CN101213295B - 变异型pcna - Google Patents
变异型pcna Download PDFInfo
- Publication number
- CN101213295B CN101213295B CN2006800244616A CN200680024461A CN101213295B CN 101213295 B CN101213295 B CN 101213295B CN 2006800244616 A CN2006800244616 A CN 2006800244616A CN 200680024461 A CN200680024461 A CN 200680024461A CN 101213295 B CN101213295 B CN 101213295B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- pcna
- pcr
- primer
- pfu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及变异型PCNA。本发明的课题在于构建一种通用性优异、便于使用的DNA复制反应体系。PCNA是参与DNA复制的因子之一，本发明所提供的PCNA单体具有如下的氨基酸序列，在单体的N末端区域与其他单体的C末端区域形成为界面而形成多聚体的情况中，在各单体的界面区域中，形成单体相互的分子间相互作用的部位上的氨基酸残基由电荷上相互排斥的氨基酸残基构成。
Description
技术领域
本发明涉及DNA复制因子，更详细地说，本发明涉及具有优异的辅助DNA复制的功能的PCNA(Proliferating Cell NuclearAntigen，增殖细胞核抗原)。
背景技术
基因扩增技术和PCR法
伴随着基因工学技术等的发展，扩增DNA和RNA等核酸的技术广泛渗透至从基础研究到产业利用的领域中。在早期，为获得特定的目标核酸序列，通常采用利用限制性酶由在酵母或大肠杆菌宿主内扩增后的核酸上切下所需的序列来进行制备的方法，但由于Mullis等人的PCR法的开发和普及，使在试管内扩增作为目标的特定的核酸区域成为了可能。对于PCR法，随着专用装置和相关试剂的积极的商品化和销售，进行了各种各样在研究上、产业上的应用开发，从而实质上成为了基因扩增技术的规范方法。随着DNA复制的研究的发展，也设计开发出原理不同于PCR的各种技术，但出于操作性/成本/品质上的观点，这些技术缺乏普遍性，因而还没有出现可以击败PCR法的技术。
PCR法的评价点
据认为PCR法的原理是最小限度地在细胞内模仿DNA复制的形式。即，1)利用目标核酸模板的热变性进行解离、2)目标序列与互补的1对引物的结合、3)利用DNA聚合酶进行引物的与模板互补的延长反应。通过连续重复这些反应，呈指数函数关系地扩增目标核酸序列。在一般的PCR的试验记录中，将数量级为ng的模板的数kb的目标序列通过2个小时左右的反应扩增至μg的数量级是常见的。
PCR法具有技术上的限制，这可以举出有代表性的4点。这4点为：1)对模板的忠实性(扩增与模板对应的精确序列的性能)、2)延长性(扩增更长序列的性能)、3)目标序列的扩增效率、4)反应特异性。大多同时提出这些作为评价PCR技术的要点。为了克服这些限制，正在进行着PCR用试剂/试剂盒的开发。
PCR的改善
作为早期的PCR用DNA聚合酶，通常为源自作为嗜热菌的水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)(非专利文献1)。以该酶为基础，随后开发、销售出各种各样的PCR用酶或试剂/试剂盒。这些技术大多对上述的技术限制点进行了改良，具有这些特征的试剂/试剂盒由各制造商进行销售。下面介绍PCR法的一个改良例。
作为提高对模板的忠实性的例子，通常在PCR法中使用高忠实度型的DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶是仅具有5’→3’聚合酶活性而不保持3’→5’核酸外切酶活性的PolI型DNA聚合酶。与此相对，源自作为极端嗜热古细菌的激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶是保持有5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性这两者的α型DNA聚合酶。3’→5’核酸外切酶活性起到校正活性的作用。因此，将该DNA聚合酶用于PCR反应的情况中，与不保持3’→5’核酸外切酶活性的Taq聚合酶相比，扩增时的模板忠实度得到飞跃性的提高(非专利文献2)。
这样的DNA聚合酶之中，作为已市售的制品的例子，包括PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa Bio社)、Pfu DNA聚合酶(Stratagene社)、KOD DNA聚合酶(东洋纺社)、DeepVent DNA聚合酶(New England Biolabs(NEB)社)、Vent DNA聚合酶(NEB社)、Pwo DNA聚合酶(Roche Diagnostics社)。
Barns等人报告出，以适当的比例混合具有校正功能的α型DNA聚合酶和不具有校正功能的PolI型DNA聚合酶用于PCR反应时，能够延长的目标序列变长，扩增效率也同时得到了提高(非专利文献3、专利文献1)。作为这种混合型DNA聚合酶已市售的制品例，包括TaKaRa EX TaqDNA聚合酶(TaKaRa Bio社)、Taq Plus Long(Stratagene社)等。
作为提高PCR的反应特异性的一个例子，已知有热启动法。PCR反应的非特异性大多是由于引物在模板DNA上的非特异性退火所导致的。为了避免这种情况，在高温下进行了PCR反应液的完全混合后立即启动PCR反应的热启动法是有效的。对于热启动法，已报告出几种方法，现在的主流是，使DNA聚合酶和其特异的抗体形成复合体，在低温条件下为非活性型，在热启动时的高温条件下才活性化并进行PCR反应。有报告指出该方法中PCR反应的特异性得到了提高(专利文献2)。与该热启动法相对应的制品也由各基因工学制造商销售，得以通常的利用。
上述PCR法的改善法均具有实用性，被制品化后得以通常的利用，但均是各有利弊，没有同时满足上述所示的PCR法的所有的改善点。例如，高忠实度型的α型DNA聚合酶与PolI型DNA聚合酶相比，大多延长性较差，并且，在混合α型和PolI型DNA聚合酶的PCR法中，其忠实度不及高忠实度型DNA聚合酶。期待一种所有方面均优异的DNA聚合酶或DNA扩增体系。
DNA复制过程
通常在DNA复制开始时，首先需要解开复制起点的双链结构，此处需要DNA解旋酶。单链DNA结合蛋白质结合在解开的DNA上，使单链稳定化。进而，用于合成引物的引物酶在各个链上发挥作用。接着，复制因子Replication Factor C(RFC)识别引物并与之结合，将增殖细胞核抗原(PCNA)诱导至DNA链上。PCNA起到将DNA聚合酶留在DNA链上的夹钳(clamp)的作用。并且，与PCNA复合的DNA聚合酶合成新生链。连续合成中直接合成出长的新生链，在不连续合成中，附属于各冈崎片段的RNA引物被核酸酶分解，转换为DNA链后，DNA连接酶使片段结合，完成一条新生链(非专利文献4和5)。
Pfu-PCNA和RFC
有报告指出，激烈火球菌PCNA(下文中表示为“Pfu-PCNA”或“PfuPCNA”)的分子量为28.0kDa，Pfu-PCNA与真核生物的PCNA同样地形成同源三聚体，与聚合酶相互作用而发挥功能(非专利文献6)。另一方面，激烈火球菌RFC(下文中表示为“Pfu-RFC”或“PfuRFC”)是RFCS和RFCL的亚单元结构。Pfu-RFCS的开放阅读框编码1处内含子，成熟型Pfu-RFCS的分子量为37.4kDa。Pfu-RFCL的分子量为55.3kDa。有报告指出，在引物延伸试验中，Pfu-RFC、Pfu-PCNA的添加会显著促进PfuDNA聚合酶的DNA延长活性(非专利文献7)。
Pfu-PCNA的结构和性质
对Pfu-PCNA进行了结晶结构解析(非专利文献8)。根据解析结果，Pfu-PCNA三聚体由2个亚单元的反平行β链(βI1和βD2)间的主链的氢键(T108-K178、T110-E176、R112-E174)形成，进而，由酸性/碱性氨基酸侧链形成的分子间的离子对网络与三聚体结构的维持相关。另外，与该离子对网络相关的残基(N末端区域的R82、K84、R109和C末端区域的E139、D143、D147)中，对将D143、D147置换为作为中性氨基酸的丙胺酸的2种变异体(PfuPCNA(D143A)和PfuPCNA(D143A/D147A))进行的研究已有论文报告(非专利文献9)。论文中不仅描述了PfuPCNA(D143A)和PfuPCNA(D143A/D147A)在凝胶过滤中在单体的位置上溶出、结晶中得到V字形二聚体而不是三聚体，还对引物延伸试验中的活性测定结果进行了记述。根据该论文，PfuPCNA(D143A/D147A)无论在PCNA单独时还是合用RFC时，都不显示DNA合成促进活性，而PfuPCNA(D143A)则与RFC无关地显示出DNA合成促进活性，并且，PCNA单独时的情况下，显示出优于野生型的结果。
KOD-PCNA和RFC
KOD-PCNA(下文中表示为“KOD-PCNA”或“KODPCNA”)和KOD-RFC(下文中表示为“KOD-RFC”或“KODRFC”)为由Thermococcuskodakaraensis(热球菌属，为超嗜热古细菌)KOD-1菌株得到的PCNA和RFC。
对于KOD-PCNA在非专利文献12中有报告。据报告，KOD-PCNA具有249个残基，计算出的分子量为28.2kDa。在先报告的Pfu-PCNA也具有249个残基，两者的氨基酸序列有84.3％一致。并且，KOD-PCNA与Pfu-PCNA同样地保持有PCNA中具有特征的全部保存区域，虽然未对KOD-PCNA进行结晶结构解析，由其与Pfu-PCNA的高相同性进行推测，其极有可能以与Pfu-PCNA同样的形态形成同源三聚体。
对于KOD-RFC在非专利文献10中有报告。据报告，KOD-RFC与其他的RFC同样地为RFCL和RFCS的亚单元结构。RFCL的分子量为57.2kDa。RFCS基因在开放阅读框中编码1处内含子，成熟型KOD-RFCS的分子量为37.2kDa。
上述2篇报告对将KOD-PCNA、KOD-RFC添加至基于KOD-DNA聚合酶的DNA合成体系中的情况的效果也进行了报告。据报告，引物延长实验的情况下，单独添加KOD-PCNA或在与KOD-RFC的共存下，会促进延长活性，在PCR反应体系中，添加KOD-PCNA时，会提高“敏感性(Sensitivity)”。
专利文献1：美国专利第5,436,149号公报
专利文献2：美国专利第5,338,671号公报
非专利文献1：Saiki，R.K.，Gelfand，D.H.，Stoffel，S.，Scharf，S.J.，Higuchi，R.，Horn，G.T.，Mullis，K.B.and Erlich，H.A.Science239，487-491(1988)
非专利文献2：Cline，JC Braman，and HH Hogrefe Nucl.Acids Res.24，3546-3551(1996)
非专利文献3：Barnes，W.M Proc.Natl.Acad.Sci.91，2216-2220(1994)
非专利文献4：Waga，S.and Stillman，B.Annu.Rev.Biochem.67，721-751(1998)
非专利文献5：Kornberg，A.and Baker，T.A.DNA replication，2nd ed.W.H.Freeman，New York.(1992)
非专利文献6：Cann et al，J.Bacteriol，181，6591-6599(1999)
非专利文献7：Cann et al.J.Bacteriol，183，2614-2623(2001)
非专利文献8：Matsumiya et al.Protein Sci.，10，17-23(2001)
非专利文献9：Matsumiya et al.Protein Sci.12，823-831(2003)
非专利文献10：Kitabayashi et al.Biosci Biotechnol Biochem.Nov；67(11)：2373-2380(2003)
非专利文献11：Takagi et al.Appl Environ Microbiol.Nov；63(11)：4504-4510(1997)
非专利文献12：Kitabayashi et al.Biosci Biotechnol Biochem.Oct；66(10)：2194-2200(2002)
发明内容
基于如上状况，本发明的课题在于构建一种通用性优异、便于使用的DNA扩增体系。
本发明人通过使用在上述DNA复制过程中利用的诸因子(下文中表示为“辅助蛋白”、“AP”)和DNA聚合酶，在试管内对细胞内DNA复制体系进行再构建，尝试着制成了克服现有PCR技术的缺点的新颖的DNA扩增体系。特别地，在具有3’→5’核酸外切酶活性、模板忠实度高的源自作为极端嗜热古细菌的激烈火球菌的DNA聚合酶、和细胞内DNA复制体系的诸因子(辅助蛋白)之中，着眼于极有可能与DNA聚合酶进行直接相互作用的PCNA和RFC，进行了深入的研究。
结果发现，一个单体的N末端区域与其他单体的C末端区域形成为界面而形成多聚体的情况下，通过使界面区域中形成单体相互的分子间相互作用的部位上的氨基酸残基由与另一个单体的界面区域内的氨基酸残基相互产生电荷排斥的氨基酸残基构成，则能够得到具有能够延长性和忠实性平衡良好地促进DNA的延长反应的作用的PCNA而几乎不依赖于是否存在RFC，从而完成了本发明。本发明提供如下的PCNA等。
(1)一种变异型PCNA单体，其是PCNA的单体，
在单体的N末端区域与其他单体的C末端区域形成为界面而形成多聚体的情况中，在各单体的界面区域中，形成单体相互的分子间相互作用的部位上的氨基酸残基由电荷上相互排斥的氨基酸残基构成，并且，
所述变异型PCNA单体在单体的状态下或是形成多聚体的状态下具有促进DNA复制的活性。
(2)如上述(1)所述的变异型PCNA单体，其中，所述PCNA单体为序列编号2或32所述的氨基酸序列的情况下，其具有选自由第82位、第84位、第109位、第139位、第143位和第147位组成的组中的至少一个位置上的氨基酸残基被替换为其他氨基酸残基的氨基酸序列，
选自下述组(i)的至少1个以上的氨基酸残基和选自下述组(ii)的1个以上的氨基酸残基由电荷上相互排斥的氨基酸残基构成，
(i)第82位、第84位和第109位的氨基酸残基组；
(ii)第139位、第143位和第147位的氨基酸残基组。
(3)如上述(2)所述的变异型PCNA单体，其中，在第82位、第84位、第109位、第139位、第143位和第147位以外的部位上含有选自由增加、插入、置换、和缺失组成的组中的1个或2个以上的氨基酸残基的变异。
(4)如上述(3)所述的变异型PCNA单体，其中，在序列编号2或32所述的氨基酸序列中，具有将第73位的氨基酸残基替换为亮氨酸后的序列。
(5)如上述(2)至(4)任一项所述的变异型PCNA单体，其中，选自所述组(i)的至少1个以上的氨基酸与选自所述组(ii)的至少1个以上的氨基酸这两者皆为酸性氨基酸或这两者皆为碱性氨基酸。
(6)如上述(2)至(5)任一项所述的变异型PCNA单体，其中，序列编号2或32所述的氨基酸序列中，具有将第143位的氨基酸残基替换为精氨酸后的序列。
(7)一种多核苷酸，其编码上述(1)～(6)任一项所述的PCNA单体所具有的氨基酸序列。
(8)一种转化体，其导入了上述(7)所述的多核苷酸。
(9)一种变异型PCNA的制造方法，其特征在于，利用培养基对上述(8)所述的转化体进行培养，使该转化体和/或培养基中累积PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体。
(10)一种DNA复制用试剂，其含有上述(1)～(6)任一项所述的PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体。
(11)一种DNA复制用试剂盒，其包括上述(10)所述的试剂。
(12)如上述(11)所述的DNA复制用试剂盒，其包括PCR用的试剂。
(13)一种DNA的复制方法，其特征在于，在上述(1)～(6)任一项所述的PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体以及DNA聚合酶的存在下进行DNA合成反应。
(14)如上述(13)所述的DNA的复制方法，其中，所述DNA的合成反应为PCR。
本发明为了进一步促进DNA复制反应，对PCNA单体的界面区域中的氨基酸序列进行了限定。本发明的PCNA对菌种不同的多种DNA聚合酶均具有适用性，通用性较高。并且，本发明的PCNA即使在不与RFC合用的情况下，也能够发挥出优异的DNA延长促进活性，在这方面，与以往相比能够发挥出极其优异的性能。
根据本发明，能够提供一种促进DNA的延长反应、通用性高的DNA复制促进因子。根据本发明，能够进行延长性和反应速度等各种特性均优异的DNA延长反应。
附图说明
图1是示意性显示PCNA的三聚体的图。
图2为显示在PCNA单体形成多聚体的情况下在成为单体间的接合部的界面区域上所形成的单体相互的分子间相互作用部位的一个例子的图。
图3为显示PCNA、RFC基因表达载体的制备的流程图。
图4为显示PCNA基因表达质粒的图。
图5为显示PCNA(蛋白质)的制备的流程图。
图6为显示PCNA蛋白质标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的图。
图7为显示RFCL表达质粒的图。
图8为显示RFCSm表达质粒的图。
图9为显示RFC(蛋白质)的制备的流程图。
图10为显示RFC标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的图。
图11为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增2kb的情况)的图。
图12为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增8.4kb的情况)的图。
图13为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增15.8kb的情况)的图。
图14为显示扩增长度为2kb的情况下在每单位延长时间中对Pyrobest添加PCNA13的添加效果的图。
图15为显示扩增长度为8.4kb的情况下在每单位延长时间中对Pyrobest添加PCNA13的添加效果的图。
图16为显示扩增长度为15.8kb的情况下在每单位延长时间中对Pyrobest添加PCNA13的添加效果的图。
图17为显示扩增长度为2kb的情况下在每单位延长时间中对ExTaq添加PCNA13的添加效果的图。
图18为显示扩增长度为8.4kb的情况下在每单位延长时间中对ExTaq添加PCNA13的添加效果的图。
图19为显示扩增长度为15.8kb的情况下在每单位延长时间中对ExTaq添加PCNA13的添加效果的图。
图20为显示扩增长度为2kb的情况下在每单位延长时间中对VentDNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图21为显示扩增长度为8.4kb的情况下在每单位延长时间中对VentDNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图22为显示扩增长度为2kb的情况下在每单位延长时间中对DeepVent DNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图23为显示扩增长度为8.4kb的情况下在每单位延长时间中对DeepVent DNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图24为显示对Pfu Turbo DNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图25为显示对KOD DNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图26为显示对Pwo DNA聚合酶添加PCNA13的添加效果的图。
