12000rpm离心10分钟后，将上清于80℃进行15分钟的热处理。其后，再12000rpm离心10分钟，将所得44ml热处理上清液供给用实施例16记载的缓冲液A平衡过的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)，用FPLC系统(Pharmacia公司)进行色谱分析。展开通过0→500mM的NaCl直线浓度梯度进行。用140mM～240mMNaCl洗脱出包含F3的部分，向11ml溶液中加入含有3M硫酸铵的缓冲液A5.5ml，供给用含1M硫酸铵的缓冲液A平衡过的HiTrap butyl柱(Pharmacia公司)。应用FPLC系统，用含有1M硫酸铵的缓冲液A洗柱，然后用含0.5M硫酸铵的缓冲液A洗脱F3。将该部分6ml供给用含有0.5M硫酸铵的缓冲液A平衡过的HiTrap phenyl柱(Pharmacia公司)。应用FPLC系统，用含0.5M硫酸铵的缓冲液A洗柱后，用缓冲液A洗脱出F3。用离心超滤仪Centricon-10(Amicon公司)浓缩该部分9.5ml，将155μl的浓缩液供给用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巯基乙醇，75mM NaCl平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Pharmacia公司)。用同一缓冲液进行洗脱，结果在保留时间42.1分钟的位置洗脱出F3。与在同一条件下分子量标准参照物的洗脱位置进行比较，推测分子量约25kDa。F3分子量的理论值是37kDa，在此基础上推算F3为单体。实施例19 纯化F5标准品的制备
在氨苄青霉素的浓度为100μg/ml的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2)500ml×4中培养实施例12(4)中得到的质粒pF5NBPET转化的大肠杆菌HMS 174(DE3)-大肠杆菌HMS174(DE3)/pF5NBPET，培养16小时。收集细菌后，将菌体悬浮到61ml的超声缓冲液中，加入到超声破碎仪。将破碎后的菌体12000rpm离心10分钟后，将上清液80℃热处理15分钟。其后，再12000rpm离心10分钟，向所得60.5ml热处理上清中加入8.71g的硫酸铵，4℃搅拌2小时后12000rpm离心10分钟。用19ml的缓冲液A溶解沉淀物，用缓冲液A进行透析。透析后的酶液供给用缓冲液A平衡过的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)，用FPLC系统(Pharmacia公司)进行色谱分析。展开通过0→500mM NaCl直线浓度梯度进行。从350mM到450mM NaCl的时候洗脱出含有F5的部分，用离心超滤仪Centricon-10(Amicon公司)浓缩该部分的11ml溶液，将222μl的浓缩液供给用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM2-巯基乙醇、75mM NaCl平衡了的Superdex 200凝胶过滤柱(Pharmacia公司)。用同一缓冲液进行洗脱，结果在保留时间32.5分的位置洗脱出F5。与在同一条件下分子量标记物的洗脱位置相比较，推测分子量约145kDa。该分子量是F5形成7聚体时的分子量。实施例20 引物的制作
以λDNA的碱基序列为基础合成λ1B～λ5、λ7～λ9的8种引物。引物λ1B～λ5、λ7～λ9的碱基序列分别列于序列表的序列号85～92中。联合应用这些引物以λDNA作模板进行PCR，扩增出的DNA片段的链长如表4所示。
                         表4
     引物对                                  扩增DNA片段的链长
     λ1B/λ2                                0.5kb
     λ1B/λ3                                1kb
     λ1B/λ4                                2kb
     λ1B/λ5                                4kb
     λ1B/λ7                                8kb
     λ1B/λ8                                10kb
     λ1B/λ9                                12kb实施例21F1蛋白质对DNA聚合酶的影响
检测实施例5中得到的F1蛋白质对PCR的影响。为了以λDNA为模板进行1～4kb DNA片段的扩增反应引物对分别使用引物λ1B和λ3，引物λ1B和λ4、引物λ1B和λ5，制备有如下组成的反应液：10mM Tris-HCl、pH9.2，75mM氯化钙，6mM氯化镁，各0.40mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，0.01％BSA和1.25单位的Pfu聚合酶C，500pg的模板DNA，各5pmol的各组引物，73pmol的F1蛋白质(终体积为75μl)。各反应液，以98℃0秒～68℃0秒为1个循环，进行30个循环的反应。本说明书中“98℃0秒”“68℃0秒”等描述表示设定的是这样一种反应程序：当温度达到设定温度的同时，马上朝另一设定温度变化。
反应终了后，取反应液5μl进行1％琼脂糖凝胶(宝酒造)电泳，确认扩增片段。
结果确证与使用的引物对相对应扩增出1kb、2kb、4kb的DNA片段。另一方面，上述反应液中未添加F1蛋白质时，用上述反应条件进行PCR时未看到任何扩增片段。实施例22F1、F3、F5蛋白质对DNA聚合酶的影响
应用实施例5得到的F1蛋白质，实施例18中得到的F3蛋白质，实施例19中得到的F5蛋白质，检测它们以λDNA作模板，通过PCR对约6kb DNA片段扩增反应的影响。除引物对使用引物λ1和λ6外，制备与实施例21组成相同的反应液。分别向反应液中加入F1蛋白质173pmol，F3蛋白质10pmol，F5蛋白质1pmol，终体积为25μl。各反应液以98℃1秒～68℃2分为1个循环进行30个循环的反应。反应终了后，取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。
结果确认在分别存在F1、F3、F5蛋白质的条件下均得到6kb的扩增片段。而在不添加这些蛋白质的情况下未见到扩增片段。实施例23F2、F4蛋白质对DNA聚合酶的影响
应用实施例6中得到的F2蛋白质、实施例7中得到的F4蛋白质，检测它们以λDNA为模板，通过PCR对4kb DNA片段扩增反应的影响。除引物对使用引物λ1B和λ5，0.75单位的Pfu聚合酶C、1ng的模板λDNA外，制备与实施例21同样组成的反应液。另外，向反应液中分别加入1.095pmol、终体积为25μl的F2蛋白质、F4蛋白质。各反应液以94℃30秒～55℃30秒～72℃2分为1个循环进行25个循环的反应。反应终了后，取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。
结果确认在分别存在F2、F4蛋白质的条件下均扩增出4kb的片段。而在不添加这些蛋白质的时候，未见到扩增片段。实施例24 rRFC-M复合体对DNA聚合酶的影响
为了检测rRFC-M复合体对各种聚合酶引物延伸反应的影响，比较rRFC-M复合体和F7共存时与只存在F7时Pfu聚合酶C、PfuDNA聚合酶(α型DNA聚合酶，Stratagene公司)的活性。
DNA聚合酶活性的测定除应用50fmol的Pfu聚合酶C或Pfu DNA聚合酶，添加400fmol的rRFC-M复合体和0～200fmol的F7之外，用与实施例8(5)同样的方法进行。应用Pfu DNA聚合酶时的结果如图17所示。对于Pfu DNA聚合酶的效果是：rRFC-M复合体与F7共存时比单用F7时酶的活性升高。另外，对于Pfu聚合酶C的效果也有与Pfu DNA聚合酶同样的倾向。实施例25 rRFC-M复合体与F7蛋白质共存对PCR的影响
为了以λDNA作模板实行4kb DNA片段的扩增反应，除应用引物λ1B和λ5，使用0.375单位的Pfu聚合酶C外，制备与实施例21同样组成的反应液。另外，分别向反应液中加入终体积23μl的312.5fmol的rRFC-M复合体，125fmol的F7蛋白质。以98℃0秒～68℃10秒为1个循环，对反应液进行30个循环的反应。反应终止后，取反应液5μl，进行1％琼脂糖凝胶(宝酒造)电泳，确认扩增片段。
结果在rRFC-M复合体，与F7蛋白质共存的反应体系中可以确证扩增出针对所使用引物的4kb的DNA片段。而在未添加这些蛋白质的情况下未见到扩增片段。
再以λDNA为模板，针对8～12kb DNA片段的扩增反应进行同样的实验。除分别使用引物λ1B和λ7、引物λ1B和λ8、引物λ1B和λ9引物对，再应用0.375单位的Pfu聚合酶C、2.5ng的模板λDNA外，制备与实施例21同样组成的反应液。再向反应液分别加入312.5fmol的rRFC-M复合体，125fmol的F7蛋白质，使其终体积为25μl。以98℃0秒～68℃3分为1个循环，对各反应液进行30个循环的反应。反应终了后，取3μl反应液进行1％琼脂糖凝胶(宝酒造)电泳，确认扩增片段。
结果在rRFC-M复合体与F7蛋白质共存在的体系中确证到与使用的引物对应的8kb、10kb、12kb的DNA扩增片段。而在什么都没加的体系中只看到8kb的DNA片段。实施例26 rRFC-M复合体与F7蛋白质共存对Pfu DNA聚合酶的影响
为了以λDNA作模板进行4kb的DNA片段的扩增反应，分别使用引物对一引物λ1B和λ3，引物λ1B和λ4、引物λ1B和λ5，制备具有以下组成的反应液：Pfu DNA聚合酶附加缓冲液，0.2mMdATP、dCTP、dGTP、dTTP和各0.5单位的Pfu聚合酶，500ng的模板DNA，各2.5pmol的各种引物，2.5pmol的rRFC-M复合体蛋白质和0.5pmol的F7蛋白质(终体积为25μl)。以94℃30秒～55℃30秒～72℃1分为1个循环，对各反应液进行25个循环的反应。反应终了后，取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。
结果确证在rRFC-M复合体和F7蛋白质共存的体系中扩增出与使用的引物相对应的1kb、2kb、4kb的DNA片段。而在未添加这些蛋白质的时候，只看到1kb～2kb的DNA片段。实施例27 rRFC-M复合体与F7蛋白质共存对混合型DNA聚合酶的影响
将2种DNA聚合酶混合使用，检测rRFC-M复合体和F7蛋白质共存对PCR的影响。
为了以λDNA作模板进行1kb DNA片段的扩增反应，使用引物对引物λ1B和λ3，制备具有如下组成的反应液：TaKaRa LATaq用附加缓冲液(加Mg2+)，各0.4mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.25单位的LA Taq DNA聚合酶(宝酒造)，500pg的模板DNA，各5pmol的各种引物，62.5fmol的RFC复合体蛋白质和12.5fmol的F7蛋白质(终体积25μl)。以98℃0秒～68℃10秒为1个循环，对各反应液进行30个循环的反应。反应终了后，取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。
结果证实添加了rRFC-M复合体和F7蛋白质的体系，与上述反应液中只加了rRFC-M复合体的体系，只添加F7蛋白质的体系，只添加LA Taq DNA聚合酶的体系相比较时，添加rRFC-M复合体和F7蛋白质的体系能最有效地扩增1kb的DNA片段。
产业上利用的可能性
本发明提供能提高DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的DNA聚合酶相关因子。该因子可对各种DNA聚合酶起作用，另外还可由于使用DNA聚合酶的各种工程，作为基因工程学研究的试剂应用。再者，应用编码本发明DNA聚合酶相关因子的基因可通过基因工程学方法制备该酶。
                         序列表序列号：1序列长度：249序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Pro Phe Glu Ile Val Phe Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Gln
              5                  10                  15Leu Ile Asp Thr Ala Ser Lys Leu Ile Asp Glu Ala Ala Phe Lys
             20                  25                  30Val Thr Glu Asp Gly Ile Ser Met Arg Ala Met Asp Pro Ser Arg
             35                  40                  45Val Val Leu Ile Asp Leu Asn Leu Pro Ser Ser Ile Phe Ser Lys
             50                  55                  60Tyr Glu Val Val Glu Pro Glu Thr Ile Gly Val Asn Met Asp His
             65                  70                  75Leu Lys Lys Ile Leu Lys Arg Gly Lys Ala Lys Asp Thr Leu Ile
             80                  85                  90Leu Lys Lys Gly Glu Glu Asn Phe Leu Glu Ile Thr Ile Gln Gly
             95                 100                 105Thr Ala Thr Arg Thr Phe Arg Val Pro Leu Ile Asp Val Glu Glu
            110                 115                 120Met Glu Val Asp Leu Pro Glu Leu Pro Phe Thr Ala Lys Val Val
            125                 130                 135Val Leu Gly Glu Val Leu Lys Asp Ala Val Lys Asp Ala Ser Leu
            140                 145                 150Val Ser Asp Ser Ile Lys Phe Ile Ala Arg Glu Asn Glu Phe Ile
            155                 160                 165Met Lys Ala Glu Gly Glu Thr Gln Glu Val Glu Ile Lys Leu Thr
            170                 175                 180Leu Glu Asp Glu Gly Leu Leu Asp Ile Glu Val Gln Glu Glu Thr
            185                 190                 195Lys Ser Ala Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Ser Asp Met Val Lys Gly
            200                 205                 210Leu Gly Lys Ala Asp Glu Val Thr Ile Lys Phe Gly Asn Glu Met
