KR20010014211A - 디엔에이 폴리머라아제 관련인자 - Google Patents

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Abstract

DNA 폴리머라아제의 DNA 합성활성을 촉진하는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자; DNA 폴리머라아제에 결합되는 활성을 갖는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자 및 이의 제조방법; 상기 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자; DNA 폴리머라아제가 상기의 DNA 폴리머라아제 관련 인자의 존재하 사용되는 DNA 의 합성방법; 및 상기 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하는 키트. 이러한 DNA 폴리머라아제 관련 인자의 사용으로 통상의 것보다 우수한 DNA 합성 시스템 및 DNA 증폭 시스템 in vitro 를 제공할 수 있다.

Description

디엔에이 폴리머라아제 관련인자{DNA POLYMERASE-RELATED FACTORS}
DNA 폴리머라아제는 유전자공학용 시약으로 유용한 효소로서, DNA 염기서열결정, DNA 의 표지, 부위특이적 변이도입 등에 널리 이용되고 있다. 또한, 최근에는 폴리머라아제 체인 반응 (PCR) 법의 개발에 의해 내열성 DNA 폴리머라아제가 주목을 받고 있으며, PCR 법에 적합한 여러 가지 DNA 폴리머라아제가 개발되어 상품화되고 있다.
현재 알려져 있는 DNA 폴리머라아제는, 그 아미노산서열의 공통성에서 크게 4 개의 패밀리로 분류할 수 있으며, 그 중에서도 패밀리 A (폴Ⅰ형 효소) 와 패밀리 B (α형 효소) 가 대다수를 차지하고 있다. 각각의 패밀리에 속하는 DNA 폴리머라아제는 대체로 유사한 생화학적 특성을 갖고 있는데, 상세히 비교하면 개개의 효소에 따라 기질특이성, 기질상동체의 받아들임 효율, 프라이머 신장성 및 신장속도, DNA 합성의 양식, 엑소누클레아제 활성의 부수, 온도, pH 등의 가장 적합한 반응조건, 저해제에 대한 감수성 등에 대해 상이한 성질을 갖고 있다. 따라서, 지금까지는 입수가능한 DNA 폴리머라아제중에서 용도에 가장 적합한 성질을 갖는 것을 선택하여 사용해 왔다.
초호열성 고세균인 피로코커스 프리오서스 (Pyrococcus furiosus) 는 α형에 속하는 DNA 폴리머라아제를 생산하고 있으며, 이미 그 유전자도 단리되어 있다 [Nucleic Acids Reaserch, Vol.21, p.259 ∼ 265 (1993)].
DNA 폴리머라아제에는 상기한 폴Ⅰ형 효소, α형 효소 등과 같이 일종의 효소단백질만으로 그 기능을 발현하는 것 외에 다수의 서브유닛단백질로 이루어지는 올리고머효소가 알려져 있다. 또한, DNA 폴리머라아제로서 기능하는 단백질 외에 그 기능을 조절하는 단백질분자가 공존하는 경우가 있음도 알려져 있다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진하는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자 및 DNA 폴리머라아제에 결합되는 활성을 갖는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 유전자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 폴리머라아제를 사용하는 DNA 의 합성방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하는 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명에 의해 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 이용함으로써, 종래보다 뛰어난 시험관내 DNA 합성 그리고 DNA 증폭계가 제공된다.
최근, 지금까지 알려져 있는 DNA 폴리머라아제와는 구조적인 유사가 전혀 없는 신규한 DNA 폴리머라아제가 본 발명자들에 의해 피로코커스 프리오서스로부터 발견되었다 (국제공개 제 87/24444 호 팜플렛). 이 DNA 폴리머라아제는 2 종의 신규 단백질이 복합체를 형성하여 DNA 폴리머라아제 활성을 발현한다. 또한, 상기 효소는 강한 3' →5' 엑소누클레아제 활성과 뛰어난 프라이머 신장활성을 나타내며, 예컨대 상기 효소를 PCR 로 사용한 경우에는 20 kb 나 되는 길이의 DNA 단편을 증폭할 수 있다. 이 피로코커스 프리오서스 유래의 신규 DNA 폴리머라아제에 대해서는 적어도 2 종의 단백질이 효소활성에 필수적인 구성요소이나, 그 외에도 상기 효소의 구성단백질이 존재하거나 혹은 상기 효소의 활성에 영향을 미치는 인자가 존재하는지의 여부는 명확하지 않다.
본 발명자들은 예의 연구한 결과, 상기한 피로코커스 프리오서스 유래의 신규 DNA 폴리머라아제에 결합하는 단백질을 단리하는 데 성공하였다. 그리고, 그 유전자를 클로닝하여 상기 단백질의 유전자공학적인 생산을 가능하게 하며, 그리고 상기 단백질이 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시킴을 발견하였다.
본 발명의 요지는 (1) DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자, (2) DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 더욱 갖는 상기 (1) 에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자, (3) 서열표의 서열번호 : 5 또는 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 DNA 폴리머라아제 구성 단백질을 함유하는 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 상기 (2) 에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자, (4) 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종의 아미노산서열 또는 상기 아미노산서열에 있어서 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산서열을 함유하여 이루어지는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자, (5) 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종의 아미노산서열 또는 이 아미노산서열에 있어서 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 혹은 삽입된 아미노산서열을 함유하고, DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자, (6) 서열표의 서열번호 : 2, 4, 18, 26, 33, 63, 69 및 79 로 이루어지는 군에서 선택된 염기서열 또는 이 염기서열에 있어서 1 개 이상의 염기가 치환, 결실, 부가 혹은 삽입된 염기서열을 함유하여 이루어지는 상기 (5) 에 기재된 유전자, (7) 상기 (5) 또는 (6) 에 기재된 유전자와 하이브리다이즈하고 또한 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 DNA, (8) 상기 (5) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 유전자를 함유시킨 형질전환체를 배양하고, 이 배양물로부터 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자를 채택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 관련인자의 제조방법, (9) 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 를 합성하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제를 사용하는 DNA 의 합성방법, (10) 2 종 이상의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 를 합성하는 상기 (9) 에 기재된 DNA 의 합성방법, (11) DNA 폴리머라아제 관련인자로서 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 의 존재하에 DNA 의 합성을 실시하는 상기 (10) 에 기재된 DNA 합성방법, (12) DNA 폴리머라아제가 내열성 DNA 폴리머라아제인 상기 (9) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 DNA 의 합성방법, (13) PCR 법에 의해 실시되는 상기 (12) 에 기재된 DNA 의 합성방법, (14) 시험관내 DNA 합성에 사용되는 키트로서, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자 및 DNA 폴리머라아제를 함유하여 이루어지는 키트, (15) 그리고, DNA 합성반응에 필요한 시약을 함유하여 이루어지는 상기 (14) 에 기재된 키트, (16) 2 종 이상의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하여 이루어지는 상기 (14) 또는 (15) 에 기재된 키트, (17) DNA 폴리머라아제 관련인자로서 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 를 함유하여 이루어지는 상기 (16) 에 기재된 키트, (18) DNA 폴리머라아제로서, 내열성 DNA 폴리머라아제를 함유하여 이루어지는 상기 (14) ∼ (17) 에 기재된 키트에 관한 것이다.
본 발명은 DNA 폴리머라아제 관련인자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 유전자공학용 시약으로 유용한 DNA 폴리머라아제 관련인자 및 그 제조방법 그리고 이것을 코드하는 유전자 등에 관한 것이다.
도 1 은 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체칼럼에 의해 단리된 7 종의 단백질 (F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7) 의 SDS-PAGE 를 나타내는 도면이다. SDS-PAGE 상에서의 분자량은 F1 ∼ F7 의 순으로 약 55 kDa, 24 kDa, 37 kDa, 19.5 kDa, 27 kDa, 64kDa, 33kDa 이다.
도 2 는 F1 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pF1-4-10 의 삽입 DNA 단편의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 3 은 F1 단백질의 5' →3' 엑소누클레아제 활성을 나타내는 도면이다.
도 4 는 F1 단백질의 3' →5' 엑소누클레아제 활성을 나타내는 도면이다.
도 5 는 F2 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pF2172Nh 의 삽입 DNA 단편의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 6 은 F7 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pF7-1-8 의 삽입 DNA 단편의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 7 은 F7 단백질 첨가시의 DNA 폴리머라아제의 프라이머 신장활성을 나타내는 오토라디오그램이다.
도 8 은 F7 단백질 첨가시의 DNA 폴리머라아제의 보다 고분자의 프라이머 신장반응물에 대한 프라이머 신장활성을 나타내는 오토라디오그램이다.
도 9 는 PFU-RFC 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pRFS254NdB 의 삽입 DNA 단편의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 10 은 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체 칼럼에 의해 분리된 단백질 (F7) 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타내는 도면이다. SDS-PAGE 상에서의 F7 의 분자량은 약 33 kDa 로 추정된다.
도 11 은 Pfu DNA 폴리머라아제 그리고 Pfu DNA 폴리머라아제와 F7 의 혼합물을 겔 여과하여 얻어진 용출액에 대하여 DNA 폴리머라아제 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는 PFU-RFCLS 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pRFLSNh 의 삽입 DNA 단편의 제한효소지도이다.
도 13 은 피로코커스 프리오서스 게놈 DNA 상의 F5 단백질을 코드하는 유전자 주변의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 14 는 항 PFU-RFC 항체 칼럼에 의해 단리된 3 종의 단백질 (PFU-RFCLS, PFU-RFC, F7) 의 SDS-PAGE 의 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는 F7 또는 RFC-N 복합체 첨가시의 DNA 폴리머라아제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 16 은 PFU-RFCLS 및 PFU-RFC 를 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pRFC 10 의 삽입 DNA 단편의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 17 은 F7 또는 F7 및 rRFC-M 복합체 첨가시의 DNA 폴리머라아제 활성을 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
1. 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자
본 명세서에 있어서「DNA 폴리머라아제 관련인자」란, DNA 폴리머라아제와 공존시킴으로서 DNA 폴리머라아제의 기능에 영향을 미치는 인자를 의미하고, 구체적으로는 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 작용을 갖는 인자, DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 인자, 나아가서는 양활성을 갖는 것 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 내열성 단백질이며, 예컨대 80 ℃, 15 분간의 열처리에 대해서도 안정하다. 따라서, 내열성 DNA 폴리머라아제를 사용한 고온조건하에서의 DNA 합성반응에도 사용할 수 있다.
(a) DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 DNA 폴리머라아제 관련인자.
DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 DNA 폴리머라아제 관련인자로서는, DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니나, 예컨대 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종에 나타나는 아미노산서열의 전부 또는 일부를 함유하는 단백질, 이들의 서열에 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 함유하고 또한 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성을 갖는 기능적 동등물을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의「1 개 이상」이란, 1 개 또는 여러 개 혹은 그 이상의 개수를 말한다. 또한「기능적 동등물」이란, 구조적으로 차이가 있어도 그 기능이나 활성에 대하여 실질적으로 동등한 것을 말하며, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 범위내에 포함된다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자가 그 활성을 촉진시키는 DNA 폴리머라아제로서는 특별히 한정이 없으며, 예컨대 내열성 DNA 폴리머라아제, 특히 초호열균 유래의 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 구체적으로는 피로코커스 프리오서스 유래의 DNA 폴리머라아제 (후술하는 Pfu 폴리머라아제 C 등) 를 들 수 있다. Pfu 폴리머라아제 C 는 후술하는 바와 같이 서열표의 서열번호 : 5 및 서열번호 : 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 DNA 폴리머라아제 구성 단백질을 함유하는 효소이다.
또한 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 특정의 DNA 폴리머라아제의 활성만을 촉진시키는 것이어도 되는데, 기원을 달리 하는 복수종의 DNA 폴리머라아제에 대하여 그 활성을 촉진시키는 것이 바람직하다.
DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성을 측정하는 방법으로서는, DNA 폴리머라아제의 DNA 합성활성 측정에 통상 사용되는 것이라면 특별히 한정이 없다. DNA 합성활성을 촉진시키는 활성은, 예컨대 신규 합성 DNA 쇄로의 표지누클레오티드 받아들임 활성을 측정할 때에 상기 인자를 첨가하고 상기 인자를 첨가하지 않은 경우의 활성과 비교함으로써 측정할 수 있다. 또한, 단위시간당 신규 합성 DNA 쇄의 쇄길이나 PCR 에 있어서의 증폭산물량을 통해 확인하는 방법 등을 들 수 있다. 상기 DNA 합성활성 측정방법으로서는 하퍼 앤드 로사 발행, D. R. Davis 편집의 DNA polymerase from Escherichia coli p.263 ∼ 276 (C. C. 리처드슨 저) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
그리고, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 복수의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 병용함으로써, 단독 사용에 비하여 공존하는 DNA 폴리머라아제에 보다 높은 DNA 폴리머라아제 활성을 발휘시킬 수도 있다.
(b) DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자.
DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자로서는, DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 것이라면 특별히 한정은 없다. 그리고, 본 명세서에 있어서의 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자란, DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 것 외에 다른 물질, 예컨대 다른 DNA 폴리머라아제 관련인자를 통해 간접적으로 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 것을 포함한다. 예컨대, 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종에 나타나는 아미노산서열의 전부 또는 일부를 함유하는 단백질, 이들의 서열에 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산서열을 함유하고 또한 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 기능적 동등물을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의「1 개 이상」이란, 1 개 또는 여러 개 혹은 그 이상의 개수를 말한다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자가 결합하는 DNA 폴리머라아제로서는 특별히 한정이 없으며, 예컨대 내열성 DNA 폴리머라아제, 특히 초호열균 유래의 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 구체적으로는 피로코커스 프리오서스 유래의 DNA 폴리머라아제 (Pfu 폴리머라아제 C 등) 를 들 수 있다. Pfu 폴리머라아제 C 에 대해서는 서열표의 서열번호 : 5, 서열번호 : 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 DNA 폴리머라아제 구성 단백질 중 어느 하나 또는 양측에 결합한다.
또한, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 특정의 DNA 폴리머라아제에 결합하는 것이어도 되지만, 기원을 달리 하는 복수종의 DNA 폴리머라아제에 대하여 결합하는 것이 바람직하다.
DNA 폴리머라아제로의 결합의 측정방법으로서는, 상기 인자와 DNA 폴리머라아제를 혼합하여 미변성 겔 전기영동, 겔 여과 등에 의해 분자량의 변화를 조사하는 방법, DNA 폴리머라아제를 고정화한 담체로의 상기 인자의 흡착을 조사하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 서열표의 서열번호 : 19 에 나타나는 아미노산서열로 이루어지는 DNA 폴리머라아제 관련인자는 엑소누클레아제 활성을 갖고 있다. 따라서, 서열번호 : 19 에 나타나는 아미노산서열로 이루어지는 DNA 폴리머라아제 관련인자는, DNA 복제, DNA 수복 등의 DNA 폴리머라아제의 작용에 관련된 기능을 갖는 단백질이라 생각된다. 그리고, 상기 DNA 폴리머라아제 관련인자의 기능적 동등물로서 서열표의 서열번호 : 19 에 나타나는 아미노산서열의 일부 혹은 이 서열에 1 개 이상의 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 아미노산서열을 함유하고, DNA 폴리머라아제 에 결합하는 활성을 가지며, 그리고 엑소누클레아제 활성을 마찬가지로 갖는 단백질 등도 DNA 폴리머라아제 관련인자로서 본 발명의 범위내이다. 본 명세서에 있어서의「1 개 이상」이란, 1 개 또는 여러 개 혹은 그 이상의 개수를 말한다.
그리고 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 설명에 있어서, 서열표의 특정의 서열번호에 나타나는 아미노산 서열의 각각 전부 또는 일부를 함유하는 단백질로 표시하였으나, 여기에서「1 개 이상」이란 1 개 또는 여러 개 혹은 그 이상의 개수를 말한다.
그리고 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 설명에 있어서, 서열표의 특정의 서열번호에 나타나는 아미노산서열의 각각 전부 또는 일부를 함유하는 단백질로 표시하였으나, 여기에서「함유하는 단백질」이란 다음과 같은 단백질을 의미하며, 이들도 본 발명의 범위내에 포함된다. 즉, 유전자공학적으로 단백질을 생산할 때에는 융합단백질로서 발현시키는 경우가 종종 있다. 예컨대, 목적단백질의 발현량을 증가시키기 위하여, N 말단에 다른 단백질 유래의 N 말단 펩티드쇄를 부가하거나, 목적단백질의 N 말단 또는 C 말단에 적당한 펩티드쇄를 부가하여 발현시키고 이 펩티드쇄에 친화성을 갖는 담체를 사용함으로써 목적단백질의 정제를 용이하게 하는 방법 등이 실시되고 있다. 본 발명에 있어서는 상기 융합단백질도 범위내에 포함된다.
2. 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자
(a) 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자의 성질
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자로서는, 상기한 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 것으로서 DNA 혹은 RNA 를 가르킨다. 구체적으로는 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종에 나타나는 아미노산서열의 전부 또는 그 일부 혹은 이들의 서열에 있어서 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산서열을 함유하며, 그리고 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성 또는 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자를 들 수 있다. 이와 같은 유전자로서는, 구체적으로 서열표의 서열번호 : 2, 4, 18, 26, 33, 63, 69 및 79 로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종에 나타나는 염기서열의 전부 또는 그 일부 혹은 이들의 서열에 있어서 1 개 이상의 염기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 함유하고, DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진하는 활성 또는 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의「1 개 이상」이란 1 개 또는 여러 개 혹은 그 이상의 개수를 말한다. 본 명세서에서는 또한 이들 본 발명의 유전자의 DNA 와 하이브리다이즈하고 또한 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성 또는 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자를 들 수 있다.
본 명세서에 기재된「(어느 유전자에) 하이브리다이즈하는 유전자」란, 어느 유전자의 DNA 에 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로 이루어지는 유전자를 말하며, 이 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자이다. 어느 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자는, 여기에 코드되어 있는 단백질의 아미노산서열, 그리고 상기 단백질이 갖고 있는 기능도 유사할 가능성이 높다. 유전자의 염기서열의 유사성은 양유전자의 DNA 또는 그 일부끼리가 엄격한 조건에서 하이브리드를 형성하는 (하이브리다이즈하는) 지의 여부에 따라 조사할 수 있으며, 이것을 이용하여 어느 유전자가 코드하는 단백질과 동일한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 취득할 수 있다. 즉, 본 발명에서 얻어진 유전자의 DNA 또는 그 일부를 프로브를 사용하여 공지의 방법으로 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 본 발명의 어느 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 본 발명의 다른 유전자를 취득할 수 있다. 하이브리다이제이션은, 예컨대 1989 년, 콜드 스프링 하버 래버러토리 발행, T. Maniatis 등 편집, Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed. 에 기재된 방법 등에 의해 실시할 수 있다.
여기서「엄격한 조건」이란, 비특이적인 하이브리다이제이션이 일어나지 않는 조건으로서, 구체적으로는 예컨대 다음 조건을 들 수 있다. 즉, DNA 를 고정한 멤브레인을 0.5 % SDS, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 폴리비닐피롤리돈, 0.1 % 피콜 400, 0.01 % 변성 연어정자 DNA 를 함유하는 6 ×SSC (1 ×SSC 는 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산나트륨, pH 7.0 을 나타낸다) 중에서 50 ℃ 에서 12 ∼ 20 시간, 표지 DNA 프로브와 함께 인큐베이트한다. 인큐베이션종료후, 0.5 % SDS 를 함유하는 2 ×SSC 중 37 ℃ 의 조건에서의 세정으로부터 시작하여 SSC 농도는 0.1 ×SSC 까지의 범위에서 또한 온도는 50 ℃ 까지의 범위에서 변화시키고, 고정된 표지 DNA 프로브 유래의 시그널이 백 그라운드와 구별할 수 있게 될 때까지 멤브레인을 세정한다.
또한, 하이브리다이제이션 대신에 본 발명의 유전자의 염기서열의 일부를 프라이머에 사용하는 유전자 증폭법, 예컨대 PCR 법을 이용할 수 있다. PCR 의 조건은 프라이머 DNA 또는 주형 DNA 의 서열 등에 의해 적절히 설정하면 된다. 이렇게 얻어진 유전자가 목적하는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 것인지의 여부는 상기 유전자에 코드되는 단백질을 적당한 숙주와 발현계를 이용하여 발현시키고, 얻어지는 단백질의 활성을 확인함으로써 조사할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 아미노산서열 혹은 염기서열에 1 개 이상의 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 아미노산서열 혹은 염기서열을 인위적으로 제작하는 방법으로서는, 예컨대 1989 년, 콜드 스프링 하버 래버러토리 발행, T. Maniatis 등 편집, Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed. 등에 기재된 여러 가지 유전자공학적수단을 들 수 있으며, 구체적으로는 부위특이적 변위도입법, 카세트변이법 등의 유전자공학적수단을 들 수 있다. 상기 부위특이적 변이도입법에 의하면, 1 개 혹은 여러 개의 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 아미노산서열 혹은 염기서열을 제작할 수 있다. 또한 상기 카세트변이법에 의하면, 상기 부위특이적 변이도입법에 의해 얻어진 서열에 비하여 보다 큰 영역의 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 아미노산서열 혹은 염기서열을 제작할 수 있으며, 이와 같은 개량체도 기능적으로 동등한 한, 본 발명의 범위내이다. 그리고, 유전자공학적인 단백질의 생산에 있어서 목적하는 단백질을 코드하는 본래의 유전자상에서 사용되고 있는 코돈이 숙주중에서는 사용빈도가 낮았던 것인 경우에는, 단백질의 발현량이 낮은 경우가 있다. 이와 같은 경우에는 코드되어 있는 아미노산서열에 변화를 부여하지 않고 코돈을 숙주로 계용되는 것으로 인위적으로 변환함으로써, 목적단백질의 고발현을 도모하는 것이 실시되고 있다 (예컨대, 일본 특허공보 평7-102146 호).