图27为显示KOD-PCNA基因表达载体的制备的流程图。
图28为显示KOD-PCNA基因表达质粒的图。
图29为显示KOD-PCNA蛋白质的制备的流程图。
图30为显示KOD-PCNA蛋白质标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的图。
图31为显示KOD-RFCL基因表达载体的制备的流程图。
图32为显示KOD-RFCL基因表达质粒的图。
图33为显示KOD-RFCSm(成熟型RFCS)基因表达载体的制备的流程图。
图34为显示KOD-RFCS基因表达质粒的图。
图35为显示KOD-RFC蛋白质的制备的流程图。
图36为显示KOD-RFC蛋白质标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的图。
图37为显示对KOD DNA聚合酶添加KOD-PCNA变异体和KOD-RFC的添加效果的图。
图38为显示对Pyrobest添加KOD-PCNA变异体和KOD-RFC的添加效果的图。
图39为显示PCR模板忠实性的测定的流程图。
图40为显示PCNA蛋白质标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的图。
图41为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增2kb的情况)的图。
图42为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增8.4kb的情况)的图。
图43为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增15.8kb的情况)的图。
图44为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增2kb的情况)的图。
图45为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增8.4kb的情况)的图。
图46为显示对Pyrobest添加各种PCNA变异体和RFC的添加效果(扩增15.8kb的情况)的图。
符号说明
1：PCNA三聚体
10a、10b、10c：PCNA单体
20：PCNA单体间的接合部
PCNA基因：PCNA基因ORF
T7启动子：T7启动子
rbs：核糖体结合部位
T7终止子：T7终止子
Amp：氨苄青霉素抗性基因
Ori：复制起点
RFCL基因：RFCL基因ORF
RFCSm基因：成熟型RFCS基因ORF
Kan：卡那霉素抗性基因
具体实施方式
下面举出本发明的实施方式，对本发明进一步详细地说明。另外，实施本发明的生物化学或基因工学的方法时，参照了例如MolecularCloning：ALABORATORYMANUAL(分子克隆试验指南)(第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001))、新遺伝子工学ハンドブック(新基因工学手册)(村松正实等编，羊土社，实验医学增刊，第3版，1999年)、タンパク質実験の進め方(蛋白质实验的进行方法)(冈田雅人、宫崎香编，羊土社，第1版，1998年)、タンパク質実験ノ一ト(蛋白质实验报告)(冈田雅人、宫崎香编，羊土社，第2版，1999年)、タンパク質実験ハンドブック(蛋白质实验手册)(竹绳忠臣编集，实验医学增刊，初版，2003年8月15日)、PCR実験ノ一ト(PCR实验报告)(谷口武俊编集，羊土社，第1版，1997年)等各种实验指南中的记载。
本说明书中，对于碱基序列、氨基酸序列及每个构成因子，有时会使用以字母表示的省略符号，但这些符号都是符合分子生物学/基因工学方面的惯例的。并且，本说明书中，为了简洁地表示氨基酸序列的变异，使用例如“D143A”等的表示方法。“D143A”表示第143位的天冬氨酸被置换为丙氨酸，即，显示出了置换前的氨基酸残基的种类、其位置、置换后的氨基酸残基的种类。并且，除非特别表示，序列编号与序列表中所记载的序列编号对应。
1.本发明的PCNA
本发明的PCNA单体对参与多聚体形成的界面区域内的规定位置上的氨基酸残基进行了限定。即，本发明的PCNA单体由如下的氨基酸残基构成，该氨基酸残基使得所述PCNA单体在界面区域内形成分子间相互作用的部位在单体彼此间电荷上相互排斥。此处“分子间相互作用”是指分子间产生的物理、化学、或者电学上的相互作用，包括例如基于立体构象/立体结构等分子的结构的作用、以及离子键、氢键、疏水性相互作用等各种分子间的作用。PCNA单体形成多聚体的情况下，通过单体彼此的界面区域相互吸引或接合等分子间的相互作用形成多聚体。作为一种优选方式，氨基酸残基构成为形成分子间离子对、或离子对网络的氨基酸残基彼此在电荷上相互排斥。并且，本发明的PCNA单体在单体的状态下或在形成多聚体的状态下具有促进DNA复制的活性。另外，本说明书中，称作“变异型PCNA”的情况下的“变异型”是指，具有与以往已知的PCNA不同的氨基酸序列的意思，而不是用于区分基于人为的变异还是基于自然界中的变异。
作为涉及DNA的复制反应的因子之一的PCNA的多聚体通过一个单体的N末端区域与另一个单体的C末端区域形成为界面并接合而形成。另外，本说明书中，N末端区域是指将蛋白质视为一条链时比中央更靠近N末端的部位，C末端区域是指比中央更靠近C末端的部位。在真核细胞和古细菌中，更多的情况下PCNA形成三聚体。图1给出了PCNA三聚体的模型。如图1所示，PCNA单体10a、10b、10c在各末端区域上与其他单体接合，形成环结构的多聚体1。接合部20中，各单体的末端区域形成为界面，在其内部形成连结单体的分子间相互作用。图2为显示激烈火球菌PCNA的分子间相互作用的模型图。图2对具有序列编号2所述的氨基酸序列(野生型Pfu-PCNA的氨基酸序列)的PCNA进行了说明。一个单体10a的N末端区域内所含有的氨基酸残基与另一个单体10c的C末端区域内所含有的氨基酸残基形成分子间对。如图2所示，可以认为序列编号2所述的氨基酸序列中的第139位、第143位和第147位的氨基酸残基组与第82位、第84位、第109位的氨基酸残基组形成了相互影响的网络。
与此相对，本发明中，产生分子间相互作用的部位的氨基酸残基中的至少一部分按照积极地相互排斥的方式来构成。此处所说的“电荷上相互排斥”是指，由于界面区域上含有的氨基酸残基所具有的电荷而相互排斥。因此，作为这种组合，界面上含有的氨基酸残基包括双方均由带有正电的分子构成的情况、双方均由带有负电的分子构成的情况。更具体地说，优选氨基酸残基双方均由酸性氨基酸构成或双方均由碱性氨基酸构成。作为酸性氨基酸，可以举出例如天冬氨酸(缩写：Asp或D)、谷氨酸(缩写：Glu或E)等。并且，作为碱性氨基酸可以举出例如赖氨酸(缩写：Lys或K)、精氨酸(缩写：Arg或R)、组氨酸(缩写：His或H)等。
因此，在以例如具有序列编号2或32所述的氨基酸序列的PCNA为主体的情况下，为获得本发明的PCNA，在序列编号2或32所述的氨基酸序列中，选自由第82位、第84位、第109位、第139位、第143位和第147位组成的组中的至少1个位置上的氨基酸残基会发生改变。作为本发明的优选方式，可以举出如下的方式：选自下述组(i)的至少1个以上的氨基酸残基和选自下述组(ii)的1个以上的氨基酸残基由电荷上相互排斥的氨基酸残基构成，
(i)第82位、第84位和第109位的氨基酸残基组；
(ii)第139位、第143位和第147位的氨基酸残基组。
更具体地说，选自所述(i)的至少1个以上的氨基酸残基、与选自所述(ii)的至少1个氨基酸残基的组合，优选为双方均为酸性氨基酸的组合，或是双方均为碱性氨基酸的组合。即，作为优选的例子，可以举出由(i)组和(ii)组的各组中选出的至少1个氨基酸残基的双方均为选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组中的酸性氨基酸的方式，以及由(i)组和(ii)组的各组中选出的至少1个氨基酸残基为选自由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成的组中的碱性氨基酸的方式等。
促进DNA复制的活性(DNA复制促进活性)是指与原有的野生型PCNA相比DNA复制得到了促进。具体地说，优选与具有序列编号2或32所述的氨基酸序列的PCNA单体或其多聚体相比DNA复制促进活性更优异。进而，作为其他具体的指标，按照下述实施例所示的DNA复制的活性测定方法测定延长性、反应速度等的情况下，在延长性和反应速度方面，优选所具有的DNA复制促进活性由等同于Taq聚合酶提升至其10倍以上。
并且，作为本发明的PCNA，还包括与具有含有上述变异的氨基酸序列的PCNA实质上相同的PCNA。具体地说，作为本发明的PCNA，可以举出例如具有如上优选的DNA复制促进活性，并且在不影响本发明的效果的范围内，在第82位、第84位、第109位、第139位、第143位和第147位以外的部位上含有选自由增加、插入、置换和缺失组成的组中的1个或几个(2个以上)氨基酸残基的变异的变异型PCNA。具体地说，“几个”是指，2～50个，优选为2～30个，进一步优选为2～10个，特别优选为2～5个。在这样的蛋白质中，对应于选自序列编号2或32所示的氨基酸序列中的(i)组和(ii)组的位置上的氨基酸残基按照电荷上相互排斥的方式构成。即，在(i)组和/或(ii)组的位置上限定的氨基酸残基以外，还允许在不明显影响其活性的范围内存在其他变异。作为这种变异，还可以包括例如氨基酸残基的所谓保守性置换。另外，在第82位、第84位、第109位、第139位、第143位和第147位以外的部位上导入了缺失、插入、增加之类的变异的情况下，导入变异后的氨基酸残基的编号可能会与导入变异前的氨基酸残基的编号不同，但在相当于上述(i)和(ii)所示位置、即位于形成多聚体的情况下的界面内并涉及分子间相互作用的位置的情况中，即使编号前后偏移，也包括在本发明的PCNA中。上述变异型PCNA中，由于易于制备和提纯，而特别优选含有将第73位的氨基酸残基替换为亮氨酸的仅为置换的变异型，或是除此之外还含有其他变异的变异型。
本发明的PCNA能够促进DNA的复制反应的作用/机理尚不清楚，但据推测，由多聚体形成的环结构具有在温度上升时解开的结构，由此顺利地进行DNA复制反应的重复，从而进一步促进了DNA复制反应。以往主要认为，PCNA的单体彼此牢固地接合形成多聚体，起到稳固的夹钳的作用，从而作为DNA复制促进因子发挥作用，但在这一点上，本发明提出了与以往不同的见解。即，在不与RFC合用的情况下的PCNA的活性中，多聚体的结合过于牢固并不好，特别是在PCR那样进行复制反应的重复时，由于环结构在温度上升时变弱而解开，跟野生型PCNA与RFC合用时相比发挥出更优异的促进活性。
作为本发明优选的PCNA的具体例，可以举出：在序列编号2或32所述的氨基酸序列中，具有将第143位的氨基酸残基由天冬氨酸换为精氨酸的序列(D143R)的PCNA单体。第143位的氨基酸残基属于(ii)组。这种情况下，属于(i)组的第82位、第84位、第109位的氨基酸残基依次为精氨酸、赖氨酸、精氨酸，对于该分子间相互作用，界面区域能够形成与通常状态相比更排斥的状态。如下述实施例所示，本形态的PCNA在DNA复制反应的延长性和反应速度等方面平衡性良好，特别发挥出优异的辅助作用。
并且，本发明提供编码上述本发明的PCNA的多核苷酸。碱基序列通过密码子表而表现为氨基酸，由于编码的简并，1个氨基酸序列可以由2种以上的碱基序列所编码。例如，序列编号2或32所述的氨基酸序列由例如序列编号1或31所述的碱基序列所编码。因此，作为本发明的多核苷酸的一个形态，可以举出下述(a)的多核苷酸。
(a)具有编码如下氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸：在序列编号2或32所述的氨基酸序列中，对氨基酸残基进行置换，以使选自(i)组的至少1个以上的氨基酸残基与选自(ii)组的1个以上的氨基酸残基电荷上相互排斥。
在序列编号1或31所述的碱基序列中，通过对上述规定位置的氨基酸残基所对应的部位的碱基序列进行改变就能够容易地制作出具有(a)那样的碱基序列的多核苷酸。并且，基于氨基酸种类的碱基序列的转换可以容易地基于密码子表来进行转换。另外，本说明书中所说的多核苷酸中包括DNA、RNA，可以是单链也可以是双链，并且还包括DNA和RNA的嵌合体、或是DNA和RNA的杂交体等。
并且，下述(b)那样的多核苷酸也属于本发明的多核苷酸。
所述(b)为如下的多核苷酸：在严谨条件下与具有下述碱基序列的多核苷酸杂交，所述碱基序列与上述(a)的多核苷酸所具有的碱基序列互补；
具有编码如下的氨基酸序列的碱基序列：所述氨基酸序列使得选自(i)组的至少1个以上的氨基酸残基与选自(ii)组的1个以上的氨基酸残基成为电荷上相互排斥的氨基酸残基的组合；并且
编码具有上述规定的DNA复制促进活性的PCNA。
对于能够用于得到杂交基因的探针，可以基于例如序列编号1或31所述的碱基序列利用常规方法来制作。并且，使用探针选出与其杂交的多核苷酸并分离出目标多核苷酸的方法也可以按照常规方法来进行。例如，对于DNA探针，将克隆于质粒或噬菌体载体中的碱基序列扩增，利用限制性酶将准备用作探针的碱基序列切下，提取后就可以制备出DNA探针。切下的部位可以根据目标DNA来调节。
并且，“严谨条件”是指，所谓形成特异性的杂交体而不形成非特异性的杂交体的条件。可以举出通常的Southern杂交的清洗的条件，即在60℃的温度下、在相当于1×SSC、0.1％SDS(优选0.1×SSC、0.1％SDS)的盐浓度下进行杂交的条件。并且，作为“在严谨条件下”杂交的多核苷酸，优选上述(b)的多核苷酸与(a)的多核苷酸具有优选为50％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、更进一步优选为95％以上的相同性(homology)。另外，作为计算相同性的方法，可以使用例如BLAST、FASTA、ClustalW等。
对于上述(b)所示的多核苷酸来说，具备其碱基序列所翻译的氨基酸序列的蛋白质具有DNA复制促进活性。更具体地说，具备其碱基序列所翻译的氨基酸序列的蛋白质具有与对上述本发明的蛋白质所做的说明同样的DNA复制促进活性。
上述本发明的多核苷酸可以载入到适当的载体中，作为重组多核苷酸来使用。本说明书中，重组多核苷酸是指，2种以上的多核苷酸彼此连结而成的杂交分子。作为本发明的重组多核苷酸的优选方式，可以举出表达载体。已知表达载体有各种形态，并且还有市售品。本发明中，可以根据用途等来适当选择重组多核苷酸的形态，也可以使用市售的表达载体等公知的表达载体。下面给出与表达载体相关的具体例，但并不限于下述具体例。
作为载体，可以使用源自大肠杆菌的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、作为市售品的pBT载体、pTRG载体(Stratagene社制造)等)；源自酵母的质粒(例如YEp24、YCp50等)；λ噬菌体等细菌噬菌体；逆转录酶病毒、牛痘病毒、杆状病毒等动物病毒；适宜用于枯草杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5、pC194等)等，还可以使用pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
作为启动子，可以使用任意的启动子，只要是与用于基因表达的宿主细胞相应的适当的启动子即可。例如，宿主细胞为大肠杆菌属(Escherichia)细菌的情况下，可以举出trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等，宿主细胞为芽孢杆菌属(bacillus)细菌的情况下，可以举出SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。并且，宿主细胞为酵母的情况下，可以举出PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。宿主细胞为昆虫细胞的情况下，可以举出多角体蛋白基因启动子、P10启动子等。并且，使用动物细胞作为宿主细胞的情况下，可以举出SRα启动子、SV40启动子、HIV-LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、HSV-TK启动子等。
从重组操作的简便性方面考虑，优选表达载体具有多克隆位点。并且，除上述之外，还可以根据需要在表达载体中载入选择性标记、增强子、剪切信号、多聚A信号、SV40复制起点(下文中有时简称为SV40ori)、终止子等。作为选择性标记，可以举出例如：氨苄青霉素抗性基因(也称为羧苄青霉素抗性基因，下文中有时简称为Amp)、卡那霉素抗性基因(下文中有时简称为Kam)、四环素抗性基因(下文中有时简称为Tet)、二氢叶酸还原酶(下文中有时简称为dhff)基因(氨甲蝶呤(MTX)抗性)、新霉素抗性基因(下文中有时简称为Neo，G418抗性)等。并且，可以根据需要将适合宿主细胞的信号序列添加至本发明的随机寡核苷酸或寡核苷酸盒(cassette)的N末端侧。宿主细胞为大肠杆菌属细菌的情况下，可以利用PhoA-信号序列、OmpA-信号序列等，宿主细胞为芽孢杆菌属细菌的情况下，可以利用α-淀粉酶-信号序列、枯草杆菌蛋白酶-信号序列等，宿主细胞为酵母的情况下，可以利用MFα-信号序列、SUC2-信号序列等，宿主细胞为动物细胞的情况下，可以利用胰岛素-信号序列、α-干扰素-信号序列、Ras法尼基化-信号序列等。
如上所述，可以制作含有本发明的多核苷酸的表达载体，将其导入宿主细胞，从而制作表达本发明的DNA聚合酶的转化体。
作为宿主细胞，可以举出例如：链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌属细菌(Escherichia coli)、链霉菌属细菌(Streptomyces)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)等的细菌细胞；酵母、曲霉属(Aspergillus)等的真菌细胞；果蝇S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(SpodopteraSf9)等的昆虫细胞；CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、人黑色素瘤细胞(Bows melanoma cell)和血球类细胞等的动物细胞；以及植物细胞。
将表达载体导入宿主细胞的操作可以按照Davis等人的BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)；Sambrook等人的MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第3版、ColdSpring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(2001))之类众多的标准实验手册中所记载的方法来进行。更具体地说，包括例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、显微注射、阳离子脂质体介导的转染、电穿孔、转导、基因枪导入(biolistics法)或感染等。