            215                 220                 225Pro Met Gln Met Glu Tyr Tyr Ile Arg Asp Glu Gly Arg Leu Thr
            230                 235                 240Phe Leu Leu Ala Pro Arg Val Glu Glu
            245序列号：2序列长度：750序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGCCATTTG AAATCGTATT TGAAGGTGCA AAAGAGTTTG CCCAACTTAT AGACACCGCA   60AGTAAGTTAA-TAGATGAGGC CGCGTTTAAA GTTACAGAAG ATGGGATAAG CATGAGGGCC  120ATGGATCCAA GTAGAGTTGT CCTGATTGAC CTAAATCTCC CGTCAAGCAT ATTTAGCAAA  180TATGAAGTTG TTGAACCAGA AACAATTGGA GTTAACATGG ACCACCTAAA GAAGATCCTA  240AAGAGAGGTA AAGCAAAGGA CACCTTAATA CTCAAGAAAG GAGAGGAAAA CTTCTTAGAG  300ATAACAATTC AAGGAACTGC AACAAGAACA TTTAGAGTTC CCCTAATAGA TGTAGAAGAG  360ATGGAAGTTG ACCTCCCAGA ACTTCCATTC ACTGCAAAGG TTGTAGTTCT TGGAGAAGTC  420CTAAAAGATG CTGTTAAAGA TGCCTCTCTA GTGAGTGACA GCATAAAATT TATTGCCAGG  480GAAAATGAAT TTATAATGAA GGCAGAGGGA GAAACCCAGG AAGTTGAGAT AAAGCTAACT  540CTTGAAGATG AGGGATTATT GGACATCGAG GTTCAAGAGG AGACAAAGAG CGCATATGGA  600GTCAGCTATC TCTCCGACAT GGTTAAAGGA CTTGGAAAGG CCGATGAAGT TACAATAAAG  660TTTGGAAATG AAATGCCCAT GCAAATGGAG TATTACATTA GAGATGAAGG AAGACTTACA  720TTCCTACTGG CTCCAAGAGT TGAAGAGTGA                                   750序列号：3序列长度：327序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Ser Glu Glu Ile Arg Glu Val Lys Val Leu Glu Lys Pro Trp
              5                  10                  15Val Glu Lys Tyr Arg Pro Gln Arg Leu Asp Asp Ile Val Gly Gln
             20                  25                  30Glu His Ile Val Lys Arg Leu Lys His Tyr Val Lys Thr Gly Ser
             35                  40                  45Met Pro His Leu Leu Phe Ala Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Thr
             50                  55                  60Thr Ala Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu Leu Phe Gly Glu Asn Trp
             65                  70                  75Arg His Asn Phe Leu Glu Leu Asn Ala Ser Asp Glu Arg Gly Ile
             80                  85                  90Asn Val Ile Arg Glu Lys Val Lys Glu Phe Ala Arg Thr Lys Pro
             95                 100                 105Ile Gly Gly Ala Ser Phe Lys Ile Ile Phe Leu Asp Glu Ala Asp
            110                 115                 120Ala Leu Thr Gln Asp Ala Gln Gln Ala Leu Arg Arg Thr Met Glu
            125                 130                 135Met Phe Ser Ser Asn Val Arg Phe Ile Leu Ser Cys Asn Tyr Ser
            140                 145                 150Ser Lys Ile Ile Glu Pro Ile Gln Ser Arg Cys Ala Ile Phe Arg
            155                 160                 165Phe Arg Pro Leu Arg Asp Glu Asp Ile Ala Lys Arg Leu Arg Tyr
            170                 175                 180Ile Ala Glu Asn Glu Gly Leu Glu Leu Thr Glu Glu Gly Leu Gln
            185                 190                 195Ala Ile Leu Tyr Ile Ala Glu Gly Asp Met Arg Arg Ala Ile Asn
            200                 205                 210Ile Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ile Thr Asp Glu
            215                 220                 225Asn Val Phe Met Val Ala Ser Arg Ala Arg Pro Glu Asp Ile Arg
            230                 235                 240Glu Met Met Leu Leu Ala Leu Lys Gly Asn Phe Leu Lys Ala Arg
            245                 250                 255Glu Lys Leu Arg Glu Ile Leu Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Glu
            260                 265                 270Asp Val Leu Val Gln Met His Lys Glu Val Phe Asn Leu Pro Ile
            275                 280                 285Glu Glu Pro Lys Lys Val Leu Leu Ala Asp Lys Ile Gly Glu Tyr
            290                 295                 300Asn Phe Arg Leu Val Glu Gly Ala Asn Glu Ile Ile Gln Leu Glu
            305                 310                 315Ala Leu Leu Ala Gln Phe Thr Leu Ile Gly Lys Lys
            320                 325序列号：4序列长度：984序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGAGCGAAG AGATTAGAGA AGTTAAGGTT CTAGAAAAAC CCTGGGTTGA GAAGTATAGA   60CCTCAAAGAC TTGACGACAT TGTAGGACAA GAGCACATAG TGAAAAGGCT CAAGCACTAC  120GTCAAAACTG GATCAATGCC CCACCTACTC TTCGCAGGCC CCCCTGGTGT CGGAAAGACT  180ACAGCGGCTT TGGCCCTTGC AAGAGAGCTT TTCGGCGAAA ACTGGAGGCA TAACTTCCTC  240GAGTTGAATG CTTCAGATGA AAGAGGTATA AACGTAATTA GAGAGAAAGT TAAGGAGTTT  300GCGAGAACAA AGCCTATAGG AGGAGCAAGC TTCAAGATAA TTTTCCTTGA TGAGGCCGAC  360GCTTTAACTC AAGATGCCCA ACAAGCCTTA AGAAGAACCA TGGAAATGTT CTCGAGTAAC  420GTTCGCTTTA TCTTGAGCTG TAACTACTCC TCCAAGATAA TTGAACCCAT ACAGTCTAGA  480TGTGCAATAT TCCGCTTCAG ACCTCTCCGC GATGAGGATA TAGCGAAGAG ACTAAGGTAC  540ATTGCCGAAA ATGAGGGCTT AGAGCTAACT GAAGAAGGTC TCCAAGCAAT ACTTTACATA  600GCAGAAGGAG ATATGAGAAG AGCAATAAAC ATTCTGCAAG CTGCAGCAGC TCTAGACAAG  660AAGATCACCG ACGAAAACGT ATTCATGGTA GCGAGTAGAG CTAGACCTGA AGATATAAGA  720GAGATGATGC TTCTTGCTCT CAAAGGCAAC TTCTTGAAGG CCAGAGAAAA GCTTAGGGAG  780ATACTTCTCA AGCAAGGACT TAGTGGAGAA GATGTACTAG TTCAGATGCA CAAAGAAGTC  840TTCAACCTGC CAATAGAGGA GCCAAAGAAG GTTCTGCTTG CTGATAAGAT AGGAGAGTAT  900AACTTCAGAC TCGTTGAAGG GGCTAATGAA ATAATTCAGC TTGAAGCACT CTTAGCACAG  960TTCACCCTAA TTGGGAAGAA GTGA                                         984序列号：5序列长度：613序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Asp Glu Phe Val Lys Ser Leu Leu Lys Ala Asn Tyr Leu Ile
              5                  10                  15Thr Pro Ser Ala Tyr Tyr Leu Leu Arg Glu Tyr Tyr Glu Lys Gly
             20                  25                  30Glu Phe Ser Ile Val Glu Leu Val Lys Phe Ala Arg Ser Arg Glu
             35                  40                  45Ser Tyr Ile Ile Thr Asp Ala Leu Ala Thr Glu Phe Leu Lys Val
             50                  55                  60Lys Gly Leu Glu Pro Ile Leu Pro Val Glu Thr Lys Gly Gly Phe
             65                  70                  75Val Ser Thr Gly Glu Ser Gln Lys Glu Gln Ser Tyr Glu Glu Ser
             80                  85                  90Phe Gly Thr Lys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Ile Lys Glu Gly Glu
                 95             100                 105Ser Phe Ile Ser Thr Gly Ser Glu Pro Leu Glu Glu Glu Leu Asn
                110             115                 120Ser Ile Gly Ile Glu Glu Ile Gly Ala Asn Glu Glu Leu Val Ser
                125             130                 135Asn Gly Asn Asp Asn Gly Gly Glu Ala Ile Val Phe Asp Lys Tyr
                140             145                 150Gly Tyr Pro Met Val Tyr Ala Pro Glu Glu Ile Glu Val Glu Glu
                155             160                 165Lys Glu Tyr Ser Lys Tyr Glu Asp Leu Thr Ile Pro Met Asn Pro
                170             175                 180Asp Phe Asn Tyr Val Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Asp Val Val Phe
                185             190                 195Asp Val Arg Asn Val Lys Leu Lys Pro Pro Lys Val Lys Asn Gly
                200             205                 210Asn Gly Lys Glu Gly Glu Ile Ile Val Glu Ala Tyr Ala Ser Leu
                215             220                 225Phe Arg Ser Arg Leu Lys Lys Leu Arg Lys Ile Leu Arg Glu Asn
                230             235                 240Pro Glu Leu Asp Asn Val Val Asp Ile Gly Lys Leu Lys Tyr Val