(b) 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자의 클로닝
얻어진 클론의 해석, 발현산물인 DNA 폴리머라아제 관련인자의 이화학성질, 기능의 해명 등에 대하여 다음에 상세하게 설명한다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 상기한 바와 같이 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진하는 작용 또는 상기 인자가 DNA 폴리머라아제에 결합하는 성질을 갖고 있다. 따라서, 이들 작용을 지표로 하여 상기 인자를 취득할 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 취득에 이용되는 DNA 폴리머라아제로서는 특별히 한정이 없으나, 예컨대 피로코커스 프리오서스가 생산하는 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 피로코커스 프리오서스가 생산하는 DNA 폴리머라아제로서는, 예컨대 피로코커스 프리오서스 (Pyrococcus furiosus) DSM 3638 주 유래의 서열표의 서열번호 : 5 및/또는 서열번호 : 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 DNA 폴리머라아제 구성 단백질을 함유하는 효소를 사용할 수 있다.
그리고, 본 명세서에 있어서는 마찬가지로 프로코커스 프리오서스에서 발견된 α형 DNA 폴리머라아제 [Pfu DNA 폴리머라아제, Nucleic Acids Research, Vol.21, p.259 ∼ 265 (1993)] 와 구별되기 때문에, 이 효소를 Pfu 폴리머라아제 C 라 기재한다. 상기 효소를 코드하는 유전자는 플라스미드 pFU1001 에 함유되어 있으며, 또한 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 의 형질전환체는 Escherichia coli JM109/pFU1001 라 명명, 표시되어 1995 년 8 월 11 일 (원기탁일) 부터 부다페스트조약하에서 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반 3 고 (우편번호 305-8566) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-5579 로서 기탁되어 있다. 따라서, Pfu 폴리머라아제 C 는 상기 형질전환체를 배양하며, 얻어진 배양물에서 정제를 실시하여 얻을 수 있다. 그리고, 상기 Pfu 폴리머라아제 C 는 서열표의 서열번호 : 5 및 서열번호 : 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 DNA 폴리머라아제 구성 단백질을 함유하는 효소이다.
Pfu 폴리머라아제 C 는 다음에 나타내는 바와 같은 성질을 갖는 효소이다.
(A) 1 개쇄의 주형 DNA 에 프라이머가 어닐링한 복합체를 기질로 하여 폴리머라아제 활성을 측정한 경우에, 활성화 DNA 를 기질로 한 경우에 활성화 DNA 를 기질로 한 경우에 비하여 높은 활성을 나타낸다.
(B) 3' →5' 엑소누클레아제 활성을 갖는다.
(C) γ-DNA 를 주형으로 한 폴리머라아제 체인 반응 (PCR) 반응을 다음 조건으로 실시한 경우, 다른 효소를 첨가하지 않고 약 20 킬로 염기쌍의 DNA 단편을 증폭할 수 있다.
PCR 의 조건 :
a) 반응액 조성 : 10 mM 트리스-염산 (pH 9.2), 3.5 mM MgCl2, 75 mM KCl, 각각 400 μM 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 0.01 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100, 5.0 ng / 50 ㎕ γ-DNA, 10 pmole / 50 ㎕ 프라이머 γ1 (서열표의 서열번호 : 58) 및 프라이머 γ11 (서열표의 서열번호 : 59), 3.7 단위 / 50 ㎕ DNA 폴리머라아제를 포함한다.
b) 반응조건 : 98 ℃, 10 초 ∼ 68 ℃, 10 분을 1 사이클로 한 30 사이클의 PCR 을 실시한다.
(D) SDS-PAGE 상에서 약 90,000 달톤, 약 140,000 달톤에 상당하는 2 종의 DNA 폴리머라아제 구성 단백질로 이루어진다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 취득하는 방법은 특별히 한정은 없으나, 예컨대 상기 Pfu 폴리머라아제 C 등의 DNA 폴리머라아제를 적당한 담체에 고정화하고, 이것과 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하는 시료를 혼합하여 담체에 결합하지 않은 것을 제거한 후, 결합한 것을 용출시킴으로써 취득할 수 있다. DNA 폴리머라아제의 담체로의 고정화는 공지의 방법으로 실시할 수 있다. 또한 DNA 폴리머라아제에 대한 항체를 제작하고, 이것을 고정화한 담체를 이용하여 DNA 폴리머라아제를 고정하여도 된다. 예컨대, 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체를 제작하고, 이 항체를 이용하여 피로코커스 프리오서스 유래의 시료, 예컨대 피로코커스 프리오서스의 세포파쇄액으로부터 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 취득하고자 할 경우에는, 이와 같은 항체 고정화 담체를 사용하면 시료중의 Pfu 폴리머라아제 C 가 이 항체에 결합하기 때문에, 시료와 별도로 상기 Pfu 폴리머라아제 C 를 첨가할 필요가 없으므로 DNA 폴리머라아제 관련인자를 쉽게 정제할 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 취득에 사용하는 시료로서는 특별히 한정이 없으나, 예컨대 미생물 유래의 시료를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 피로코커스 프리오서스 DSM 3638 주 유래의 시료를 사용할 수 있다. 상기 균주는 도이체 자무룬크 폰 미크로오르가니스멘 운트 체르크루체우렌 Gmbh 로부터 입수할 수 있다. 상기 균주를 적당한 증식배지에서 배양하고, 배양물로부터 조제한 세포파쇄액을 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체 고정화 담체를 충전한 칼럼에 적용하면, Pfu 폴리머라아제 C 이외에 수종의 단백질이 칼럼에 흡착된다. 이들 단백질을 코드하는 유전자는 다음에 예시하는 공정에 의해 클로닝할 수 있다.
우선, 공지의 방법을 이용해서 상기 단백질을 단리하여 그 N 말단 아미노산서열을 결정하고, 이것을 참고로 프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위한 합성 올리고누클레오티드를 제작한다. 이어서, 이 합성 올리고누클레오티드를 프라이머에 사용하고, 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 을 실시함으로써, 목적하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 취득할 수 있다. PCR 의 조건은 적절히 설정하면 된다. 혹은 상기 올리고누클레오티드를 프로브에 사용한 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 로부터 목적하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 취득할 수 있다. 이 경우, 하이브리다이제이션으로서는 적당한 제한효소로 소화한 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 를 사용하는 서던하이브리다이제이션, 이 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 의 유전자 라이브러리를 사용한 콜로니하이브리다이제이션, 플라크하이브리다이제이션, 도트하이브리다이제이션 등을 사용할 수 있다.
이렇게 얻어진 DNA 단편은 목적하는 유전자 전체길이를 포함하고 있지 않은 경우에는 얻어진 DNA 단편의 염기서열을 참고로 하여 새로운 프라이머를 제작하며, 그리고 PCR 을 실시하거나 또는 얻어진 DNA 단편 혹은 그 일부를 프로브에 사용한 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 목적하는 유전자 전체길이를 얻을 수 있다.
상기한 PCR 이나 하이브리다이제이션 조작은, 예컨대 특별히 한정이 없지만, 1989 년, 콜드 스프링 하버 래버러토리 발행, T. Maniatis 등 편집, Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed. 를 참고로 실시할 수 있다.
피로코커스 프리오서스 DSM 3638 주의 세포파쇄액을 상기한 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체 고정화 담체와 혼합한 경우, 상기 담체에는 Pfu 폴리머라아제 외에 7 종의 단백질이 흡착된다. 그 중 6 종류에 대해서는 본 발명에 있어서 그 유전자가 상기한 조작에 의해 단리되어 있다. 이들 단백질은 각각 F1, F2, F3, F4, F5 및 F7 이라 명명되어 있으며, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 구체예이다. 이들을 코드하는 유전자의 오픈리딩프레임의 염기서열을 각각 서열표의 서열번호 : 18, 26, 79, 33, 69 및 2 에 나타낸다. 또한, 이들 염기서열로부터 추정되는 각 단백질의 아미노산서열을 각각 서열표의 서열번호 : 19, 27, 80, 34, 70 및 1 에 나타낸다.
클로닝한 유전자를 적당한 숙주, 예컨대 대장균에 도입함으로써 그 곳에 코드되는 단백질을 발현시킬 수 있다. 예컨대, 상기한 F7 을 코드하는 유전자를 도입된 대장균 JM109 의 형질전환체는 Escherichia coli JM109/pF7-HH-18 이라 명명, 표시되어 1997 년 6 월 3 일 (원기탁일) 부터 부다페스트조약하에서 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반 3 고 (우편번호 305-8566) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-6338 로서 기탁되어 있다. 상기 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 F7 을 취득할 수 있다. 이렇게 얻어진 F7 은 상기 단백질의 단리에 사용된 Pfu 폴리머라아제 C 외에 피로코커스 프리오서스 유래의 α형 폴리머라아제 (Pfu DNA 폴리머라아제) 및 피로딕티움 오쿨툼(Pyrodictium occultum) 유래의 2 종의 DNA 폴리머라아제 [Jouranl of Bacteriology, Vol.177, p.2164 ∼ 2177 (1995)] 의 활성을 촉진시킴이 본 발명에서 밝혀졌다.
또한, 상기 F1, F2, F3, F4 및 F5 도 각각 Pfu 폴리머라아제 C 나 Pfu DNA 폴리머라아제의 활성을 촉진시킴이 밝혀졌다.
상기한 피로코커스 프리오서스 DSM 3638 주 유래의 단백질의 아미노산서열을 기지의 단백질의 아미노산서열과 비교한 경우, F1 은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 유래의 1 개쇄 DNA 특이적 엑소누클레아제 [Science, Vol.269, p.496 ∼ 512 (1995)] 와의 사이에 상동성을 갖고 있다. F3 는 마이코플라나 라모사 (Mycoplana ramosa) 유래의 아세틸폴리아민아미노하이드라아제 [Jouranl of Bacteriology, Vol.178, p.5781 ∼ 5786 (1996)] 및 인체의 히스톤데아세틸레아제 [Science, Vol.272, p408 ∼ 411 (1996)] 와의 사이에 상동성을 갖고 있다. 또한, F7 은 진핵생물의 DNA 복제에 관여하는 증식세포핵항원 (proliferating cell nuclear antigen : PCNA) [엠보 저널 (EMBO J.), Vol.11, p.5111 ∼ 5120 (1995) ; Nucleic Acids Reaserch, Vol.18, p.1363 ∼ 1381 (1990) ; 프로시딩스 오브 더 네셔널 아카데미 오브 사이언스 오브 더 USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol.84, p.1575 ∼ 1579 (1987)] 와의 사이에 상동성을 갖고 있다. F2, F4 및 F5 에 대해서는 기지의 단백질과의 상동성은 발견되지 않았다.
PCNA 는 복제인자 C (RFC, RF-C) 와 복합체를 형성하여 DNA 합성에 관여한다고 보고되어 있다 [생화학, Vol.68, p1542 ∼ 1548 (1996)]. 따라서, 히로코커스 프리오서스에 있어서도 RFC 에 상당하는 단백질이 발현되며, 상기 F7 과 함께 DNA 합성반응에 관여하고 있음이 기대된다. 이 단백질을 취득하여, 예컨대 상기 F7 과 함께 DNA 폴리머라아제의 반응계에 첨가함으로써, 더욱 뛰어난 DNA 폴리머라아제 활성 촉진효과를 얻을 수 있다. 히로코커스 프리오서스의 RFC 동족체를 코드하는 유전자는 다음에 나타내는 공정으로 취득할 수 있다.
고세균 (Methanococcus jannaschii) 염색체 DNA 의 전염기서열은 이미 해명되어 있으며 [Science, Vol.273, p.1058-1073 (1996)], 상기 염기서열에는 PCNA 및 RFC 의 동족체라 생각되는 단백질을 코드하는 유전자가 포함되어 있다. 상기 균주의 RFC 소서브유닛 및 대서브유닛의 동족체의 유전자 그리고 기지의 RFC 소서브유닛 유전자가 코드하고 있는 아미노산서열 [Nucleic Acids Reaserch, Vol.21, p.1 ∼ 3 (1993) ; Nucleic Acids Reaserch, Vol.22, p.1527 ∼ 1535 (1994)] 을 비교하여 상동성이 높은 아미노산서열을 조사하고, 이것을 참고로 RFC 소서브유닛 및 대서브유닛을 코드하는 유전자단편을 취득하기 위한 프라이머 또는 프로브로 사용하는 합성 올리고누크레오티드를 제작할 수 있다. 계속해서 상기 올리고누클레오티드를 사용하고, 상기 F1 ∼ F7 을 코드하는 유전자의 취득에 사용된 조작에 의해, 예컨대 피로코커스 프리오서스 유래의 RFC 소서브유닛의 동족체인 PFU-RFC 를 코드하는 유전자 및 RFC 대서브유닛의 동족체인 PFU-RFCLS 를 코드하는 유전자를 취득할 수 있다.
이렇게 얻어진 PFU-RFC 를 코드하는 유전자의 염기서열을 결정하여 여기에 코드되어 있다고 추정되는 아미노산서열을 조사하고, 이것과 기지의 RFC 소서브유닛의 아미노산서열을 비교한 결과, 이 아미노산서열중에 개재서열 (intein) 이 존재하고 있음이 밝혀졌다.
상기 유전자에 의해 개재서열에 대응하는 영역을 제거함으로써, PFU-RFC 를 발현가능한 상태에서 포함하는 유전자를 취득할 수 있다. 상기 유전자중의 PFU-RFC 를 코드하는 영역의 오픈리딩프레임의 염기서열 및 이 염기서열로부터 추정되는 PFU-RFC 의 아미노산서열을 각각 서열표의 서열번호 : 4 및 3 에 각각 나타낸다. 또한, PFU-RFCLS 유전자중의 PFU-RFCLS 를 코드하는 오픈리딩프레임의 염기서열 및 그 곳에 코드되는 단백질의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 63 및 64 에 각각 나타낸다. 이들 양단백질도 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 구체예중 하나이다.
그리고, 상기 유전자를 사용하여 PFU-RFC 의 발현에 사용하기 위한 플라스미드를 구축할 수 있다. 이와 같은 발현플라스미드로서는 플라스미드 pRFS254SNc 가 있으며, 또한 상기 플라스미드가 도입된 대장균 JM109 의 형질전환체는 Escherichia coli JM109/pRFS254SNc 라 명명, 표시되어 1997 년 6 월 3 일 (원기탁일) 부터 부다페스트조약하에서 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반 3 고 (우편번호 305-8566) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-6339 로서 기탁되어 있다. 상기 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 PFU-RFC 를 취득할 수 있다. 상기 PFU-RFC 는 단독으로 DNA 폴리머라아제의 활성을 촉진하며, 그리고 상기한 F7 과 병용한 경우에는 각 단백질을 단독으로 첨가한 경우에 비하여 상승효과적인 촉진효과가 인정된다.
또한, PFU-RFC 유전자와 PFU-RFCLS 유전자 양측을 도입된 형질전환체를 제작함으로써, PFU-RFC 와 PFU-RFCLS 에 의해 형성된 복합체 (이하, holo-RFC 라 함. 또한, 특히 유전자공학적으로 생산된 holo-RFC 를 rRFC-M 복합체라 기재함.) 를 발현시킬 수 있다. 상기 복합체는 DNA 폴리머라아제 활성을 촉진하며, 특히 상기 F7 과 병용한 경우에 높은 효과를 나타낸다.
상기 PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 는 F7 과 혼합하여 사용함으로써, DNA 폴리머라아제 활성을 보다 촉진시킬 수 있다. 이 경우, 상기 holo-RFC (또는 rRFC-M 복합체) 와 F7 을 혼합하여 사용하여도 되고, 상기 PFU-RFC, PFU-RFCLS 및 F7 로 이루어지는 복합체 (RFC-N 복합체) 로서 사용하여도 된다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명에 의해 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진하는 DNA 폴리머라아제 관련인자 및 이 인자를 코드하는 유전자가 제공된다. 상기 인자는 그 유전자를 이용함으로써, 유전자공학적으로 생산할 수 있다. 그리고, 상기 유전자를 이용하여 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자와 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 취득할 수도 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자에는 상술한 바와 같이 DNA 합성반응에 관여함이 알려져 있는 단백질, 예컨대 진핵생물 유래의 PCNA, RFC 등의 단백질과의 사이에 상동성을 갖는 것이 포함되어 있다. 이들 PCNA, RFC 등의 단백질은 복합체를 형성하고, DNA 폴리머라아제 δ에 의한 DNA 합성반응에 관여한다고 알려져 있다 [생화학, Vol.68, p.1542 ∼ 1548 (1996)]. 그러나, 본 발명에 개시된 DNA 폴리머라아제 관련인자는 복합체 뿐만 아니라 각각 단독이나 DNA 폴리머라아제의 활성을 촉진하고 또한 DNA 폴리머라아제 δ와는 구조적으로 다른 DNA 폴리머라아제에도 효과를 나타낸다. 촉진할 수 있는 것으로서, DNA 폴리머라아제가 이용되는 여러 공정, 예컨대 DNA 염기서열의 결정, DNA 의 표지, PCR 에 의한 DNA 의 증폭 등에 이용할 수 있다. DNA 폴리머라아제의 반응계에 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 첨가함으로써, 특히 프라이머로부터 DNA 쇄를 신장하는 활성에 개선이 보인다. 또한, 상기 인자는 높은 열안정성을 갖고 있는 점에서 PCR, 특히 장쇄의 DNA 의 증폭이 요망되는 PCR 에 이용할 수 있다.
그리고, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자중 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 것은 DNA 폴리머라아제의 검출, 정제 등에 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 결합시킨 담체를 사용한 친화성 크로마토그래피를 실시함으로써, 상기 인자가 결합하는 DNA 폴리머라아제를 효율적으로 정제할 수 있다.
3. 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 제조방법
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 제조방법은, 본 발명의 유전자를 함유시킨 형질전환체를 배양하여 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 또는 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자를 상기 배양물로부터 채취하는 공정을 포함하는 것을 하나의 특징으로 한다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 제조방법에 있어서는, 단백질의 정제에 일반적으로 사용되는 방법을 적용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 DNA 를 발현벡터에 연결하여 발현벡터의 프로모터의 제어하에서 괴잉발현시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 DNA 와 관용 글루타티온리덕타아제, β-갈락토시다아제 등의 단백질을 코드하는 DNA 또는 히스티딘태그를 코드하는 DNA 를 연결시켜 융합단백질로서 발현시킴으로써, 본 발명의 유전자를 지지하는 형질전환체로부터의 상기 DNA 폴리머라아제 관련인자의 채취를 용이하게 할 수 있다. 상기 융합단백질은 통상 사용되는 니켈칼럼 등의 친화성 칼럼 크로마토그래피 등을 사용함으로써 쉽게 분리할 수 있다. 상기 융합단백질은 통상의 방법에 의해 글루타티온리덕타아제리덕타아제시다아제 등의 단백질로부터 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 분리할 수 있다.
또한 발현시킨 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는, 히로코커스 프리오서스로부터 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 취득하는 방법과 마찬가지로 Pfu 폴리머라아제 C 등의 DNA 폴리머라아제를 적당한 담체에 고정화하고, 이것과 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하는 시료를 혼합하여 담체에 결합하지 않은 것을 제거한 후에 결합한 것을 용출시킴으로써 얻을 수 있다.
4. DNA 의 합성방법
본 발명의 DNA 의 합성방법은, 상기 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 폴리머라아제를 사용하여 DNA 를 합성하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 본 발명의 DNA 의 합성에 있어서는 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 폴리머라아제를 사용하여 DNA 를 합성함으로써 약 20 kb 의 장쇄의 DNA 를 증폭할 수 있다.
본 발명의 DNA 의 합성방법에 사용되는 DNA 폴리머라아제 관련인자로서는 F1, F2, F3, F4, F5, F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 등을 들 수 있다. 본 발명의 DNA 의 합성방법에 있어서는 상기 DNA 폴리머라아제 관련인자는 단독 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용하여도 된다. 본 발명의 DNA 의 합성방법에 있어서는, 예컨대 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 3 종의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 사용함으로써, 종래의 DNA 합성방법으로 얻어지는 DNA 단편길이에 비하여 보다 긴 DNA 단편을 합성할 수 있다. 본 발명의 DNA 의 합성방법에 있어서는 상기 3 종의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 각각을 단독으로 혼합하여 사용하여도 되고, F7 과 PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 로 이루어지는 holo-RFC (rRFC-M 복합체) 의 2 종을 혼합해서 사용하여도 된다. 그리고, 상기 3 종의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 로 이루어지는 복합체 (RFC-N 복합체) 를 사용하여도 된다.
본 발명의 DNA 의 합성방법에 사용되는 DNA 폴리머라아제로서는, E.Coli 유래의 폴Ⅰ등의 DNA 폴리머라아제, 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 유래의 Tth DNA 폴리머라아제, 써머스 아쿠아티커스 (Thermus aquaticus) 유래의 Taq DNA 폴리머라아제, 피로코커스 프리오서스 유래의 Pfu DNA 폴리머라아제 등으로 대표되는 내열성 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다.
또한 본 발명의 DNA 의 합성방법에 있어서는, 상기 DNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR 법에 의해 DNA 를 합성할 수 있다.
본 발명의 DNA 의 합성방법에 있어서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 존재시키기 위한 사용량은 특별히 한정되지 않으며, DNA 폴리머라아제가 갖는 합성활성을 촉진하는 활성을 발휘시키는 데 충분한 양을 사용하면 된다.
5. 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하는 키트
본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 DNA 폴리머라아제가 사용되는 여러 반응에 이용할 수 있다. 따라서, 시험관내에서의 DNA 합성반응을 실시하기 위한 키트, 예컨대 디데옥시법에 의한 DNA 염기서열결정을 위한 키트, DNA 표지용 키트, PCR 키드 등에 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 첨가함으로써 이들 키트의 성능을 개선할 수 있다. 이와 같은 키트로서는 DNA 폴리머라아제와 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하는 것 외에, 예컨대 dNTP, MgCl2등의 DNA 폴리머라아제의 반응에 필요한 시약을 함유하고 있어도 된다. 본 발명의 키트에 함유되는 DNA 폴리머라아제 관련인자로서는 F1, F2, F3, F4, F5, F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 등을 들 수 있다. 본 발명의 키트에 있어서 상기 DNA 폴리머라아제 관련인자는 단독으로 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용하여도 된다. F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 3 종의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 3 종의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 각각을 단독으로 혼합하여 사용하여도 되고, F7 과 PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 로 이루어지는 holo-RFC (rRFC-M 복합체) 의 2 종을 혼합해서 사용하여도 된다. 그리고, 상기 3 종의 DNA 폴리머라아제 관련인자는 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 로 이루어지는 복합체 (RFC-N 복합체) 를 사용하여도 된다. 또한, 본 발명의 키트에 함유되는 DNA 폴리머라아제로서는 E.coli 유래의 폴Ⅰ형 DNA 폴리머라아제, 써머스 써모필러스유래의 Tth DNA 폴리머라아제, 써머스 아쿠아티커스유래의 Taq DNA 폴리머라아제, 피로코커스 프리오서스 유래의 Pfu DNA 폴리머라아제 등으로 대표되는 내열성 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 본 발명의 키트에 있어서는 내열성 DNA 폴리머라아제를 함유시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 키트를 상기 DNA 의 합성방법에 사용함으로써 보다 간편하게 고분자의 DNA 를 합성할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다.