转化体的培养可以根据宿主的种类等来进行调节。尽管宿主的种类为数众多，关于培养可以具体举例如下。例如，对宿主为大肠杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌的转化体进行培养的情况下，用于培养的培养基既可以是液体培养基，也可以是琼脂培养基，其中混合转化体的生长所必须的碳源、氮源、无机物及其他。作为碳源，可以举出例如葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等，作为氮源，可以举出例如铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、胨、酪蛋白、肉膏、大豆粕、马铃薯提取液等无机或有机物质；作为无机盐，可以举出例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。并且，也可以添加酵母浸膏、维生素类、成长促进因子等。培养基的pH优选为约5～8。作为培养大肠杆菌属细菌时优选的培养基，具体地可以举出含有酵母浸膏、胰蛋白胨、盐(NaCl)的LB培养基等。为了根据需要有效地发挥启动子的作用，也可以在此添加例如异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)之类的诱导剂。宿主为大肠杆菌属细菌的情况下，培养通常在约15～43℃进行约3～24小时，根据需要施加通气或搅拌。宿主为芽孢杆菌属细菌的情况下，培养通常在约30～40℃进行约6～24小时，根据需要施加通气或搅拌。
对宿主为酵母的转化体进行培养时，作为培养基，可以举出例如Burkholder最小培养基、含有0.5％酸水解酪蛋白(casamino acid)的SD培养基等。培养基的pH优选调整为约5～8。培养通常在约20℃～35℃进行约24～72小时，根据需要施加通气或搅拌。
并且，对宿主为昆虫细胞或昆虫的转化体进行培养时，作为培养基，使用在Grace’s昆虫细胞培养基(Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962))中适当加有灭活的10％牛血清等添加物后的培养基等。培养基的pH优选调整为约6.2～6.4。培养通常在约27℃进行约3～5天，根据需要施加通气或搅拌。
对宿主为动物细胞的转化体进行培养时，作为培养基，可以使用例如含有约5～20％的胎牛血清的MEM培养基、DMEM培养基、RPMI 1640培养基(The Journal of the American Medical Association，199卷，519(1967))、199培养基(Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，73卷，1(1950))等。优选pH约为6～8。培养通常在约30～40℃进行约15～60小时，根据需要施加通气或搅拌。并且，根据需要进行CO2浓度的调节。
对于在转化体中生成的本发明的蛋白质，可以根据需要按照蛋白质提纯的常规方法进行提纯、分离。可以如上述那样使用转化体获得本发明的PCNA。
2.利用本发明的PCNA的DNA复制方法
本发明的DNA复制方法的特征在于，在PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体和DNA聚合酶的存在下进行DNA的合成反应。作为DNA的合成方法，可以举出PCR、引物延伸、缺口翻译、利用逆转录酶的第一链cDNA合成等。
作为本发明的DNA复制方法，可以举出基于PCR的DNA扩增作为优选的方式。PCR中，使用引物和模板DNA来重复进行DNA的复制，呈几何级数地扩增DNA。因此，优选PCNA在起到对DNA聚合酶的夹钳的作用的同时，还能够在DNA聚合酶稳定结合在模板上后或是在指定区域的扩增之后迅速从模板上脱落下来，据推断，本发明的PCNA具有这样的特性。
本发明的PCNA适用于各种各样的DNA聚合酶，通用性高。DNA聚合酶通常在延长性或忠实性的任一方面优异，一般是各有短长。但是，通过与本发明的PCNA进行组合，能够在不降低忠实性的条件下提高延长性，所以能够在补足DNA聚合酶的缺点的同时增强DNA复制活性。作为在本发明的DNA复制方法中优选使用的DNA聚合酶，可以使用例如Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa Bio社)、TaKaRa EX Taq(TaKaRa Bio社)、Vent DNA聚合酶(NEW ENGLAND Bio Labs社)、Deep VentR DNA聚合酶(New England Biolabs社)、Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene社)、KODDNA聚合酶(东洋纺社)和Pwo DNA聚合酶(Roche Diagnostics社)等现在主要使用着的DNA聚合酶中的每一种。并且，本发明的PCNA尤其在延长性改善方面有效，忠实性优异，在与延长性较差的类型的α型聚合酶的组合中特别有用。
本发明的DNA复制方法中，由于本发明的PCNA不需要RFC，所以也可以不在反应体系中添加RFC。RFC标准品通常没有市售，其制备麻烦。即使能够利用RFC标准品，在添加RFC进行使用的情况下，需要设定与RFC以外的DNA复制体系的诸因子的适当含量比等条件，而本发明具有无须考虑这些问题的优点。并且，特别是在PCR中使用的情况下，本发明的PCNA即使不与RFC合用，也会发挥出优于野生型PCNA与RFC合用时的促进活性。
并且，关于PCR的具体条件，已经在众多的讲解资料中有介绍，因此在本发明的方法中也可以参考这些文献适当地调整反应条件等。作为PCR的条件，可以对例如DNA聚合酶的添加量、PCR的反应时间、反应溶液的温度的设定、反应溶液的成分、反应溶液的pH、投入的模板多核苷酸的量等各种条件进行调整。
3.试剂盒
本发明的试剂盒是含有上述本发明的PCNA和根据需要使用的其他试剂类的DNA复制用试剂盒。本发明的PCNA为含有单体和/或由所述单体构成的多聚体的形态，可以作为DNA复制用试剂的一个成分而适宜地使用。对于本发明的试剂盒，由于本发明的PCNA特别适宜在PCR中使用，因而本发明的试剂盒作为PCR用的试剂盒是特别优选的。
本发明的试剂盒中所具有的PCNA可以是任意的形态，可以举出提纯蛋白质、载有编码蛋白质的多核苷酸的重组多核苷酸、或是导入了该重组多核苷酸的转化体等形态。对于重组多核苷酸或转化体的优选形态，如上述说明所示。并且，也可以组合本发明的PCNA与其他PCNA。并且，本发明的PCNA以重组DNA或转化体的形式提供时，还可以具有用于表达本发明的PCNA的试剂类等。并且，根据需要，还可以在含有本发明的PCNA的试剂中添加通常用作生物技术试剂的其他成分或介质。
实施例
下面通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
1：Pfu-PCNA及RFC蛋白质的制备
PCNA变异体蛋白质标准品和RFC蛋白质标准品如下制备：在大肠杆菌内使它们的基因大量表达，由表达菌体提纯蛋白质。
1.1：获得菌体及制备基因组DNA
1.1.1：获得Pfu菌体及制备基因组DNA
激烈火球菌DSM3638菌株由Deutsche Sammlung vonMikrooganismen und Zelkuluren GmbH(英文名：German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures，地址：Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)获得。按照文献(Uemori et al.，Nucl.Acids Res.21：259-265(1993))所记载的方法对DSM3638菌株进行培养。由500mL的培养液得到约1.2g的菌体。将其悬浮在10mL缓冲液(10mMTris-Cl pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl)中，添加1mL10％SDS。搅拌后，添加50μL蛋白酶K(20mg/mL)，于55℃静置60分钟。然后依次对反应液进行苯酚提取、苯酚/三氯甲烷提取、三氯甲烷提取后，添加乙醇，使DNA溶出。将回收到的DNA溶解在1mLTE溶液(10mMTris-Cl，pH8.0，1mMEDTA)中，添加0.75mg的RnaseA，于37℃反应60分钟。然后，再次对反应液进行苯酚提取、苯酚/三氯甲烷提取、三氯甲烷提取后，添加乙醇回收DNA。
1.2：PCNA基因克隆
Pfu-PCNA基因如下获得：参考NCBI数据库中登记的碱基序列信息AB017486(序列编号1和2)，利用PCR进行克隆(图3)。下面进行具体说明。
1.2.1：PCR引物
使用Pfu-PCNA-F、Pfu-PCNA-R用于Pfu-PCNA基因的扩增。设计这些引物的序列以对相当于由PCNA基因的起始甲硫氨酸至终止密码子的区域进行扩增，进而在5’侧增加限制性酶NdeI识别部位、限制性酶XhoI识别部位。每个引物的序列于表1(序列编号3和4)给出。
表1 PCNA基因扩增用引物
| 引物名称 | 引物序列5’＝＞3’ | 序列编号 |
| Pfu-PCNA-F | cat atg cca ttt gaa atc gta tt | 3 |
| Pfu-PCNA-R | ctc gag tca ctc ttc aac tct | 4 |
1.2.2：模板DNA
作为PCR的模板，使用上述1.1.1中制备的Pfu基因组DNA。
1.2.3：PCR反应液组成
PCR反应液为如下组成。(向50μL反应液体系中的添加量)
模板DNA：100ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EXTaq*：1.25U
10×ExTaq缓冲液：5μL
向上述组成中添加无菌水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
1.2.4：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min的循环30次的程序来进行PCR反应。
1.2.5：PCR产物的提纯
使用1％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切下含有800bp前后的条带的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
1.2.6：PCR产物的亚克隆
利用pUC118-HincII/BAP、TaKaRa BKL试剂盒(均来自TaKaRa Bio社)，按照操作指南对提纯后的PCR产物进行连接反应。以该连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α(TaKaRa Bio社)，涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mLIPTG、40μg/mLX-GAL)上，于37℃静置培养一夜，得到带有PCR产物的大肠杆菌克隆体。
将在琼脂板上呈白色的大肠杆菌菌落在3mLLB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
1.2.7：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对在质粒载体pUC118的限制性酶HincII识别部位中插入的DNA序列进行测定。结果确认到，插入部分中具有Pfu-PCNA基因的开放阅读框，在5’端增加了限制性酶NdeI识别序列，在3’端增加了限制性酶XhoI识别序列。将带有Pfu-PCNA基因的开放阅读框的本质粒载体命名为pUC/PPC。
1.3：PCNA表达质粒的制作
以限制性酶NdeI和XhoI对pUC/PPC进行双重切断，制备PCNA基因断片。将基因断片插入表达载体，制备Pfu-PCNA的表达载体。
1.3.1：PCNADNA断片的制备
在以下的反应体系中，使用限制性酶NdeI和XhoI对pUC/PPC进行双重切断。
质粒DNA：5μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述溶液中添加无菌水，调成50μL，在37℃进行30分钟的限制性酶切断反应。反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳。将对应于Pfu-PCNA基因的条带(约800bp前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南由凝胶中提纯PCNA DNA断片。
1.3.2：pET-21a表达载体
通过如下的反应，利用限制性酶NdeI和XhoI对pET-21a载体DNA(美国Novagen公司)进行双重切断。
质粒DNA：2μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述溶液中添加无菌水，调成50μL，于37℃静置2小时。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将相当于直线型的pET-21a载体DNA的条带(约5.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南，由凝胶中提纯pET-21aDNA断片。
1.3.3：连接反应和转化
利用DNA连接试剂盒V2(TaKaRa Bio社)对上述得到的Pfu-PCNADNA断片(100ng)和pET-21aDNA断片(50ng)进行如下的反应。
PCNADNA断片：100ng
pET-21aDNA断片：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
向上述组成中添加无菌水，调为10μL，于16℃反应30分钟。
用该连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(100μg/mL氨苄青霉素)上，于37℃静置培养一夜。在形成于琼脂板上的大肠杆菌菌落中，取3个菌落在3mLLB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
1.3.4：通过测序确认序列
对于上述重组质粒，使用DNA测序仪对插进质粒载体pET-21a中的DNA序列和插入部位附近的序列进行测定。其结果，多克隆位点的NdeI和XhoI部分中完全插进了Pfu-PCNA基因的ORF(开放阅读框)。将该带有Pfu-PCNA基因的质粒称为pPPCNA(图4)。
如图4所示，确认到在pPPCNA中由pET-21a所具有的T7启动子开始依次排列着rbs(核糖体结合部位)、PCNA基因ORF(开放阅读框)、T7终止子。期待本质粒能够大量表达PCNA基因。
1.4：向PCNA基因导入变异
为了制作更高功能的PCNA，对Pfu-PCNA进行了氨基酸置换。氨基酸置换通过对编码该氨基酸的密码子的碱基进行置换来进行。在表2所示的变异部位中导入了氨基酸变异。
表2 PCNA变异部位
| 变异体ID | 变异部位 |
| Pfu-PCNA01 | M73L |
| Pfu-PCNA10 | M73L+D143A |
| Pfu-PCNA12 | M73L+R82C |
| Pfu-PCNA13 | M73L+D143R |
| Pfu-PCNA16 | M73L+R82C+D143R |
| Pfu-PCNA70 | M73L+D143K |
| Pfu-PCNA71 | M73L+D143H |
| Pfu-PCNA72 | M73L+R109E |
| Pfu-PCNA77 | M73L+D147R |
| Pfu-PCNA78 | M73L+E139A |
| Pfu-PCNA79 | M73L+E139R |
1.4.1：导入置换变异
利用要导入变异的质粒和导入变异用寡核苷酸对(表3、序列编号5～12)，采用Quik Change II定点突变试剂盒(Stratagene社)，按照其操作指南，向PCNA基因导入变异。
表3 PCNA导入变异用寡DNA序列
| 引物名称 | 序列5’＝＞3’ | 序列编号 |
| Pfu_M73L-F | CA ATT GGA GTT AAC CTG GAC CAC CTA AAG | 5 |
| Pfu_M73L-R | CTT TAG GTG GTC CAG GTT AAC TCC AAT TG | 6 |
| Pfu_D143A-F | TT CTT GGA GAA GTC CTA AAA GCT GCT GTT AAA GAT GCC TCT CTA GTG AGT GAC AG | 7 |
| Pfu_D143A-R | CT GTC ACT CAC TAG AGA GGC ATC TTT AAC AGC AGC TTT TAG GAC TTC TCC AAG AA | 8 |
| Pfu_R82C-F | CCT AAA GAA GAT CCT AAA GTG CGG TAA AGC AAA GG | 9 |
| Pfu_R82C-R | CCT TTG CTT TAC CGC ACT TTA GGA TCT TCT TTA GG | 10 |
| Pfu_D143R-F | GGA GAA GTC CTA AAA CGT GCT GTT AAA GAT GCC | 11 |
| Pfu_D143R-R | GGC ATC TTT AAC AGC ACG TTT TAG GAC TTC TCC | 12 |
| Pfu_D143K-F | GGA GAA GTC CTA AAA AAA GCT GTT AAA GAT | 62 |
| Pfu_D143K-R | ATC TTT AAC AGC TTT TTT TAG GAC TTC TCC | 63 |
| Pfu_D143H-F | GGA GAA GTC CTA AAA CAT GCT GTT AAA GAT | 64 |
| Pfu_D143H-R | ATC TTT AAC AGC ATG TTT TAG GAC TTC TCC | 65 |
| Pfu_R109E-F | CAA GGA ACT GCA ACA GAA ACA TTT AGA GTT CCC C | 66 |
| Pfu_R109E-R | GGG GAA CTC TAA ATG TTT CTG TTG CAG TTC CTT G | 67 |
| Pfu_D147R-F | CCT AAA AGA TGC TGT TAA AAG AGC CTC TCT AGT GAG TGA C | 68 |
| Pfu_D147R-R | GTC ACT CAC TAG AGA GGC TCT TTT AAC AGC ATC TTT TAG G | 69 |
| Pfu_E139A-F | GGT TGT AGT TCT TGG AGC AGT CCT AAA AGA TGC TG | 70 |
| Pfu_E139A-R | CAG CAT CTT TTA GGA CTG CTC CAA GAA CTA CAA CC | 71 |
| Pfu_E139R-F | GGT TGT AGT TCT TGG AAG AGT CCT AAA AGA TGC TG | 72 |
| Pfu_E139R-R | CAG CAT CTT TTA GGA CTC TTC CAA GAA CTA CAA CC | 73 |
导入变异后通过测序确认DNA序列，确认到目标部位中导入了变异且目标部位以外的部位没有变异。下面对各PCNA变异体的设计进行说明。
1.4.1.1：Pfu-PCNA01
根据有关Pfu-PCNA的报告(非专利文献6)，在制备以大肠杆菌为宿主的天然型Pfu-PCNA的重组蛋白质的情况下，除了生成起自原本的启始Met的翻译蛋白质以外，还生成了起自N末端的第73个残基的约20kDa的蛋白质的副产物，而利用基因工学的方法将第73个残基的Met单残基置换为Leu的情况下，就抑制了这个约20kDa的蛋白质的生成。并且，还报告出如此制成的Pfu-PCNA具有无异于野生型PCNA蛋白质的性质。基于这些事实，在本说明书中使用Pfu_M73L的变异体作为准野生型。