                245             250                 255Lys Glu Asp Glu Thr Val Thr Ile Ile Gly Leu Val Asn Ser Lys
                260             265                 270Arg Glu Val Asn Lys Gly Leu Ile Phe Glu Ile Glu Asp Leu Thr
                275             280                 285Gly Lys Val Lys Val Phe Leu Pro Lys Asp Ser Glu Asp Tyr Arg
            290                 295                 300Glu Ala Phe Lys Val Leu Pro Asp Ala Val Val Ala Phe Lys Gly
            305                 310                 315Val Tyr Ser Lys Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Asn Lys Phe Tyr Leu
            320                 325                 330Pro Asp Val Pro Leu Tyr Arg Arg Gln Lys Pro Pro Leu Glu Glu
            335                 340                 345Lys Val Tyr Ala Ile Leu Ile Ser Asp Ile His Val Gly Ser Lys
            350                 355                 360Glu Phe Cys Glu Asn Ala Phe Ile Lys Phe Leu Glu Trp Leu Asn
            365                 370                 375Gly Asn Val Glu Thr Lys Glu Glu Glu Glu Ile Val Ser Arg Val
            380                 385                 390Lys Tyr Leu Ile Ile Ala Gly Asp Val Val Asp Gly Val Gly Val
            395                 400                 405Tyr Pro Gly Gln Tyr Ala Asp Leu Thr Ile Pro Asp Ile Phe Asp
            410                 415                 420Gln Tyr Glu Ala Leu Ala Asn Leu Leu Ser His Val Pro Lys His
            425                 430                 435Ile Thr Met Phe Ile Ala Pro Gly Asn His Asp Ala Ala Arg Gln
            440                 445                 450Ala Ile Pro Gln Pro Glu Phe Tyr Lys Glu Tyr Ala Lys Pro Ile
            455                 460                 465Tyr Lys Leu Lys Asn Ala Val Ile Ile Ser Asn Pro Ala Val Ile
            470                 475                 480Arg Leu His Gly Arg Asp Phe Leu Ile Ala His Gly Arg Gly Ile
            485                 490                 495Glu Asp Val Val Gly Ser Val Pro Gly Leu Thr His His Lys Pro
            500                 505                 510Gly Leu Pro Met Val Glu Leu Leu Lys Met Arg His Val Ala Pro
            515                 520                 525Met Phe Gly Gly Lys Val Pro Ile Ala Pro Asp Pro Glu Asp Leu
            530                 535                 540Leu Val Ile Glu Glu Val Pro Asp Val Val His Met Gly His Val
            545                 550                 555His Val Tyr Asp Ala Val Val Tyr Arg Gly Val Gln Leu Val Asn
            560                 565                 570Ser Ala Thr Trp Gln Ala Gln Thr Glu Phe Gln Lys Met Val Asn
            575                 580                 585Ile Val Pro Thr Pro Ala Lys Val Pro Val Val Asp Ile Asp Thr
            590                 595                 600Ala Lys Val Val Lys Val Leu Asp Phe Ser Gly Trp Cys
            605                 610序列号：6序列长度：1263序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Glu Leu Pro Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Phe Glu Met Leu Gln
              5                  10                  15Arg Glu Ile Asp Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Lys Ala Arg Ser
             20                  25                  30Gln Gly Lys Asp Pro Ser Thr Asp Val Glu Ile Pro Gln Ala Thr
             35                  40                  45Asp Met Ala Gly Arg Val Glu Ser Leu Val Gly Pro Pro Gly Val
             50                  55                  60Ala Gln Arg Ile Arg Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Asp Lys Glu Ile
             65                  70                  75Val Ala Leu Lys Ile Val Asp Glu Ile Ile Glu Gly Lys Phe Gly
             80                  85                  90Asp Phe Gly Ser Lys Glu Lys Tyr Ala Glu Gln Ala Val Arg Thr
             95                 100                 105Ala Leu Ala Ile Leu Thr Glu Gly Ile Val Ser Ala Pro Leu Glu
            110                 115                 120Gly Ile Ala Asp Val Lys Ile Lys Arg Asn Thr Trp Ala Asp Asn
            125                 130                 135Ser Glu Tyr Leu Ala Leu Tyr Tyr Ala Gly Pro Ile Arg Ser Ser
            140                 145                 150Gly Gly Thr Ala Gln Ala Leu Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Val
            155                 160                 165Arg Arg Lys Leu Gly Leu Asp Arg Phe Lys Pro Ser Gly Lys His
            170                 175                 180Ile Glu Arg Met Val Glu Glu Val Asp Leu Tyr His Arg Ala Val
            185                 190                 195Ser Arg Leu Gln Tyr His Pro Ser Pro Asp Glu Val Arg Leu Ala
            200                 205                 210Met Arg Asn Ile Pro Ile Glu Ile Thr Gly Glu Ala Thr Asp Asp
            215                 220                 225Val Glu Val Ser His Arg Asp Val Glu Gly Val Glu Thr Asn Gln
            230                 235                 240Leu Arg Gly Gly Ala Ile Leu Val Leu Ala Glu Gly Val Leu Gln
            245                 250                 255Lys Ala Lys Lys Leu Val Lys Tyr Ile Asp Lys Met Gly Ile Asp
            260                 265                 270Gly Trp Glu Trp Leu Lys Glu Phe Val Glu Ala Lys Glu Lys Gly
            275                 280                 285Glu Glu Ile Glu Glu Ser Glu Ser Lys Ala Glu Glu Ser Lys Val
            290                 295                 300Glu Thr Arg Val Glu Val Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Lys Leu Tyr
            305                 310                 315Glu Lys Phe Arg Ala Glu Ile Ala Pro Ser Glu Lys Tyr Ala Lys
            320                 325                 330Glu Ile Ile Gly Gly Arg Pro Leu Phe Ala Gly Pro Ser Glu Asn
            335                 340                 345Gly Gly Phe Arg Leu Arg Tyr Gly Arg Ser Arg Val Ser Gly Phe
            350                 355                 360Ala Thr Trp Ser Ile Asn Pro Ala Thr Met Val Leu Val Asp Glu
            365                 370                 375Phe Leu Ala Ile Gly Thr Gln Met Lys Thr Glu Arg Pro Gly Lys
            380                 385                 390Gly Ala Val Val Thr Pro Ala Thr Thr Ala Glu Gly Pro Ile Val
            395                 400                 405Lys Leu Lys Asp Gly Ser Val Val Arg Val Asp Asp Tyr Asn Leu
            410                 415                 420Ala Leu Lys Ile Arg Asp Glu Val Glu Glu Ile Leu Tyr Leu Gly
            425                 430                 435Asp Ala Ile Ile Ala Phe Gly Asp Phe Val Glu Asn Asn Gln Thr
            440                 445                 450Leu Leu Pro Ala Asn Tyr Val Glu Glu Trp Trp Ile Gln Glu Phe
            455                 460                 465Val Lys Ala Val Asn Glu Ala Tyr Glu Val Glu Leu Arg Pro Phe
            470                 475                 480Glu Glu Asn Pro Arg Glu Ser Val Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Leu
            485                 490                 495Glu Val Asp Pro Glu Phe Leu Ala Lys Met Leu Tyr Asp Pro Leu
            500                 505                 510Arg Val Lys Pro Pro Val Glu Leu Ala Ile His Phe Ser Glu Ile