실시예 1
(1) 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 의 조제
피로코커스 프리오서스 DSM 3638 의 배양은 다음과 같이 실시한다.
트립톤 1 %, 효모엑기스 0.5 %, 가용성전분 1 %, 쟈마린 S·솔리드 (쟈마린래버러토리사 제조) 3.5 %, 쟈마린S·리키드 (쟈마린래버러토리사 제조) 0.5 %, MgSO40.003 %, NaCl 0.001 %, FeSO4·7H2O 0.0001 %, CoSO40.0001 %, CaCl2·7H2O 0.0001 %, ZnSO40.0001 %, CuSO4·5H2O 0.1 ppm, KAl(SO4)20.1 ppm, H3BO30.1 ppm, Na2MoO4·2H2O 0.1 ppm, NiCl2·6H2O 0.25 ppm 의 조성의 배지를 2 ℓ용량의 배지병에 넣고, 120 ℃, 20 분간 살균한 후에 질소가스를 불어넣어 용존산소를 제거한 후, 얻어진 배지에 상기 균주를 접종하여 95 ℃, 16 시간 가만히 놓아두어 배양한다. 배양종료후, 원심분리에 의해 균체를 모은다.
이어서, 균체를 25 % 수크로스를 함유하는 0.05 M 트리스-염산 (pH 8.0) 4 ㎖ 에 현탁하고, 이 현탁액에 0.8 ㎖ 의 리조자임 [5 ㎎/㎖, 0.25 M 트리스-염산 (pH 8.0)], 2 ㎖ 의 0.2 M EDTA 를 첨가하여 20 ℃ 에서 1 시간 보온한 후, 24 ㎖ 의 SET 용액 [150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM 트리스-염산 (pH 8.0)] 을 첨가하며, 그리고 5 % SDS 4 ㎖, 프로테이나아제 K (10 ㎎/㎖) 400 ㎕ 를 첨가하여 37 ℃, 1 시간 반응시킨다. 반응종료후, 페놀-클로로포름 추출, 계속해서 에탄올침전을 실시하여 약 3.2 ㎎ 의 게놈 DNA 를 조제한다.
(2) 코스미드 DNA 래버러토리의 제작
피로코커스 프리오서스 DSM 3638 의 게놈 DNA 400 ㎍ 을 Sau3AⅠ으로 부분소화하고, 밀도구배 초원심법에 의해 35 ∼ 50 kb 에 사이즈분획한다. 이어서, 트리플헤릭스코스미드벡터 (스트라타진사 제조) 1 ㎍ 을 XbaⅠ소화한 후, 알칼리포스파타아제 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 탈인산화하며, 그리고 BamHⅠ 소화한 후, 상기 분획된 35 ∼ 50 kb 의 DNA 140 ㎍ 과 혼합한 후에 라이게이션반응을 실시한다. 얻어진 반응액과 가이거팩·골드 (스트라타진사 제조) 를 사용한 인·히드로·패키징법에 의해 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 의 단편을 갖는 코스미드를 람다퍼지입자중에 패키징하여 코스미드라이브러리를 조제한다. 이어서, 이 라이브러리의 일부를 사용하여 대장균 DH 5αMCR (BRL사 제조) 로 형질도입한다. 얻어진 형질전환체로부터 500 개 클론을 선택하여 각각 코스미드클론 No.1 ∼ No.500 으로 하며, 그리고 각각의 클론으로부터 코스미드 DNA 를 조제한다. 이들중 여러 개를 선택하여 제한효소소화를 실시하여 적당한 크기의 단편이 삽입되어 있음을 확인하였다.
(3) Pfu 폴리머라아제 C 유전자의 클로닝
반응액으로서 20 mM 트리스-염산 (pH 7.7), 2 mM MgCl2, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 0.2 ㎎/㎖ 활성화 DNA, 각각 40 μM 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 60 nM[3H]-dTTP (아마샤무사 제조) 를 준비한다. 상기한 코스미드 DNA 라이브러리의 각 클론 유래의 추출액 1 ㎕ 를 5 클론분 (5㎕) 을 상기 반응용액 45 ㎕ 에 첨가하여 75 ℃ 에서 15 분간 반응시킨 후, 얻어진 각 반응물로부터 각각 40 ㎕ 분을 DE 페이퍼에 스폿하여 5 % Na2HPO4로 세정을 5 회 실시하고, DE 페이퍼상에 남아 있는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. 5 클론을 1 그룹으로 하여 일차측정을 실시한다. 활성이 인정된 그룹은 계속해서 5 클론을 1 클론씩으로 나누고 이차측정을 실시한다. 코스미드 DNA 라이브러리중에 기지의 DNA 폴리머라아제 유전자를 함유하는 것은 미리 상기 유전자를 프로브로 한 하이브리다이제이션 테스트로부터 클론 No. 57, 154, 162 및 363 임을 알 수 있는 점에서 이들 이외의 클론으로 DNA 합성활성을 포함하는 클론으로서 No. 41, 153, 264, 462 및 491 의 5 클론을 얻는다.
상기 5 클론에 대하여 코스미드를 단리하여 각각을 BamHⅠ으로 분해하여 그 영동패턴을 조사해 보면 서로 공통되는 밴드가 몇개 보이며, 이 5 클론은 오버랩하면서 조금씩 어긋난 영역을 넣고 있음이 예상된다. 따라서, 클론 No. 264 및 491 의 삽입 DNA 단편에 대하여 제한효소지도를 제작한다. 얻어진 제한효소지도에 의거하여 클론 264 또는 491 유래의 코스미드로부터 10 킬로 염기쌍 전후의 여러 가지 DNA 단편을 잘라내서 pTV118N 또는 pTV119N 벡터 (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝한다. 얻어진 재조합 플라스미드를 유지하는 형질전환체에 대하여 내열성 DNA 폴리머라아제 활성을 측정한 결과, 약 10 킬로 염기쌍의 XbaⅠ-XbaⅠ단편에 강한 내열성 DNA 폴리머라아제를 생산하는 유전자가 있음이 판명되었다. 따라서, 상기 XbaⅠ-XbaⅠ단편이 pTV118N 벡터에 넣어진 것을 플라스미드 pFU1001 이라 명명하고, 이 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 Escherichia coli JM109/pFU1001 (FERM BP-5579) 이라 명명한다.
(4) Pfu 폴리머라아제 C 의 DNA 폴리머라아제 구성 단백질의 해석
상기 플라스미드 pFU1001 로부터 DNA 폴리머라아제 유전자를 함유하는 상기 XbaⅠ-XbaⅠ단편을 XbaⅠ으로 한번 더 잘라내고, DNA 블랜팅키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 평활말단화한 후, 새로운 pTV118N 벡터를 SmaⅠ으로 개환한 것과 연결하여 결손변위체 제작용 플라스미드를 조제하여 삽입단편의 방향성에 따라 각각 pFU1002 및 pFU1003 이라 명명한다. 이들 플라스미드를 사용하여 삽입 DNA 단편의 양단에서 순차 결실시킴으로써 결손변이체를 제작한다. 제작에는 Henikoff 의 방법 (Gene Vol.28, p.351 ∼ 359) 을 응용한 Kilo-Sequence 용 Deletion Kit (다카라슈조사 제조) 를 이용한다. 3' 돌출형 및 5' 돌출형 제한효소로서는 각각 PstⅠ 및 XbaⅠ를 이용한다. 얻어진 여러 가지 결손변이체를 주형으로 하여 BcaBEST 디데옥시시퀀스키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용한 디데옥시법에 의해 삽입단편의 염기서열을 결정한다. 얻어진 염기서열을 해석한 결과, 단백질을 코드할 수 있는 6 개의 오픈리딩프레임 (OFR) 이 발견되었다. 여러 가지 결손변이체를 사용하여 내열성 DNA 폴리머라아제 활성을 측정한 결과, ORF 3 및 ORF 4 의 번역산물이 DNA 폴리머라아제 활성의 발현에 중요함이 나타났다. 서열표의 서열번호 : 5 에 ORF 3 의 아미노산서열, 서열번호 : 6 에 아미노산서열을 각각 나타낸다. 즉, Pfu 폴리머라아제 C 는 각각 서열표의 서열번호 : 5 및 서열번호 : 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 2 종의 DNA 폴리머라아제 구성 단백질을 함유하는 효소이다.
실시예 2
(1) Pfu 폴리머라아제 C 의 조제
항원으로 하는 Pfu 폴리머라아제 C 는 다음과 같이 조제한다. Escherichia coli JM109/pFU1001 을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 LB 배지 (트립톤 1.0 %, 효모엑기스 0.5 %, 염화나트륨 0.5 %, pH 7.2) 2 ℓ중에서 배양한다. 배양액의 탁도가 0.6 A600에 도달하였을 때, 유도물질인 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 를 최종농도 1 mM 이 되도록 첨가하며, 그리고 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 37 ㎖ 의 소니케이션버퍼 (50 mM 트리스-염산 pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤, 2 mM PMSF (페닐메탄술포닐플루오라이드)) 에 현탁하여 초음파파쇄기에 가한다. 이 파쇄액을 12000 rpm, 10 분 원심분리하여 얻어진 상청액을 80 ℃, 15 분간의 열처리에 가한다. 그 후, 다시 12000 rpm, 10 분의 원심분리를 실시하여 상청액을 모아 33 ㎖ 의 열처리 상청액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 버퍼 (A) (50 mM 인산칼륨, pH 6.5, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤) 2 ℓ를 투석외액으로 하여 2 시간의 투석을 4 회 실시한다. 투석후의 효소액 32 ㎖ 를 버퍼 (A) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, FPLC 시스템 (파르마시아사 제조) 을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 용출은 0 ∼ 500 mM 의 NaCl 직선농도구배에 의해 실시한다. DNA 폴리머라아제 활성은 340 mM NaCl 의 농도로 용출된다.
활성이 있는 획분을 모아 얻어진 10 ㎖ 의 효소용액을 센트리플로 CF-50 (그레이스저팬사 제조) 을 사용하여 농축한 후, PD-10 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 150 mM NaCl 을 함유하는 버퍼 (A) 로 치환하고, 얻어진 3.5 ㎖ 의 효소용액을 동일한 버퍼로 평형화한 HiTrap Hepar in 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용해서 150 ∼ 650 mM NaCl 직선농도구배에 의해 용출하여 400 mM NaCl 의 농도로 용출된 활성획분을 얻는다. 이 획분 5 ㎖ 를 센트리콘-10 (아미콘사 제조) 을 사용한 한외여과에 의해 농축하고, 120 ㎕ 의 농축액을 75 mM 염화나트륨, 2 mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 50 mM 인산칼륨버퍼 (pH 6.5) 로 평형화한 Superose 6 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하여 동일한 버퍼로 용출한 결과, DNA 폴리머라아제 활성은 유지시간 34.7 분 및 38.3 분의 위치에 용출되었다. 38.3 분의 위치에 용출된 획분을 농축하여 얻어진 농축액을 항원으로 하여 항 Pfu 폴리머라아제 C 폴리크로날항체의 조제에 사용한다.
그리고 상기 Pfu 폴리머라아제 C 의 정제에 있어서, 효소활성은 다음 방법으로 측정한다. 기질에는 송아지 흉선 DNA (워징톤사 제조) 를 활성화한 것 (활성화 DNA) 을 사용한다. DNA 의 활성화 및 DNA 폴리머라아제 활성의 측정은 하버 앤드 로사 발행, D. R. Davis 편집의 DNA polymerase from Escherichia coli, p263 ∼ 276 (C. C. 리처드슨 저) 에 기재된 방법으로 실시한다. 활성을 측정하고자 하는 시료 5 ㎕ 에 반응액 [20 mM 트리스-염산 (pH 7.7), 15 mM MgCl2, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 0.2 ㎎/㎖ 활성화 DNA, 각각 40 μM 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 60 nM [3H]-dTTP (아마샴사 제조)] 45 ㎕ 를 첨가하여 75 ℃ 에서 5 분간 반응시킨다. 그 중의 40 ㎕ 를 DE 페이퍼 (와트먼사 제조) 에 스폿하여 5 % Na2HPO4로 세정을 5 회 실시한 후, DE 페이퍼상에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. 상기 효소활성 측정방법에 의해 30 분당 10 nmol 의 [3H]-dTMP 를 기질 DNA 에 받아들이는 효소량을 효소 1 단위로 한다.
(2) 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체의 조제
상기 Pfu 폴리머라아제 C 표품을 1 ㎎ / 100 ㎕ 로 되도록 50 mM 인산칼륨, pH 6.5, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM NaCl 로 희석하고, 이것에 등량의 완전 Freund's adjuvant 를 첨가하여 유화시킨다. 이것을 1 회마다 50 ㎕ 씩 3 주일 걸러 4 회 토끼피하에 주사한다. 최종면역으로부터 10 일후에 전혈을 채취하고, 이것을 실온에 60 분간 방치한 후, 원심분리하여 항 Pfu 폴리머라아제 C 폴리크로날항체를 함유하는 항혈청 60 ㎖ 를 얻는다. 이 항혈청 20 ㎖ 에 20 ㎖ 의 포화황산암모늄용액을 첨가하여 4 ℃ 에서 45 분간 천천히 교반한 후에 원심분리한다. 얻어진 침전을 5 ㎖ 의 20 mM 인산나트륨버퍼 pH 7.0 으로 현탁하고, 동일한 버퍼 2 ℓ를 투석외액으로 하여 2 시간의 투석을 3 회 실시한다. 투석후의 용액 14 ㎖ 를 20 mM 인산나트륨 버퍼 (pH 7.0) 로 평형화한 프로테인 A 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하여 동버퍼로 세정한 후, 0.1M 구연산나트륨 버퍼 (pH 3.0) 로 용출한다. 용출한 항 Pfu 폴리머라아제 C 폴리크로날항체를 1M 트리스-염산, pH 9.0 으로 중화한 후에 센트리플로 CF-50 으로 농축하고, PD-10 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 커플링버퍼 (0.5M 염화나트륨, 0.2M 중탄산나트륨, pH 8.3) 로 치환하여 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체를 함유하는 용액을 조제한다.
(3) 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체의 조제
HiTrap NHS-activated 칼럼 (파르마시아사 제조) 을 1 mM 염산 6 ㎖ 로 세정한 후, 상기 항 Pfu 폴리머라아제 C 폴리크로날 항체 용액 0.9 ㎖ (3.6 ㎎ 상당의 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체를 포함함) 를 적용한다. 실온에서 1 시간 방치한 후에 3 ㎖ 의 커플링버퍼로 세정한다. 계속해서 칼럼을 6 ㎖ 의 플로킹버퍼 (0.5M 트리스-염산 pH 8.3, 0.5M 염화나트륨), 6 ㎖ 의 버퍼 (B) (0.1M 아세트산나트륨 pH 4.0, 0.5M 염화나트륨), 6 ㎖ 의 플로킹버퍼로 순차 세정하고, 실온에서 30 분간 방치한다. 그리고, 6 ㎖ 의 버퍼 (B), 6 ㎖ 의 플로킹버퍼, 6 ㎖ 의 버퍼 (B) 로 칼럼을 세정한 후, 50 mM 트리스-염산 pH 8.0 으로 칼럼을 평형화하여 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체 칼럼을 제작한다.
실시예 3
(1) 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체 칼럼을 사용한 Pfu 폴리머라아제 C 를 함유하는 복합체의 정제
피로코커스·프리오서스 DSM 3638 을 실시예 1 에 기재된 방법과 마찬가지로 2 개의 배지병에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 34.7 ㎖ 의 2 mM PMSF 를 함유하는 버퍼 (C) (50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 1 mM ATP) 에 현탁하여 초음파파쇄기에 가한다. 파쇄액을 12000 rpm, 10 분간 원심하여 얻어진 상청액 46 ㎖ 를 버퍼 (C) 로 평형화한 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체 칼럼에 제공한다. 칼럼을 버터 (C) 로 세정한 후, 용출버퍼 (0.1M 글리신-염산 pH 2.5, 1 mM ATP) 로 Pfu 폴리머라아제 C 를 함유하는 복합체를 용출한다. 용출액을 1 M 트리스-염산 pH 9.0 으로 중화한 후, 센트리플로 CF-50 을 사용해서 농축하여 Pfu 폴리머라아제 C 복합체 농축액으로 한다.
(2) Pfu 폴리머라아제 C 복합체의 해석
Pfu 폴리머라아제 C 복합체 농축액을 SDS-PAGE (12.5 % 폴리아크릴아미드 겔, 영동완충액으로서 25 mM 트리스-염산, 192 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.4 를 사용) 에 제공하고, 얻어진 겔에 대하여 다음에 나타내는 방법에 의해 항 Pfu 폴리머라아제 C 항체를 사용한 웨스턴블로팅을 실시한다. SDS-PAGE 후의 겔을 40 mM ε-아미노-n-카프론산을 함유하는 블로팅완충액 (1) (25 mM 트리스-염산, 20 % 메탄올, pH 9.4) 에 담근다. 이어서, 세미드라이블로팅장치 (사이언티픽사 제조) 에 블로팅완충액 (2) (0.3 M 트리스-염산, 20 % 메탄올, pH 10.4) 에 담근 여과지, 25 mM 트리스-염산, 20 % 메탄올, pH 10.4 에 담근 여과지, 40 mM ε-아미노-n-카프론산을 함유하는 블로팅완충액 (1) 에 담근 PVDF 막, 상기 겔 및 40 mM ε-아미노-n-카프론산을 함유하는 블로팅완충액 (1) 에 담근 여과지를 겹쳐서 2 ㎃/㎠, 1 시간 블로팅한다. 이 PVDF 막을 0.01 % 티메로살을 함유하는 블록에이스 (유키지루시뉴교가부시키가이사 제조) 에 담가서 10 분간 진탕한 후, 0.01 % 티메로살을 함유하는 블록에이스로 1000 배 희석한 항 Pfu 폴리머라아제 C 항혈청에 막을 담근다. 실온에서 1 시간 방치한 후, 0.02 % 트인-20 을 함유하는 TBS 버퍼 (50 mM 트리스-염산, pH 7.5, 150 mM NaCl) 로 10 분간 3 회 세정하며, 그리고 TBS 버퍼로 세정한다. 그리고, 0.01 % 티메로살을 함유하는 블록에이스로 5000 배 희석한 퍼옥시다아제 표지 항토끼 IgG(Fc) 항체 (오르가논테크니커사 제조) 에 막을 담근다. 실온에서 1 시간 방치한 후, PVDF 막을 0.02 % 트인-20 을 함유하는 TBS 버퍼로 10 분간 3 회 세정하며, 그리고 TBS 버퍼로 세정하여 코니카이뮤노스테인 HRP-1000 (코니카사 제조) 에 막을 담가 발색시킨다. 도 1 에 나타내는 SDS-PAGE 후의 겔을 Coomassie brilliant blue R-250 으로 염색한 결과와 상기 웨스턴블로팅의 결과로부터 상기 복합체 획분에는 항 PFU 폴리머라아제 C 항체와 반응하지 않는 7 종의 단백질 (도 1 에 나타내는 F1 ∼ F7) 이 함유되어 있음이 밝혀졌다.
항 Pfu 폴리머라아제 C 항체와 반응하지 않은 밴드는, Pfu 폴리머라아제 C 를 통해 칼럼에 흡착한 단백질로 생각되기 때문에, 다음 방법으로 이들 단백질의 N 말단 아미노산서열을 분석한다. 실시예 3 (1) 에서 얻어진 Pfu 폴리머라아제 C 복합체 농축액을 상기한 바와 마찬가지로 SDS-PAGE 하고, PVDF 막상에 블로팅한다. 이 막을 Coomassie brilliant blue R-250 으로 염색한 후, 목적하는 밴드를 잘라내서 이 막의 단편을 시료로 하여 G1000A 프로테인시퀀서 (휴렛팩커드사 제조) 를 사용한 자동 Edman 분해법에 의해 목적하는 단백질의 N 말단 아미노산서열을 결정한다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다. 또한, 얻어진 F1 ∼ F5 및 F7 의 N 말단 아미노산서열을 각각 서열표의 서열번호 : 7 ∼ 12 에 나타낸다.
시료 N 말단 아미노산서열
F1F2F3F4F5F6F7 MDKEGFLNKVREAVDVVKLHMFTGKVLIPVKVLKKFENWNMIGSIFYSKKFNLHRPSEYHMKDYRPLLGAIKVKGDNVFSMDIEVLRRLLERELSSEH해석할 수 없음PFEIVFEGAKEFAQLID
실시예 4
카세트 DNA 의 조제
실시예 1 에서 조제한 피로코커스·프리오서스의 게놈 DNA 10 ㎍ 을 EcoRⅠ (다카라슈조사 제조) 로 완전소화하고, 그 중 500 ng 상당을 50 ng 의 EcoRⅠ카세트 (다카라슈조사 제조) 로 혼합한 후에 라이게이션을 실시한다. 라이게이션반응액으로부터 에탄올침전을 실시하여 회수한 DNA 를 20 ㎕ 의 멸균수에 용해하고, 이것을 EcoRⅠ카세트 DNA 로서 이후의 조작에 사용한다.
상기한 바와 동일한 조작으로 HindⅢ 카세트, XbaⅠ카세트, SalⅠ카세트, PstⅠ카세트 및 Sau3AⅠ카세트 (모두 다카라슈조사 제조) 가 각각 부가된 카세트 DNA 를 조제한다. 그리고, XbaⅠ카세트를 첨가할 때에는 XbaⅠ 및 NheⅠ의 2 가지 효소로 소화된 게놈 DNA 를 사용하고, 얻어진 DNA 를 각각 XbaⅠ카세트 DNA 및 NheⅠ/XbaⅠ카세트 DNA 라 명명한다. 또한, SalⅠ카세트를 부가할 때에는 SalⅠ 및 XhoⅠ의 2 가지 효소로 소화된 게놈 DNA 를 사용하고, 얻어진 DNA 를 각각 SalⅠ카세트 및 XhoⅠ/SalⅠ카세트 DNA 라 명명한다. 또한, Sau3AⅠ카세트의 부가에는 BglⅡ 소화된 게놈 DNA 를 사용하고, 얻어진 DNA 를 BalⅡ/Sau3AⅠ카세트 DNA 라 명명한다.