将该Pfu_M73L的变异体称为Pfu-PCNA01，制作变异体。制作Pfu-PCNA01时，使用pPPCNA作模板质粒，使用导入变异用寡核苷酸对(Pfu_M73L-F和Pfu_M73L-R)进行制作。
1.4.1.2：Pfu-PCNA10
Pfu-PCNA10是将Pfu-PCNA01的第143个残基的氨基酸由D置换为A的单残基置换的变异，由Matsumiya(非专利文献9)对结构和性质进行了报告。根据报告，第143个残基的天冬氨酸在Pfu-PCNA形成同源三聚体时位于界面，是涉及三聚体形成的氨基酸中的一个，将该第143个残基的天冬氨酸变换为丙氨酸后，虽然会阻碍三聚体形成，但DNA聚合酶活性刺激本身得到了维持。
该具有D143A和M73L的双重变异的PCNA变异体为Pfu-PCNA10，制作时，以Pfu-PCANA01产生质粒为模板，使用了Pfu_D143A-F和Pfu_D143A-R的导入变异用寡核苷酸。
1.4.1.3：Pfu-PCNA12
Pfu-PCNA12是将第82个残基的氨基酸由R置换为C的单残基置换的变异，根据Matsumiya(非专利文献9)的报告，第82个残基的精氨酸在Pfu-PCNA形成同源三聚体时位于界面。
该具有R82C和M73L的双重变异的PCNA变异体为Pfu-PCNA12，制作时，以Pfu-PCANA01产生质粒为模板，使用了Pfu_R82C-F和Pfu_R82C-R的导入变异用寡核苷酸。
1.4.1.4：Pfu-PCNA13
通过将第143个残基变换为精氨酸(碱性氨基酸)，可使其电学性质完全不同于准野生型(Pfu-PCNA01)的天冬氨酸(酸性氨基酸)或Pfu-PCNA10的丙氨酸(中性氨基酸)，从而可以在主动阻碍PCNA的三聚体形成能的情况下研究其对DNA复制的影响，为此制作了Pfu-PCNA13。具体地说，以Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_D143R-F和Pfu_D143R-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.5：Pfu-PCNA16
第82个残基的精氨酸和第143个残基的天冬氨酸这2个氨基酸为很有可能参与形成三聚体的2种氨基酸，为了对这2种氨基酸同时变异时所产生的效果进行研究，制作了Pfu-PCNA16。具体地说，以Pfu-PCNA12产生质粒为模板，使用了Pfu_D143R-F和Pfu_D143R-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.6：Pfu-PCNA70
为了对通过置换导入第143个残基的氨基酸所带来的活性进行比较，制作了将第143个残基的氨基酸置换为赖氨酸(碱性氨基酸)的变异体。虽然同为碱性氨基酸，但精氨酸的侧链的胍盐基的pKR值为12.48，赖氨酸的侧链的丁基铵基的pKR值为10.54，赖氨酸的碱性低。表达质粒使用Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_D143K-F和Pfu_D143K-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.7：Pfu-PCNA71
为了对通过置换导入第143个残基的氨基酸所带来的活性进行比较，制作了将第143个残基的氨基酸置换为组氨酸(碱性氨基酸)的变异体。组氨酸的侧链的pKR值为6.0，在生理pH下解离。由于组氨酸在pH6.0时咪唑基的50％为具有电荷的类型、剩余的50％为不具有电荷的类型，因而即使在生理pH范围内，pH较高时为中性。因此可以预想其作为导入置换的氨基酸会具有与精氨酸或赖氨酸不同的性质。表达质粒使用Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_D143H-F和Pfu_D143H-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.8：Pfu-PCNA72
制作将第109个残基的精氨酸(碱性氨基酸)置换为谷氨酸(酸性氨基酸)的变异体，该第109个残基的氨基酸在Pfu-PCNA形成同源三聚体时位于界面，是参与三聚体形成的氨基酸中的一个。表达质粒使用Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_R109E-F和Pfu_R109E-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.9：Pfu-PCNA77
制作将第147个残基的天冬氨酸(酸性氨基酸)置换为精氨酸(碱性氨基酸)的变异体，该第147个残基的氨基酸在Pfu-PCNA形成同源三聚体时位于界面，是参与三聚体形成的氨基酸中的一个。表达质粒使用Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_D147R-F和Pfu_D147R-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.10：Pfu-PCNA78
制作将第139个残基的谷氨酸(酸性氨基酸)置换为丙氨酸(中性氨基酸)的变异体，该第139个残基的氨基酸在Pfu-PCNA形成同源三聚体时位于界面，是参与三聚体形成的氨基酸中的一个。表达质粒使用Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_E139A-F和Pfu_E139A-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.1.11：Pfu-PCNA79
制作将第139个残基的谷氨酸(酸性氨基酸)置换为精氨酸(碱性氨基酸)的变异体，该第139个残基的氨基酸在Pfu-PCNA形成同源三聚体时位于界面，是参与三聚体形成的氨基酸中的一个。表达质粒使用Pfu-PCNA01产生质粒为模板，使用Pfu_E139R-F和Pfu_E139R-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作。
1.4.2：表达菌株的制作
利用以上获得的变异型PCNA表达质粒载体转化大肠杆菌BL21CodonPlus(DE3)RIL(Stratagene社)，获得表达各变异基因的大肠杆菌菌株。
1.4.3：菌体培养和表达诱导
将各变异PCNA表达菌株在1.5升LB培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)中于37℃振荡培养。在对数增殖期的OD600为0.3-0.5的时候添加IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以使最终浓度为0.1mM，以此来诱导基因的表达，诱导后的培养进行约3小时。离心分离(4℃，6,000×g，6分钟)培养后的菌体进行回收。
1.4.4：PCNA蛋白质提纯(图5)
如图5所示，离心回收菌体(S51)，进行菌体破碎(超声波破碎，S52)、5分钟煮沸(S53)和聚乙烯亚胺沉淀(S54)，进而进行硫铵沉淀(S55)，通过离子交换层析(S56，使用HiTrap Q为柱)、凝胶过滤层析(S57，使用Superdex 200)这样的处理来制备标准品。通过SDS-PAGE确认到进行了充分的提纯。
1.4.4.1：菌体破碎
将经离心分离进行沉淀而得到的菌体悬浮于25mL的缓冲液A(50mMTris-HCl pH8.5，0.1M NaCl，2mM2-巯基乙醇，10％甘油)或缓冲液B(50mMTris-HCl pH8.0，0.1M NaCl，0.1mMEDTA，10％甘油，0.5mMDTT)中。利用超声波处理进行菌体破碎。
1.4.4.2：加热处理
将菌体破碎液煮沸5分钟后，进行离心分离(18,500×g，4℃，25分钟)，回收上清液。
1.4.4.3：聚乙烯亚胺沉淀
向上清液中添加聚乙烯亚胺(SIGMA P-3143)和NaCl以使最终浓度分别为0.2％(w/v)和0.58M，在冰上搅拌30分钟。离心分离(18,500×g，25分钟，4℃)该溶液，回收上清液。
1.4.4.4：硫铵沉淀
向每10mL上清液中添加硫酸铵5.61g(最终浓度80％)，于冰上搅拌30分钟，使蛋白质沉淀。向该溶液中添加80mL以硫铵80％饱和的50mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液，通过离心分离(30,000×g，25分钟，4℃)回收沉淀后，将该沉淀溶解于缓冲液C(50mMTris-HCl pH8.0，0.1M NaCl)中，同样地对缓冲液C进行透析。
1.4.4.5：离子交换层析
对于透析后的样品实施离子交换层析(HiTrap Q，AmershamBiosciences公司)，对于Pfu-PCNA01、10、12、13、16，使用FPLC蛋白质提纯系统(Amersham Biosciences公司)，对于其他的Pfu-PCNA70、71、72、77、78、79，使用AKTAexplorer 10S(Amersham Biosciences公司)。洗脱条件为0.1-0.8M NaCl/17.5mL的线性梯度，流速为1mL/min。
1.4.4.6：凝胶过滤层析
利用使用了Superdex 200(Amersham Biosciences公司)的凝胶过滤层析分别对HiTrap Q离子交换层析中的峰值馏分进行进一步提纯，作为之后的分析(assay)用标准品。
对所得到的标准品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认到了标准品分子的大小以及其被充分地提纯(图6和图40)。
1.5：Pfu-RFC基因克隆
RFC由2个亚单元RFCL和RFCS构成，它们在激烈火球菌基因组上为串联的位置关系。制备RFC蛋白质标准品时采用如下方法：分别将RFCL和RFCS基因载入表达载体，在同一宿主内导入各个表达载体，使其同时表达。制作表达质粒时，参考了非专利文献7。下面进行具体说明。
1.5.1：RFCL的基因克隆和表达质粒的制作
Pfu-RFCL基因(NCBI GeneID1467921)以Pfu基因组为模板利用PCR而获得(碱基序列为序列编号13，氨基酸序列为序列编号14)。作为PCR用引物，使用了RFCL-F引物和RFCL-R引物(表4，序列编号15和16)。为了便于克隆操作，在RFCL-F引物上增加了限制性酶NdeI识别部位，在RFCL-R引物上增加了限制性酶XhoI识别部位。
表4 RFCL基因扩增用引物
| 引物名称 | 引物序列5’＝＞3’ | 序列编号 |
| RFCL-F引物 | AGC CAT ATG CCA GAG CTT CCC TGG GTA GAA | 15 |
| RFCL-R引物 | AGC TCG AGT CAC TTT TTA AGA AAG TCA AAG AGA G | 16 |
使用上述1.1中制备的Pfu基因组DNA作为PCR的模板。
PCR反应以如下组成进行。(添加于50μL反应体系中的添加量)
模板DNA：100ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq*：1.25U
10×EX Taq缓冲液：5μL
向上述组成中添加无菌蒸馏水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
1.5.1.1：PCR反应条件
使用上述制备的反应液并利用PCR装置，以重复95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min的循环30次的程序来进行PCR反应。
1.5.1.2：PCR产物的提纯
使用1％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切下含有1.4kb前后的条带的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
1.5.1.3：PCR产物的亚克隆
利用pUC118-HincII/BAP、TaKaRa BKL试剂盒(均为TaKaRa Bio社)，按照操作指南对提纯后的PCR产物进行连接反应。以该连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α(TaKaRa Bio社)，涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL IPTG、40μg/mL X-GAL)上，于37℃静置培养一夜，得到带有PCR产物的大肠杆菌克隆体。
将在琼脂板上呈白色的大肠杆菌菌落在3mLLB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
1.5.1.4：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对在质粒载体pUC118的限制性酶HincII识别部位中插入的DNA序列进行测定。结果确认到，插入部分中具有Pfu-RFCL基因的开放阅读框，在5’端增加了限制性酶NdeI识别序列，在3’端增加了限制性酶XhoI识别序列。将该质粒命名为pUC118/RFCL。
1.5.1.5：RFCL表达质粒制作
以限制性酶NdeI和XhoI对pUC118/RFCL进行双重切断，制备RFCL基因断片。将基因断片插入表达载体，制备Pfu-RFCL的表达载体。
1.5.1.6：RFCL DNA断片制备
在以下的反应体系中，使用限制性酶NdeI和XhoI对pUC118/RFCL进行双重切断。
质粒DNA：5μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，在37℃进行2小时限制性酶切断反应。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将对应于Pfu-RFCL基因的条带(约1.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南由凝胶中提纯RFCLDNA断片。
1.5.1.7：pET-29a表达载体
通过如下的反应，利用限制性酶NdeI和XhoI对pET-29a载体DNA(美国Novagen公司)进行双重切断。
质粒DNA：2μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，于37℃静置2小时。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将相当于直线型的pET-29a载体DNA的条带(约5.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南，由凝胶中提纯pET-29aDNA断片。
1.5.1.8：连接反应和转化
利用DNA连接试剂盒V2(TaKaRa Bio社)对上述得到的Pfu-RFCLDNA断片(100ng)和pET-29a DNA断片(50ng)进行如下的反应。
RFCL DNA断片：100ng
pET-29a DNA断片：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
在上述溶液中添加无菌水，调为10μL，于16℃反应30分钟。
用该连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(含有30μg/mL卡那霉素)上，于37℃静置培养一夜。在形成于琼脂板上的大肠杆菌菌落中，取3个菌落在3mLLB液体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
1.5.1.9：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对插进质粒载体pET-29a中的DNA序列和插入部位附近的序列进行测定。其结果，在每个质粒DNA中，多克隆位点的NdeI和XhoI部分中完全插进了Pfu-RFCL基因的ORF(开放阅读框)。将该带有Pfu-RFCL基因的质粒称为pRFCL(图7)。
如图7所示，确认到在pRFCL中由pET-29a所具有的T7启动子开始依次排列着rbs(核糖体结合部位)、RFCL基因ORF(开放阅读框)、T7终止子。期待本质粒能够大量表达RFCL基因。
1.5.2：RFCS基因的克隆和表达质粒的制作
据非专利文献7的报告，Pfu-RFCS基因(GeneID：1467922)具有1个内含子(由1,575个碱基所编码)，N端的外显子由177个碱基所编码，C端的外显子由804个碱基所编码(其中不含有终止密码子)。序列编号17和18中给出了Pfu-RFCS的碱基序列和氨基酸序列(均含有内含子部分)。
制作RFCS表达载体时，首先利用PCR反应扩增包括内含子的Pfu-RFCS全长基因，然后，制备去除了内含子的成熟型RFCS(也称为RFCSm)，内含子的去除如下实施：分别以PCR对N端侧和C端侧的外显子进行扩增后，利用PCR反应融合2种外显子断片。
1.5.2.1包括内含子的RFCS基因的PCR反应
以Pfu基因组(上述1.1中制备)、RFCS-F、RFCS-R引物(表5，序列编号19、20)的组合进行PCR反应。
表5 RFCS基因用引物
| 引物名称 | 引物序列5’＝＞3’ | 序列编号 |
| RFCS-F引物 | ATG AGC GAA GAG ATT AGA GAA GTT | 19 |
| RFCS-R引物 | ATC ACT TCT TCC CAA TTA GGG TGA AC | 20 |
| RFCSF1引物 | TCA TAT GAG CGA AGA GAT TAG AGA AGT TAA G | 21 |
| RFCSF2引物 | GCA GGC CCC CCT GGT GTC GGA AAG ACT ACA GCG GCT TTG GCC CTT G | 22 |
| RFCSR2引物 | CAA GGG CCA AAG CCG CTG TAG TCT TTC CGA CAC CAG GGG GGC CTG | 23 |
| RFCSR1引物 | AGG TCG ACC ATC ACT TCT TCC CAAT TA GGG TGA AC | 24 |
PCR反应液为如下组成。(添加于50μL反应液体系中的添加量)
模板DNA：100ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq*：1.25U
10×EX Taq缓冲液：5L
向上述组成中添加无菌水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
1.5.2.2：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min的循环30次的程序来进行PCR反应。
1.5.2.3：PCR产物的提纯
使用1％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切下含有2.6kb前后的条带的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
1.5.2.4：PCR产物的亚克隆
利用pUC118-HincII/BAP、TaKaRa BKL试剂盒(均来自TaKaRa Bio社)，按照操作指南对提纯后的PCR产物进行连接反应。以该连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α(TaKaRa Bio社)，涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL IPTG、40μg/mL X-GAL)上，于37℃静置培养一夜，得到带有PCR产物的大肠杆菌克隆体。
将在琼脂板上呈白色的大肠杆菌菌落在3mLLB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