            515                 520                 525Leu Glu Ile Pro Leu His Pro Tyr Tyr Thr Leu Tyr Trp Asn Thr
            530                 535                 540Val Asn Pro Lys Asp Val Glu Arg Leu Trp Gly Val Leu Lys Asp
            545                 550                 555Lys Ala Thr Ile Glu Trp Gly Thr Phe Arg Gly Ile Lys Phe Ala
            560                 565                 570Lys Lys Ile Glu Ile Ser Leu Asp Asp Leu Gly Ser Leu Lys Arg
            575                 580                 585Thr Leu Glu Leu Leu Gly Leu Pro His Thr Val Arg Glu Gly Ile
            590                 595                 600Val Val Val Asp Tyr Pro Trp Ser Ala Ala Leu Leu Thr Pro Leu
            605                 610                 615Gly Asn Leu Glu Trp Glu Phe Lys Ala Lys Pro Phe Tyr Thr Val
            620                 625                 630Ile Asp Ile Ile Asn Glu Asn Asn Gln Ile Lys Leu Ara Asp Ara
            635                 640                 645Gly Ile Ser Trp Ile Gly Ala Arg Met Gly Arg Pro Glu Lys Ala
            650                 655                 660Lys Glu Arg Lys Met Lys Pro Pro Val Gln Val Leu Phe Pro Ile
            665                 670                 675Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Lys Lys Ala Ala Glu
            680                 685                 690Glu Gly Lys Ile Ala Glu Val Glu Ile Ala Phe Phe Lys Cys Pro
            695                 700                 705Lys Cys Gly His Val Gly Pro Glu Thr Leu Cys Pro Glu Cys Gly
            710                 715                 720Ile Arg Lys Glu Leu Ile Trp Thr Cys Pro Lys Cys Gly Ala Glu
            725                 730                 735Tyr Thr Asn Ser Gln Ala Glu Gly Tyr Ser Tyr Ser Cys Pro Lys
            740                 745                 750Cys Asn Val Lys Leu Lys Pro Phe Thr Lys Arg Lys Ile Lys Pro
            755                 760                 765Ser Glu Leu Leu Asn Arg Ala Met Glu Asn Val Lys Val Tyr Gly
            770                 775                 780Val Asp Lys Leu Lys Gly Val Met Gly Met Thr Ser Gly Trp Lys
            785                 790                 795Ile Ala Glu Pro Leu Glu Lys Gly Leu Leu Arg Ala Lys Asn Glu
            800                 805                 810Val Tyr Val Phe Lys Asp Gly Thr Ile Arg Phe Asp Ala Thr Asp
            815                 820                 825Ala Pro Ile Thr His Phe Arg Pro Arg Glu Ile Gly Val Ser Val
            830                 835                 840Glu Lys Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Thr His Asp Phe Glu Gly Lys
            845                 850                 855Pro Leu Val Ser Glu Asp Gln Ile Val Glu Leu Lys Pro Gln Asp
            860                 865                 870Val Ile Leu Ser Lys Glu Ala Gly Lys Tyr Leu Leu Arg Val Ala
            875                 880                 885Arg Phe Val Asp Asp Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu Pro Arg
            890                 895                 900Phe Tyr Asn Ala Glu Lys Met Glu Asp Leu Ile Gly His Leu Val
            905                 910                 915Ile Gly Leu Ala Pro His Thr Ser Ala Gly Ile Val Gly Arg Ile
            920                 925                 930Ile Gly Phe Val Asp Ala Leu Val Gly Tyr Ala His Pro Tyr Phe
            935                 940                 945His Ala Ala Lys Arg Arg Asn Cys Asp Gly Asp Glu Asp Ser Val
            950                 955                 960Met Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Asn Phe Ser Arg Tyr Tyr Leu
            965                 970                 975Pro Glu Lys Arg Gly Gly Lys Met Asp Ala Pro Leu Val Ile Thr
            980                 985                 990Thr Arg Leu Asp Pro Arg Glu Val Asp Ser Glu Val His Asn Met
            995                1000                1005Asp Val Val Arg Tyr Tyr Pro Leu Glu Phe Tyr Glu Ala Thr Tyr
           1010                1015                1020Glu Leu Lys Ser Pro Lys Glu Leu Val Arg Val Ile Glu Gly Val
           1025                1030                1035Glu Asp Arg Leu Gly Lys Pro Glu Met Tyr Tyr Gly Ile Lys Phe
           1040                1045                1050Thr His Asp Thr Asp Asp Ile Ala Leu Gly Pro Lys Met Ser Leu
           1055                1060                1065Tyr Lys Gln Leu Gly Asp Met Glu Glu Lys Val Lys Arg Gln Leu
           1070                1075                1080Thr Leu Ala Glu Arg Ile Arg Ala Val Asp Gln His Tyr Val Ala
           1085                1090                1095Glu Thr Ile Leu Asn Ser His Leu Ile Pro Asp Leu Arg Gly Asn
           1100                1105                1110Leu Arg Ser Phe Thr Arg Gln Glu Phe Arg Cys Val Lys Cys Asn
           1115                1120                1125Thr Lys Tyr Arg Arg Pro Pro Leu Asp Gly Lys Cys Pro Val Cys
           1130                1135                1140Gly Gly Lys Ile Val Leu Thr Val Ser Lys Gly Ala Ile Glu Lys
           1145                1150                1155Tyr Leu Gly Thr Ala Lys Met Leu Val Ala Asn Tyr Asn Val Lys
           1160                1165                1170Pro Tyr Thr Arg Gln Arg Ile Cys Leu Thr Glu Lys Asp Ile Asp
           1175                1180                1185Ser Leu Phe Glu Tyr Leu Phe Pro Glu Ala Gln Leu Thr Leu Ile
           1190                1195                1200Val Asp Pro Asn Asp Ile Cys Met Lys Met Ile Lys Glu Arg Thr
           1205                1210                1215Gly Glu Thr Val Gln Gly Gly Leu Leu Glu Asn Phe Asn Ser Ser
           1220                1225                1230Gly Asn Asn Gly Lys Lys Ile Glu Lys Lys Glu Lys Lys Ala Lys
           1235                1240                1245Glu Lys Pro Lys Lys Lys Lys Val Ile Ser Leu Asp Asp Phe Phe
           1250                1255                1260Ser Lys Arg序列号：7序列长度：20序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Asp Lys Glu Gly Phe Leu Asn Lys Val Arg Glu Ala Val Asp
          5                      10                  15Val Val Lys Leu His
             20序列号：8序列长度：20序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Phe Thr Gly Lys Val Leu Ile Pro Val Lys Val Leu Lys Lys
              5                  10                  15Phe Glu Asn Trp Asn
             20序列号：9序列长度：20序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Ile Gly Ser Ile Phe Tyr Ser Lys Lys Phe Asn Leu His Arg
              5                  10                  15Pro Ser Glu Tyr His
             20序列号：10序列长度：20序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Lys Asp Tyr Arg Pro Leu Leu Gly Ala Ile Lys Val Lys Gly
              5                  10                  15Asp Asn Val Phe Ser
             20序列号：11序列长度：18序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Asp Ile Glu Val Leu Arg Arg Leu Leu Glu Arg Glu Leu Ser
              5                  10                  15Ser Glu His序列号：12序列长度：17序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Pro Phe Glu Ile Val Phe Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Gln Leu