실시예 5
(1) F1 유전자를 포함하는 코스미드클론의 선택
실시예 3 에서 얻어진 F1 의 N 말단 아미노산서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 13 및 14 에 각각 염기서열을 나타내는 프라이머 F1-1 및 F1-2 를 합성한다. 실시예 4 에서 조제한 EcoRⅠ카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 씩의 F1-1 및 카세트 프라이머 C1 (다카라슈조사 제조) 을 사용하여 1 회째의 PCR 을 실시하고, 그 반응액 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 씩의 F1-2 및 카세트 프라이머 C2 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 2 회째의 PCR 을 실시한다. 이 2 회의 PCR 에는 Pfu DNA 폴리머라아제 (α형 효소, 스트라타진사 제조) 를 사용한다. 반응액의 조성 및 반응의 조건을 다음에 나타낸다 : 20 mM 트리스-염산, pH 8.2, 10 mM KCl, 20 mM MgCl2, 6 mM (NH4)2SO4, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 % 트리톤 X-100, 0.01 % BSA 및 2.5 단위의 Pfu DNA 폴리머라아제 (최종용량은 100 ㎕), 94 ℃ (30 초) ∼ 45 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 를 1 사이클로 하여 1 회째의 PCR 은 30 사이클, 2 회째는 25 사이클을 실시한다. 그리고, 이후의 실시예에 나타내는 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용한 PCR 도 동일한 반응액을 사용하여 실시한다. 증폭된 약 550 bp 의 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC119 (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝하여 그 염기서열을 결정한다. 그 후, 얻어진 서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 15 및 16 에 각각 염기서열을 나타내는 프라이머 F1S1 및 F1S2 를 합성한다. 이 F1S1 및 F1S2 를 사용해서 실시예 1 에 나타낸 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하여 F1 유전자를 포함하는 코스미드클론을 선택한다. PCR 은 TaKaRa PCR 증폭키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하고, 첨부한 명세서에 따라 실시한다. 그 결과, No. 22, 46, 61, 133, 178, 180, 210 및 317 의 코스미드클론에 F1 유전자가 포함됨을 알 수 있었다.
(2) F1 유전자의 서브클로닝
실시예 4 에서 조제한 HindⅢ 카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 하고, 각 20 pmol 씩의 F1S1 및 카세트 프라이머 C2 또는 F1S2 및 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하여 50 사이클의 반응을 실시한다. 그 결과, F1S2 및 카세트 프라이머 C2 에서 570 bp 의 DNA 단편이 증폭되었으나, F1S1 및 카세트 프라이머 C2 에서는 DNA 의 증폭은 보이지 않았다. 그럼으로써, HindⅢ 부위는 F1 유전자의 개시코돈의 바로 상류와 F1S1 의 어닐링하는 위치로부터 Pfu DNA 폴리머라아제로 증폭할 수 없는 거리에 있음이 예상되었다. 따라서, 동유전자를 포함하는 코스미드클론으로부터 임의로 선택한 No. 61 을 HindⅢ 으로 소화하고, 1.5 kb 이상의 DNA 단편을 단리하여 플라스미드벡터 pTV118N (다카라슈죠사 제조) 에 서브클로닝한다. 얻어진 각각의 재조합 플라스미드를 주형에 F1S1 과 F1S2 를 프라이머에 사용하여 PCR 에 의해 F1 유전자의 유무를 조사한 결과, 약 2 kb 의 HindⅢ 단편에 F1 유전자가 포함됨이 판명되었다. 이 DNA 단편중의 F1 유전자가 pTV118N 벡터의 lac 프로모터 하류에 연결된 플라스미드를 pF1-4-10 이라 명명한다. 또한, 이 플라스미드에 포함되는 삽입 DNA 단편에 대하여 NcoⅠ, EcoRⅠ, BamHⅠ, PstⅠ, SacⅠ 및 NdeⅠ의 제한효소지도를 작성한 결과, 도 2 에 나타내는 바와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
(3) F1 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
플라스미드 pF1-4-10 및 상기 플라스미드에서 잘라낸 NcoⅠ-HindⅢ, EcoRⅠ-EcoRⅠ, BamHⅠ-PstⅠ, EcoRⅠ-HindⅢ, HindⅢ-EcoRⅠ 및 HindⅢ-BamHⅠ단편을 각각 플라스미드벡터 pTV119N (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝하며, 얻어진 각 플라스미드의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 의해 결정한다. 이들 결과를 종합하여 얻어진 pF1-4-10 으로의 삽입 DNA 단편의 염기서열중 2009 bp 의 서열을 서열표의 서열번호 : 17 에 나타낸다. 상기 염기서열을 해석한 결과, F1 의 N 말단 아미노산서열을 포함하는 오픈리딩프레임이 발견되었다. 상기 서열을 서열표의 서열번호 : 18 에, 또한 상기 서열로부터 추정되는 F1 의 번역산물의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 19 에 각각 나타낸다. 이 아미노산서열에 대하여 기지의 단백질의 아미노산서열과의 상동성을 검색한 결과, 헤모필루스 인플루엔자 유래의 1 개쇄 DNA 특이적 엑소누클레아제 [Science, Vol.269, p.496 ∼ 512 (1995)] 와의 사이에 상동성이 보였다. 상동성은 전반부분에서 23.2 %, 후반부분에서 24.3 % 있었다.
(4) F1 을 발현하기 위한 플라스미드의 구축
실시예 5 (2) 에 기재된 플라스미드 pF1-4-10 을 주형으로 하고, 서열표의 서열번호 : 20 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F1Nc 및 상기한 프라이머 F1S2 를 사용하여 PCR 을 실시한다. 이 PCR 에는 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하여 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 실시한다. 1 ng 의 주형 DNA 및 20 pmol 씩의 양프라이머를 사용하여 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 을 1 사이클로 한 25 사이클의 반응을 실시한다. 증폭된 약 460 염기쌍의 DNA 단편을 NcoⅠ 및 BglⅡ (모두 다카라슈조사 제조) 로 소화하여 얻어지는 단편과, 상기 플라스미드 pF1-4-10 을 BglⅡ 와 HindⅢ 으로 소화하여 얻어지는 DNA 단편을 합하여 플라스미드벡터 pTV118N (다카라슈조사 제조) 의 NcoⅠ-HindⅢ 부위 사이에 넣어진다. 이 플라스미드를 pF1Nc-2 라 명명한다. 상기 플라스미드중의 삽입 DNA 단편중 PCR 로 증폭한 영역은 디데옥시법으로 염기서열을 확인하여 PCR 에 기인하는 변이가 없음을 확인하였다.
(5) 정제 F1 표품의 조제
실시예 5 (4) 에서 얻어진 플라스미드 pF1Nc-2 로 형질전환된 대장균 JM109, Escherichia coli JM109/pFINc2 를 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지에서 16 시간 배양을 실시한다. 집균후, 실시예 2 (1) 과 동일한 방법으로 열처리 상청액을 33 ㎖ 얻는다. 이어서, 이 용액을 버퍼 (D) (50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올 10 % 글리세롤) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, FPLC 시스템 (파르마시아사 제조) 을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 용출은 0 ∼ 500 mM 의 NaCl 직선농도구배에 의해 실시한다. F1 은 340 mM NaCl 부분에서 용출된다.
F1 획분을 모아 얻어진 10 ㎖ 의 효소용액을 센트리플로 CF50 을 사용하여 농축한 후, PD-10 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 버퍼 (D) 로 치환하고, 3.5 ㎖ 의 용액을 동일한 버퍼로 평형화한 HiTrap Blue 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 버퍼 (D) 로 칼럼을 세정한 후, 2M 염화나트륨을 함유하는 버퍼 (D) 로 F1 을 용출한다. 이 획분 5 ㎖ 를 센트리콘-10 을 사용하여 농축하고, 120 ㎕ 의 농축액을 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-염산, pH 8.0 으로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출한 결과, F1 은 약 49 킬로달톤의 분자량에 상당하는 위치에 용출되었다. 이 분자량은 F1 이 1 단량체로서 존재하고 있는 경우에 상당한다.
(6) 엑소누클레아제 활성의 측정
F1 정제표품의 5' →3' 및 3' →5' 엑소누클레아제 활성을 다음과 같이 조사한다.
우선, 플라스미드벡터 pUC119 (다카라슈조사 제조) 를 SsPⅠ(다카라슈조사 제조) 로 소화하여 아가로스 겔 전기영동에 사용하고, 386 bp 의 DNA 단편을 겔에서 회수하여 정제한다. 이 DNA 단편의 5'-말단을 [γ-32P]-ATP (아마샤무사 제조) 와 폴리누클레오티드키나아제 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 표지하고, 얻어진32P-표지 DNA 단편을 5' →3' 엑소누클레아제 활성 검출용 기질로 사용한다. 또한, 플라스미드벡터 pUC119 를 Sau3AⅠ (다카라슈조사 제조) 으로 소화하고, 얻어진 341 bp 의 DNA 단편을 상기와 동일한 방법으로 회수, 정제한다. 그리고, [α-32P]-dCTP (아마샤무사 제조) 와 클레노우단편 (다카라슈조사 제조) 를 사용한 말단수복반응에 의해 이 DNA 단편의 3'-말단을32P 표지하여 3' →5' 엑소누클레아제 활성 검출용 기질을 조제한다. 상기 2 종의 표지 DNA 는 NICK 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 겔 여과하고 정제하여 다음 반응에 사용한다.
이들 표지 DNA 단편 2 ng 및 γ-DNA (다카라슈조사 제조) 를 HaeⅢ (다카라슈조사 제조) 으로 완전소화하고, 얻어진 소화물 12.5 ㎍ 및 상기 F1 정제표품을 함유하는 10 ㎕ 의 반응액 (20 mM 트리스-염산, pH 7.7, 15 mM MgCl2, 2 mM 2-메르캅토에탄올) 을 조제하여 85 ℃ 에서 2.5, 5 또는 7.5 분간 반응시킨 후, 에탄올침전을 실시하여 DNA 를 침전시킨다. 이 상청액중에 존재하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정함으로써, 엑소누클레아제 활성에 의한 기질의 분해량을 구한다. 그리고, 5' →3' 엑소누클레아제 활성 측정에는 50 fmol, 3' →5' 엑소누클레아제 활성 측정에는 125 pmol 의 F1 정제표품을 첨가한다. 이들의 결과를 도 3 및 도 4 에 각각 나타낸다.
도 3 은 5' →3' 엑소누클레아제 활성의 결과를, 도 4 는 3' →5' 엑소누클레아제 활성 측정의 결과를 각각 나타낸다. 도면중 횡축은 반응시간을, 종축은 반응액 전체에 함유되는 방사활성에 대한 상청액에 유리된 방사활성의 비율을 나타낸다. 또한, 도면중 검은 원은 본 발명의 F1 정제표품에 대하여, 흰 원은 F1 정제표품을 첨가하지 않고 반응시킨 블랭크에 대하여 얻어진 결과를 나타낸다. 도면에 나타내는 바와 같이 본 발명의 F1 정제표품은 5' →3' 및 3' →5' 엑소누클레아제 활성의 양측을 갖고 있다. 또한, 상기 결과로부터 5' →3' 엑소누클레아제 활성은 3' →5' 엑소누클레아제 활성에 비하여 약 500 배 강력함이 나타난다.
실시예 6
(1) F2 유전자를 함유하는 코스미드클론의 선택
실시예 3 에서 얻어진 F2 의 N 말단 아미노산서열에 의거하여 서열표의 서열번호 21 및 22 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F2-2 및 F2-3 을 합성한다. 실시예 4 에서 조제한 XbaⅠ카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 의 프라이머 F2-2 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C1 을 사용하여 1 회째의 PCR 을 실시하며, 그리고 그 반응액 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 의 프라이머 F2-3 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 2 회째의 PCR 을 실시한다. 이 2 회의 PCR 에는 Pfu 폴리머라아제 C 를 사용한다. 반응액의 조성 및 반응조건을 다음에 나타낸다 : 10 mM 트리스-염산, pH 9.2, 75 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 각각 0.4 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.01 % BSA 및 2.0 단위의 Pfu 폴리머라아제 C (최종용량은 100 ㎕), 94 ℃ (30 초) ∼ 45 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2분) 를 1 사이클로 하여 1 회째는 30 사이클 또한 2 회째는 25 사이클의 반응을 실시한다. 증폭된 약 250 bp 의 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC119 에 서브클로닝하여 그 DNA 서열을 결정한 후, 얻어진 서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 23 및 24 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F2S3 및 F2S4 를 합성한다. 이 프라이머를 사용하여 실시예 1 에서 조제한 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하여 F2 유전자를 포함하는 코스미드클론을 선택한다. PCR 에는 주형으로서 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 각 20 pmol 의 프라이머를 사용하여 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 반응은 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2분) 를 1 사이클로 하는 25 사이클로 실시한다. 그 결과, No. 172 의 코스미드클론에 F2 유전자가 포함됨을 알 수 있었다.
(2) F2 유전자의 서브클로닝
실시예 4 의 NheⅠ/XbaⅠ 및 XhoⅠ/SalⅠ카세트 DNA 의 각각 1 ㎕ 를 주형으로 프라이머로서 각 20 pmol 씩의 F2S3 와 카세트 프라이머 C2 또는 F2S4 와 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 50 사이클반응을 실시한다. 그 결과, F2S3 및 카세트 프라이머 C2 의 프라이머 1 쌍에서는 NheⅠ/XbaⅠ 및 XhoⅠ/SalⅠ카세트 DNA 의 각각에 대하여 약 700 및 약 1400 bp 의 DNA 단편이 증폭되었으나, F2S4 및 카세트 프라이머 C2 의 프라이머 1 쌍에서는 DNA 의 증폭은 보이지 않았다. 그럼으로써, NheⅠ 및 XhoⅠ부위는 F2S4 프라이머의 어닐링하는 위치로부터 Pfu DNA 폴리머라아제로 증폭할 수 없는 거리에 있다고 예상된다.
따라서, No. 172 를 NheⅠ으로 소화하여 얻어지는 여러 가지 DNA 단편을 잘라내서 플라스미드벡터 pTV118N (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝한다. 얻어진 각각의 재조합 플라스미드를 주형으로 F2S3 및 F2S4 를 프라이머에 사용해서 PCR 을 실시하여 F2 유전자가 존재하는지의 여부를 조사한 결과, 약 8 kb 의 NheⅠ단편에 F3 유전자가 존재함이 판명되었다. 따라서, 이 NheⅠ단편이 pTV118N 에 넣어진 것을 플라스미드 pF2172Nh 라 명명한다. 또한, 이 플라스미드에 포함되는 삽입 DNA 단편에 대하여 제한효소지도를 작성한 결과, 도 5 에 나타내는 바와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
도 5 에 나타낸 제한효소지도에 의거하여 플라스미드 pF2172Nh 를 HindⅢ 으로 소화하여 약 1.5 kb 의 HindⅢ 단편을 잘라내서 플라스미드벡터 pTV118N 에 서브클로닝한다. 얻어진 재조합 플라스미드에 대하여 F2 유전자의 삽입방향을 조사한 결과, 모두 벡터의 lac 프로모터에 대하여 역방향을 삽입되어 있었다. 이 플라스미드를 pF2172H16 이라 명명한다. 이 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109, Escherichia coli JM109/pF2172H16 에 대하여 F2 의 발현을 조사하였으나, 고발현되지 않았다. 따라서, F2 유전자를 벡터에 대하여 정방향으로 연결하기 위하여 pF2172H16 을 HindⅢ 및 EcoRⅠ으로 소화하고, 잘라낸 HindⅢ-EcoRⅠ단편을 플라스미드벡터 pTV119Nd (다카라슈조사 제조의 플라스미드벡터 pTV119N 의 NcoⅠ부위를 NdeⅠ (다카라슈조사 제조의 플라스미드벡터 pTV119N 의 NcoⅠ부위를 NdeⅠ으로 변환한 것) 에 연결한다. 얻어진 재조합 플라스미드를 pF2172HE11 이라 명명하고, 이 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 Escherichia coli JM109/pF2172HE11 이라 명명한다.
(3) F2 표품의 조제
실시예 6 (2) 에서 얻어진 Escherichia coli JM109/pF2172HE11 을 1 mM 의 IPTG 및 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지중에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 23.4 ㎖ 의 소니케이션버퍼에 현탁하여 실시예 2 (1) 과 동일한 방법으로 19.5 ㎖ 의 열처리 상청액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 버퍼 (D) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼에 제공하고, FPLC 시스템을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. F2 는 RESOURCE Q 칼럼을 그냥 지나친다.
그냥 지나친 F2 획분 22 ㎖ 를 버퍼 (D) 로 평형화한 RESOURCE S 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 0 ∼ 500 mM NaCl 직선농도구배에 의해 용출하고, 170 mM NaCl 부분에 용출된 F2 획분을 얻는다. 이 획분을 센트리콘 10 에 의해 농축하고, 얻어진 75 ㎕ 의 농축액을 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-염산 버퍼 (pH 8.0) 로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출을 실시한 결과, F2 는 약 120 킬로달톤 또는 약 45 킬로달톤의 분자량에 상당하는 위치에 용출되었다. 이 분자량은 F2 가 6 또는 2 량체를 형성한 경우에 상당한다.
(4) F2 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
상기 플라스미드 pF2172HE11 의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 의해 결정한다. 서열표의 서열번호 : 25 에 얻어진 염기서열중 957 bp 의 서열을 나타낸다. 이 염기서열을 해석한 결과, F2 의 N 말단 아미노산서열을 갖는 오픈리딩프레임이 발견되었다. 이 오픈리딩프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 : 26 에, 또한 이 염기서열로부터 추정되는 F2 의 번역산물의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 27 에 각각 나타낸다. 이 아미노산서열에 대하여 기지의 단백질의 아미노산서열과의 상동성을 검색한 결과, 상동성이 있는 단백질은 보이지 않았다.
실시예 7
(1) F4 유전자를 함유하는 코스미드클론의 선택
실시예 3 에서 얻어진 F4 의 N 말단 아미노산서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 28 및 29 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F4-1 및 F4-2 를 합성한다. 실시예 4 의 HindⅢ 카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 의 프라이머 F4-1 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C1 을 사용하여 1 회째의 PCR 을 실시하고, 그 반응액 1 ㎕ 를 주형으로 하여 F4-2 및 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 2 회째의 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 반응은 94 ℃ (30 초) ∼ 45 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 를 1 사이클로 하여 1 회째를 30 사이클 또한 2 회째를 25 사이클로 실시한다. 이 반응에 의해 증폭된 약 1100 bp 의 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC119 에 서브클로닝하고, M4 및 RV 프라이머 (다카라슈조사 제조) 를 사용한 디데옥시법에 의해 그 염기서열의 일부를 결정한 후, 얻어진 서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 30 및 31 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F4S1 및 F4S2 를 합성한다. 이 F4S1 및 F4S2 프라이머를 사용하여 실시예 1 에서 조제한 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, F4 유전자를 포함하는 코스미드클론을 선택한다. PCR 에는 효소로서 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (1 분) 를 1 사이클로 하는 30 사이클의 반응을 실시한다. 그 결과, No. 16, 26, 88, 112, 250, 269, 427 및 451 의 코스미드클론에 F4 유전자가 포함됨을 알 수 있었다.
(2) F4 유전자의 서브클로닝
실시예 4 의 XbaⅠ카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 각 20 pmol 씩의 F4S2 및 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 50 사이클반응을 실시한다. 그 결과, F4S2 및 카세트 프라이머 C2 로 약 700 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 또한 HindⅢ 카세트 DNA 를 주형으로 F4-2 와 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 동일한 조건으로 PCR 을 실시한 결과, 약 1100 bp 의 DNA 단편이 증폭되었다. 이러한 점에서 약 1.6 kb 의 XbaⅠ-HindⅢ 단편에 F4 유전자가 존재함이 예상되었다. 따라서, 코스미드 No. 16 을 XbaⅠ 및 HindⅢ 으로 소화하고, 1.6 kb 전후의 DNA 단편을 잘라내서 pTV118N 벡터에 서브클로닝한다. 얻어진 각각의 재조합 플라스미드를 주형에 F4S1 및 F4S2 프라이머를 사용한 PCR 에 의해 F4 유전자의 유무를 조사한다. 그 결과, F4 유전자를 포함하는 1.6 kb 의 XbaⅠ-HindⅢ 단편을 갖는 플라스미드를 얻을 수 있으며, 이것을 플라스미드 pF4-1-4 라 명명한다. 또한, 이 플라스미드에 대하여 NcoⅠ, EcoRⅠ, BamHⅠ, PstⅠ, SacⅠ 및 NdeⅠ의 제한효소소화를 실시한 결과, 상기 플라스미드 또는 삽입 DNA 단편중에는 이들의 부위가 없음이 판명되었다.
(3) F4 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
상기 플라스미드 pF4-1-4 의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 의해 결정한다.
서열표의 서열번호 : 32 에 얻어진 염기서열중 1012 bp 의 서열을 나타낸다. 상기 염기서열을 해석한 결과, F4 의 N 말단 아미노산서열을 갖는 오픈리딩프레임이 발견되었다. 이 오픈리딩프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 : 33 에, 또한 상기 염기서열로부터 추정되는 F4 의 번역산물의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 34 에 각각 나타낸다. 이 아미노산서열에 대하여 기지의 단백질의 아미노산서열과의 상동성을 검색한 결과, 상동성이 있는 단백질은 보이지 않았다.
(4) F4 를 발현하기 위한 플라스미드의 구축
실시예 7 (3) 에 기재된 플라스미드 pF4-1-4 를 주형으로 하고, 서열표의 서열번호 : 35 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F4NNd 및 서열표의 서열번호 : 36 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F4CEc 를 사용하여 Pfu DNA 폴리머라아제에 의해 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 PCR 을 실시한다. 반응조건을 다음에 나타낸다 : 1 ng 의 주형 DNA, 20 pmol 씩의 양프라이머를 사용, 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 를 1 사이클로 하는 25 사이클 반응. 증폭된 약 450 bp 의 DNA 단편을 NdeⅠ 및 EcoRⅠ (모두 다카라슈조사 제조) 로 소화하여 얻어진 DNA 단편을 상기한 플라스미드벡터 pTV119Nd 의 NdeⅠ 및 EcoRⅠ사이에 넣은 플라스미드 pF4Nd-6 을 제작한다. 그리고, 상기 플라스미드중의 삽입 DNA 단편은 디데옥시법으로 염기서열을 확인하여 PCR 에 기인하는 변이가 없음을 확인하였다.