1.5.2.5：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对在质粒载体pUC118的限制性酶HinciI识别部位中插入的DNA序列进行测定。其结果，插入部分与包括内含子的RFCS基因一致。将该质粒命名为pUC/RFCS。
1.5.2.6：外显子扩增用引物
作为N端侧外显子用PCR引物，准备出RFCSF1引物、RFCSR2引物(表5，序列编号21、23)。并且，作为C端侧外显子用PCR引物，准备出RFCSF2引物、RFCSR1引物(表5，序列编号22、24)。为了便于克隆，在5’端增加序列，在RFCSF1引物中增加了限制性酶NdeI序列，在RFCSR1引物中增加了限制性酶SalI序列。并且，以PCR反应将2种外显子断片融合在一起时所利用的互补序列被设计在RFCSF2引物和RFCSR2引物上。
用于扩增2种外显子的PCR反应以如下组成进行。(添加于50μL反应液体系中的添加量)
pUC/RFCS DNA：50ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq*：1.25U
10×EX Taq缓冲液：5μL
在上述组成中添加无菌水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
1.5.2.7：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min的循环30次的程序来进行PCR反应。
1.5.2.8：PCR产物的提纯
使用2％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色。在RFCSF1引物和RFCSR2引物组的PCR产物中观察到约180个碱基的条带，在RFCSF2引物和RFCSR1引物组的PCR产物中观察到约800个碱基的条带。在紫外线照射下切下含有各自的条带的凝胶，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
1.5.2.9：PCR融合反应
在1个管内以一组引物组对2种外显子PCR产物进行PCR反应，由此融合2种断片，获得编码成熟型RFCS的基因断片。下面进行具体说明。
2种外显子PCR产物的退火反应以如下组成进行。
N端外显子断片：2μL(相当于50ng)
C端外显子断片：2μL(相当于50ng)
10×EX Taq缓冲液：5μL
在上述组成中添加无菌水，调成44.5μL。
将上述溶液在95℃加热3min，然后用30分钟缓慢冷却至37℃。
在上述反应液中添加如下成分：
dNTP：5μL(各10nmol)
EX Taq*：0.5μL(2.5U)
使其在72℃反应10min。
(*TaKaRa Bio社制造)
在上述反应液中添加RFCSF1引物和RFCSR1引物各10pmol，以重复95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min的循环30次的程序来进行PCR反应。
1.5.2.10：PCR产物的限制性酶切断·提纯
按照常规方法对上述PCR反应产物进行乙醇沉淀提纯。提纯后的DNA断片以限制性酶NdeI和SalI进行双重切断。
PCR产物：相当于1μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶SalI：5单位
在上述反应液中添加无菌水，调成50μL，于37℃进行2小时限制性酶切断。反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳，将预计为2种内含子的融合断片(成熟型RFCS编码序列)的条带(约1kb前后)切下，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)进行提纯。
1.5.2.11：pET-21a表达载体的限制性酶切断
通过以下反应，对pET-21a载体DNA(Novagen公司)以限制性酶NdeI和SalI进行双重切断。
质粒DNA：2μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶SalI：5单位
在上述反应液中添加无菌水，调成50μL，于37℃静置2小时。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将相当于直线型的pET-21a载体DNA的条带(约5.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南，由凝胶中提纯pET-21a DNA断片。
1.5.2.12：连接反应和转化
对于上述得到的预计为2种内含子的融合断片(成熟型RFCS编码序列)的约1kb的DNA断片(100ng)和pET-21a DNA断片(50ng)，利用DNA连接试剂盒V2(TaKaRa Bio社)如下进行反应。
1kbDNA断片：100ng
pET-21a DNA断片：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
在上述反应液中添加无菌水，调为10μL，于16℃反应30分钟。
用该连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素)上，于37℃静置培养一夜。在形成于琼脂板上的大肠杆菌菌落中，取3个菌落在3mL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
1.5.2.13：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对插进质粒载体pET-21a中的DNA序列和插入部位附近的序列进行测定。其结果，在多克隆位点的NdeI和SalI部分中确认到去除了内含子的成熟型RFCSm的序列(984个碱基)(命名为pRFCSm)。
如图8所示，确认到在pRFCSm中由pET-21a所具有的T7启动子开始依次排列着rbs(核糖体结合部位)、成熟型RFCS基因ORF(开放阅读框)、T7终止子。期待本质粒能够大量表达成熟型RFCS基因。
1.6：Pfu-RFC基因表达菌株的制作
用pRFCL和pRFCSm同时转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，用氨苄青霉素和卡那霉素的双重选择来选择出具有两种质粒的转化体，获得表达菌株。
1.7：Pfu-RFC基因表达
将上述表达菌株在1.5升LB培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL卡那霉素)中于37℃进行振荡培养。在对数增殖期的OD600为0.3-0.5的时候添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以使最终浓度为0.1mM，由此来诱导基因的表达，诱导后的培养进行约3小时。离心分离(4℃，6,000×g，6分钟)培养后的菌体进行回收。
1.8：Pfu-RFC蛋白质提纯
如图9所示，离心回收菌体(S91)，通过超声波破碎来破碎菌体(S92)，进行5分钟煮沸处理(S93)和聚乙烯亚胺沉淀(S94)，进行硫铵沉淀(S95)，通过亲和层析(S96，使用HiTrap Heparin)、凝胶过滤层析(S97，使用Superdex 200)处理，制备标准品。通过SDS-PAGE确认到确保有90％以上的纯度。
1.8.1：菌体破碎
将经离心分离沉淀得到的菌体悬浮于25mL缓冲液B(如上所述)中。利用超声波处理进行菌体破碎。
1.8.2：加热处理
将菌体破碎液煮沸5分钟后，进行离心分离(18,500×g，4℃，25分钟)，回收上清液。
1.8.3：聚乙烯亚胺沉淀
向上清液中添加聚乙烯亚胺(SIGMA P-3143)以使最终浓度为0.18％(w/v)，在冰上搅拌30分钟。离心分离(18,500×g，25分钟，4℃)该溶液，回收上清液。
1.8.4：硫铵沉淀
向每10mL上清液中添加5.61g硫酸铵(最终浓度80％)，于冰上搅拌30分钟，使蛋白质沉淀。通过离心分离(18,500×g，4℃，25分钟)回收沉淀后，将该沉淀溶解于缓冲液C(如上所述)中，同样地对缓冲液C进行透析。
1.8.5：亲和层析
透析后的样品使用HiTrap Heparin HP柱(Amersham Biosciences公司)进行提纯。
洗脱条件为0.1-0.8M NaCl/17.5mL的线性梯度，流速为1mL/min。
1.8.6：凝胶过滤层析
利用使用了Superdex 200(如上所述)的凝胶过滤层析对HiTrapHeparin亲和层析中的峰值馏分进行进一步提纯，作为分析用标准品。对所得到的标准品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认到了标准品分子的大小以及其被充分地提纯(图10)。
2：PCNA变异体的评价
调查了上述制备出的各种PCNA变异体对DNA扩增体系的效果，尤其是对PCR反应体系的效果。具体地说，在PCR反应体系中单独使用PCNA变异体、RFC或合用两者进行添加的情况下，以及不添加的情况下，进行PCR反应，对其反应产物进行电泳，比较目标区域的扩增状态，从而进行评价。
2.1：各种PCNA变异体的评价
作为源自火球菌属(Pyrococcus)的DNA合成酶，以市售的PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa Bio社)为对象，利用PCR反应体系调查各种PCNA变异体的添加效果。Pyrobest DNA聚合酶是源自火球菌属的具有3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)的耐热性α型DNA聚合酶。其特点在于进行与源自激烈火球菌的Pfu DNA聚合酶、或Vent DNA聚合酶同等的高精确性的扩增。
2.1.1：反应液组成
该组成除了添加辅助蛋白质(也表示为AP)以外，为标准的PCR反应液组成，作为缓冲液使用附带的反应缓冲液(10×Pyrobest缓冲液II，组成未公开，TaKaRa Bio社)。如下显示PCR反应液的组成。另外，作为模板DNA使用λDNA(GenBank登录号02459)。
表6
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL) | 0.5μL | 0.2μM |
| 反向引物(20pmol/μL) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×Pyrobest缓冲液II | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL) | 0.25μL | 0.025U/μL |
| AP溶液(参见表7) | 1.1μL | |
| 无菌水 | 37.4μL | |
| 合计 | 50μL |
根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。
有关引物的组合参见表8和表9。
表7 AP溶液(辅助蛋白质溶液)
| 无AP | RFC0 | RFC200 | RFC400 | |
| PCNAxx | 0μL | 0.3μL | 0.3μL | 0.3μL |
| RFC | 0μL | 0μL | 0.4μL | 0.8μL |
| 缓冲液* | 1.1μL | 0.8μL | 0.4μL | 0μL |
| 合计 | 1.1μL | 1.1μL | 1.1μL | 1.1μL |
其中，PCNAxx的原液浓度：100ng/μL，RFC原液浓度：500ng/μL
缓冲液*：25mMTris-HCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
2.1.2：PCR反应程序
扩增2kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、1min)30次循环→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、3.5min)30次循环→于4℃保持
扩增15.8kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、7min)30次循环→于4℃保持
2.1.3：电泳
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。结果显示如下，根据扩增后的断片的大小，分别于图11～图13(PCNA01、10、12、13、16)、图41～图43(PCNA01、10、13、70、71)和图44～图46(PCNA13、72、77、78、79)中给出。
表8 PCNA评价用引物序列
| 引物名称 | 引物位置(λDNA) | 引物序列(5’至3’) | 序列编号 |
| F02 | 23,119-23,138 | GTC GTT TCT GCA AGC TTG GC | 25 |
| F11 | 24,634-24,654 | GCT GCT GAAACG TTG CGG TTG | 26 |
| F24 | 18,483-18,504 | CGT CGG GGA CAT TGT AAA GGC G | 27 |
| R03 | 25,142-25,122 | CCG AGATAA AAA CAA ACC CGC | 28 |
| R14 | 26,914-26,894 | GGC ATT CCT ACG AGC AGA TGG | 29 |
| R16 | 40,479-40,460 | TCC CGT TCT TCC CTG GTA GC | 30 |
表9 λDNA扩增区域
| 大小 | 正向引物 | 反向引物 | λDNA位置 | ||
| 2kb | F02 | R03 | 23,119 | - | 25,142 |
| 8.4kb | F24 | R14 | 18,483 | - | 26,914 |
| 15.8kb | F11 | R16 | 24,634 | - | 40,479 |
2.1.4：结果1
对图11～图13的结果进行说明。
PCNA01
扩增大小为2kb、8.4kb时，仅在添加400ngRFC时观察到了扩增，其他的情况中，添加PCNA01与未添加(无AP)的情况相比起到了抑制作用。这说明，使用野生型PCNA时，必须合用适量的RFC才能扩增，这与通过单独添加来显示DNA合成促进活性的引物延伸试验结果(非专利文献6和9)不同，在PCR中，单独添加野生型PCNA会明显抑制反应。
PCNA10
扩增大小为2kb、8.4kb时，仅在添加200ng、400ngRFC时观察到了扩增，扩增大小为15.8kb时，仅在添加400ng RFC时观察到扩增。扩增量虽优于PCNA01的情况，但与PCNA01同样地需要存在RFC，说明RFC的最佳添加量随扩增大小的不同而不同。
PCNA12
在扩增大小为2kb、8.4kb、15.8kb的每种情况下，都观察到扩增量由于RFC的添加而得到促进。并且，在未添加RFC的情况中也得到了扩增。但是，与单独的PCR酶的情况相比，仅观察到少许的扩增促进。
PCNA13
在扩增大小为2kb、8.4kb、15.8kb的每种情况下都确认到大量的扩增，扩增量不依赖于RFC的添加量。PCNA13的添加效果中不需要RFC，认为显著地促进了基于PCR的扩增。
PCNA16
在扩增大小为2kb、8.4kb、15.8kb的每种情况下都确认到了扩增。即使在未添加RFC的情况下也进行了扩增，但扩增水平等同于单独的PCR酶的情况。并且，没有明确观察到RFC添加的效果。
对于5种PCNA，确认其向使用Pyrobest DNA聚合酶的PCR反应体系中添加的效果，对于PCNA13，添加时的扩增效果绝对高于未添加时，并且表明其不需要RFC的添加。
2.1.5：结果2
对图41～图43的结果进行说明。
PCNA01(准野生型)
与2.1.4中的结果相同，除了添加400ng RFC的情况以外，在任何大小的情况下都未观察到扩增，与未添加PCNA(无AP)的情况相比起到了抑制作用。
PCNA10(D143A)
扩增大小为2kb的情况下添加200～400ngRFC、大小为8.4kb的情况下添加400ngRFC时明显观察到扩增，大小为15.8kb时，即使添加400ngRFC，也未观察到扩增。与2.1.4中的结果相同，作为扩增量虽优于PCNA01，但扩增中需要存在RFC，说明RFC的最佳添加量随扩增大小的不同而不同。
PCNA71(D143H)
未添加RFC时观察不到扩增，扩增大小为2kb和8.4kb的情况下，添加200～400ngRFC可以观察到扩增，大小为15.8kb的情况下，添加400ngRFC可以观察到扩增。与PCNA10相比，尽管扩增量进一步增加，但扩增中需要添加RFC。
PCNA70(D143K)
无论是否存在RFC，添加量多少，在每个大小的情况下都观察到大量的扩增。
PCNA13(D143R)
与2.1.4中的结果相同，在每个大小的情况下，都与RFC无关地观察到大量的扩增，扩增水平优于PCNA70。
对于在PCNA的第143个残基上导入了变异的4种变异体(PCNA10、13、70、71)，验证了其在PCR反应体系中的添加效果，仅PCNA70(D143K)和PCNA13(D143R)显示出与RFC无关的促进效果，被置换为碱性度更高的精氨酸残基的PCNA13显示出最强的促进效果。因此可以认为，通过向D143残基导入变异，会带来单独的PCNA所导致的PCR促进效果，为此需要将其置换为显示碱性的氨基酸残基，该置换后的残基在PCR反应条件下(pH8.0～)所具有的正电荷在引起相对于单体界面的离子对网络的电荷排斥方面是重要的。
2.1.6：结果3
对图44～图46的结果进行说明。
PCNA13(D143R)
与2.1.4、2.1.5中的结果相同，在每个大小下都与RFC无关地观察到了大量的扩增。
PCNA77(D147R)
无论是否存在RFC，添加量多少，在每个大小的情况下都观察到大量的扩增，其扩增量劣于PCNA13。
PCNA72(R109E)
在每个大小的扩增情况下，无论是否存在RFC，添加量多少，与未添加(无AP)的情况相比，几乎没有变化。
PCNA79(E139R)
在每个大小的扩增情况下，在同时添加200～400ng RFC时会确认到促进效果，但扩增中必须存在RFC，单独添加PCNA79会抑制反应。
PCNA78(E139A)
在每个大小的扩增情况下，在同时添加200～400ngRFC时会确认到促进效果，但扩增中必须存在RFC，单独添加PCNA78会抑制反应。并且，与PCNA79比较时，同时添加200ngRFC的情况下，优劣会随着扩增大小的不同而不同，同时添加400ngRFC的情况下，其扩增量劣于PCNA79。可以认为，对E139进行导入置换的情况下，置换为碱性氨基酸(精氨酸)的效果大于置换为中性氨基酸(丙氨酸)的情况。
Pfu-PCNA在形成同源三聚体时位于界面，在涉及三聚体形成的氨基酸中，对于4种导入了置换变异的变异体，验证了其向PCR反应体系中的添加效果，结果分为3类。一类是，单独添加时会抑制反应，但同时添加RFC时反应会依赖于RFC的添加量而有所恢复，根据添加量会观察到优于未添加(无AP)时的扩增。一类是，单独添加以及与RFC同时添加时，均未观察到不同于未添加(无AP)的情况的变化，据推测与反应无关。另一类是，无论是否存在RFC，都会促进反应。据认为该要点在于三聚体的形成能，是基于减弱离子对网络的程度而出现的现象。即，三聚体结构过于牢固时，没有RFC的协助就不能进行反应。丧失了三聚体形成能的话就起不到夹钳的作用。据推测，处于其中间的适当地使三聚体结构变弱的状态对于PCR中的酶活性促进是重要的。
认为通过引发对单体界面的离子对网络的电荷排斥来实现对PCR中的酶活性促进有效的三聚体形成能。并且，通过减弱了据认为参与了热稳定性的离子对网络，使得三聚体在高温下易于解离。可以推测出如下的反应机理：由于在PCR中向着下一个循环升高温度时、或是循环最初的变性环节中的高温时三聚体会解离，从而使复制反应重复进行。