              5                  10                  15Ile Asp序列号：13序列长度：17序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：ATGGATAARG ARGGNTT                             17序列号：14序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：AATAAAGTWA GRGARGCNGT                          20序列号：15序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：CTCTGCGGCA ATTCTTGCAA                          20序列号：16序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：CTTGCAAAGA AGTATGTAAC                                               20序列号：17序列长度：2009序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：AAGCTTCCAA AGAACTGGCG TTACGACCCA GAGACTGCAA AGTTGCTCGT CCGCTGATCC   60TTCCCTATAT TTTCATTTGG TGTTTTTCAT GGATAAGGAG GGTTTTTTGA ACAAGGTTAG  120GGAGGCTGTG GATGTAGTAA AGCTCCACAT CGAGTTAGGT CATACTATAA GGATAATCTC  180TCATAGGGAT GCGGATGGAA TAACCTCTGC GGCAATTCTT GCAAAGGCTT TGGGAAGAGA  240AGGAGCGAGC TTTCACATTT CGATTGTTAA ACAGGTAAGT GAAGATCTTT TAAGAGAATT  300AAAGGATGAA GATTACAAAA TCTTCATTTT TTCCGACCTG GGTAGTGGTT CTTTAAGTTT  360GATAAAAGAG TATCTTAAGG AAAAAACTGT TATAATCCTT GATCACCATC CTCCGGAAAA  420TGTGAAGTTG GAAGAAAAGC ATATACTTGT TAATCCAGTT CAATTTGGCG CAAATAGCGT  480TAGGGATCTG AGTGGATCTG GGGTTACATA CTTCTTTGCA AGGGAGCTAA ATGAAAAGAA  540TAGGGACCTT GCTTACATTG CAATAGTGGG AGCAGTTGGG GATATGCAAG AGAACGATGG  600AGTTTTCCAT GGGATGAACC TTGATATTAT TGAAGATGGG AAATCTCTGG GAATTCTTGA  660GGTTAAAAAA GAATTGCGCC TGTTTGGTAG GGAAACTAGA CCTCTCTATC AAATGCTCGC  720ATATGCCACA AATCCGGAAA TTCCTGAAGT TACTGGAGAC GAGAGGAAGG CCATAGAGTG  780GTTAAAGAAC AAGGGCTTCA ATCCCGAGAA AAAATATTGG GAATTAAGTG AGGAGGAAAA  840GAAAAAGTTA CATGATTTCC TAATCATTCA CATGATCAAG CATGGAGCTG GAAAAGAGGA  900TATAGATAGG CTAATAGGAG ACGTTGTTAT TAGTCCCTTA TATCCTGAAG GGGATCCCAG  960GCACGAGGCT AGAGAATTTG CTACCCTATT AAACGCTACA GGCAGGTTAA ACTTGGGCAA 1020CTTAGGAGTG GCTGTATGTT TGGGAGATGA GGAGGCTTTC AGAAAGGCCC TAAAGATGGT 1080TGAAGACTAC AAGAGGGAGC AAATTGAAGC AAGAAAGTGG CTACTTCAAA ATTGGAACAG 1140TGAAGTTTGG GAGGGGGATC ATGTTTACGT CTTATATGTG GGAAAGAGTA TTAGAGATAC 1200TCTCGTTGGA ATAGCAGCTA GCATGGCCAT CAATGCTGGA CTGGCAGATC CTGAAAAGCC 1260GGTTATAGTG TTTGCAGATA CTGATGAAGA TCCAAACCTT CTCAAAGGTT CAGCTAGAAC 1320AACTGAAAGG GCTTTAGCTA AGGGTTACAA TTTGGGAGAA GCTCTTAGGA AAGCGGCTGA 1380GCTAGTGAAT GGGGAAGGGG GAGGACACGC GATAGCTGCA GGTATAAGAA TTCCCAGGGC 1440CAGGTTGGCG GAGTTTAGAA AATTAATAGA TAAAATCCTT GGAGAACAGG TGAGCAAAGG 1500TGGAGATAAA AGCGAAAGCT GAAATATTGT GGGAGTACAG CGATGAGAAG GTTGCTGAGG 1560CTATTGCGAA GTCTGTTGAT GTTGATAATA TTTCTCTCCC TCCAAACCTC AAGAAAAGTT 1620TAAATCTTAT GACGTTTTCC GATGGAGCGA AGGTAATAAC AAAGGTTAAA TATCATGGAG 1680AAATTGAGAC TCTCATAGTT GCTCTCGATG ATTTGATATT CGCTGTAAAA GTTGCTGAGG 1740AGGTGTTATG ATGGTGNGAA AAGGGNAACA ACAACANGGG ATAAGGGAAG NTGAAGCAAT 1800GGTATATTAT TTATGCTCCN GANTTCTTGG GCGGGGTAGA GGTAGGATTA ACGCCAGCAG 1860ACGATCCAGA GAAAGTACTC AACAGAGTCG TTGAAGTTAC TCTGAAGGAT GTTACAGGAG 1920ACTTTACAAA GAGTCACGTG AAGCTCTATT TCCAAGTATA TGATGTCAAG GGACAGAATG 1980CCTACACAAA GTTCAAGGGA ATGAAGCTT                                   2009序列号：18序列长度：1434序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGGATAAGG AGGGTTTTTT GAACAAGGTT AGGGAGGCTG TGGATGTAGT AAAGCTCCAC   60ATCGAGTTAG GTCATACTAT AAGGATAATC TCTCATAGGG ATGCGGATGG AATAACCTCT  120GCGGCAATTC TTGCAAAGGC TTTGGGAAGA GAAGGAGCGA GCTTTCACAT TTCGATTGTT  180AAACAGGTAA GTGAAGATCT TTTAAGAGAA TTAAAGGATG AAGATTACAA AATCTTCATT  240TTTTCCGACC TGGGTAGTGG TTCTTTAAGT TTGATAAAAG AGTATCTTAA GGAAAAAACT  300GTTATAATCC TTGATCACCA TCCTCCGGAA AATGTGAAGT TGGAAGAAAA GCATATACTT  360GTTAATCCAG TTCAATTTGG CGCAAATAGC GTTAGGGATC TGAGTGGATC TGGGGTTACA  420TACTTCTTTG CAAGGGAGCT AAATGAAAAG AATAGGGACC TTGCTTACAT TGCAATAGTG  480GGAGCAGTTG GGGATATGCA AGAGAACGAT GGAGTTTTCC ATGGGATGAA CCTTGATATT  540ATTGAAGATG GGAAATCTCT GGGAATTCTT GAGGTTAAAA AAGAATTGCG CCTGTTTGGT  600AGGGAAACTA GACCTCTCTA TCAAATGCTC GCATATGCCA CAAATCCGGA AATTCCTGAA  660GTTACTGGAG ACGAGAGGAA GGCCATAGAG TGGTTAAAGA ACAAGGGCTT CAATCCCGAG  720AAAAAATATT GGGAATTAAG TGAGGAGGAA AAGAAAAAGT TACATGATTT CCTAATCATT  780CACATGATCA AGCATGGAGC TGGAAAAGAG GATATAGATA GGCTAATAGG AGACGTTGTT  840ATTAGTCCCT TATATCCTGA AGGGGATCCC AGGCACGAGG CTAGAGAATT TGCTACCCTA  900TTAAACGCTA CAGGCAGGTT AAACTTGGGC AACTTAGGAG TGGCTGTATG TTTGGGAGAT  960GAGGAGGCTT TCAGAAAGGC CCTAAAGATG GTTGAAGACT ACAAGAGGGA GCAAATTGAA 1020GCAAGAAAGT GGCTACTTCA AAATTGGAAC AGTGAAGTTT GGGAGGGGGA TCATGTTTAC 1080GTCTTATATG TGGGAAAGAG TATTAGAGAT ACTCTCGTTG GAATAGCAGC TAGCATGGCC 1140ATCAATGCTG GACTGGCAGA TCCTGAAAAG CCGGTTATAG TGTTTGCAGA TACTGATGAA 1200GATCCAAACC TTCTCAAAGG TTCAGCTAGA ACAACTGAAA GGGCTTTAGC TAAGGGTTAC 1260AATTTGGGAG AAGCTCTTAG GAAAGCGGCT GAGCTAGTGA ATGGGGAAGG GGGAGGACAC 1320GCGATAGCTG CAGGTATAAG AATTCCCAGG GCCAGGTTGG CGGAGTTTAG AAAATTAATA 1380GATAAAATCC TTGGAGAACA GGTGAGCAAA GGTGGAGATA AAAGCGAAAG CTGA       1434序列号：19序列长度：477序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Asp Lys Glu Gly Phe Leu Asn Lys Val Arg Glu Ala Val Asp
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             35                  40                  45Lys Ala Leu Gly Arg Glu Gly Ala Ser Phe His Ile Ser Ile Val
             50                  55                  60Lys Gln Val Ser Glu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Lys Asp Glu Asp
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            155                 160                 165Met Gln Glu Asn Asp Gly Val Phe His Gly Met Asn Leu Asp Ile
            170                 175                 180Ile Glu Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Leu Glu Val Lys Lys Glu
            185                 190                 195Leu Arg Leu Phe Gly Arg Glu Thr Arg Pro Leu Tyr Gln Met Leu
            200                 205                 210Ala Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Ile Pro Glu Val Thr Gly Asp Glu
            215                 220                 225Arg Lys Ala Ile Glu Trp Leu Lys Asn Lys Gly Phe Asn Pro Glu
            230                 235                 240Lys Lys Tyr Trp Glu Leu Ser Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu His
            245                 250                 255Asp Phe Leu Ile Ile His Met lle Lys His Gly Ala Gly Lys Glu
            260                 265                 270Asp Ile Asp Arg Leu Ile Gly Asp Val Val Ile Ser Pro Leu Tyr
            275                 280                 285Pro Glu Gly Asp Pro Arg His Glu Ala Arg Glu Phe Ala Thr Leu
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            320                 325                 330Val Glu Asp Tyr Lys Arg Glu Gln Ile Glu Ala Arg Lys Trp Leu
            335                 340                 345Leu Gln Asn Trp Asn Ser Glu Val Trp Glu Gly Asp His Val Tyr
            350                 355                 360Val Leu Tyr Val Gly Lys Ser Ile Arg Asp Thr Leu Val Gly Ile
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            455                 460                 465Glu Gln Val Ser Lys Gly Gly Asp Lys Ser Glu Ser