(5) 정제 F4 표품의 조제
실시예 7 (4) 에서 얻어진 플라스미드 pF4Nd-6 으로 형질전환된 대장균 JM109, Escherichia coli JM109/p4Nd-6 을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지중에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 33.4 ㎖ 의 소니케이션버퍼에 현탁하고, 실시예 2 (1) 과 동일한 방법으로 28 ㎖ 의 열처리 상청액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 버퍼 (D) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼에 제공하여 FPLC 시스템을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 용출은 0 ∼ 500 mM 의 NaCl 직선농도구배에 의해 실시한다. F4 는 325 mM NaCl 의 농도로 용출된다.
F4 획분을 모아 얻어진 3 ㎖ 의 용액을 PD-10 칼럼으로 150 mM NaCl 을 함유하는 버퍼 (D) 로 치환하고, 6.9 ㎖ 의 용액을 동일한 버퍼로 평형화한 HiTrap Heparin 칼럼에 제공한다. F4 는 HiTrap Heparin 칼럼에 흡착되지 않으며, 칼럼을 그냥 지나친 F4 획분 7.2 ㎖ 에 최종농도 1 M 으로 되도록 (NH4)2SO4를 첨가한다. 이 용액을 1 M (NH4)2SO4를 함유하는 버퍼 (D) 로 평형화한 HiTrap Phenyl 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 1M, 0.5 M (NH4)2SO4로 각각 칼럼을 세정한 후에 버퍼 (D) 로 F4 를 용출한다. 이 획분 5 ㎖ 를 센트리콘-10 에 의해 농축하고, 얻어진 76 ㎕ 의 농축액을 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-염산, pH 8.0 으로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출한 결과, F4 는 분자량 약 39 킬로달톤에 상당하는 위치에 용출된다. 이 분자량은 F4 가 2 혹은 3 단량체를 형성한 경우에 상당한다.
실시예 8
(1) F7 유전자를 포함하는 코스미드클론의 선택
실시예 3 에서 얻어진 F7 의 N 말단 아미노산서열에 의거하여 서열표의 서열번호 37 및 38 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F7-1 및 F7-2 를 합성한다. 실시예 4 에서 조제한 HindⅢ 카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 의 F7-1 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C1 을 사용하여 1 회째의 PCR 을 실시하고, 그 반응액 1 ㎕ 를 주형으로 하여 100 pmol 의 프라이머 F7-2 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 2 회째의 PCR 을 실시한다. 반응액의 조성 및 반응조건은 실시예 6 (1) 과 동일한 방법으로 실시한다. 증폭한 약 830 bp 의 DNA 단편을 플라스미디벡터 pUC119 에 서브클로닝하여 염기서열을 결정한 후, 얻어진 서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 39 및 40 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F7S1 및 F7S2 를 합성한다. 이들 프라이머를 사용해서 실시예 1 에 나타낸 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하여 F7 유전자를 포함하는 코스미드클론을 선택한다. PCR 은 효소로서 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 반응은 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 30 사이클로 실시한다. 그 결과, No. 15, 96, 114, 167, 277, 348, 386, 400, 419, 456, 457 및 484 의 코스미드클론에 F7 유전자가 포함됨을 알 수 있었다.
(2) F7 유전자의 서브클로닝
실시예 4 에서 조제한 HindⅢ 카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 각 20 pmol 씩의 F7S2 및 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 50 사이클의 반응으로 한다. 그 결과, 약 900 bp 의 단편이 증폭되며 또한 그 결과와 실시예 8 (1) 의 F7-2 및 카세트 프라이머 C2 에서의 증폭의 결과로부터 약 1.0 kp 의 HindⅢ 단편에 F7 유전자가 존재함이 예상되었다. 따라서, 동유전자를 포함하는 코스미드에서 임의로 선택한 No. 15 를 HindⅢ 으로 소화하고, 1.0 kb 전후의 DNA 단편을 잘라내서 플라스미드벡터 pTV118N 에 서브클로닝한다. 얻어진 각각의 재조합 플라스미드를 주형으로 F7S1 및 F7S2 프라이머를 사용한 PCR 에 의해 F7 유전자의 유무를 조사한 결과, 1 kb 의 HindⅢ 단편에 F7 유전자가 포함됨이 판명되었다. 이 DNA 단편중의 F7 유전자가 pTV118N 벡터의 lac 프로모터의 하류에 연결된 플라스미드를 pF7-HH-18, 역방향에 연결된 플라스미드를 PF7-1-8 이라 각각 명명하였다. 또한, 이 플라스미드에 포함되는 삽입 DNA 단편에 대하여 제한효소지도를 작성한 결과, 도 6 에 나타내는 바와 같은 지도를 얻을 수 있었다.
(3) F7 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
상기 2 종의 플라스미드 그리고 이들 플라스미드에서 잘라낸 BamHⅠ-HindⅢ, NdeⅠ-HindⅢ, HindⅢ-NdeⅠ 및 HindⅢ-BamHⅠ단편을 각각 플라스미드벡터 pTV119Nd 에 서브클로닝한 플라스미드를 제작하고, 그 삽입부분의 염기서열을 디데옥시법에 의해 결정한다. 이들 결과를 종합하여 얻어진 상기 플라스미드의 삽입 DNA 단편의 염기서열중 989 bp 의 서열을 서열표의 서열번호 : 41 에 나타낸다. 상기 염기서열을 해석한 결과, F7 의 N 말단 아미노산서열을 포함하는 오픈리딩프레임이 발견되었다. 이 오픈리딩프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 : 2 에, 또한 상기 서열로부터 추정되는 F7 의 번역산물의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 1 에 각각 나타낸다. 상기 아미노산서열과 기지의 단백질의 아미노산서열의 상동성을 검색한 결과, 진핵생물의 DNA 복제에 관여하는 증식세포핵항원 (proliferating cell nuclear antigen : PCNA) [엠보 저널 (EMBO J.), Vol.11, p.5111 ∼ 5120 (1995) ; Nucleic Acids Research, Vol.18, p.261 ∼ 265 (1990) ; 프로시딩스 오브 더 네셔널 아카데미 오브 사이언스 오브 더 USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol.84, p.1575 ∼ 1579 (1987)] 과의 사이에 상동성이 보였다. 각 문헌에 기재된 단백질과의 상동성은 각각 24, 28 및 24 % 였다.
(4) 정제 F7 표품의 조제
실시예 8 (2) 에서 얻어진 플라스미드 pF7-HH-18 로 형질전환된 대장균 JM109, Escherichia coli JM109/pF7-HH-18 을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지중에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 45 ㎖ 의 소니케이션버퍼에 현탁하고, 실시예 2 (1) 과 동일한 방법으로 41.9 ㎖ 의 열처리 상청액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 2 ℓ의 버퍼 (A) 를 외액으로 하여 2 시간의 투석을 3 회 실시한다. 투석후의 효소액 36 ㎖ 를 버퍼 (A) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼에 제공하고, FPLC 시스템을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 용출은 0 ∼ 500 mM 의 NaCl 직선농도구배에 의해 실시한다. 그결과, F7 은 340 mM NaCl 부분에서 용출되었다.
F7 획분을 모아 얻어진 10 ㎖ 의 용액을 센트리플로 CF-50 을 사용하여 농축한 후, PD-10 칼럼 1M (NH4)2SO4를 함유하는 버퍼 (A) 로 치환하고, 얻어진 3.5 ㎖ 의 용액을 동일한 버퍼로 평형화한 HiTrap Phenyl 칼럼에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 1M 및 0.5M (NH4)2SO4로 순차 칼럼을 세정한 후, 버퍼 (A) 로 F7 을 용출한다. 이 획분 4 ㎖ 를 센트리콘-10 을 사용하여 농축한다. 이 농축액 80 ㎕ 를 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산칼륨버퍼 (pH 6.5) 로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출한 결과, F7 은 분자량 약 99 킬로달톤에 상당하는 위치에 용출되었다. 이 분자량은 F7 이 3 단량체를 형성한 경우에 상당한다.
(5) 프라이머 신장반응에 미치는 F7 의 효과
F7 의 각종 폴리머라아제의 프라이머 신장반응에 미치는 효과를 조사하기 위하여 Pfu 폴리머라아제 C, Pfu DNA 폴리머라아제 (α형 DNA 폴리머라아제, 스트라타진사 제조) 그리고 피로딕티윰 옥툴툼유래의 Poc DNA 폴리머라아제Ⅰ 및 Ⅱ [Poc DNA 폴리머라아제Ⅰ 및 Ⅱ, 저널 오브 박테리올로지 (J. Bacteriol.) Vol.177, p.2164 ∼ 2177 (1995)] 의 활성을 F7 의 첨가의 유무에 대하여 비교한다.
DNA 폴리머라아제 활성의 측정은 실시예 2 (1) 에 기재된 Pfu 폴리머라아제 C 의 활성측정법을 참고로 하여 실시한다. 그리고, 기질에는 M13 퍼지본쇄 DNA (M13mp18ssDNA, 다카라슈조사 제조) 에 45 염기의 합성올리고누클레오티드인 HT 프라이머를 어닐링시킨 것 (M13-HT 프라이머) 을 사용한다. 서열표의 서열번호 : 42 에 HT 프라이머의 염기서열을 나타낸다.
즉, 표 2 에 기재된 DNA 폴리머라아제 및 F7 을 함유하는 최종용량 50 ㎕ 의 반응액 [20 mM 트리스-염산, pH 7.7, 15mM MgCl2, 2mM 2-메르캅토에탄올, 0.01 ㎍/㎕ M13-HT 프라이머, 각각 40 μM 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 60 nM [3H]-dTTP (아마샤무사 제조)] 을 조제하여 75 ℃ 에서 5 분간 반응시킨다. 반응액을 빙랭하여 반응을 정지시킨 후, 그 중 40 ㎕ 를 DE 페이퍼, (와트먼사 제조) 에 스폿하여 5 % Na2HPO4로 세정을 5 회 실시한 후, DE 페이퍼상에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다.
표 2 에 나타내는 바와 같이 사용한 모든 DNA 폴리머라아제에 대하여 F7 의 첨가에 의한 DNA 폴리머라아제 활성의 상승이 인정되었다.
DNA 폴리머라아제 F7 효소활성 (cpm)
블랭크 1블랭크 2Pfu 폴리머라아제 C (25 fmol)Pfu 폴리머라아제 C (25 fmol)Pfu 폴리머라아제 C (25 fmol)Pfu DNA 폴리머라아제 (120 fmol)Pfu DNA 폴리머라아제 (120 fmol)Pfu DNA 폴리머라아제 (120 fmol)Poc DNA 폴리머라아제Ⅰ(74 pmol)Poc DNA 폴리머라아제Ⅰ(74 pmol)Poc DNA 폴리머라아제Ⅱ(6.0 pmol)Poc DNA 폴리머라아제Ⅱ(6.0 pmol) -10 pmol-5 pmol10 pmol-0.48 pmol4.8 pmol-10 pmol-10 pmol 6135888289731759071363163762694331443
주 : 표중의 Pfu 폴리머라아제 C 의 양은 2 개의 DNA 폴리머라아제 구성 단백질 1 분자씩으로이루어지는 단백질로서, 또한 F7 의 양은 3 량체 단백질로서의 양을 나타낸다.
그리고, 프라이머 신장활성에 대하여 상세히 검토한다. 기질로서 M13-HT 프라이머를 사용하고, 프라이머의 5' 말단을 [γ-32P]-ATP (아마샤무사 제조) 와 T4 폴리누클레오티드키나아제 (다카라슈조사 제조) 로 표지하여 사용한다.
다음의 시료를 함유하는 1 ㎕ 의 시료액을 조제한 : ① 18 fmol 의 Pfu 폴리머라아제 C, ② 18 fmol 의 Pfu 폴리머라아제 C ＋ 2 pmol 의 F7, ③ 0.24 pmol 의 Pfu DNA 폴리머라아제, ④ 0.24 pmol 의 Pfu DNA 폴리머라아제 ＋ 0.78 pmol 의 F7. 이들의 시료액에 각각 0.01 ㎍/㎕ 의32P 표지 M13-HT 프라이머를 함유하는 9 ㎕ 의 반응액 (20 mM 트리스-염산 (pH 9.0), 15 mM MgCl2, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 각각 40 μM 의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 을 첨가하여 75 ℃ 에서 2.5 분간 또는 5 분간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 빙랭하여 반응을 정지하며, 그리고 1 ㎕ 의 200 mM EDTA, 5.5 ㎕ 의 반응정지액 (95 % 포름아미드, 20 mM EDTA, 0.05 % 브로모페놀블루, 0.05 % 크실렌시아놀) 을 첨가하여 95 ℃, 5 분간의 열변성처리를 실시한다. 이 반응액중 1.6 ㎕ 를 8 M 요소를 함유하는 6 % 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 전기영동한 후에 오토라디오그램을 제작한다. 얻어진 오토라디오그램을 도 7 에 나타낸다.
도면중, Pfu-C 및 pfu 는 각각 Pfu 폴리머라아제 C 및 Pfu DNA 폴리머라아제에 대하여 얻어진 결과를 나타내며, 2.5 및 5 는 각각 반응시간 (분) 을 나타낸다. 또한, 도면중 - 및 + 의 표시는 각각 F7 비첨가 및 첨가의 반응액으로 얻어진 결과를 나타낸다. 그리고, 도면중 양단의 레인은 γ-EcoT14Ⅰ소화물 (다카라슈조사 제조) 을 [γ-32P]-ATP (아마샤무사 제조) 와 T4 폴리누클레오티드키나아제 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 5' 말단표지한 것을 전기영동한 결과이며, 신장산물의 길이를 측정하는 데 사용한다.
도 7 에 나타내는 바와 같이 F7 을 첨가하지 않은 경우, Pfu 폴리머라아제 C 에서는 300 ∼ 600 염기 정도의 DNA 가 주요 신장산물임에 비하여, F7 이 첨가된 경우에는 저쇄길이의 신장산물이 감소함과 동시에 1000 염기를 초과하는 신장산물의 비율이 증가하고 있다. 또한, Pfu DNA 폴리머라아제에서도 F7 DML 첨가에 의해 신장산물의 쇄길이가 현저하게 연장되었다. 이와 같이 하여 F7 이 Pfu 폴리머라아제 C 및 Pfu DNA 폴리머라아제 쌍방의 프라이머 신장속도를 증대시킴이 밝혀졌다.
이어서, 보다 고분자의 프라이머 신장반응물을 해석하기 위하여32P 표지 M13-HT 프라이머를 기질로 하였을 때의 Pfu 폴리머라아제 C 및 Pfu DNA 폴리머라아제의 프라이머 신장반응물을 알칼리 아가로스 겔 전기영동에 의해 해석한다. 상기 ① ∼ ④ 의 시료액 각 1 ㎕ 에 종농도 0.01 ㎍/㎕ 의 M13-HT 프라이머를 함유하는 9 ㎕ 의 반응액 (20 mM 트리스-염산, pH 9.0, 15 mM MgCl2, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 각각 40 μM 의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP, 84 nM [α-32P]-dCTP) 을 첨가하여 75 ℃ 에서 2.5 분간 반응시킨다. 반응종료후, 빙랭한 반응액에 1.11 ㎕ 의 200 mM EDTA, 1.23 ㎕ 의 500 mM NaOH, 2.47 ㎕ 의 6 배 농도의 로딩버퍼 (0.125 % 브로모페놀블루, 0.125 % 크실렌시아놀, 9 % 글리세롤) 을 순차 첨가하고, 그 중 6 ㎕ 를 0.5 % 알칼리 아가로스 겔을 사용하여 전기영동한 후에 오토라디오그램을 제작한다. 얻어진 오토라디오그램을 도 8 에 나타낸다.
도면중, Pfu-C 및 pfu 는 각각 Pfu 폴리머라아제 C 및 Pfu DNA 폴리머라아제에 대하여 얻어진 결과를 나타내고, 도면중 - 및 + 의 표시는 각각 F7 비존재하 및 존재하에서 얻어진 결과를 나타낸다. 그리고, 도면중 M 의 레인은 상기한 바와 마찬가지로 말단표지된 γ-EcoT14Ⅰ소화물이다. 도 8 에 나타내는 바와 같이 Pfu 폴리머라아제 C 의 경우, F7 비존재하에서는 2.5 kb 부근에 신장산물이 약한 시그널이 보임에 비하여, F7 존재하에서는 M13ssDNA 를 완전히 일주한 7.3 kb 의 시그널이 보인다. 또한, Pfu DNA 폴리머라아제에서는 F7 존재하에서 2.7 kb 부근에 시그널이 보이지만, F7 비존재하에서는 시그널은 보이지 않았다. 이상의 점에서 F7 은 양 DNA 폴리머라아제의 신장반응을 높임이 나타났다.
실시예 9
(1) RFC 소서브유닛의 상동성을 코드하는 유전자를 포함하는 코스미드클론의 선택
메타노코커스 쟈나쉬이 (Methanococcus jannaschii) 의 RFC 소서브유닛의 아미노산서열 [Science, Vol.273, p.1058 ∼ 1073 (1996)] 에 대하여 다른 생물유래의 RFC (RF-C) 소서브유닛의 아미노산서열과의 상동성을 조사하고, 이들 사이에서 잘 보존되어 있는 영역의 아미노산서열로부터 RFC 소서브유닛을 코드하는 유전자를 탐색하기 위한 프라이머 RF-F1, RF-F3, RF-F4, RF-R1, RF-R2, RF-R3 및 RF-R4 를 합성한다. 서열표의 서열번호 : 43 ∼ 49 에 각각 이들 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 이들의 프라이머를 조합하여 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 을 실시하고, RFC 소서브유닛을 코드하는 유전자의 탐색을 실시한다. 이 PCR 에는 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 0.25 ㎍ 의 주형 DNA 및 각 100 pmol 씩의 프라이머를 사용하여 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 실시한다. RF-F1 및 RF-R4 에서 1 회째의 PCR 을 실시한 경우에는 이 반응액 1 ㎕ 씩을 주형으로 하여 RF-F4 및 RF-R4 또는 RF-F1 및 RF-R1 을 사용한 2 회째의 PCR 을, 또한 RF-F1 및 RF-R3 에서 1 회째의 PCR 을 실시한 경우에는 반응액 1 ㎕ 씩을 주형으로 하여 RF-F3 및 RF-R2 를 사용한 2 회째의 PCR 을 실시하여 각각 약 240 bp, 약 140 bp 및 약 140 bp 의 증폭 DNA 단편을 얻는다. 이들 DNA 단편을 각각 플라스미드벡터 pUC119 에 서브클로닝하여 그 염기서열을 결정한 후, 얻어진 서열을 참고로 서열표의 서열번호 : 50 ∼ 54 에 각각 염기서열을 나타내는 프라이머 RF-S1, RF-S2, RF-S3, RF-S4 및 RF-S5 를 합성한다. 이 RF-S1 및 RF-S3 프라이머를 사용하여 실시예 1 에서 조제한 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, RFC 소서브유닛의 동족체를 코드하는 유전자를 갖는다고 생각되는 코스미드클론을 선택한다. PCR 에는 TaKaRa PCR 증폭키트를 사용하고, 반응은 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 를 1 사이클로 한 25 사이클의 반응을 실시한다. 그 결과, No. 254, 310, 313, 377 및 458 의 코스미드클론에 목적하는 유전자 (PFU-RFC 유전자) 가 포함됨을 알 수 있었다.
(2) PFU-RFC 유전자의 서브클로닝
실시예 4 에서 조제한 XbaⅠ 및 EcoRⅠ카세트 DNA 1 ㎍ 을 주형으로 100 pmol 의 RF-S1 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C2 또는 100 pmol 의 RF-S2 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu 폴리머라아제 C 를 사용하고, 실시예 6 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 50 사이클의 반응을 실시한다. 그 결과, XbaⅠ카세트를 주형으로 한 경우에 RF-S1 및 카세트 프라이머 C2 에서 약 2 kb 의 DNA 단편이, EcoRⅠ카세트를 주형으로 한 경우에 RF-S2 및 카세트 프라이머 C2 에서 약 1.5 kb 의 DNA 단편이 증폭되었다. 이들 DNA 단편을 각각 플라스미드벡터 pUC199 에 서브클로닝하고, 얻어진 재조합 플라스미드를 pRFSXS1-26 및 pRFSES2-8 이라 명명한다. 이들 플라스미드의 제한효소지도를 제작한 결과, NdeⅠ 및 BamHⅠ부위는 PFU-RFC 의 유전자내에 존재하지 않음이 예상되었다.
상기 (1) 의 5 클론의 코스미드를 각각 NdeⅠ 및 BamHⅠ으로 소화하고, 그 영동패턴을 조사한 결과, 5 kb 부근에 공통된 밴드가 보였다. 이 DNA 단편에 PFU-RFC 유전자가 존재한다고 예상하고, 클론 No.254 유래의 약 5 kb 의 NdeⅠ-BamHⅠ단편을 잘라내서 상기 pTV119Nd 벡터에 서브유닛한다. 얻어진 재조합 플라스미드에 의한 형질전환체에 대하여 RF-S1 및 RF-S3 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 PFU-RFC 유전자의 유무를 조사한 결과, 이 NdeⅠ-BamHⅠ단편에 PFU-RFC 유전자가 존재함이 판명되었다. 따라서, NdeⅠ-BamHⅠ단편이 pTV119Nd 벡터에 넣어진 것을 플라스미드 pRFS254NdB 라 명명한다. 또한, 이 플라스미드에 대하여 제한효소지도를 제작한 결과, 도 9 에 나타내는 바와 같은 지도를 얻을 수 있었다.