对于11种变异体，进行了向PCR反应体系中的添加效果的确认，确认到PCNA13(D143R)、PCNA70(D143K)和PCNA77(D147R)这3种显示出了不依赖于RFC的促进效果，其中PCNA13显示出最强的绝对性的扩增效果。并且还发现了由于同时添加RFC而出现扩增量减少的倾向。
2.2：PCNA13对各种PCR用DNA聚合酶的效果
基于上述结果，对于各种PCNA变异体中性质尤其优异的PCNA13，以使用市售的7种PCR用DNA聚合酶的PCR反应体系为对象，调查了添加效果。具体地说，对于2～3种扩增链长不同的目标序列，进行延长时间不同的PCR反应，对添加效果进行了确认。
2.2.1：PCNA13对Pyrobest DNA聚合酶的添加效果
Pyrobest DNA聚合酶是源自火球菌属、具有3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)的耐热性α型DNA聚合酶。
除了添加PCNA13以外，制成制造商在使用说明书中推荐的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×Pyrobest缓冲液II，组成未公开，TaKaRa Bio社)。如下给出PCR反应液的组成。
表10
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 反向引物(20pmolμ/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×Pyrobest缓冲液II | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL) | 0.25μL | 0.025U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液2) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 38.2μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2)PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、0.5min/1min/2min)30次循环→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、2min/3.5min/5min)30次循环→于4℃保持
扩增15.8kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、2min/5min/6min/7min)30次循环→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，采用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。根据扩增断片的大小分别于图14～图16给出结果。
总结：
扩增2kb的情况
如图14所示，延长时间(Extension time)为0.5min、1min时，清楚地观察到添加PCNA13所带来的反应促进。延长时间为2min时，观察到反应为近于饱和的状态，但还是添加PCNA13时扩增量稍多。
扩增8.4kb的情况
如图15所示，延长时间为2min时观察不到添加效果，3.5min、5min时观察到添加所带来的促进效果。
扩增15.8kb的情况
如图16所示，延长时间为2min时观察不到添加效果，5min、6min、7min时观察到添加所带来的促进效果。
2.2.2：PCNA13对TaKaRa EX Taq的添加效果
TaKaRa EX Taq(TaKaRa Bio社)是具有3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)的耐热性DNA聚合酶。在通常的PCR条件下，与现有的Taq DNA聚合酶相比，能够以高扩增效率、低错误率来实现高灵敏度的PCR。
除了添加PCNA13以外，制成制造商在使用说明书中推荐的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×Ex Taq缓冲液(20mM Mg2+plus)，组成未公开，TaKaRa Bio社)。如下给出PCR反应液的组成。
表11
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20nG/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 反向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×Ex Taq缓冲液(20mMMg2+) | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| TaKaRa EX Taq(5U/μL) | 0.25μL | 0.025U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液2) | 0.5μL | 0或1ng/μL |
| 无菌水 | 38μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2)PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、30sec/40sec/1min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、1.5min/2min/3min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
扩增15.8kb的情况
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、3.5min/4min/5min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。根据扩增断片的大小分别于图17～图19给出结果。
总结：
扩增2kb的情况
由图17可知，延长时间为30sec、40sec时，清楚地观察到添加PCNA13所带来的扩增量与反应速度的增加。延长时间为1min时，无论添加还是未添加，反应均会达到饱和，在延长时间为40sec时，添加PCNA13时的扩增量几乎近于反应的饱和状态。
扩增8.4kb的情况
如图18所示，延长时间为1.5min、2min时，清楚地观察到添加PCNA13所带来的扩增量和反应速度的增加。延长时间为3min时，无论添加还是未添加，反应均会达到饱和，延长时间为2min时，添加PCNA13时的扩增量几乎近于反应的饱和状态。
扩增15.8kb的情况
如图19所示，延长时间为3.5min、4min时，清楚地观察到添加PCNA13所带来的扩增量和反应速度的增加。延长时间为5min时，无论是添加还是未添加，反应均会达到饱和，延长时间为4min时，添加PCNA13时的扩增量几乎近于反应的饱和状态。
2.2.3：对于Vent DNA聚合酶的PCNA13添加效果
Vent DNA聚合酶是源自作为嗜热菌的Thermococcus litoralis(热球菌属)的DNA聚合酶，是由NEW ENGLAND Bio Labs公司销售的PCR用酶。
评价时，除了添加PCNA13以外，制成标准的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×ThermoPol反应缓冲液；200mMTris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mMKCl，20mMMgSO4，1％Triton X-100，25℃时的pH为8.8)。如下给出PCR反应液的组成。
表12
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 反向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×ThermoPol反应缓冲液 | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Vent DNA聚合酶(2U/μL) | 0.25μL | 0.01U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液2) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 38.2μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2)PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
95℃、2min→(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、5sec/15sec/30sec)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
95℃、2min→(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min/3min/5min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。根据扩增断片的大小分别于图20、图21给出结果。
总结：
扩增2kb的情况
如图20所示，延长时间为5sec、15sec时，清楚地观察到添加PCNA13所带来的反应的促进。延长时间为30sec时，观察到反应为近于饱和的状态，但还是添加PCNA13时扩增量稍多。
扩增8.4kb的情况
如图21所示，延长时间为1min、3min、5min时，观察到添加所带来的促进效果(扩增量、反应速度)。
2.2.4：PCNA13对Deep Vent DNA聚合酶的添加效果
Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs社)是源于火球菌属GB-D1的耐热性DNA聚合酶，其具有3’→5’核酸外切酶活性。
评价时，除了添加PCNA13以外，制成标准的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×ThermoPol反应缓冲液；200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mMKCl，20mMMgSO4，1％Triton X-100，25℃时的pH为8.8)。如下给出PCR反应液的组成。
表13
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 1μL | 0.4μM |
| 反向引物(20pmol/μL)1) | 1μL | 0.4μM |
| 10×ThermoPol反应缓冲液 | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Deep Vent DNA聚合酶(2U/μL) | 0.5μL | 0.02U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液2) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 36.95μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2) PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
95℃、2min→(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、0.5min/1min/2min/3min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
95℃、2min→(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、5min/7min/9min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。根据扩增断片的大小分别于图22和图23给出结果。
总结：
扩增2kb的情况
如图22所示，延长时间为0.5min、1min、2min时，清楚地观察到添加PCNA13所带来的反应的促进。延长时间为3min时，无论添加还是未添加，反应均会达到饱和，延长时间为2min时，添加PCNA13时的扩增量几乎近于反应的饱和状态。
扩增8.4kb的情况
如图23所示，在延长时间为5min、7min、9min的任一条件下，都观察到添加所带来的促进效果(扩增量、反应速度)。
2.2.5：PCNA13对Pfu Turbo DNA聚合酶的添加效果
Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene社)是在源自激烈火球菌的耐热性DNA聚合酶中添加有被称为ArchaeMaxx(R)((R)表示注册商标)因子的PCR反应促进剂的产品。已知PCR反应过程中作为副产物产生的dUTP抑制PCR反应，ArchaeMaxx(R)因子为分解dUTP的因子，通过添加该因子可以防止其对PCR反应的抑制，从而提高PCR反应效率。
评价时，除了添加PCNA13以外，制成标准的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×克隆后Pfu DNA聚合酶反应缓冲液；200mM Tris-HCl(pH 8.8)、100mM(NH4)2SO4、100mMKCl、20mMMgSO4、1％Triton X-100、1mg/mlBSA)。如下给出PCR反应液的组成。
表14
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 反向引物(20pmol/μL)1) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×克隆后Pfu DNA聚合酶反应缓冲液 | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5U/μL) | 1μL | 0.05U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液2) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 37.45μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2)PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
95℃、2min→(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min)30次循环→72℃、10min→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
92℃、2min→(92℃、10sec→55℃、30sec→68℃、8min)10次循环→(92℃、10sec→55℃、30sec→68℃、8min+10sec/循环)20次循环→于4℃保持
扩增15.8kb的情况
92℃、2min→(92℃、10sec→55℃、30sec→68℃、15min)10次循环→(92℃、10sec→55℃、30sec→68℃、15min+10sec/循环)20次循环→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。
总结：
如图24所示，在每个大小的PCR反应中均观察到PCNA13的添加所带来的反应速度促进、扩增量增加的效果。
2.2.6：PCNA13对KOD DNA聚合酶的添加效果
KOD DNA聚合酶(东洋纺社)是源自作为超嗜热古细菌的Thermococcus kodakaraensis(热球菌属)KOD1菌株的DNA聚合酶。除了聚合酶活性外还具有较强的3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)，显示出高于Taq DNA聚合酶约50倍的PCR忠实性。市售的以源自火球菌(pyrococcus)属为主的其他高精确性PCR用酶大多延长速度较慢，而本酶的延长速度非常快，具有Taq DNA聚合酶的约2倍的延长速度。因此，能够在短时间内进行精确性高的PCR。
评价时，除了添加PCNA13以外，制成标准的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×PCR缓冲液#1：1.2MTris-HClpH8.0、60mM(NH4)2SO4、100mMKCl、1％TritonX-100、0.01％BSA或10×PCR缓冲液#2：1.2MTris-HCl pH8.8、60mM(NH4)2SO4、100mMKCl、1％TritonX-100、0.01％BSA)。如下给出PCR反应液的组成。
表15
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 1.25μL | 0.5μM |
| 反向引物(20pmol/μL)1) | 1.25μL | 0.5μM |
| 10×附带缓冲液#1或#22) | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| 25mMMgCl2 | 2μL | 1mM |
| KOD DNA聚合酶(2.5U/μL) | 0.28μL | 0.014U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液3) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 34.67μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2)10×附带缓冲液#1：2kb，#2：8.4kb、15.8kb
3)PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
94℃、1min→(98℃、10sec→68℃、12sec)30次循环→72℃、3min→于4℃保持
扩增8.4kb、15.8kb的情况
94℃、1min→(98℃、10sec→68℃、2min)30次循环→72℃、3min→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记，使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。
总结：
如图25所示，在每个大小的PCR反应中，均观察到PCNA13的添加所带来的反应速度促进、扩增量增加的效果。
2.2.7：PCNA13对Pwo DNA聚合酶的添加效果
Pwo DNA聚合酶(Roche Diagnostics社)是源自作为嗜热性古细菌的伍斯氏火球菌(Pyrococcus woesei)菌株的DNA聚合酶。其除了聚合酶活性外还具有较强的3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)，显示出高于TaqDNA聚合酶的PCR忠实性。因此，能够在短时间内进行精确性高的PCR。
评价时，除了添加PCNA13以外，制成制造商在使用说明书中推荐的PCR反应液的组成，作为缓冲液使用产品附带的反应缓冲液(10×PCR缓冲液；100mMTris-HCl pH8.85、50mM(NH4)2SO4、250mMKCl、20mMMgSO4)。如下给出PCR反应液的组成。