            470                 475序列号：20序列长度：31序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TTCATTTGGT GTTTTCCATG GATAAGGAGG G              31序列号：21序列长度：23序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：AAAGTWYTAA TWCCWGTNAA RGT                        23序列号：22序列长度：23序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：AAAGTWYTAA AAAARTTYGA RAA                        23序列号：23序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GATACTGCTA GAAGATTGGA                            20序列号：24序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TTCGTACAGT CCCTCTGGTA                            20序列号：25序列长度：957序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：CTACGAAGCT AAAATTTGAT GTCTCAACTC AAGGACTTTT AGCTTATAAA ATGTGTCAAG   60TCTTCCCCGA ACTTTCTCCT CCAGTAAGGG TTTTGTACCT CTCAGCAAAG ACAGGAGTAG  120GATTTGAAGA CCTTGAAACT TTAGCGTATG AACATTATTG TACATGCGGC GACCTCACTT  180AGATTTTTTA ACCCCTATTT TCTCTAATGT CATTCAAGTA TTGGGGGAGT AATCATGTTC  240ACGGGTAAGG TATTGATTCC AGTAAAAGTA CTCAAGAAGT TTGAGAATTG GAATGAAGGA  300GATATGATAC TGCTAGAAGA TTGGAAAGCC AAGGAATTGT GGGAGAGTGG AGTAGTTGAA  360ATAATCGATG AAGCTGATAA AGTCATAGGA GAGATCGATA GAGTGTTATC AGAAGAAAAG  420AAAAACCTCC CATTGACTCC AATACCAGAG GGACTGTACG AAAAAGCTGA ATTTTACATC  480TATTATCTAG AAAAGTACAT CCAAGAGAAG GTCGACAACA TAGAAACAAT ACAAACTAAG  540GTCACAAAGT TAGCAAATCT AAAGAAGAAG TATAAGACTC TGAAAGAGAT AAGATTTAAA  600AAGATACTAG AGGCTGTGAG GCTTAGACCA AACAGTATGG AAATTCTAGC GAGATTATCC  660CCAGCTGAAA AGAGAATATA CCTTGAGATC TCTAAAATAA GGAGAGAGTG GATAGGTGAT  720TAGCGTGGAC AGGGAGGAGA TGATTGAGAG ATTTGCAAAC TTCCTTAGGG AGTATACAGA  780CGAAGATGGT AACCCAGTAT ACAGAGGTAA AATAACTGAT TTACTTACAA TAACACCCAA  840GAGGTCTGTT GCAATAGACT GGATGCACCT AAATTCCTTT GACTCAGAGC TAGAGTCGAC  900CTGCAGGCAT GCATGCAGGT CGACTCTAGA GGATCCCCGG GTACCGAGCT CGAATTC     957序列号：26序列长度：489序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGTTCACGG GTAAGGTATT GATTCCAGTA AAAGTACTCA AGAAGTTTGA GAATTGGAAT   60GAAGGAGATA TGATACTGCT AGAAGATTGG AAAGCCAAGG AATTGTGGGA GAGTGGAGTA  120GTTGAAATAA TCGATGAAGC TGATAAAGTC ATAGGAGAGA TCGATAGAGT GTTATCAGAA  180GAAAAGAAAA ACCTCCCATT GACTCCAATA CCAGAGGGAC TGTACGAAAA AGCTGAATTT  240TACATCTATT ATCTAGAAAA GTACATCCAA GAGAAGGTCG ACAACATAGA AACAATACAA  300ACTAAGGTCA CAAAGTTAGC AAATCTAAAG AAGAAGTATA AGACTCTGAA AGAGATAAGA  360TTTAAAAAGA TACTAGAGGC TGTGAGGCTT AGACCAAACA GTATGGAAAT TCTAGCGAGA  420TTATCCCCAG CTGAAAAGAG AATATACCTT GAGATCTCTA AAATAAGGAG AGAGTGGATA  480GGTGATTAG                                                          489序列号：27序列长度：162序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Phe Thr Gly Lys Val Leu lle Pro Val Lys Val Leu Lys Lys
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             20                  25                  30Lys Ala Lys Glu Leu Trp Glu Ser Gly Val Val Glu Ile Ile Asp
             35                  40                  45Glu Ala Asp Lys Val Ile Gly Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Glu
             50                  55                  60Glu Lys Lys Asn Leu Pro Leu Thr Pro Ile Pro Glu Gly Leu Tyr
             65                  70                  75Glu Lys Ala Glu Phe Tyr Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Tyr Ile Gln
             80                  85                  90Glu Lys Val Asp Asn Ile Glu Thr Ile Gln Thr Lys Val Thr Lys
             95                 100                 105Leu Ala Asn Leu Lys Lys Lys Tyr Lys Thr Leu Lys Glu Ile Arg
            110                 115                 120Phe Lys Lys Ile Leu Glu Ala Val Arg Leu Arg Pro Asn Ser Met
            125                 130                 135Glu Ile Leu Ala Arg Leu Ser Pro Ala Glu Lys Arg Ile Tyr Leu
            140                 145                 150Glu Ile Ser Lys Ile Arg Arg Glu Trp Ile Gly Asp
            155                 160序列号：28序列长度：17序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：ATGAAAGAYT AYAGRCC                             17序列号：29序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：CAAGCWATWA ARGTNAAGGG                           20序列号：30序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TTCAAGTAAG AGTGAGTTAG                           20序列号：31序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TAAGTACTCC ACCATTTCCC                           20序列号：32序列长度：1012序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：TCTAGAACAT AGCAGTAAAA CTTTCCTTCT AGTACAACTT CTTCTCCTCT GTAAACTTTC   60ACATCAACTA TCTTCTTTCT CCCTTGATCC TCCACCACCT GAGCTTTTGC TAAAAGCACG  120TCTCCAACTT TCACCGGCTT TGTAAAGCGT ACCTCTGCCT TTCCAAGAAC TACAGTAGGC  180TCATTTACAG CAAGCATTGC GGCGTAATCA GCTAAACCAA ATGTAAAGCC CCCGTGAACT  240AGCCCCTTCT CATCAACCTT CATCTCGTCA ATGGTTTTCA GTTCCACTTC AGCATACCCC  300TCTCTTATTA CCCTGGGTTT TCCTACAAGT CTCTCAGATG TCAGATTGTG CGTTTTCTGC  360TCCATACCAC CACCGAAAAG AATAAGGTTT TTGAAATTTA AAAGCTAAGG GAGGAGTGAT  420GAAAGACTAT AGGCCACTCC TCCAAGCAAT AAAAGTTAAG GGAGATAATG TTTTTTCAAG  480TAAGAGTGAG TTAGTTGGTA TTCTAGCCTT TAATTTGGGA ATATTAACAG TTGGTGAGGC  540AAAAGAACTC ATAGAGGAGG CCATAAAGGA GGGAATCATT GAGGAAACTC CCGAAGGTCT  600CATAGTTCAT GAGGATGCCA TAACTGAAAA GGAAAGCAAA AGGGATATAT TCGGGGAAAT  660GGTGGAGTAC TTAGCGAGAG AACTTGAGCT TAGCGAGATA GAAGTTCTTG AAGAGATAGA  720AAAAATGAAA GAGAGGTACG GAAATTTGGA TAAAAAAATT CTTGCTTACT TATTCGGACT  780ATCAAAAGGA GTTAACATGG AGAAATTCAA AGAATACTTG GAGGATGAAT GATGCCCAAA  840ATAGAACCTT TTGAAAAGTA CACTGAGAGA TACGAGGAGT GGTTTGAAAG AATAAATTTG  900CATACCTCAG TGAGCTTAAT GCCCTGAAAT CTCTTCTTCC TACCAGAGAA TGTGTTGAAG  960TGGGAATAGG TAGTGGAAGG TTTGCGGCTC CCCTGGGAAT TAAGATGGGG GT         1012序列号：33序列长度：414序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGAAAGACT ATAGGCCACT CCTCCAAGCA ATAAAAGTTA AGGGAGATAA TGTTTTTTCA   60AGTAAGAGTG AGTTAGTTGG TATTCTAGCC TTTAATTTGG GAATATTAAC AGTTGGTGAG  120GCAAAAGAAC TCATAGAGGA GGCCATAAAG GAGGGAATCA TTGAGGAAAC TCCCGAAGGT  180CTCATAGTTC ATGAGGATGC CATAACTGAA AAGGAAAGCA AAAGGGATAT ATTCGGGGAA  240ATGGTGGAGT ACTTAGCGAG AGAACTTGAG CTTAGCGAGA TAGAAGTTCT TGAAGAGATA  300GAAAAAATGA AAGAGAGGTA CGGAAATTTG GATAAAAAAA TTCTTGCTTA CTTATTCGGA  360CTATCAAAAG GAGTTAACAT GGAGAAATTC AAAGAATACT TGGAGGATGA ATGA        414序列号：34序列长度：137序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Lys Asp Tyr Arg Pro Leu Leu Gln Ala Ile Lys Val Lys Gly
              5                  10                  15Asp Asn Val Phe Ser Ser Lys Ser Glu Leu Val Gly Ile Leu Ala
             20                  25                  30Phe Asn Leu Gly Ile Leu Thr Val Gly Glu Ala Lys Glu Leu Ile
             35                  40                  45Glu Glu Ala Ile Lys Glu Gly Ile Ile Glu Glu Thr Pro Glu Gly
             50                  55                  60Leu Ile Val His Glu Asp Ala Ile Thr Glu Lys Glu Ser Lys Arg
             65                  70                  75Asp Ile Phe Gly Glu Met Val Glu Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Glu
             80                  85                  90Leu Ser Glu Ile Glu Val Leu Glu Glu Ile Glu Lys Met Lys Glu
             95                 100                 105Arg Tyr Gly Asn Leu Asp Lys Lys Ile Leu Ala Tyr Leu Phe Gly
            110                 115                 120Leu Ser Lys Gly Val Asn Met Glu Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Glu