도 9 에 나타낸 제한효소지도에 의거하여 pRFS254NdB 로부터 다음에 나타내는 방법으로 각 단편을 잘라내서 pTV118N 벡터 (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝한다. 우선, pRFS254NdB 를 XbaⅠ 및 SacⅠ으로 소화하여 얻어지는 약 500 bp 의 DNA 단편, XbaⅠ 및 NcoⅠ으로 소화하여 얻어지는 약 2 kb 의 DNA 단편, 그리고 NcoⅠ 및 BamHⅠ으로 소화하여 얻어지는 약 1.1 kb 의 DNA 단편을 각각 조제하고, 이들과 SacⅠ 및 BamHⅠ으로 개환한 pTV118N 을 혼합하여 라이게이션을 실시하여 재조합 플라스미드를 구축한다. 이 플라스미드를 pRFS254SXNB 라 명명한다.
(3) PFU-RFC 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
실시예 9 (2) 에서 얻어진 플라스미드 pRFS254NdB 에 포함되는 삽입 DNA 단편에 대하여 디데옥시법에 의해 염기서열을 결정한다. 서열표의 서열번호 : 55 에 얻어진 염기서열중 3620 염기쌍분의 서열을 나타낸다. 이 염기서열로부터 여기에 코드되는 단백질의 아미노산서열을 추정하고, 이것을 기지의 RFC 소서브유닛의 것과 비교한 결과, PFU-RFC 의 아미노산서열중에는 개재서열 (intein) 이 1 개 존재하고 있음이 예상되었다. 이 개재서열은 서열표의 서열번호 : 55 의 721 번에서 2295 번에 코드되어 있다.
(4) 개재서열을 제거한 PFU-RFC 발현용 플라스미드의 구축
실시예 9 (3) 에서 얻어진 염기서열 그리고 기지의 RFC 소서브유닛의 아미노산서열 및 이것을 코드하는 유전자의 염기서열을 참고로 서열표의 서열번호 : 56 및 57 에 염기서열을 나타내는 프라이머 RF-CBΔⅠ 및 RF-CAΔⅠ을 합성한다. 이 양프라이머의 5'말단을 인산화한 것을 사용하여 상기한 플라스미드 pRFS254SXNB 를 주형에 사용한 인버스 PCR 을 실시한다. 인버스 PCR 에는 TaKaRa Ex Taq 를 사용하고, 이 효소의 사용설명서에 따라 100 ㎕ 의 반응액을 조제한다. 이 반응액에는 15 ng 의 플라스미드 pRFS254SXNB 및 20 pmol 씩의 프라이머를 첨가하고, 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 30 사이클의 반응을 실시한다. 인버스 PCR 에서 얻어진 증폭 DNA 단편을 DNA 블로팅키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 평활말단으로 한 후, 셀프라이게이션시켜 플라스미드를 구축하고, 이것을 플라스미드 pRFS254ⅠSΔⅠ이라 명명한다.
그리고, 상기 플라스미드를 XbaⅠ 및 NcoⅠ으로 소화하여 단리된 약 400 bp 의 XbaⅠ-NcoⅠ단편과, 실시예 9 (2) 에서 얻어진 플라스미드 pRFS254NdB 에서 단리된 약 500 bp 의 XbaⅠ-SacⅠ단편, 약 1.1 kb 의 NcoⅠ-BamHⅠ단편을 혼합하여 플라스미드벡터 pTV118N 의 BamHⅠ-SacⅠ부위간에 서브클로닝한다. 이렇게 얻어진 재조합 플라스미드를 pRFS254SNc 라 명명한다. 또한, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 Escherichia coli JM109/pRFS254SNc 라 명명한다. 이 형질전환체는 PFU-RFC 를 고발현함이 판명되었다.
(5) 개재서열을 포함하지 않은 PFU-RFC 를 코드하는 유전자의 염기서열의 결정
실시예 9 (4) 에서 얻어진 플라스미드 pRFS254SXNB 유래의 약 400 bp 의 XbaⅠ-NcoⅠ단편을 플라스미드벡터 pTV118N 벡터에 서브클로닝하여 그 삽입 DNA 단편의 염기서열을 결정함으로써, 제거된 개재서열의 경계부분을 코드하는 염기서열을 확인하였다. 그 결과 및 실시예 9 (3) 의 결과로부터 개재서열을 포함하지 않는 PFU-RFC 를 코드하는 유전자의 염기서열을 결정한다. 이렇게 얻어진 개재서열을 포함하지 않는 PFU-RFC 를 코드하는 오픈리딩프레임의 염기서열 및 이 염기서열로부터 추정되는 PFU-RFC 의 아미노산서열을 각각 서열표의 서열번호 : 4 및 3 에 나타낸다.
(6) 정제 PFU-RFC 표품의 조제
실시예 9 (4) 에서 얻어진 Escherichia coli JM109/pRFS254SNc 를 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지중에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 44.1 ㎖ 의 소니케이션버퍼에 현탁하고, 실시예 2 (1) 과 동일한 방법으로 35.2 ㎖ 의 열처리 상청액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 버퍼 (D) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼에 제공하고 FPLC 시스템을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. PFU-RFC 는 RESOURCE Q 칼럼을 그냥 지나친다.
그냥 지나친 PFU-RFC 획분 35 ㎖ 를 버퍼 (D) 로 평형화한 RESOURCE S 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용해서 0 ∼ 500 mM NaCl 직선농도구배에 의해 용출하여 170 mM NaCl 부분에 용출된 PFU-RFC 획분을 얻는다. 이 획분 2.9 ㎖ 를 센트리콘 10 에 의해 농축하고, 얻어진 105 ㎕ 의 농축액을 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-염산 버퍼, pH 8.0 로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출을 실시한 결과, PFU-RFC 는 약 150 킬로달톤의 분자량에 상당하는 위치에 용출되었다. 이 분자량은 PFU-RFC 가 4 량체를 형성한 경우에 상당한다.
(7) 프라이머 신장반응에 미치는 PFU-RFC 의 효과
실시예 8 (5) 와 동일한 방법으로 PFU-RFC 및 F7 의 존재가 Pfu 폴리머라아제 C 의 프라이머 신장반응에 미치는 효과에 대하여 조사하였다. 표 3 에 그 결과를 나타낸다. 표 3 에 나타내는 바와 같이 PFU-RFC 는 Pfu 폴리머라아제 C 의 활성을 약간 촉진하고 있다. 그리고, F7 과 동시에 PFU-RFC 를 첨가한 경우에는 F7 을 단독으로 첨가한 경우에 비하여 2 배 이상의 활성촉진이 보였다.
Pfu 폴리머라아제 C F7 PFU-RFC 효소활성 (cpm)
-90 fmol90 fmol90 fmol90 fmol --9.6 pmol-9.6 pmol ---356 fmol356 fmol 10036627434638740
주 : 표중의 Pfu 폴리머라아제 C 의 양은 2 개의 DNA 폴리머라아제 구성 단백질 1 분자씩으로이루어지는 단백질로서, 또한 F7, PFU-RFC 의 양은 각각 3 량체, 4 량체 단백질로서의양을 나타낸다.
실시예 10
(1) 항 Pfu DNA폴리머라아제 항체의 조제
12 ㎖ (30,000 유닛) 의 클론된 Pfu DNA 폴리머라아제 (스트라타진사 제조) 를 센트리콘-10 을 사용한 한외여과에 의해 농축한 후, 얻어진 0.1 ㎖ 의 농축액을 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM NaCl 을 함유하는 50 mM 트리스-염산 (pH 8.0) 으로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. 동일한 버퍼에 의해 용출하고, 약 76 킬로달톤의 분자량에 상당하는 위치에 용출된 Pfu DNA 폴리머라아제 획분을 회수한다. 이 획분 0.8 ㎖ 를 센트리콘-10 에 의해 농축하고, 이 농축액을 항원으로 하여 항 Pfu DNA 폴리머라아제 폴리크로날 항체의 조제에 사용한다. Pfu DNA 폴리머라아제의 농도가 2 ㎎/㎖ 로 되도록 상기한 농축액을 생리식염수로 희석하고, 이것에 등량의 완전 Freund's adjuvant 를 첨가하여 유화시킨다. 이것을 1 회 250 ㎕, 3 주일 걸러 4 회 토끼피하에 주사한다. 최종면역으로부터 10 일후에 전혈을 채취하고, 이것을 실온에 60 분간 방치한 후, 원심분리하여 항 Pfu 폴리머라아제 폴리크로날 항체를 함유하는 항혈청 60 ㎖ 를 얻는다. 이 항혈청 26 ㎖ 에 26 ㎖ 의 포화황산암모늄용액을 첨가하여 4 ℃ 에서 45 분간 천천히 교반한 후에 원심분리한다. 침전을 5 ㎖ 의 20 mM 인산나트륨버퍼 (pH 7.0) 에 현탁하고, 동일한 버퍼로 평형화한 PD-10 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 탈염을 실시한다. 이 용액 10 ㎖ 를 20 mM 인산나트륨버퍼 (pH 7.0) 로 평형화한 프로테인 A 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, 동버퍼로 세정한 후, 0.1M 구연산나트륨버퍼 (pH 3.0) 로 용출한다. 용출한 항 Pfu DNA 폴리머라아제 폴리크로날항체를 포함하는 획분을 1M 트리스-염산, pH 9.0 으로 중화한 후, 센트리플로 CF-50 으로 농축하고, PD-10 칼럼으로 커플링버퍼 (0.5M 염화나트륨, 0.2M 중탄산나트륨, pH 8.3) 로 치환하여 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체를 함유하는 용액을 조제한다.
(2) 항 Pfu 폴리머라아제 항체 칼럼의 제작
HiTrap NHS-activated 칼럼 (파르마시아사 제조) 을 1 mM 염산 6 ㎖ 로 세정한 후, 상기 항 Pfu DNA 폴리머라아제 폴리크로날 항체 용액 0.9 ㎖ (4.5 ㎎ 상당의 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체를 포함함) 를 적용한다. 이하, 실시예 2 (3) 과 동일한 방법에 의해 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체 칼럼을 조제한다.
(3) 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체 칼럼을 사용한 Pfu DNA 폴리머라아제 F7 복합체 형성의 확인
피로코커스·프리오서스 DSM 3638 을 실시예 1 에 기재된 방법과 마찬가지로 배양하여 배양액 9 ℓ분의 균체를 얻는다. 이 균체를 33 ㎖ 의 2 mM PMSF 를 함유하는 버퍼 (C) (50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 1 mM ATP) 에 현탁하여 초음파파쇄기에 가한다. 얻어진 파쇄액을 12000 rpm, 10 분간 원심하고, 얻어진 상청액 44 ㎖ 를 버퍼 (C) 로 평형화한 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체 칼럼에 제공한다. 칼럼을 0.1M NaCl 을 함유하는 버퍼 (C) 로 세정한 후, 용출버퍼 (50 mM 트리스-염산 pH 8.0, 8 M 요소) 로 Pfu DNA 폴리머라아제 복합체를 용출하고, 이 용출액을 SDS-PAGE (12.5 % 폴리아크릴아미드 겔, 영동완충액으로서 25 mM 트리스-염산, 192 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.4 를 사용) 에 제공한다. 영동후의 겔을 통상의 방법으로 Coomassie brilliant blue R-250 으로 염색한 결과, 도 10 에 나타내는 바와 같이 Pfu DNA 폴리머라아제의 밴드 이외에 상기한 F7 에 상당하는 위치에 밴드가 검출되었다.
따라서, 이 용출액의 농축액을 상기한 바와 마찬가지로 SDS-PAGE 에 제공하고, 얻어진 겔에 대하여 실시예 3 (2) 와 동일한 방법으로 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체를 사용한 웨스턴 블로팅을 실시한다. 도 10 에 나타내는 SDS-PAGE 의 결과 및 상기한 웨스턴블로팅의 결과로부터 F7 에 상당하는 위치의 밴드가 항 Pfu DNA 폴리머라아제 항체와 반응하지 않는 단백질임이 밝혀졌다.
그리고, 이 밴드에 존재하는 단백질의 N 말단 아미노산서열을 실시예 3 (2) 와 동일한 방법으로 분석한 결과, 이 단백질이 F7 임이 판명되었다.
(4) 겔 여과 크로마토그래피를 사용한 Pfu DNA 폴리머라아제와 F7 의 복합체 형성의 확인
실시예 8 (4) 에서 얻어진 F7 표품 1.2 ㎖ 를 PD-10 칼럼을 사용하여 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM NaCl 을 함유하는 50 mM 트리스-염산 (pH 8.0) 으로 버퍼치환한 후, 센트리콘-10 을 사용하여 50 ㎕ 로 농축한다.
실시예 10 (1) 에 기재된 Pfu DNA 폴리머라아제 0.1 mM 의 용액, 상기한 F7 0.1 mM (3 량체로서 계산) 의 용액 및 Pfu DNA 폴리머라아제 0.1 Mm 과 F7 0.1 mM 의 혼합물 각각 10 ㎕ 씩을 60 ℃ 에서 90 ℃ 까지 30 분 동안 가열한다. 가열처리한 각각의 용액을 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-염산 버퍼, pH 8.0 으로 평형화한 Superdex 200 PC 3.2/30 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하여 동일한 버퍼로 용출을 실시한다. Pfu DNA 폴리머라아제 및 F7 은 각각 약 76 킬로달톤 및 128 킬로달톤의 분자량에 상당하는 위치에 용출된다. 이에 비하여 Pfu DNA 폴리머라아제와 F7 의 혼합물의 경우에는 약 320 킬로달톤에 상당하는 메인피크 및 약 128 킬로달톤에 상당하는 마이너피크로서 용출된다. 이 2 개의 피크를 갖는 획분을 각각 SDS-PAGE (12.5 % 폴리아크릴아미드 겔, 영동완충액으로 25 mM 트리스-염산, 192 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.4 를 사용) 에 제공한 결과, 약 320 킬로달톤에 상당하는 획분에는 Pfu DNA 폴리머라아제 및 F7 이, 또한 약 128 킬로달톤에 상당하는 획분에는 F7 만이 포함되어 있었다. 이 점에서 Pfu DNA 폴리머라아제와 F7 이 복합체를 형성하고 있음이 판명되었다.
(5) Pfu DNA 폴리머라아제 F7 복합체의 신장활성
실시예 10 (4) 에 기재된 겔 여과에 있어서, 약 76 킬로달톤에 상당하는 Pfu DNA 폴리머라아제 단독 및 320 킬로달톤에 상당하는 Pfu DNA 폴리머라아제와 F7 의 혼합체의 겔 여과에 의해 얻어진 용출액을 20 ㎕ 씩 나누어 취하고, 각각에 대하여 실시예 8 (5) 에 나타내는 비표지 M13-HT 프라이머를 기질로 한 활성측정방법에 의해 프라이머 신장활성을 측정한다. 또한, 동시에 실시예 2 (1) 에 기재된 활성화 DNA 를 기질로 한 방법으로 받아들임 활성의 측정을 실시한다. 그 결과를 도 11 에 나타낸다. 양획분에 대하여 받아들임 활성에 대한 프라이머 신장활성의 비율을 조사한 결과, 약 320 킬로달톤 획분으로 0.65, 약 76 킬로달톤 획분으로 0.29 라는 값을 얻을 수 있으며, F7 과의 복합체 형성에 의해 Pfu DNA 폴리머라아제 신장활성이 촉진됨이 판명되었다.
실시예 11
(1) RFC 대서브유닛의 동족체를 코드하는 유전자를 포함하는 코스미드클론의 선택
메타노코커스 쟈나쉬이의 RFC 대서브유닛의 아미노산서열 [Science, Vol.273, p.1058 ∼ 1073 (1996)] 에 대하여 실시예 9 에 기재된 개재서열을 포함하지 않는 PFU-RFC 소서브유닛의 아미노산서열과의 상동성을 조사하고, 이들 사이에서 잘 보존되어 있는 영역의 아미노산서열을 참고로 RFC 대서브유닛을 코드하는 유전자를 탐색하기 위한 프라이머 RFLS15 를 합성한다. 서열표의 서열번호 : 60 에 프라이머 RFLS15 의 염기서열을 나타낸다. 이 프라이머와 RFC 의 양서브유닛 단백질에 존재하는 유사 아미노산서열에 대응하는 상기 프라이머 RF-F1 을 조합하여 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 을 실시한다. 이 PCR 에는 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 0.25 ㎍ 의 주형 DNA 및 각 100 pmol 씩의 프라이머를 사용하여 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 실시한다. 이 PCR 에 의해 증폭된 2 종의 DNA 단편중 PFU-RFC 소서브유닛 유전자 유래의 증폭산물에 대하여 예상되는 것과는 사이즈가 다른 약 630 bp 의 증폭 DNA 단편을 단리한다. 이 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC119 에 서브클로닝하여 그 염기서열을 결정한 후, 얻어진 염기서열을 참고로 서열포의 서열번호 : 61 및 62 에 각각 염기서열을 나타내는 프라이머 RFLS-S3 및 RFLS-S4 를 합성한다.
이 양프라이머를 사용하여 실시예 1 에서 조제한 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, RFC 대서브유닛의 동족체를 코드하는 유전자를 갖는 것으로 생각되는 코스미드클론을 선택한다. PCR 에는 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 를 1 사이클로 하는 30 사이클의 반응을 실시한다. 그 결과, No. 254, 310, 313, 377 및 458 의 코스미드클론에 목적하는 유전자 (PFU-RFCLS 유전자) 가 포함되는 것을 알 수 있었다. 이들 번호의 코스미드클론은 상기 PFU-RFC 유전자가 포함되는 코스미드클론과 일치하였다. 따라서, 서열표의 서열번호 : 55 에 나타난 플라스미드 pRFS254NdB 의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 조사한 결과, PFU-RFC 유전자의 훨씬 하류에 해당하는 상기 서열의 3109 번에서 시작되는 오픈리딩프레임에 RFC 대서브유닛의 동족체 (PFU-RFCLS) 가 코드되어 있음이 판명되었다. 그러나, 이 플라스미드 pRFS254NdB 에는 PFU-RFCLS 유전자의 전체길이는 유지되어 있지 않았다.
(2) PFU-RFCLS 유전자의 서브클로닝
PFU-RFCLS 유전자 전체길이를 포함하는 DNA 단편을 단리하기 위하여 상기 클론 No.254 를 NheⅠ으로 소화하고, 얻어진 여러 NDA 단편을 잘라내서 플라스미드벡터 pTV118N (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝한다. 얻어진 각각의 재조합 플라스미드를 주형으로 RFLS-S3 및 RFLS-S4 를 프라이머에 사용하여 PCR 을 실시하고, PFU-RFCLS 유전자가 존재하는지의 여부를 조사한 결과, 약 11 kb 의 NheⅠ단편에 RFLS 유전자가 존재함이 판명되었다. 따라서, 이 NheⅠ단편이 pTV118N 에 넣어진 것을 플라스미드 pRFLSNh 라 명명한다. 또한, 이 플라스미드에 포함되는 삽입 DNA 단편에 대하여 제한효소지도를 작성한 결과, 도 12 에 나타내는 바와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
그리고, 이 플라스미드에 포함되는 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법으로 결정한다. 얻어진 염기서열중 PFU-RFCLS 를 코드하는 오픈리딩프레임 부분의 염기서열을 서열표의 서열번호 : 63 에 나타낸다. 또한, 상기 서열로부터 추정되는 PFU-RFCLS 의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 64 에 나타낸다.
실시예 12
(1) F5 유전자를 포함하는 코스미드클론의 선택
실시예 3 에서 얻어진 F5 의 N 말단 아미노산서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 65 및 66 에 각각 염기서열을 나타내는 프라이머 F5-1-1 및 F5-2 를 합성한다. 실시예 4 에서 조제한 PstⅠ카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 해서 100 pmol 씩의 F5-1-1 및 카세트 프라이머 C1 (다카라슈조사 제조) 을 사용하여 1 회째의 PCR 을 실시하고, 그 반응액 1 ㎕ 를 주형으로 해서 100 pmol 씩의 F5-2 및 카세트 프라이머 C2 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 2 회째의 PCR 을 실시한다. 이 2 회의 PCR 에는 TaKaRa PCR 증폭키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 첨부한 명세서에 따라 실시한다. 증폭된 약 900 bp 의 DNA 단편을 플라스미드벡터 pTV118N (다카라슈조사 제조) 에 서브클로닝한다. 얻어진 플라스미드를 pF5P2 라 명명하고, 그 염기서열을 결정한다. 그 후, 얻어진 서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 67 및 68 에 각각 염기서열을 나타내는 프라이머 F5S1 및 F5S2 를 합성한다. 이 F5S1 및 F5S2 를 사용해서 실시예 1 에 나타낸 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하여 F5 유전자를 포함하는 코스미드클론을 선택한다. PCR 에는 TaKaRa PCR 증폭키트를 사용하여 첨부한 명세서에 따라 실시한다. 그 결과, No. 15, 96, 114, 167, 277, 348, 386, 400, 419, 456, 457 및 484 의 코스미드클론에 F5 유전자가 포함됨을 알 수 있었다. 이들 번호의 코스미드클론은 F7 유전자가 포함되는 코스미드클론과 일치한다. 따라서, 서열표의 서열번호 : 41 에 나타난 염기서열을 조사한 결과, 상기 서열상에서 F7 유전자 하류에 해당하는 892 번 이후에 F5 유전자의 전반부분이 포함되어 있음이 판명되었다.
(2) F5 유전자의 서브클로닝
F5 유전자를 서브클로닝하기 위하여 실시예 8 에서 얻어진 플라스미드 pF7-HH-18 및 상기 플라스미드 pF5P2 를 사용하여 F5 유전자 주변의 NcoⅠ, BamHⅠ, PstⅠ, HindⅢ 및 NdeⅠ (다카라슈조사 제조) 의 제한효소지도를 작성한 결과, 도 13 에 나타내는 바와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
도 13 에 나타낸 제한효소지도에 의거하여 코스미드클론 No. 15 를 NdeⅠ으로 소화하여 약 900 bp 의 단편을 잘라내서 플라스미드벡터 pTV118Nd 에 서브클로닝한다. 얻어진 재조합 플라스미드에 대하여 F5 유전자가 lac 프로모터에 대하여 정방향으로 삽입되어 있던 플라스미드를 pF5NNF-1 이라 명명한다.
(3) F5 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
상기 플라스미드 pF5NNF-1 의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법으로 결정한다. 얻어진 염기서열을 해석한 결과, 그곳에 코드되는 단백질의 N 말단 아미노산서열이 F5 의 것과 일치하는 오픈리딩프레임이 발견되었다. 이 오픈리딩프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 : 69 에, 또한 상기 염기서열로부터 추정되는 F5 의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 70 에 각각 나타낸다. 이 아미노산서열에 대하여 기지의 단백질의 아미노산서열과의 상동성을 검색한 결과, 상동성이 있는 단백질은 보이지 않았다.