表16
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5nG/μL |
| 正向引物(20pmol/μL)1) | 1.5μL | 0.6μM |
| 反向引物(20pmol/μL)1) | 1.5μL | 0.6μM |
| 10×含有MgSO4的PCR缓冲液 | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Pwo DNA聚合酶(5U/μL) | 0.14μL | 0.014U/μL |
| PCNA13溶液或缓冲液2) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 36.31μL | |
| 合计 | 50μL |
1)根据扩增的链长改变正向引物和反向引物的组合。有关引物的组合参见表8和表9。
2)PCNA13的原液浓度：100ng/μL，缓冲液：25mMTrisCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
PCR反应程序：
扩增2kb的情况
94℃、1min→(98℃、10sec→68℃、30sec或1min)30次循环→72℃、3min→于4℃保持
扩增8.4kb的情况
95℃、2min→(95℃、30sec→60℃、30sec→72℃、2min或4min)30次循环→72℃、3min→于4℃保持
电泳：
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，用1％琼脂糖凝胶对相当于10μL的量的PCR反应液进行电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。
总结：
如图26所示，在每个大小的PCR反应及延长时间下均观察到PCNA13的添加所带来的反应速度促进、扩增量增加的效果。
如上述实施例所示，证明了PCNA13对具有代表性的市售的7种PCR用DNA聚合酶发挥出优异的延长促进活性。并且，所使用的PCNA13虽为源自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的PCNA的变异改良体，但其不仅对源自激烈火球菌的DNA聚合酶有效，对菌种不同的DNA聚合酶也有效。
3：KOD-PCNA-RFC蛋白质的制备
源自Thermococcus kodakaraensis(热球菌属，为超嗜热古细菌)KOD1菌株的PCNA变异体蛋白质标准品和RFC蛋白质标准品如下制备：在大肠杆菌内使它们的基因大量表达，由表达菌体提纯蛋白质。
3.1：获得菌体、制备基因组DNA
Thermococcus kodakaraensis KOD1 菌株为由 JCM(JAPANCOLLECTION OF MICROORGANISMS)获得的10mL培养液(JCMNO.12,380)。在6,000×g、15min、4℃的条件下离心该培养液，回收菌体。将回收到的菌体悬浮在1mL的TBS缓冲液(50mMTris-HCl pH7.2，150mMNaCl)中，清洗后，通过15,000×g、5min、4℃的离心操作来回收。
将沉淀物溶解在100μL的溶菌缓冲液(50mMTris-HCl pH8.0，50mMEDTA pH8.0，0.5％SDS)中，于50℃进行3小时的保温反应。然后，在该反应液中添加100μL苯酚/三氯甲烷溶液。然后对该溶液在15,000×g、5min、室温的条件下进行离心分离操作，回收上清液约100μL。利用MagExtractor Genome试剂盒(东洋纺)，按照其操作指南由该上清液回收基因组DNA。
3.2：KOD-PCNA的制备
3.2.1：KOD-PCNA基因克隆
KOD-PCNA基因如下获得：参考Genbank ID BD182828(序列编号31和序列编号32)，利用PCR进行克隆(图27)。下面进行具体说明。
3.2.1.1：PCR引物
使用KOD-PCNA-F、KOD-PCNA-R用于KOD-PCNA基因的扩增。设计该引物组以扩增相当于由PCNA基因的起始甲硫氨酸至终止密码子的区域，进而在5’侧增加限制性酶NdeI识别部位、限制性酶XhoI识别部位。每个引物的序列于表17(序列编号33和34)给出。
表17 KOD-PCNA克隆用PCR引物
| 引物名称 | 引物序列5’→3’ | 序列编号 |
| KOD-PCNA-F | cca tat gcc gtt cga agt tgt ttt tga | 33 |
| KOD-PCNA-R | ctc gag tca ctc ctc aac gcg cgg | 34 |
3.2.1.2：PCR反应液组成
PCR反应液为如下组成。(添加于50μL反应液体系中的添加量)
模板DNA*：100ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq**：1.25U
10×ExTaq缓冲液：5μL
在上述液体中添加无菌水，调为50μL。
(*模板DNA：3.1中制备出的基因组DNA，**EX Taq：TaKaRa Bio社制造)
3.2.1.3：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min)的循环30次的程序来进行PCR反应。
3.2.1.4：PCR产物的提纯
使用1％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切下含有750bp前后的条带的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
3.2.1.5：PCR产物的亚克隆
利用pUC118-HincII/BAP、TaKaRa BKL试剂盒(均来自TaKaRa Bio社)，按照操作指南对提纯后的PCR产物进行连接反应。以该连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α(TaKaRa Bio社)，涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL IPTG、40μg/mL X-GAL)上，于37℃静置培养一夜，得到带有PCR产物的大肠杆菌克隆体。
将在琼脂板上呈白色的大肠杆菌菌落在3mL的LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
3.2.1.6：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对在质粒载体pUC118的限制性酶HincII识别部位中插入的DNA序列进行测定。结果确认到，插入部分中具有KOD-PCNA基因的开放阅读框，在5’端增加了限制性酶NdeI识别序列，在3’端增加了限制性酶XhoI识别序列。将带有KOD-PCNA基因的开放阅读框的本质粒载体命名为pUC/KPC。
3.2.2：KOD-PCNA基因表达质粒的构建
以限制性酶NdeI和XhoI对pUC/KPC进行双重切断，制备PCNA基因断片。将基因断片插入表达载体，制备KOD-PCNA的表达载体。
3.2.2.1：PCNADNA断片的制备
在以下的反应体系中，使用限制性酶NdeI和XhoI对pUC/KPC进行双重切断。
质粒DNA：5μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，在37℃进行2小时限制性酶切断反应。反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳。将对应于KOD-PCNA基因的条带(约750bp前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南由凝胶中提纯PCNADNA断片。
3.2.2.2：pET-21a表达载体
通过如下的反应，利用限制性酶NdeI和XhoI对pET-21a载体DNA(美国Novagen公司)进行双重切断。
质粒DNA：2μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，于37℃静置2小时。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将相当于直线型的pET-21a载体DNA的条带(约5.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南，由凝胶中提纯pET-21aDNA断片。
3.2.2.3：连接反应和转化
利用DNA连接试剂盒V2(TaKaRa Bio社)对上述得到的KOD-PCNADNA断片(100ng)和pET-21a DNA断片(50ng)进行如下的反应。
PCNADNA断片：100ng
pET-21a DNA断片：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
在上述溶液中添加无菌水，调为10μL，于16℃反应30分钟。
用该连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(100μg/mL氨苄青霉素)上，于37℃静置培养一夜。在形成于琼脂板上的大肠杆菌菌落中，取3个菌落在3mL的LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
3.2.2.4：通过测序确认序列
对于上述重组质粒，使用DNA测序仪对插进质粒载体pET-21a中的DNA序列和插入部位附近的序列进行测定。其结果，多克隆位点的NdeI和XhoI部分中完全插进了KOD-PCNA基因的开放阅读框。将该带有KOD-PCNA基因的质粒称为pKPCNA(图28)。
如图28所示，确认到在pKPCNA中由pET-21a所具有的T7启动子开始依次排列着rbs(核糖体结合部位)、PCNA基因ORF(开放阅读框)、T7终止子。期待本质粒能够大量表达PCNA基因。
3.2.3：向KOD-PCNA基因导入变异
为了制作更高功能的PCNA，对KOD-PCNA进行了氨基酸置换。氨基酸置换通过对编码该氨基酸的密码子的碱基进行置换来进行。在表18所示的变异部位中导入了氨基酸变异。
表18 KOD-PCNA变异导入部位
| 变异体 | 变异部位 |
| KOD-PCNA01 | M73L |
| KOD-PCNA13 | M73L+E143R |
3.2.3.1：导入置换变异
利用要导入变异的质粒和导入变异用寡核苷酸对(表19、序列编号35～38)，采用Quik Change II定点突变试剂盒(Stratagene社)，按照其操作指南，向PCNA基因导入变异。
表19 KOD-PCNA变异导入用引物
| 引物名称 | 引物序列5’→3’ | 序列编号 |
| KOD_M73L-F | C GAG ACA ATC GGC ATC AAC CTG GAC CAG TTC AAG | 35 |
| KOD_M73L-R | CTT GAA CTG GTC CAG GTT GAT GCC GAT TGT CTC G | 36 |
| KOD_E143R-F | CTC GGT GAG GTT CTC AAG CGT GGC ATA AAG GAC GCT TC | 37 |
| KOD_E143R-R | GA AGC GTC CTT TAT GCC ACG CTT GAG AAC CTC ACC GAG | 38 |
导入变异后通过测序确认DNA序列，确认到目标部位中导入了变异且目标部位以外的部位没有变异。下面对各PCNA变异体的设计进行说明。
KOD-PCNA01
根据有关激烈火球菌(Pyrococcus friosus)的PCNA的报告(非专利文献6)，在制备以大肠杆菌为宿主的野生型Pfu-PCNA的重组蛋白质的情况下，除了生成起自原本的启始Met的翻译蛋白质以外，还生成了从N末端的第73个残基开始翻译的约20kDa的蛋白质的副产物，降低了目标蛋白质的生产效率。将第73个残基的Met单残基置换为Leu的情况下，抑制了这个约20kDa的蛋白质的生成，如此制成的Pfu-PCNA具有无异于野生型PCNA蛋白质的性质。KOD-PCNA与Pfu-PCNA的全长均为249个氨基酸残基，完全一致的氨基酸为84.3％，再加上性质类似的氨基酸，二者具有非常高的相同性。基于这些情况，对于KOD-PCNA，在本说明书中使用将第73残基的Met单残基置换为Leu的KOD-PCNA的M73L的变异体作为准野生型。
将该KOD_M73L的变异体命名为KOD-PCNA01，制作变异体。制作KOD-PCNA01时，使用pKPCNA作模板质粒，使用导入变异用寡核苷酸对(KOD_M73L-F和KOD_M73L-R)进行制作(参见表19，序列35、序列36)。
KOD-PCNA13
在激烈火球菌(Pyrococcus friosus)的PCNA的情况下，已知第143个残基的氨基酸残基在单体彼此形成三聚体时涉及离子对网络的形成(非专利文献9)。如上述实施例1～2所示，我们的研究小组发现了将该位置上的氨基酸残基转变为电学性质相反的残基后的变异型PCNA在DNA合成时会飞跃性地促进DNA聚合酶的反应。在Thermococcus kodakaraensis的情况下，相当于该位置的氨基酸在野生型中为谷氨酸(酸性氨基酸)，可以通过将其置换为精氨酸(碱性氨基酸)来完全改变该部位的氨基酸的电学性质。为了调查其在添加的情况下对DNA合成的影响，制作了该变异体。具体地说，以KOD-PCNA01产生质粒为模板，使用了KOD_E143R-F和KOD_E143R-R的导入变异用寡核苷酸进行了制作(表19、序列37、38)。
3.2.3.2：KOD-PCNA表达菌株的制作
利用以上获得的变异型PCNA表达质粒载体转化大肠杆菌BL21CodonPlus(DE3)RIL(Stratagene社)，获得表达各变异基因的大肠杆菌菌株。
3.2.4：KOD-PCNA蛋白质提纯
如图29所示，离心回收菌体(S291)，进行菌体破碎(超声波破碎，S292)、5分钟煮沸(S293)和聚乙烯亚胺沉淀(S294)，进而进行硫铵沉淀(S295)，通过离子交换层析(S296，使用HiTrap Q为柱)、凝胶过滤层析(S297，使用Superdex 200)这样的处理来制备标准品。通过SDS-PAGE确认到每个标准品都能确保90％以上的纯度。
3.2.4.1：菌体培养和KOD-PCNA表达诱导
将各变异PCNA表达菌株在1.5升LB培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)中于37℃振荡培养。在对数增殖期的OD600为0.3-0.5的时候添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以使最终浓度为0.1mM，由此来诱导基因的表达，诱导后的培养进行约3小时。离心分离(4℃，6,000×g，6分钟)培养后的菌体进行回收。
3.2.4.2：菌体破碎
将经离心分离沉淀得到的菌体悬浮于25mL的缓冲液B(50mMTris-HCl pH8.0，0.1MNaCl，0.1mMEDTA，10％甘油，0.5mMDTT)中。利用超声波处理进行菌体破碎。
3.2.4.3：加热处理
将菌体破碎液煮沸5分钟后，进行离心分离(18,500×g，4℃，25分钟)，回收上清液。
3.2.4.4：聚乙烯亚胺沉淀
向上清液中添加聚乙烯亚胺(SIGMA P-3143)和NaCl以使最终浓度分别为0.2％(w/v)和0.58M，在冰上搅拌30分钟。离心分离(18,500×g，25分钟，4℃)该溶液，回收上清液。
3.2.4.5：硫铵沉淀
向每10mL上清液中添加5.61g硫酸铵(最终浓度80％)，于冰上搅拌30分钟，使蛋白质沉淀。向该溶液中添加80mL以硫铵80％饱和的50mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液，通过离心分离(30,000×g，25分钟，4℃)回收沉淀后，将该沉淀溶解于缓冲液C(50mMTris-HCl pH8.0，0.1MNaCl)中，同样地对缓冲液C进行透析。
3.2.4.6：离子交换层析
对于透析后的样品使用AKTAexplorer 10S(Amersham Biosciences公司)来实施离子交换层析(HiTrap Q，Amersham Biosciences公司)。洗脱条件为0.1-0.8MNaCl/17.5mL的线性梯度，流速为1mL/min，得到KOD-PCNA01和KOD-PCNA13的峰值馏分。
3.2.4.7：凝胶过滤层析
利用使用了Superdex 200(Amersham Biosciences公司)的凝胶过滤层析分别对HiTrap Q离子交换层析中的峰值馏分进行进一步提纯，作为之后的分析用标准品。
对所得到的标准品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认到了标准品分子的大小以及其被充分地提纯(图30)。
3.3：KOD-RFC的制备
Thermococcus kodakaraensis KOD的RFC由2个亚单元RFCL和RFCS构成，它们在基因组上为串联的位置关系。制备RFC蛋白质标准品时采用如下方法：分别将RFCL和RFCS基因载入表达载体，在同一宿主内导入各个表达载体，使其同时表达。制作表达质粒时，参考了非专利文献10。下面进行具体说明。
3.3.1：KOD-RFCL的基因克隆和表达质粒的构建(图31)
KOD-RFCL基因(Genbank ID：182,830)以KOD基因组为模板，通过PCR获得(序列编号39)。
3.3.1.1：PCR引物
作为PCR用引物，使用了KOD-RFCL-F引物和KOD-RFCL-R引物(表20，序列编号40和41)。为了便于克隆操作，在KOD-RFCL-F引物上增加了限制性酶NdeI识别部位，在KOD-RFCL-R引物上增加了限制性酶XhoI识别部位。
表20 KOD-RFCL克隆用引物
| 引物名称 | 引物序列5’→3’ | 序列编号 |
| KOD-RFCL-F | cca tat gac gga agt ccc atg ggt tg | 40 |
| KOD-RFCL-R | ctc gag tca ctt ctt gag gaa gtc gaa cag | 41 |
3.3.1.2：PCR反应液组成
作为PCR的模板，使用上述3.1中制备出的KOD基因组DNA。
PCR反应以如下组成进行。(添加于50μL反应体系中的添加量)
模板DNA：100ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq*：1.25U
10×EX Taq缓冲液：5μL
在上述体系中添加无菌蒸馏水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
3.3.1.3：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复(95℃·30sec→55℃、30sec→72℃、1min)的循环30次的程序来进行PCR反应。
3.3.1.4：PCR产物的提纯
使用1％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切下含有1.5kb前后的条带的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
3.3.1.5：PCR产物的亚克隆
利用pUC118-HincII/BAP、TaKaRa BKL试剂盒(均来自TaKaRa Bio社)，按照操作指南对提纯后的PCR产物进行连接反应。以该连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α(TaKaRa Bio社)，涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL IPTG、40μg/mL X-GAL)上，于37℃静置培养一夜，得到带有PCR产物的大肠杆菌克隆体。