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            470                 475序列号：65序列长度：23序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：ATGGATATWG ARGTDYTNAG RAG                       23序列号：66序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：ATWGARGTWY TWAGRAGRYT                           20序列号：67序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GAGAGAGAAC TTTCAAGCGA                           20序列号：68序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：CTCTAAGAAG ATATGCCTCT                           20序列号：69序列长度：558序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGGATATTG AGGTTCTCAG AAGATTATTG GAGAGAGAAC TTTCAAGCGA AGAACTGACT   60AAAATAGAGG AAGAATTTTA TGACGATTTA GAAAGCTTTA GAAAAGCCTT GGAAATCAAT  120GCCGAGAGAC ATGAAGAAAG AGGAGAGGAC ATTCACAAAA AGCTGTATTT AGCTCAACTA  180TCTTTGGTTA GGAATCTTGT TAGAGAAATA TTAAGGATTA GGTTGCATAA GATTGTTGAT  240ATGGCATTTG AGGGAGTTCC CAGAAATTTA GTTGGAGATG AAAAGAAAAT ATACAAGATA  300ATAACAGCTT TCATAAATGG AGAACCTCTT GAAATTGAAA CGGCAGGAGA AGAGAGTATT  360GAAGTTATTG AAGAGGAAAA AGAAACATCT CCTGGGATAA TAGAGGCATA TCTTCTTAGA  420GTTGATATTC CCAAAATATT GGATGAAAAT TTGAGAGAAT ATGGGCCCTT CAAGGCTGGC  480GATCTTGTTG TATTGCCGAA GTCTATTGGC AGGGTACTCA TTCAGAGGGA TGCCGCGGAT  540AAGGTATTGA TACAATTG                                                558序列号：70序列长度：186序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Asp Ile Glu Val Leu Arg Arg Leu Leu Glu Arg Glu Leu Ser
              5                  10                  15Ser Glu Glu Leu Thr Lys Ile Glu Glu Glu Phe Tyr Asp Asp Leu
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             65                  70                  75His Lys Ile Val Asp Met Ala Phe Glu Gly Val Pro Arg Asn Leu
             80                  85                  90Val Gly Asp Glu Lys Lys Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ala Phe Ile
             95                 100                 105Asn Gly Glu Pro Leu Glu Ile Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ser Ile
            110                 115                 120Glu Val Ile Glu Glu Glu Lys Glu Thr Ser Pro Gly Ile Ile Glu
            125                 130                 135Ala Tyr Leu Leu Arg Val Asp Ile Pro Lys Ile Leu Asp Glu Asn
            140                 145                 150Leu Arg Glu Tyr Gly Pro Phe Lys Ala Gly Asp Leu Val Val Leu
            155                 160                 165Pro Lys Ser Ile Gly Arg Val Leu Ile Gln Arg Asp Ala Ala Asp
            170                 175                 180Lys Val Leu Ile Gln Leu
            185序列号：71序列长度：33序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TTTAATTTG GGGATAACCAT GGATATTGAG GTT              33序列号：72序列长度：31序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TAGGATGGGT TTTGGATCCT CTCATTGGAG G               31序列号：73序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：ATGATWGGWW SWATHTTYTA                            20序列号：74序列长度：23序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：AAGAAGTTTA ATYTDCAYAG RCC                        23序列号：75序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TGAGTATCAT CCAGAGAATC                            20序列号：76序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TCACATCGGG ATCGTTCCAG                            20序列号：77序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GATTTTGACG CTCATCATGG                            20序列号：78序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GGAAAGAACG ATTTCGAGTC                                               20序列号：79序列长度：1005序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：基因组DNA序列：ATGATTGGCT CAATATTTTA TTCCAAGAAG TTTAACCTCC ATAGACCTAG TGAGTATCAT   60CCAGAGAATC CCAAGAGACT CGAAATCGTT CTTTCCAAGG TCAGAGAGCT TGGACTTGAA  120GAAAGAATAG AAGAACCAAA CCCAGTTGAA GAGACTTTCG TTGAGAAAAT TCACGACAGG  180GATTACATCA ACTTCGTTAA AGAGGCCGTT GAAAAAGGAA TCACAAGACT TGATCCAGAC  240ACTTATGTTT CTCCTGGGAC TTGGAGTGCG GCATTGTTAG CTTTAGGAGC CGCAAGGAGT  300GCAGCTTTAT CAGCCCTTCA CTATGGAGGC CTCCACATGG CTCTAGTTAG GCCCCCTGGG  360CATCATGCAG GGAGAAGAGG AAGGGCCATG GGTGCCCCAA CACTAGGCTT CTGCATCTTC  420AACAACGCGG CCTCTGCAGT TGTCACCTTG AAAGAAGAGG GAGTTGGAAA AGTTGTTGTA  480ATAGATTTTG ACGCTCATCA TGGAAACGGG ACTCAGGAAA TATTCTGGAA CGATCCCGAT  540GTGATTCACA TAGATCTACA CGAGAGAGAC ATCTACCCAG GGAGTGGGGA TGTGAGTGAA  600GTTGGAGGGT CAAATGCTTA TGGGAGCAAG ATAAACCTCC CAATGCCCCA CTATTCTGGG  660GATGGGGATT ACATATATGT TTGGGACGAA ATTGTGCTTC CAATAGTTGA AGAAGTTAAG  720CCAAAGGTCA TCGTAATTTC CGCGGGCTTT GATGGATTTA AAGGGGATGG TCTAACAACA  780TTAAGGCTCA CAGAAAGTTT TTACTCTTAT GCAGGGGCTA CATTAAATAA ATATCCCTTG  840GCATTTATAT TGGAAGGCGG GTATGGAGTA GGGTTAGATA AAGGTTTTCC GGCCTTCATA  900ATGGGCTACG AAGAGGGTAA AGCGAAAGCT CGAGAAGAGC CAAGATATGA GACCCTAAAG  960TTGGCGGAGG AGGTTAAGGA CATCTTGAGT CCCTGGTGGT CGTTA                 1005序列号：80序列长度：335序列类型：氨基酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：肽序列：Met Ile Gly Ser Ile Phe Tyr Ser Lys Lys Phe Asn Leu His Arg
              5                  10                  15Pro Ser Glu Tyr His Pro Glu Asn Pro Lys Arg Leu Glu Ile Val
             20                  25                  30Leu Ser Lys Val Arg Glu Leu Gly Leu Glu Glu Arg Ile Glu Glu
             35                  40                  45Pro Asn Pro Val Glu Glu Thr Phe Val Glu Lys Ile His Asp Arg
             50                  55                  60Asp Tyr Ile Asn Phe Val Lys Glu Ala Val Glu Lys Gly Ile Thr
             65                  70                  75Arg Leu Asp Pro Asp Thr Tyr Val Ser Pro Gly Thr Trp Ser Ala
             80                  85                  90Ala Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Arg Ser Ala Ala Leu Ser Ala
             95                 100                 105Leu His Tyr Gly Gly Leu His Met Ala Leu Val Arg Pro Pro Gly
            110                 115                 120His His Ala Gly Arg Arg Gly Arg Ala Met Gly Ala Pro Thr Leu
            125                 130                 135Gly Phe Cys Ile Phe Asn Asn Ala Ala Ser Ala Val Val Thr Leu
            140                 145                 150Lys Glu Glu Gly Val Gly Lys Val Val Val Ile Asp Phe Asp Ala
            155                 160                 165His His Gly Asn Gly Thr Gln Glu Ile Phe Trp Asn Asp Pro Asp
            170                 175                 180Val Ile His Ile Asp Leu His Glu Arg Asp Ile Tyr Pro Gly Ser
            185                 190                 195Gly Asp Val Ser Glu Val Gly Gly Ser Asn Ala Tyr Gly Ser Lys
            200                 205                 210Ile Asn Leu Pro Met Pro His Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Tyr Ile
            215                 220                 225Tyr Val Trp Asp Glu Ile Val Leu Pro Ile Val Glu Glu Val Lys
            230                 235                 240Pro Lys Val Ile Val Ile Ser Ala Gly Phe Asp Gly Phe Lys Gly
            245                 250                 255Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Leu Thr Glu Ser Phe Tyr Ser Tyr
            260                 265                 270Ala Gly Ala Thr Leu Asn Lys Tyr Pro Leu Ala Phe Ile Leu Glu
            275                 280                 285Gly Gly Tyr Gly Val Gly Leu Asp Lys Gly Phe Pro Ala Phe Ile
            290                 295                 300Met Gly Tyr Glu Glu Gly Lys Ala Lys Ala Arg Glu Glu Pro Arg
            305                 310                 315Tyr Glu Thr Leu Lys Leu Ala Glu Glu Val Lys Asp Ile Leu Ser