(4) F5 를 발현하기 위한 플라스미드의 구축
상기 플라스미드 pF5NNF-1 을 주형으로 하고, 서열표의 서열번호 : 71 및 72 에 각각의 염기서열을 나타내는 프라이머 F5Nco 및 F5CBam 을 사용하여 PCR 을 실시한다. 이 PCR 에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 실시한다. 1 ng 의 주형 DNA 및 20 pmol 씩의 양프라이머를 사용하여 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 을 1 사이클로 한 25 사이클의 반응을 실시한다. 증폭된 약 640 염기쌍의 DNA 단편을 NcoⅠ 및 BamHⅠ (모두 다카라슈조사 제조) 으로 소화하고, 얻어진 단편을 NcoⅠ 및 BamHⅠ으로 개환한 pET15b (노바겐사 제조) 와 라이게이션한다. 이 플라스미드를 pF5NBPET 라 명명한다. 상기 플라스미드중의 삽입 DNA 단편중 PCR 로 증폭한 영역은 디데옥시법으로 염기서열을 확인하여 PCR 에 기인하는 변이가 없음을 확인하였다.
플라스미드 pF5NBPET 로 형질전환된 대장균 HMS174(DE3), Escherichia coli HMS174(DE3)/pF5NBPET 에 대하여 F5 의 발현을 조사한 결과, 상기 형질전환체의 배양물중에 F5 에 상당하는 분자량의 단백질이 발현되어 있음이 나타났다.
실시예 13
(1) F3 유전자의 서브클로닝
실시예 3 에서 얻어진 F3 의 N 말단 아미노산서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 73 및 74 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F3-1 및 F3-3-1 을 합성한다. 실시예 4 의 BglⅡ/Sau3AⅠ카세트 DNA 1 ㎕ 를 주형으로 해서 100 pmol 의 프라이머 F3-1 및 20 pmol 의 카세트 프라이머 C1 을 사용하여 1 회째의 PCR 을 실시하고, 그 반응액 1 ㎕ 를 주형으로 해서 F3-3-1 및 카세트 프라이머 C2 를 사용하여 2 회째의 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소에 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 반응액으로 반응은 94 ℃ (30 초) ∼ 45 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (2 분) 을 1 사이클로 하여 1 회째를 30 사이클, 2 회째를 25 사이클로 실시한다. 이 반응에 의해 증폭된 약 500 bp 의 DNA 단편을 플라스미드벡터 pTV118N 에 서브클로닝하고, M4 및 RV 프라이머 (다카라슈조사 제조) 를 사용한 디데옥시법에 의해 그 염기서열의 일부를 결정한 후, 얻어진 서열에 의거하여 서열표의 서열번호 : 75, 76, 77 및 78 에 그 염기서열을 나타내는 프라이머 F3S1, F3S2, F3S3 및 F3S4 를 합성한다. 이 F3S1 및 F3S2 프라이머를 사용하여 실시예 1 에서 조제한 코스미드 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, F3 유전자를 포함하는 코스미드클론을 검색한 결과, F3 유전자를 포함하는 것으로 생각되는 코스미드클론은 발견되지 않았다. 따라서, 프라이머 F3S3 또는 F3S4 와 프라이머 C2 를 사용하여 실시예 4 의 각 카세트 DNA 를 주형으로 한 PCR 을 실시하고, F3 유전자 주변의 제한효소 확인부위를 맵핑한 결과로부터 SalⅠ부위와 HindⅢ 부위에 끼워진 약 2.6 kb 의 단편에 F3 유전자가 존재하는 것으로 예상된다. 이 결과에 의거하여 피로코커스 프리오서스의 게놈 DNA 4 ㎍ 을 SalⅠ 및 HindⅢ 으로 소화한 후, 2.6 kb 전후의 DNA 단편을 나누어 취하여 pTV118N 벡터에 서브클로닝한다. 이렇게 얻어진 각각의 재조합 플라스미드를 주형으로 프라이머 F3S4 및 프라이머 RV-N (다카라슈조사 제조) 을 사용한 PCR 에 의해 F3 유전자의 유무를 조사한다. 그 결과, F3 유전자를 포함하는 2.6 kb 의 SalⅠ-HindⅢ 단편을 갖는 플라스미드를 얻을 수 있으며, 이것을 플라스미드 pF3SH92 라 명명한다. 이 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109, Escherichia coli JM109/pF3SH92 에 대하여 F3 의 발현을 조사하였으나, F3 에 상당하는 분자량의 단백질이 발현되어 있음이 확인되었다.
(2) F3 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정
상기 플라스미드 pF3SH92 의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법으로 결정한다. 얻어진 염기서열을 해석한 결과, 그 곳에 코드되는 단백질의 N 말단 아미노산서열이 F3 의 것과 일치하는 오픈리딩프레임이 발견되었다. 이 오픈리딩프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 : 79 에, 또한 이 염기서열로부터 추정되는 F3 의 아미노산서열을 서열표의 서열번호 : 80 에 각각 나타낸다. 이 아미노산서열에 대하여 기지의 단백질의 아미노산서열과의 상동성을 검색한 결과, 마이코플라나 라모사유래의 아세틸폴리아민아미노하이드라아제 [Journal of Bacteriology, Vol.178, p.5781 ∼ 5786 (1996)] 및 인체의 히스톤데아세틸라아제 [Science, Vol.272, p.408 ∼ 411 (1996)] 사이에 상동성이 보였다.
실시예 14
다음 실시예에 있어서 시판되는 효소의 활성은 각 효소의 표시에 의거하여 나타낸다. 또한, 시판되는 효소를 포함하는 반응액의 조제는 특별히 구애되지 않는 한 각 효소의 설명서에 따르거나 혹은 첨부되어 있는 반응용 완충액을 사용하여 조제한다. PCR 은 GeneAmp PCR System 9600 (퍼킨엘머사 제조) 를 사용하여 실시한다.
(1) 항 PFU-RFC 항체의 조제
실시예 9 (6) 의 PFU-RFC 표품을 1 ㎎ / 100 ㎕ 가 되도록 50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM NaCl 로 희석하고, 이것에 등량의 완전 Freund's adjuvant 를 첨가하여 유화시킨다. 이것을 1 회마다 50 ㎕ 씩 3 주일 걸러 4회 토끼피하에 주사한다. 최종면역으로부터 10 일후에 전혈을 채취하고, 이것을 실온에 60 분간 방치한 후, 원심분리하여 항 PFU-RFC 폴리크로날 항체를 함유하는 항혈청 50 ㎖ 를 얻는다. 이 항혈청 20 ㎖ 에 20 ㎖ 의 포화황산암모늄용액을 첨가하여 4 ℃ 에서 45 분간 천천히 교반한 후에 원심분리한다. 얻어진 침전을 5 ㎖ 의 20 mM 인산나트륨 버퍼 pH 7.0 에 현탁하고, 동일한 버퍼 2 ℓ를 외액으로 하여 2 시간의 투석을 3 회 실시한다. 투석후의 용액 14 ㎖ 를 20 mM 인산나트륨 버퍼 (pH 7.0) 로 평형화한 프로테인 A 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, 동 버퍼로 세정한 후, 0.1 M 구연산나트륨 버퍼 (pH 3.0) 로 용출한다. 용출한 항 PFU-RFC 항체를 1M 트리스-염산, pH 9.0 으로 중화한 후, 센트리플로 CF-50 으로 농축하고, PD-10 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 커플링버퍼 (0.5M 염화나트륨, 0.2M 중탄산나트륨, pH 8.3) 로 치환하여 항 PFU-RFC 항체를 함유하는 용액을 조제한다.
(2) 항 PFU-RFC 항체 칼럼의 제작
HiTrap NHS-activated 칼럼 (파르마시아사 제조) 을 1 mM 염산 6 ㎖ 로 세정한 후, 상기 항 PFU-RFC 폴리클로날 항체 용액 0.95 ㎖ (3.8 ㎎ 상당의 항 PFU-RFC 항체를 포함함) 를 적용한다. 이후, 실시예 2 (3) 과 동일한 방법으로 항 PFU-RFC 항체 칼럼을 조제한다.
(3) 항 PFU-RFC 항체 칼럼을 사용한 PFU-RFC 를 함유하는 복합체의 정제
피로코커스·프리오서스 DSM 3638 을 실시예 1 에 기재된 방법과 마찬가지로 배양하여 배양액 10 ℓ분의 균체를 얻는다. 이 균체를 33 ㎖ 의 2 mM PMSF 를 함유하는 버퍼 (C) (50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 1 mM ATP) 에 현탁하여 초음파파쇄기에 가한다. 파쇄액을 12000 rpm, 10 분간 원심하여 얻어진 상청액 38 ㎖ 를 0.1 M NaCl 을 함유하는 버퍼 (C) 로 평형화한 항 PFU-RFC 항체 칼럼에 제공한다. 칼럼을 0.1 M NaCl 을 함유하는 버퍼 (C) 로 세정한 후, 85 ℃ 에서 1 시간 가열하여 0.1 M NaCl 을 함유하는 버퍼 (C) 로 PFU-RFC 복합체를 용출한다. 이 용출액을 SDS-PAGE (12.5 % 폴리아크릴아미드 겔, 영동완충액으로서 25 mM 트리스-염산, 192 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.4 를 사용) 에 제공하고, 영동후의 겔을 통상의 방법으로 Coomassie brilliant blue R-250 으로 염색한 결과, PFU-RFC 의 밴드 이외에 상기 F7 에 상당하는 33 킬론달톤의 위치에 1 개와 60 킬로달톤 부근에 2 개의 밴드가 검출되었다.
따라서, 이들 3 개의 밴드에 존재하는 단백질의 N 말단 아미노산서열을 실시예 3 (2) 와 동일한 방법으로 분석한 결과, 도 14 에 나타내는 바와 같이 상기 F7 에 상당하는 위치의 단백질의 N 말단 아미노산서열은 F7 과, 60 킬로달톤 부근의 2 종류의 단백질의 N 말단 아미노산서열은 모두 상기 PFU-RFCLS 의 N 말단 아미노산서열과 일치한다.
이어서, 이 용출액에 함유되는 PFU-RFC, PFU-RFCLS, F7 의 단백질량을 이들의 단백질에 결합되는 Coomassie brilliant blue 의 양에 의해 정량한다. 용출액을 SDS-PAGE (12.5 % 폴리아크릴아미드 겔, 영동완충액으로서 25 mM 트리스-염산, 192 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.4 를 사용) 에 제공하고, 영동후의 겔을 통상의 방법으로 Coomassie brilliant blue R-250 으로 염색한 후, 밴드를 잘라내고 500 ㎕ 의 70 % 포름산으로 Coomassie brilliant blue 를 추출하여 630 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정한다. 농도 기지의 실시예 8 (4) 의 F7 표품 및 실시예 9 (6) 의 PFU-RFC 표품을 사용하여 작성한 검량선에 의거하여 용출액 500 ㎕ 중에 208 ㎍ 의 PFU-RFC, 55 ㎍ 의 PFU-RFCLS, 51 ㎍ 의 F7 단백질이 함유됨을 알 수 있었다. 상기한 바와 같이 PFU-RFC, PFU-RFCLS 및 F7 3 개의 단백질로 구성된 복합체를, 이하 RFC-N 복합체라 한다.
(4) 프라이머 신장반응에 미치는 RFC-N 복합체의 효과
실시예 14 (3) 에서 얻어진 RFC-N 복합체의 각종 폴리머라아제로의 프라이머 신장반응에 미치는 효과를 조사하기 위하여 Pfu 폴리머라아제 C, Pfu DNA 폴리머라아제 (α형 DNA 폴리머라아제, 스트라타진사 제조) 의 활성을 RFC-N 복합체를 첨가한 경우와 그 구성성분인 F7 만을 첨가한 경우에 대하여 비교한다. DNA 폴리머라아제 활성의 측정은, Pfu 폴리머라아제 C 또는 Pfu DNA 폴리머라아제를 50 fmol 사용한 것을 제외하고, 실시예 8 (5) 에 기재된 방법과 동일하게 실시한다. DNA 폴리머라아제 활성의 측정은 실시예 8 (5) 에 나타낸 바와 같이 M13 퍼지 본쇄 DNA (M13mp18ss DNA, 다카라슈조사 제조) 에 45 염기의 합성 올리고누클레오티드인 HT 프라이머를 어닐링시킨 것 (M13-HT 프라이머) 을 사용한다. 서열표의 서열번호 : 42 에 HT 프라이머의 염기서열을 나타낸다. Pfu DNA 폴리머라아제에서의 결과를 도 15 에 나타낸다. F7 및 RFC-N 복합체의 첨가량은 반응액중에 함유되는 F7, RFC-N 복합체의 몰수로 나타낸다. 도 15 에 나타내는 바와 같이 Pfu DNA 폴리머라아제에 대하여 RFC-N 복합체는 F7 단독에 비하여 높은 활성의 상승을 나타낸다.
그리고, 프라이머 신장활성에 대하여 실시예 8 (5) 에 기재된 방법으로 검토를 실시한다. 측정용 반응액은 하기 조성으로 조제한 : ① 100 fmol 의 F7, ② 0.05 ㎕ 의 RFC-N 복합체 (60 fmol 의 F7 함유), ③ 10 fmol 의 Pfu 폴리머라아제 C, ④ 10 fmol 의 Pfu 폴리머라아제 C + 100 fmol 의 F7, ⑤ 10 fmol 의 Pfu 폴리머라아제 C + 0.05 ㎕ 의 RFC-N 복합체, ⑥ 20 fmol 의 F7, ⑦ 0.02 ㎕ 의 RFC-N 복합체 (24 fmol 의 F7 함유), ⑧ 10 fmol 의 Pfu DNA 폴리머라아제, ⑨ 10 fmol 의 Pfu DNA 폴리머라아제 + 20 fmol 의 F7, ⑩ 10 fmol 의 Pfu DNA 폴리머라아제 + 0.02 ㎕ 의 RFC-N 복합체. 각각의 측정용 반응액 1 ㎕ 에 0.01 ㎍ / ㎕ 의32P 표지 M13-HT 프라이머를 함유하는 9 ㎕ 의 반응액 (20 mM 트리스-염산 (pH 9.0), 15 mM 염화마그네슘, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 각각 40 μM 의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 을 첨가하여 75 ℃ 에서 2.5 분간 반응시킨다. 반응종료후, 반응액을 빙랭하여 반응을 정지하며, 그리고 1 ㎕ 의 200 mM EDTA, 5 ㎕ 의 반응정지액 (95 % 포름아미드, 20 mM EDTA, 0.05 % 브로모페놀블루, 0.05 % 크실렌시아놀) 을 첨가하여 95 ℃, 5 분간의 열변성처리를 실시한다. 이 반응액중 1.6 ㎕ 를 8M 요소를 함유하는 6 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동한 후에 오토라디오그램을 제작한다.
이어서, 보다 장쇄인 프라이머 신장반응물을 해석하기 위하여 실시예 8 (5) 에 기재된 방법으로 해석한다. 상기 ①∼⑩ 의 시료액 각 1 ㎕ 에 종농도 0.01 ㎍/㎕ 의 M13-HT 프라이머를 함유하는 9 ㎕ 의 반응액 (20 mM 트리스-염산, pH 9.0, 0.15 mM 염화마그네슘, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 각각 40 μM 의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP, 84 nM [α-32P]-dCTP) 을 첨가하여 75 ℃ 에서 2.5 분간 반응시킨다. 반응종료후, 빙랭한 반응액에 1.11 ㎕ 의 200 mM EDTA, 1.23 ㎕ 의 500 mM NaOH, 2.47 ㎕ 의 6 배 농도 로딩버퍼 (0.125 % 브로모페놀블루, 0.125 % 크실렌시아놀, 9 % 글리세롤) 를 순차 첨가하고, 그 중 6 ㎕ 를 0.5 % 알칼리 아가로스 겔을 사용하여 전기영동한 후, 오토라이오그램을 제작한다.
Pfu 폴리머라아제 C 및 Pfu DNA 폴리머라아제 C 모두 F7 단독에 비하여 RFC-N 복합체 첨가시의 장쇄의 신장산물의 양이 증가하였다.
그리고, 장쇄신장산물의 장쇄에 대해서는 모든 폴리머라아제가 F7 단독과 RFC-N 복합체로 주형 전체길이의 약 7.2 kb 까지 인정되었다.
실시예 15 rRFC-M 발현용 플라스미드의 구축
(1) PFU-RFCLS 와 PFU-RFC 를 동시에 발현시키는 플라스미드를 구축한다. 실시예 11 (2) 에서 얻어진 염기서열을 참고로 서열표의 서열번호 : 81 에 염기서열을 나타내는 프라이머 RFLS-NdeN 및 서열번호 : 82 에 염기서열을 나타내는 RFLS-S9 를 합성한다. 이 양프라이머를 사용하고, 상기한 플라스미드 pRFLSNh 를 주형으로 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소로서 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 10 ng 의 플라스미드 pRFLSNh 와 20 pmol 씩의 프라이머를 첨가하고, 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (3 분) 를 1 사이클로 하는 30 사이클의 반응을 실시한다. PCR 에서 얻어진 증폭 DNA 단편을 NdeⅠ과 PstⅠ으로 소화하여 단리된 약 920 bp 의 NdeⅠ-PstⅠ단편과, 실시예 11 (2) 에서 얻어진 플라스미드 pRFLSNh 에서 단리된 약 600 bp 의 PstⅠ-EcoRⅠ단편, 실시예 9 (4) 에서 얻어진 플라스미드 pRFS254SNc 에서 단리된 약 2 kb 의 EcoRⅠ-BamHⅠ단편을 혼합하여 플라스미드벡터 pTV119Nd 의 NdeⅠ-BamHⅠ부위간에 서브클로닝한다. 이렇게 얻어진 재조합 플라스미드를 pRFC10 이라 명명하고, 또한 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 Escherichia coli JM109/pRFC10 이라 명명한다. 상기 형질전환체는 PFU-RFCLS 및 PFU-RFC 를 고발현함이 판명되었다.
(2) PFU-RFCLS 및 PFU-RFC 를 코드하는 유전자의 염기서열의 결정
실시예 15 (1) 에서 얻어진 플라스미드 pRFC10 중의 삽입 DNA 단편중 PCR 로 증폭한 영역은 디데옥시법으로 염기서열을 확인하여 PCR 에 기인하는 변이가 없음을 확인한다. 이 결과와 실시예 9 (3) 및 실시예 11 (2) 의 결과로부터 PFU-RFCLS 및 개재서열을 포함하지 않는 PFU-RFC 를 코드하는 유전자의 염기서열을 결정한다. 이렇게 얻어진 PFU-RFCLS 및 개재서열을 포함하지 않는 PFU-RFC 를 코드하는 유전자에 대하여 염기서열을 서열표의 서열번호 : 83 에, 또한 그 제한효소지도를 도 16 에 나타낸다.
실시예 16 rRFC-M 표품의 조제
실시예 15 (1) 에서 얻어진 Escherichia coli JM109/pRFC10 을 암피실린이 100 ㎍/㎖, IPTG 가 1 mM 의 농도로 존재하는 LB 배지 (트립톤 10 g/ℓ, 효모엑기스 5 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ, pH 7.2) 500 ㎖ ×4 에서 16 시간 배양을 실시한다. 집균후, 균체를 35.9 ㎖ 의 소니케이션버퍼 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤, 2 mMPMSF (페닐메탄술포닐플루오라이드)) 에 현탁하여 초음파파쇄기에 가한다. 12000 rpm, 10 분 원심분리한 후, 80 ℃, 15 분간의 열처리를 실시한다. 그 후, 다시 12000 rpm, 10 분의 원심분리를 실시하여 33.0 ㎖ 의 열처리 효소액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 버퍼 (A) (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, FPLC 시스템 (파르마시아사 제조) 을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 용출은 0 ∼ 500 mM 의 염화나트륨 직선농도구배에 의해 실시한다.
용출액을 SDS-PAGE (12.5 % 폴리아크릴아미드 겔, 영동완충액으로서 25 mM 트리스-염산, 192 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.4 를 사용함) 로 분석한 결과, PFU-RFCLS 및 PFU-RFC 는 모두 240 mM 염화나트륨의 농도로 용출되어 있었다. 실시예 9 (6) 에 기재된 바와 같이 PFU-RFC 단독으로 발현시킨 균체로부터 얻어진 용출액을 RESOURSE Q 칼럼에 제공한 경우에는 상기 RESOURCE Q 칼럼에는 흡착되지 않았으나, PFU-RFCLS 와 PFU-RFC 를 동시에 발현시킨 균체로부터 얻어진 용출액을 RESOURCE Q 칼럼에 제공하면 흡착되어, 상기한 바와 같이 240 mM 염화나트륨의 농도로 PFU-RFCLS 와 PFU-RFC 가 동시에 용출된다. 그 결과로부터 이들 양단백질이 복합체를 형성하고 있음을 나타낸다. 이하, 이 복합체를 rRFC-M 복합체라 한다.
rRFC-M 복합체 획분을 모아 얻어진 4.8 ㎖ 의 효소용액을 센트리플로 CF50 을 사용하여 농축한 후, PD-10 칼럼 (파르마시아사 제조) 으로 150 mM 염화나트륨을 함유하는 버퍼 (A) 로 치환하고, 3.5 ㎖ 의 용액을 150 mM 염화나트륨을 함유하는 버퍼 (A) 로 평형화한 헤파린 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 150 mM →650 mM 염화나트륨 직선농도구배에 의해 전개하고, 450 mM 염화나트륨 부분에 용출된 rRFC-M 복합체 획분을 얻는다. 이 획분 3.9 ㎖ 를 센트리콘-10 (아미콘사 제조) 을 사용하여 농축하고, 115 ㎕ 의 농축액을 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM 염화나트륨으로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출을 실시한 결과, rRFC-M 복합체의 리텐션타임은 26.3 분이었다. 동일조건에서의 분자량 마커의 용출위치와의 비교결과로부터 rRFC-M 복합체는 약 370 킬로달톤으로 산출된다.
그리고, rRFC-M 복합체중의 각 유닛의 구성비를 구하기 위하여, 상기 약 370 kDa 의 분자량의 용출획분을 SDS-PAGE 에 제공한다.