            320                 325                 330Pro Trp Trp Ser Leu
            335序列号：81序列长度：36序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GGGAAGAAGT GATGACATAT GCCAGAGCTT CCCTGG         36序列号：82序列长度：20序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TTCCAAGCTC CTTAAGTTTC                           20序列号：83序列长度：3574序列类型：核酸链数：双链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：CATATGCCAG AGCTTCCCTG GGTAGAAAAA TACAGGCCAA AAAAGTTAAG TGAAATTGTA   60AACCAAGAAG AGGCTATAGA GAAAGTTAGA GCGTGGATAG AGAGCTGGTT GCATGGCCAC  120CCCCCTAAGA AAAAAGCCCT ATTATTAGCA GGACCCCCAG GGAGCGGAAA GACAACCACA  180GTCTACGCTC TAGCAAATGA GTACAACTTT GAAGTCATTG AGCTCAACGC GAGTGATGAG  240AGAACTTATG AAAAAATCTC CAGGTATGTT CAAGCAGCAT ACACTATGGA TATCCTCGGA  300AAGAGGAGGA AGATAATCTT CCTCGATGAA GCAGATAATA TAGAGCCCAG CGGAGCTAAG  360GAAATCGCAA AACTAATTGA TAAGGCCAAA AATCCAATAA TAATGGCTGC AAATAAGTAC  420TGGGAAGTTC CAAAAGAGAT CCGAGAAAAA GCTGAGCTAG TAGAGTACAA GAGGTTAACC  480CAGAGAGATG TAATGAATGC CTTAATAAGG ATCCTAAAGA GGGAAGGTAT AACAGTTCCA  540AAAGAAATCC TCCTAGAAAT AGCAAAAAGA TCTAGTGGAG ATCTAAGAGC AGCTATAAAT  600GATCTACAGA CCGTTGTAGT GGGTGGTTAC GAAGATGCTA CGCAAGTTTT GGCATATAGA  660GATGTAGAAA AGACAGTCTT TCAAGCCCTA GGACTCGTCT TTGGAAGTGA CAACGCCAAG  720AGGGCAAAGA TGGCAATGTG GAACTTGGAC ATGTCCCCTG ATGAATTCCT GCTATGGGTA  780GATGAGAACA TTCCTCACCT CTACCTAAAT CCAGAGGAGA TTGCCCAGGC GTATGATGCA  840ATTAGTAGAG CCGACATATA CCTCGGAAGG GCCGCCAGAA CTGGAAACTA TTCACTCTGG  900AAGTACGCAA TAGATATGAT GACTGCAGGA GTTGCCGTGG CAGGGAGAAA GAGAAGGGGA  960TTTGTCAAGT TTTATCCTCC CAACACCCTA AAGATTTTAG CGGAAAGCAA AGAAGAAAGA 1020GAGATCAGAG AGTCAATAAT TAAAAAGATA ATACGAGAGA TGCACATGAG TAGGCTACAG 1080GCAATAGAAA CGATGAAAAT AATTAGAGAG ATTTTCGAGA ACAATCTAGA CCTTGCTGCG 1140CACTTTACAG TGTTCCTTGG TCTGTCTGAA AAAGAAGTTG AGTTTCTAGC TGGAAAGGAA 1200AAAGCTGGTA CCATTTGGGG CAAAGCCTTA GCATTAAGAA GGAAACTTAA GGAGCTTGGA 1260ATAAGAGAGG AGGAGAAGCC TAAAGTTGAA ATTGAAGAAG AGGAAGAAGA GGAAGAAAAG 1320ACCGAAGAAG AAAAAGAGGA AATAGAAGAA AAACCCGAAG AAGAGAAAGA AGAGGAGAAG 1380AAAGAAAAGG AAAAGCCAAA GAAAGGCAAA CAAGCAACTC TCTTTGACTT TCTTAAAAAG 1440TGATTACCCT TTTTCTTCTA TTAGAGCTCC GAATAAAGTT GGCCCTCTAA TTTTTTCTAT 1500TGTCTCCTCC ACATTAATCT TTACGAATTC GAGCTCCAGC AACAACAATA ACCCAAGATG 1560GAAAGGACTT TGGAGTAAGG TACTTTGGAT TACCGGCAGG TCATGAGTTC GCAGCATTCT 1620TAGAGGACAT TGTGGATGTT AGTAGAGAAG AAACAAACCT TATGGACGAG ACAAAACAGG 1680CCATCAGAAA CATAGACCAG GATGTAAGAA TATTGGTGTT TGAAACTCCA ACATGCCCAT 1740ACTGTCCACT TGCCGTTAGA ATGGCTCACA AGTTTGCCAT TGAAAACACA AAAGCTGGGA 1800AAGGTAAGAT ACTTGGGGAT ATGGTCGAGG CCATTGAGTA TCCAGAGTGG GCTGACCAGT 1860ACAATGTAAT GGCAGTACCA AAAATTGTTA TTCAGGTCAA CGGAGAAGAC AGAGTAGAAT 1920TTGAAGGAGC TTATCCAGAG AAAATGTTCT TAGAGAAGTT ACTCTCAGCT CTCAGCTGAT 1980CTACTGTTTT TCCTTCTTTT CTTCTGTTCT GTTATTGCCT AGGATAAGCT TAATAATACT 2040TTGATACCTT TCTTAGTTTA GGTGTGTGAG AGTATGAGCG AAGAGATTAG AGAAGTTAAG 2100GTTCTAGAAA AACCCTGGGT TGAGAAGTAT AGACCTCAAA GACTTGACGA CATTGTAGGA 2160CAAGAGCACA TAGTGAAAAG GCTCAAGCAC TACGTCAAAA CTGGATCAAT GCCCCACCTA 2220CTCTTCGCAG GCCCCCCTGG TGTCGGAAAG ACTACAGCGG CTTTGGCCCT TGCAAGAGAG 2280CTTTTCGGCG AAAACTGGAG GCATAACTTC CTCGAGTTGA ATGCTTCAGA TGAAAGAGGT 2340ATAAACGTAA TTAGAGAGAA AGTTAAGGAG TTTGCGAGAA CAAAGCCTAT AGGAGGAGCA 2400AGCTTCAAGA TAATTTTCCT TGATGAGGCC GACGCTTTAA CTCAAGATGC CCAACAAGCC 2460TTAAGAAGAA CCATGGAAAT GTTCTCGAGT AACGTTCGCT TTATCTTGAG CTGTAACTAC 2520TCCTCCAAGA TAATTGAACC CATACAGTCT AGATGTGCAA TATTCCGCTT CAGACCTCTC 2580CGCGATGAGG ATATAGCGAA GAGACTAAGG TACATTGCCG AAAATGAGGG CTTAGAGCTA 2640ACTGAAGAAG GTCTCCAAGC AATACTTTAC ATAGCAGAAG GAGATATGAG AAGAGCAATA 2700AACATTCTGC AAGCTGCAGC AGCTCTAGAC AAGAAGATCA CCGACGAAAA CGTATTCATG 2760GTAGCGAGTA GAGCTAGACC TGAAGATATA AGAGAGATGA TGCTTCTTGC TCTCAAAGGC 2820AACTTCTTGA AGGCCAGAGA AAAGCTTAGG GAGATACTTC TCAAGCAAGG ACTTAGTGGA 2880GAAGATGTAC TAGTTCAGAT GCACAAAGAA GTCTTCAACC TGCCAATAGA GGAGCCAAAG 2940AAGGTTCTGC TTGCTGATAA GATAGGAGAG TATAACTTCA GACTCGTTGA AGGGGCTAAT 3000GAAATAATTC AGCTTGAAGC ACTCTTAGCA CAGTTCACCC TAATTGGGAA GAAGTGATGA 3060AGTATGCCAG AGCTTCCCTG GGTAGAAAAA TACAGGCCAA AAAAGTTAAG TGAAATTGTA 3120AACCAAGAAG AGGCTATAGA GAAAGTTAGA GCGTGGATAG AGAGCTGGTT GCATGGCCAC 3180CCCCCTAAGA AAAAAGCCGT ATTATTAGCA GGACCCCCAG GGAGCGGAAA GACAACCACA 3240GTCTACGCTC TAGCAAATGA GTACAACTTT GAAGTCATTG AGCTCAACGC GAGTGATGAG 3300AGAACTTATG AAAAAATCTC CAGGTATGTT CAAGCAGCAT ACACTATGGA TATCCTCGGA 3360AAGAGGAGGA AGATAATCTT CCTCGATGAA GCAGATAATA TAGAGCCCAG CGGAGCTAAG 3420GAAATCGCAA AACTAATTGA TAAGGCCAAA AATCCAATAA TAATGGCTGC AAATAAGTAC 3480TGGGAAGTTC CAAAAGAGAT CCGAGAAAAA GCTGAGCTAG TAGAGTACAA GAGGTTAACC 3540CAGAGAGATG TAATGAATGC CTTAATAAGG ATCC                             3574序列号：84序列长度：33序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TACTTGTAAT ATTCTCATAT GATTGGCTCA ATA                                33序列号：85序列长度：35序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACTGGCGTAA TCATG                              35序列号：86序列长度：25序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC                      25序列号：87序列长度：23序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GCGTACCTTT GTCTCACGGG CAA                        23序列号：88序列长度：22序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GATAGCTGTC GTCATAGGAC TC                         22序列号：89序列长度：23序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：CTTAACCAGT GCGCTGAGTG ACT                       23序列号：90序列长度：28序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：GACAATCTGG AATACGCCAC CTGACTTG                  28序列号：91序列长度：28序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TTGCCACTTC CGTCAACCAG GCTTATCA                  28序列号：92序列长度：29序列类型：核酸链数：单链拓朴学：直链序列的种类：其它核酸(合成DNA)序列：TGTCCGTCAG CTCATAACGG TACTTCACG                 29

Claims (18)

1.耐热性DNA聚合酶相关因子，它能促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性。
2.权利要求1的DNA聚合酶相关因子，它还具有与DNA聚合酶结合的活性。
3.权利要求2的DNA聚合酶相关因子，它具有与DNA聚合酶结合的活性，该DNA聚合酶含有具有序列表的序列号5或6中所示氨基酸序列的DNA聚合酶组成蛋白质。
4.权利要求1～3任一权项中的DNA聚合酶相关因子，它含有选自序列表的序列号1，3，19，27，34，64，70和80中的至少一种氨基酸序列，或者含有该碱基序列中有1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列。
5.编码DNA聚合酶相关因子的基因，该DNA聚合酶相关因子具有促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的活性，它含有选自序列表的序列号1，3，19，27，34，64，70和80中的至少一种氨基酸序列，或者含有该碱基序列中有1个以上的氨基酸发生了置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列。
6.权利要求5的基团，它含有选自序列表的序列号2，4，18，26，33，63，69和79中的至少一种碱基序列，或含有该碱基序列中有1个以上的碱基发生了置换、缺失、添加或插入的碱基序列。
7.编码DNA聚合酶相关因子的基团，能与权利要求5或6中的基因进行杂交，且具有促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的活性。
8.DNA聚合酶相关因子的制备方法，其特征在于其工序如下：培养含有权利要求5-7任一权项中基因的转化体，从该培养物中获取能促进DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的耐热性DNA聚合酶相关因子。
9.使用DNA聚合酶合成DNA的方法，其特征在于在权利要求1-4任一权项中的DNA聚合酶相关因子存在的条件下合成DNA。
10.权利要求9的DNA合成方法，它是在2种以上的DNA聚合酶相关因子存在的条件下合成DNA。
11.权利要求10的DNA合成方法，它是在F7、PFU-RFC和PFU-RFCLS作为DNA聚合酶相关因子存在的条件下合成DNA。
12.权利要求9-11任一权项中的DNA合成方法，其中DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。
13.权利要求12的DNA合成方法，它通过PCR来实施。
14.试管内合成DNA试剂盒，它含有权利要求1-4任一权项中的DNA聚合酶相关因子和DNA聚合酶。
15.权利要求14的试剂盒，它还含有进行DNA合成反应所必要的试剂。
16.权利要求14或15的试剂盒，它含有2种以上的DNA聚合酶相关因子。
17.权利要求16的试剂盒，它所含有的DNA聚合酶相关因子是F7、PFU-RFC和PFU-RFCLS。
18.权利要求14-17任一权项中的试剂盒，它所含有的DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。
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