영동후의 겔을 통상의 방법으로 Coomassie brilliant blue R-250 염색후, PFU-RFCLS 및 PFU-RFC 의 단백질의 밴드를 잘라내고, 500 ㎕ 의 70 % 포름산으로 추출한다. 각 추출액의 630 ㎚ 의 흡수를 측정하고, 그 결과를 실시예 9 (6) 에서 조제한 PFU-RFC 를 사용하여 제작한 검량선과 비교함으로써, 각각의 단백질량을 구하여 몰수를 계산한다.
그 결과, PFU-RFCLS 와 PFU-RFC 는 1 : 4 의 비율로 존재하였다. 상기에 나타낸 겔 여과로부터 산출된 rRFC-M 복합체의 분자량은 약 370 kDa 임에 의거하여 rRFC-M 복합체는 2 분자의 PFU-RFCLS 와 8 분자의 PFU-RFC 로 형성되어 있는 것으로 생각된다. 따라서, 상기 rRFC-M 복합체를 1 단위로 하여 몰수를 산출한다.
실시예 17 F3 발현용 플라스미드의 구축
(1) 실시예 13 에서 제작한 플라스미드 pF3SH92 를 주형으로 해서 서열표의 서열번호 : 84 에 염기서열을 나타내는 프라이머 F3Nd 및 서열번호 : 76 에 염기서열을 나타내는 F3S2 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 효소로서 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 실시예 5 (1) 과 동일한 조성의 반응액으로 1 ng 의 플라스미드 pF3SH92 와 20 pmol 씩의 프라이머를 첨가하고, 94 ℃ (30 초) ∼ 55 ℃ (30 초) ∼ 72 ℃ (1 분) 를 1 사이클로 하는 30 사이클의 반응을 실시한다. PCR 에서 얻어진 증폭 DNA 단편을 NdeⅠ과 PstⅠ으로 소화하여 단리된 약 0.5 kb 의 NdeⅠ-PstⅠ단편과, 플라스미드 pF3SH92 에서 단리된 약 1.1 kb 의 PstⅠ-EcoRⅠ단편을 혼합하여 플라스미드벡터 pTV119Nd 의 NdeⅠ-EcoRⅠ부위간에 서브클로닝한다. 이렇게 얻어진 재조합 플라스미드를 pF3-19 라 명명한다. 또한, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 Escherichia coli JM109/pF3-19 라 명명한다. 상기 형질전환체는 F3 를 고발현함이 판명되었다.
(2) F3 를 코드하는 유전자의 염기서열의 결정
실시예 17(1) 에서 얻어진 플라스미드 pF3-19 중 삽입 DNA 단편중 PCR 로 증폭한 영역은 디데옥시법으로 염기서열을 확인하여 PCR 에 기인하는 변이가 없음을 확인한다.
실시예 18 정제 F3 표품의 조제
실시예 17 (1) 에서 얻은 Escherichia coli JM109/pF3-19 을 암피실린이 100 ㎍/㎖ 농도로 존재하는 LB 배지 (트립톤 10 g/ℓ, 효모엑기스 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, pH 7.2) 500 ㎖ ×4 에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 50 ㎖ 의 소니케이션버퍼 [50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤, 2 mM PMSF (페닐메탄술포닐플루오라이드)] 로 현탁하여 초음파파쇄기에 가한다. 12000 rpm, 10 분의 원심분리후, 상청액을 80 ℃, 15 분간의 열처리에 가한다. 그 후, 다시 12000 rpm, 10 분간의 원심분리를 실시하여 얻어진 44 ㎖ 의 열처리 상청액을 실시예 16 에 기재된 버퍼 (A) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, FPLC 시스템 (파르마시아사 제조) 을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 전개는 0 →500 mM 의 NaCl 직선농도구배에 따라 실시한다. 140 mM 에서 240 mM NaCl 부분에서 용출된 F3 을 함유하는 획분 11 ㎖ 의 용액에 3 M 의 황산암모늄을 함유하는 버퍼 (A) 를 5.5 ㎖ 첨가하여 1 M 황산암모늄을 함유하는 버퍼 (A) 로 평형화한 HiTrap butyl 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 1 M 황산암모늄을 함유하는 버퍼 (A) 로 칼럼을 세정한 후, 0.5 M 황산암모늄을 함유하는 버퍼 (A) 로 F3 를 용출한다. 상기 획분 6 ㎖ 를 0.5 M 황산암모늄을 함유하는 버퍼 (A) 로 평형화한 HiTrap phenyl 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. FPLC 시스템을 사용하여 0.5 M 황산암모늄을 함유하는 버퍼 (A) 로 칼럼을 세정한 후에 버퍼 (A) 로 F3 을 용출한다. 이 획분 9.5 ㎖ 을 센트리콘-10 (아미콘사 제조) 을 사용하여 농축하고, 155 ㎕ 농축액을 50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM NaCl 로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출한 결과, F3 은 리텐센타임 42.1 분의 위치에 용출된다. 동일조건에서의 분자량 메이커의 용출위치와 비교한 결과로부터 분자량 약 25 킬로달톤으로 예상된다. F3 의 분자량의 이론값은 37 킬로달톤임에 의거하여 F3 은 단량체인 것으로 추정된다.
실시예 19 정제 F5 표품의 조제
실시예 12 (4) 에서 얻은 플라스미드 pF5NBPET 에서 형질전환된 대장균 HMS174 (DE3), Escherichia coli HMS174(DE3)/pF5NBPET 를 암피실린이 100 ㎍/㎖ 농도로 존재하는 LB 배지 (트립톤 10 g/ℓ, 효모엑기스 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, pH 7.2) 500 ㎖ ×4 에서 16 시간 배양한다. 집균후, 균체를 61 ㎖ 의 소니케이션버퍼로 현탁하여 초음파파쇄기를 사용하여 파쇄한다. 파쇄후의 균체를 12000 rpm, 10 분의 원심분리후, 상청액을 80 ℃, 15 분간의 열처리에 가한다. 그 후, 다시 12000 rpm, 10 분의 원심분리를 실시하여 얻어진 60.5 ㎖ 의 열처리 상청액에 8.71 g 의 황산암모늄을 첨가하여 4 ℃ 에서 2 시간 교반한 후에 12000 rpm, 10 분의 원심분리를 실시한다. 침전물을 19 ㎖ 의 버퍼 (A) 로 용해시켜 버퍼 (A) 로 투석한다. 투석후의 효소액을 버퍼 (A) 로 평형화한 RESOURCE Q 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공하고, FPLC 시스템 (파르마시아사 제조) 을 사용하여 크로마토그래피를 실시한다. 전개는 0 →500 mM 의 NaCl 직선농도구배에 따라 실시한다. 350 mM 에서 450 mM NaCl 부분에서 용출된 F5 를 함유하는 획분 11 ㎖ 의 용액을 센트리콘-10 (아미콘사 제조) 을 사용하여 농축하고, 222 ㎕ 농축액을 50 mM 트리스-염산, pH 8.0, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 75 mM NaCl 로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 제공한다. 동일한 버퍼로 용출한 결과, F5 은 리텐센타임 32.5 분의 위치에 용출되었다. 동일조건에서의 분자량 메이커의 용출위치와 비교한 결과로부터 분자량 약 145 킬로달톤으로 예상된다. 이 분자량은 F5 가 7 량체를 형성한 경우에 상당한다.
실시예 20 프라이머의 제작
γDNA 의 염기서열에 의거하여 γ1B ∼ γ5, γ7 ∼ γ9 의 8 종류의 프라이머를 합성한다. 프라이머 γ1B ∼ γ5, γ7 ∼ γ9 의 염기서열을 각각 서열표의 서열번호 : 85 ∼ 92 에 나타낸다. 이들 프라이머의 조합에 의해 γDNA 를 주형으로 한 PCR 로 증폭되는 증폭 DNA 단편의 쇄길이를 표 4 에 나타낸다.
프라이머쌍 증폭 DNA 단편의 쇄길이
γ1B/γ2γ1B/γ3γ1B/γ4γ1B/γ5γ1B/γ7γ1B/γ8γ1B/γ9 0.5 kb1 kb2 kb4 kb8 kb10 kb12 kb
실시예 21 DNA 폴리머라아제에 대한 F1 단백질의 효과
실시예 5 에서 얻은 F1 단백질에 대하여 PCR 로의 효과를 조사한다. γDNA 을 주형으로 한 1 ∼ 4 kb 의 DNA 단편의 증폭반응을 실시하기 위하여, 프라이머쌍으로서 프라이머 γ1B 및 γ3, 프라이머 γ1B 및 γ4, 프라이머 γ1B 및 γ5 의 각각을 사용하고, 다음에 나타내는 조성의 반응액을 조사한다 : 10 mM 트리스 염산, pH 9.2, 75 mM 염화칼륨, 6 mM 염화마그네슘, 각각 0.4 mM 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 0.01 % BSA 및 1.25 단위의 Pfu 폴리머라아제 C, 500 pg 의 주형 DNA, 5 p㏖ 씩의 각 프라이머, 173 p㏖ 의 F1 단백질 (최종용량은 25 ㎕). 각 반응액에 대하여 98 ℃, 0 초 ∼ 68 ℃, 0 초를 1 사이클로 한 30 사이클의 반응을 실시한다. 그리고, 본 명세서에 있어서「98 ℃, 0 초」,「68 ℃, 0 초」등의 기재는 온도가 설정된 온도에 도달함과 동시에 다음 설정온도로의 이행이 일어나도록 반응장치를 프로그램한 것을 나타낸다.
반응종료후, 반응액 5 ㎕ 를 1 % 아가로스 겔 (다카라슈조사 제조) 로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, 사용한 프라이머쌍에 따라 1 kb, 2 kb, 4kb 의 DNA 단편이 증폭되어 있음이 확인되었다. 한편, 상기 반응액의 F1 단백질을 첨가하지 않은 것을 상기 반응조건으로 PCR 한 결과 어떤 증폭단편도 확인되지 않았다.
실시예 22 DNA 폴리머라아제에 대한 F1, F3, F5 단백질의 효과
실시예 5 에서 얻어진 F1 단백질, 실시예 18 에서 얻어진 F3 단백질, 실시예 19 에서 얻어진 F5 단백질을 사용하여 PCR 에 의한 λDNA 를 주형으로 한 6 kb 의 DNA 단편의 증폭으로의 효과에 대하여 검토한다. 프라이머쌍으로서 프라이머 λ1 및 λ6 을 사용한 것 이외에는 실시예 21 과 동일한 조성의 반응액을 조제한다. 그리고, F1 단백질은 173 p㏖, F3 단백질은 10 pmol, F5 단백질은 1 p㏖ 을 각각 반응액에 첨가하여 최종용량은 25 ㎕ 로 한다. 각 반응액에 대하여 98 ℃, 1 초 ∼ 68 ℃, 2 분을 1 사이클로 한 30 사이클의 반응을 실시한다. 반응종료후, 반응액 5 ㎕ 를 1 % 아가로스 겔로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, F1, F3, F5 단백질의 각 존재하 모든 경우에서 6 Kb 의 증폭단편이 확인되었다. 한편, 이들 단백질을 첨가하지 않은 경우에는 증폭단편은 확인할 수 없었다.
실시예 23 DNA 폴리머라아제에 대한 F2, F4 단백질의 효과
실시예 6 에서 얻어진 F2 단백질, 실시예 7 에서 얻어진 F4 단백질을 사용하여 PCR 에 의한 λDNA 를 주형으로 한 4 kb 의 DNA 단편의 증폭반응으로의 효과에 대하여 검토한다. 프라이머쌍으로서 프라이머 λ1B 및 λ5, 0.75 단위의 Pfu 폴리머라아제 C, 1 ng 의 주형 λDNA 를 사용한 것 이외에는 실시예 21 과 동일한 조성의 반응액을 조제한다. 그리고 F2 단백질, F4 단백질은 각각 1.095 p㏖ 을 반응액에 첨가하여 최종용량을 25 ㎕ 로 한다. 각 반응액에 대하여 94 ℃, 30 초 ∼ 55 ℃, 30 초 ∼ 72 ℃, 2 분을 1 사이클로 한 25 사이클의 반응을 실시한다. 반응종료후, 반응액 5 ㎕ 를 1 % 아가로스 겔로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, F2, F4 단백질의 각 존재하 모든 경우에서 4 Kb 의 증폭단편이 확인되었다. 한편, 이들 단백질을 첨가하지 않은 경우에는 증폭단편은 확인할 수 없었다.
실시예 24 DNA 폴리머라아제에 대한 rRFC-M 복합체의 효과
rRFC-M 복합체의 각종 폴리머라아제로의 프라이머 신장반응에 미치는 효과를 조사하기 위하여, Pfu 폴리머라아제 C, Pfu DNA 폴리머라아제 (α형 DNA 폴리머라아제, 스트라타진사 제조) 의 활성을 rRFC-M 복합체와 F7 이 공존하는 경우와 F7 만 존재하는 경우에 대하여 비교한다.
DNA 폴리머라아제 활성의 측정은 50 fmol 의 Pfu 폴리머라아제 C 또는 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하고, 400 fmol 의 rRFC-M 복합체 및 0 ∼ 200 fmol 의 F7 을 첨가한 것 이외에는 실시예 8 (5) 에 기재된 방법과 동일하게 실시한다. Pfu DNA 폴리머라아제를 사용한 경우의 효과를 도 17 에 나타낸다. Pfu DNA 폴리머라아제에 대한 효과로서 rRFC-M 복합체와 F7 가 공존하는 경우가 F7 단독에 비하여 높은 활성의 상승을 나타낸다. 또한, Pfu 폴리머라아제 C 에 대한 효과도 Pfu DNA 폴리머라아제의 경우와 동일한 경향이었다.
실시예 25 PCR 에 있어서의 rRFC-M 복합체와 F7 단백질 공존의 효과
λDNA 를 주형으로 한 4 kb 의 DNA 단편의 증폭반응을 실시하기 위하여, 프라이머 λ1B 및 λ5 를 사용하고, 0.375 단위의 Pfu 폴리머라아제 C 를 사용한 것 이외에는 실시예 21 과 동일한 조성의 반응액을 조제한다. 그리고, rRFC-M 복합체는 312.5 fmol, F7 단백질은 125 fmol 을 반응액에 각각 첨가하여 최종용량은 25 ㎕ 로 한다. 각 반응액에 대하여 98 ℃, 0 초 ∼ 68 ℃, 10 초를 1 사이클로 한 30 사이클의 반응을 실시한다. 반응종료후, 반응액 5 ㎕ 를 1 % 아가로스 겔 (다카라슈조사 제조) 로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, rRFC-M 복합체와 F7 단백질이 공존한 계는 사용한 프라이머쌍에 따라 4 kb 의 DNA 단편이 증폭되어 있음이 확인되었다. 한편, 이들 단백질을 첨가하지 않은 경우에는 증폭단편은 확인할 수 없었다.
또한, λDNA 를 주형으로 한 8 ∼ 12 kb 의 DNA 단편의 증폭반응에 대하여 동일한 실험을 실시한다. 프라이머쌍으로서 프라이머 λ1B 및 λ7, 프라이머 λ1B 및 λ8, 프라이머 λ1B 및 λ9 의 각각을 사용하며, 그리고 0.375 단위의 Pfu 폴리머라아제 C, 2.5 ng 의 주형 λDNA 를 사용한 것 이외에는 실시예 21 과 동일한 조성으로 조제한다. 그리고, rRFC-M 복합체는 312.5 fmol, F7 단백질은 125 fmol 을 반응액에 각각 첨가하여 최종용량은 25 ㎕ 로 한다. 각 반응액에 대하여 98 ℃, 0 초 ∼ 68 ℃, 3 분을 1 사이클로 한 30 사이클의 반응을 실시한다. 반응종료후, 반응액 5 ㎕ 를 1 % 아가로스 겔 (타카라슈조사 제조) 로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, rRFC-M 복합체와 F7 단백질이 공존한 계는 사용한 프라이머쌍에 따라 8 kb, 10 kb, 12 kb 의 DNA 단편이 증폭되어 있음이 확인되었다. 한편, 아무것도 첨가하지 않은 계에서는 8 kb 의 DNA 단편만 확인할 수 있었다.
실시예 26 Pfu DNA 폴리머라아제에 대한 rRFC-M 복합체와 F7 단백질 공존의 효과
λDNA 를 주형으로 한 4 kb 의 DNA 단편의 증폭반응을 실시하기 위하여, 프라이머쌍으로서 프라이머 λ1B 및 λ3, 프라이머 λ1B 및 λ4, 프라이머 λ1B 및 λ5 의 각각을 사용하여 다음에 나타내는 조성의 반응액을 조제한다 : Pfu DNA 폴리머라아제 첨부 버퍼, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 각 0.5 단위의 Pfu 폴리머라아제, 500 pg 의 주형 DNA, 2.5 p㏖ 씩의 각 프라이머, 2.5 p㏖ 의 rRFC-M 복합체 단백질 및 0.5 p㏖ 의 F7 단백질 (최종용량은 25 ㎕). 각 반응액에 대하여 94 ℃, 30 초 ∼ 55 ℃, 30 초 ∼ 72 ℃, 1 분을 1 사이클로 한 25 사이클의 반응을 실시한다. 반응종료후, 반응액 5 ㎕ 을 1 % 아가로스 겔로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, rRFC-M 복합체와 F7 단백질이 공존한 계는 사용한 프라이머쌍에 따라 1 kb, 2kb, 4kb 의 DNA 단편이 증폭되어 있음이 확인되었다. 한편, 이들 단백질을 첨가하지 않은 경우에는 1 kb ∼ 2 kb 의 DNA 단편만을 확인할 수 있었다.
실시예 27 혼합형 DNA 폴리머라아제에 대한 rRFC-M 복합체와 F7 단백질 공존의 효과
2 종의 DNA 폴리머라아제를 혼합하여 사용하는 PCR 에 대하여 rRFC-M 복합체와 F7 단백질 공존의 효과를 조사한다.
λDNA 를 주형으로 한 1 kb 의 DNA 단편의 증폭반응을 실시하기 위하여, 프라이머쌍으로서 프라이머 λ1B 및 λ3 을 사용하여 다음에 나타내는 조성의 반응액을 조제한다 : 다카라 LA Taq용 첨부 버퍼 (Mg 플러스), 각각 0.4 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 1.25 단위의 LA Taq DNA 폴리머라아제 (다카라슈조사 제조), 500 pg 의 주형 DNA, 5 p㏖ 씩의 각 프라이머, 62.5 fmol 의 RFC 복합체 단백질 및 12.5 fmol 의 F7 단백질 (최종용량은 25 ㎕). 각 반응액에 대하여 98 ℃, 0 초 ∼ 68 ℃, 10 초를 1 사이클로 한 30 사이클의 반응을 실시한다. 반응종료후, 반응액 5 ㎕ 을 1 % 아가로스 겔로 전기영동하여 증폭단편을 확인한다.
그 결과, rRFC-M 복합체와 F7 단백질을 첨가한 계와 상기 반응액에 rRFC-M 복합체만 첨가한 계, F7 단백질만 첨가한 계, LA Taq DNA 폴리머라아제만의 계를 비교한 결과, rRFC-M 복합체와 F7 단백질을 첨가한 계가 가장 효율적으로 1 kb 의 DNA 단편을 증폭함이 확인되었다.
본 발명에 의해 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 향상시키는 DNA 폴리머라아제 관련인자가 제공된다. 이 인자는 각종 DNA 폴리머라아제에 대하여 작용을 나타내고, 또한 DNA 폴리머라아제가 사용되는 각종 공정에 이용할 수 있고, 유전자공학 연구용 시약으로 유용하다. 그리고, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자를 사용한 유전자공학적인 이 효소의 제조도 가능해진다.

Claims (18)

  1. DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자.
  2. 제 1 항에 있어서, DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 더욱 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자.
  3. 제 2 항에 있어서, 서열표의 서열번호 : 5 또는 6 에 나타나는 아미노산서열을 갖는 DNA 폴리머라아제 구성 단백질을 함유하는 DNA 폴리머라아제에 결합하는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종의 아미노산서열 또는 상기 아미노산서열에 있어서 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산서열을 함유하여 이루어지는 DNA 폴리머라아제 관련인자.
  5. 서열표의 서열번호 : 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 및 80 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종의 아미노산서열 또는 이 아미노산서열에 있어서 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 혹은 삽입된 아미노산서열을 함유하고, DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자.
  6. 제 5 항에 있어서, 서열표의 서열번호 : 2, 4, 18, 26, 33, 63, 69 및 79 로 이루어지는 군에서 선택된 염기서열 또는 이 염기서열에 있어서 1 개 이상의 염기가 치환, 결실, 부가 혹은 삽입된 염기서열을 함유하여 이루어지는 유전자.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 유전자와 하이브리다이즈하고 또한 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 관련인자를 코드하는 유전자.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 함유시킨 형질전환체를 배양하고, 이 배양물로부터 DNA 폴리머라아제가 갖는 DNA 합성활성을 촉진시키는 내열성 DNA 폴리머라아제 관련인자를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 관련인자의 제조방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 를 합성하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제를 사용하는 DNA 의 합성방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 2 종 이상의 DNA 폴리머라아제 관련인자의 존재하에 DNA 를 합성하는 DNA 의 합성방법.
  11. 제 10 항에 있어서, DNA 폴리머라아제 관련인자로서 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 의 존재하에 DNA 의 합성을 실시하는 DNA 합성방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 폴리머라아제가 내열성 DNA 폴리머라아제인 DNA 의 합성방법.
  13. 제 12 항에 있어서, PCR 법에 의해 실시되는 DNA 의 합성방법.
  14. 시험관내 DNA 합성에 사용되는 키트로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 폴리머라아제 관련인자 및 DNA 폴리머라아제를 함유하여 이루어지는 키트.
  15. 제 14 항에 있어서, DNA 합성반응에 필요한 시약을 더욱 함유하여 이루어지는 키트.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 2 종 이상의 DNA 폴리머라아제 관련인자를 함유하여 이루어지는 키트
  17. 제 16 항에 있어서, DNA 폴리머라아제 관련인자로서 F7, PFU-RFC 및 PFU-RFCLS 를 함유하여 이루어지는 키트.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 폴리머라아제로서 내열성 DNA 폴리머라아제를 함유하여 이루어지는 키트.
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