将在琼脂板上呈白色的大肠杆菌菌落在3mL的LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
3.3.1.6：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对在质粒载体pUC118的限制性酶HincII识别部位中插入的DNA序列进行测定。结果确认到，插入部分中具有KOD-RFCL基因的开放阅读框，在5’端增加了限制性酶NdeI识别序列，在3’端增加了限制性酶XhoI识别序列。将该质粒命名为pUC118/KRFCL。
3.3.1.7：KOD-RFCL表达质粒制作
以限制性酶NdeI和XhoI对pUC118/KRFCL进行双重切断，制备RFCL基因断片。将基因断片插入表达载体，制备KOD-RFCL的表达载体。
3.3.1.8：RFCL DNA断片制备
在以下的反应体系中，使用限制性酶NdeI和XhoI对pUC118/KRFCL进行双重切断。
质粒DNA：5μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，在37℃进行2小时限制性酶切断反应。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将对应于KOD-RFCL基因的条带(约1.5kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南由凝胶中提纯RFCLDNA断片。
3.3.1.9：pET-29a表达载体
通过如下的反应，利用限制性酶NdeI和XhoI对pET-29a载体DNA(美国Novagen公司)进行双重切断。
质粒DNA：2μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶XhoI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，于37℃静置2小时。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将相当于直线型的pET-29a载体DNA的条带(约5.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南，由凝胶中提纯pET-29aDNA断片。
3.3.1.10：连接反应和转化
利用DNA连接试剂盒V2(TaKaRa Bio社)对上述得到的KOD-RFCLDNA断片(100ng)和pET-29a DNA断片(50ng)进行如下的反应。
RFCL DNA断片：100ng
pET-29a DNA断片：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
在上述体系中添加无菌水，调为10μL，于16℃反应30分钟。
用该连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(30μg/mL卡那霉素)上，于37℃静置培养一夜。在形成于琼脂板上的大肠杆菌菌落中，取3个菌落在3mLLB液体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
3.3.1.11：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对插进质粒载体pET-29a中的DNA序列和插入部位附近的序列进行测定。其结果，在每个质粒DNA中，多克隆位点的NdeI和XhoI部分中完全插进了KOD-RFCL基因的ORF(开放阅读框)。将该带有KOD-RFCL基因的质粒称为pKRFCL(图32)。
如图32所示，确认到在pKRFCL中由pET-29a所具有的T7启动子开始依次排列着rbs(核糖体结合部位)、RFCL基因开放阅读框、T7终止子。期待本质粒能够大量表达RFCL基因。
3.3.2：KOD-RFCS的基因克隆和表达质粒的构建
据非专利文献10的报告，KOD-RFCS基因(Genebank ID：BD182,829)由全长2,601个碱基编码，其具有1个内含子，N端的外显子由177个碱基所编码，C端的外显子由804个碱基所编码(其中不含有终止密码子)。序列表的序列编号42中给出了KOD-RFCS的碱基序列(去除了内含子部分的成熟型序列)。
如图33所示，制作RFCS表达载体时，首先利用PCR反应对包括内含子的KOD-RFCS全长基因进行克隆(S331～S334)，然后，利用PCR反应分别对2种外显子断片进行扩增后(S335～336)，去除内含子，从而制成将2种外显子结合在一起的成熟型RFCS(也称为RFCSm)，将其载入表达载体(S337～S339)。
3.3.2.1：对包含内含子的RFCS全长基因进行的克隆
3.3.2.1.1：PCR引物
PCR引物使用了KOD-RFCS-F、KOD-RFCS-R引物(表21，序列编号43和44)。
表21 KOD-RFCS克隆用引物
| 引物名称 | 引物序列5’→3’ | 序列编号 |
| KOD-RFCS-F | atg tcc gag gaa gtg aag gaa g | 43 |
| KOD-RFCS-R | tca ctt acc cat aat cgt gaa ctg | 44 |
3.3.2.1.2：PCR反应组成
作为PCR的模板，使用了上述3.1中制备出的KOD基因组DNA。
PCR反应液为如下组成。(添加于50μL反应液体系中的添加量)
模板DNA：100ng
引物：10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq*：1.25U
10×EX Taq缓冲液：5μL
在上述体系中添加无菌水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
3.3.2.1.3：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min)的循环30次的程序来进行PCR反应。
3.3.2.1.4：PCR产物的提纯
使用1％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切下含有2.6kb前后的条带的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
3.3.2.1.5：PCR产物的亚克隆
利用pUC118-HincII/BAP、TaKaRa BKL试剂盒(均来自TaKaRa Bio社)，按照操作指南对提纯后的PCR产物进行连接反应。以该连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α(TaKaRa Bio社)，涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mLIPTG、40μg/mLX-GAL)上，于37℃静置培养一夜，得到带有PCR产物的大肠杆菌克隆体。
将在琼脂板上呈白色的大肠杆菌菌落在3mL的LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
3.3.2.1.6：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对在质粒载体pUC118的限制性酶HincII识别部位中插入的DNA序列进行测定。其结果，插入部分完全包括RFCS基因的2种外显子的碱基序列。将该质粒命名为pUC/KRFCS。
3.3.2.2：外显子结合操作(内含子去除操作)
3.3.2.2.1：外显子结合用引物
作为N端侧外显子用PCR引物，准备出RFCS-Nde-F引物、RFCS-Ex1-R引物(表22，序列编号45和48)。并且，作为C端侧外显子用PCR引物，准备出RFCS-Ex2-F引物、RFCS-Sal-R引物(表22，序列编号47和46)。为了便于克隆，在5’端增加序列，在RFCS-Nde-F引物中增加了限制性酶NdeI序列，在RFCS-Sal-R引物中增加了限制性酶SalI序列。并且，以PCR反应将2种外显子断片融合在一起时所利用的互补序列被设计在RFCS-Ex1-R引物和RFCS-Ex2-F引物中。
表22 KOD-RFCS外显子结合用(内含子去除用)引物
| 引物名称 | 引物序列5’→3’ | 序列编号 |
| RFCS-Nde-F | cca tat gtc cga gga agt gaa gga ag | 45 |
| RFCS-Sal-R | gtc gac tca ctt acc cat aat cgt gaa ctg | 46 |
| RFCS-Ex2-F | cgt cgg gaa gac aac cgc tgc act ggc ttt ag | 47 |
| RFCS-Ex1-R | cag cgg ttg tct tcc cga cgc cgg gtg gc | 48 |
3.3.2.2.2：PCR反应液组成
用于扩增2种外显子的PCR反应以如下组成进行。(添加于50μL反应液体系中的添加量)
pUC/KRFCS DNA：50ng
引物：各10pmol
dNTP：各10nmol
EX Taq*：1.25U
10×EX Taq缓冲液：5μL
在上述体系中添加无菌水，调为50μL。
(*TaKaRa Bio社制造)
3.3.2.2.3：PCR反应条件
使用上述制备的反应液和PCR装置，以重复(95℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1min)的循环30次的程序来进行PCR反应。
3.3.2.2.4：PCR产物的提纯
使用2％琼脂糖凝胶对上述PCR反应产物进行电泳，进行溴化乙锭染色。在RFCS-Nde-F引物和RFCS-Ex1-R引物组的PCR产物中观察到约180个碱基的条带，在RFCS-Ex2-F引物和RFCS-Sal-R引物组的PCR产物中观察到约800个碱基的条带。在紫外线照射下切下含有各自的条带的凝胶，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(AmershamBiosciences公司)，按照其操作指南对凝胶中的PCR产物进行提纯。
3.3.2.2.5：PCR融合反应
在1个管内以一组引物组对2种外显子PCR产物进行PCR反应，由此融合2种断片，获得编码成熟型RFCS的基因断片。下面进行具体说明。
2种外显子PCR产物的退火反应以如下组成进行。
N端外显子断片：2μL(相当于50ng)
C端外显子断片：2μL(相当于50ng)
10×EX Taq缓冲液：5μL
在上述组成中添加无菌水，调成44.5μL。
将上述溶液在95℃、3min的条件下加热，然后用30分钟缓慢冷却至37℃。
在上述反应液中添加如下成分：
dNTP：5μL(各10nmol)
EX Taq*：0.5μL(2.5U)
使其在72℃、10min的条件下反应。
(*TaKaRa Bio社制造)
在上述溶液中添加RFCS-Nde-F引物和RFCS-Sal-R引物各10pmol，以重复(95℃·30sec→55℃、30sec→72℃、1min)的循环30次的程序来进行PCR反应。
3.3.2.2.6：PCR产物的限制性酶切断、提纯
按照常规方法对上述PCR反应产物进行乙醇沉淀提纯。提纯后的DNA断片以限制性酶NdeI和SalI进行双重切断。
PCR产物：相当于1μg
10×限制性酶缓冲液：5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶SalI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，于37℃进行2小时限制性酶切断。反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳，将预计为2种内含子的融合断片(成熟型RFCS的编码序列)的条带(约1kb前后)切下，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)进行提纯。
3.3.2.2.7：pET-21a表达载体的限制性酶切断
通过以下反应，以限制性酶NdeI和SalI对pET-21a载体DNA(Novagen公司)进行双重切断。
质粒DNA：2μg
10×限制性酶缓冲液： 5μL
限制性酶NdeI：5单位
限制性酶SalI：5单位
在上述体系中添加无菌水，调成50μL，于37℃静置2小时。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将相当于直线型的pET-21a载体DNA的条带(约5.4kb前后)切下，使用GFX PCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)，按照其操作指南，由凝胶中提纯pET-21aDNA断片。
3.3.2.2.8：连接反应和转化
利用DNA连接试剂盒V2(TaKaRa Bio社)对上述得到的预计为2种内含子的融合断片(成熟型RFCS编码序列)的约1kb的DNA断片(100ng)和pET-21a DNA断片(50ng)进行如下的反应。
1kbDNA断片：100ng
pET-21a DNA断片：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
在上述体系中添加无菌水，调为10μL，于16℃反应30分钟。
用该连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(100μg/mL氨苄青霉素)上，于37℃静置培养一夜。在形成于琼脂板上的大肠杆菌菌落中，取3个菌落在3mL的LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
3.3.2.2.9：通过测序确认序列
对于上述质粒DNA，使用DNA测序仪对插进质粒载体pET-21a中的DNA序列和插入部位附近的序列进行测定。其结果，在多克隆位点的NdeI和SalI部分中确认到了结合了2种外显子(去除了内含子)的成熟型RFCSm的序列(984个碱基)(命名为pKRFCSm)。
如图34所示，确认到在pKRFCSm中由pET-21a所具有的T7启动子开始依次排列着rbs(核糖体结合部位)、成熟型RFCS基因的开放阅读框、T7终止子。期待本质粒能够大量表达成熟型RFCS基因。
3.3.3：KOD-RFC表达菌株的制作
用pKRFCL和pKRFCSm同时转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，用氨苄青霉素和卡那霉素的双重选择来选择具有两种质粒的转化体，获得表达菌株。
3.3.4：KOD-RFC蛋白质提纯
如图35所示，离心回收菌体(S351)，进行菌体破碎(超声波破碎，S352)、5分钟煮沸(S353)和聚乙烯亚胺沉淀(S354)，进而进行硫铵沉淀(S355)，通过亲和层析(S356，使用HiTrap Heparin HP作为柱)、凝胶过滤层析(S357，使用Superdex 200)处理，制备标准品。通过SDS-PAGE确认到每个标准品都确保有90％以上的纯度。
3.3.4.1：菌体培养和表达诱导
将上述表达菌株在1.5升LB培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素)中于37℃振荡培养。在对数增殖期的OD600为0.3-0.5的时候添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以使最终浓度为0.1mM，由此来诱导基因的表达，诱导后的培养进行约3小时。离心分离(4℃，6,000×g，6分钟)培养后的菌体进行回收。
3.3.4.2：菌体破碎
将经离心分离沉淀得到的菌体悬浮于25mL的缓冲液B(如上所述)中。利用超声波处理对其进行菌体破碎。
3.3.4.3：加热处理
将菌体破碎液煮沸5分钟后，进行离心分离(18,500×g，4℃，25分钟)，回收上清液。
3.3.4.4：聚乙烯亚胺沉淀
向上清液中添加聚乙烯亚胺(SIGMA P-3143)以使最终浓度为0.18％(w/v)，在冰上搅拌30分钟。离心分离(18,500×g，25分钟，4℃)该溶液，回收上清液。
3.3.4.5：硫铵沉淀
向每10mL上清液中添加5.61g硫酸铵(最终浓度80％)，于冰上搅拌30分钟，使蛋白质沉淀。通过离心分离(18,500×g，25分钟，4℃)回收沉淀后，将该沉淀溶解于缓冲液C(如上所述)中，同样地对缓冲液C进行透析。
3.3.4.6：亲和层析
透析后的样品使用HiTrap Heparin HP柱(Amersham Biosciences公司)进行了提纯。
洗脱条件为0.1-0.8MNaCl/17.5mL的线性梯度，流速为1mL/min，得到了峰值馏分。
3.3.4.7：凝胶过滤层析
利用使用了Superdex 200(如上所述)的凝胶过滤层析对HiTrapHeparin亲和层析中的峰值馏分进行进一步提纯，作为分析用标准品。对所得到的标准品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认到了标准品分子的大小以及其被充分地提纯(图36)。
4：KOD-PCNA变异体的评价
调查了上述制备出的各种PCNA变异体对DNA扩增体系的效果，尤其是对PCR反应体系的效果。具体地说，在PCR反应体系中单独使用PCNA变异体、RFC或合用两者进行添加的情况下，以及不添加的情况下，进行PCR反应，对其反应产物进行电泳，比较目标区域的扩增状态，从而进行评价。作为用于PCR反应的聚合酶，使用了市售的2种PCR用DNA聚合酶KOD DNA聚合酶(东洋纺社)和Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa Bio社)。
4.1：对于KOD DNA聚合酶的KOD-PCNA添加效果
KOD DNA聚合酶是源自作为嗜热性古细菌的Thermococcuskodakaraensis KOD-1菌株的DNA聚合酶。KOD DNA聚合酶除了具有聚合酶活性外还具有较强的3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)，是所谓的α型DNA聚合酶。为了保持3’→5’核酸外切酶活性，其显示出高于通常使用的Taq DNA聚合酶的PCR忠实性。并且，有报告指出，以源自火球菌属为主的其他α型高精确性PCR用酶大多延长速度较慢，而本酶的延长速度非常快(非专利文献11)。
4.1.1：模板DNA和反应引物
作为模板DNA使用了λDNA(GenBank登录号02459)。作为PCR扩增的目标序列为λDNA的第23,119至第25,142的序列。此时所使用的PCR引物序列在表8中有记载，又另外在表23给出。
表23 PCR分析用引物
| 引物名称 | 引物序列5’→3’ | 序列编号 |
| F02 | GTC GTT TCT GCA AGC TTG GC | 25 |
| R03 | CCG AGA TAA AAA CAA ACC CGC | 28 |
4.1.2：反应液组成
反应液的组成如表24和25所示。
表24
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| F02引物(20pmol/μL) | 1.25μL | 0.5μM |
| R03引物(20pmol/μL) | 1.25μL | 0.5μM |
| 10×附带缓冲液#1 | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| 25mM MgCl2 | 2μL | 1mM |
| KOD DNA聚合酶(2.5U/μL) | 0.28μL | 0.014U/μL |
| 辅助蛋白质溶液(参见表25) | 1.1μL | - |
| 无菌水 | 33.87μL | - |
| 合计 | 50μL |
表25
| 辅助蛋白质溶液组成 | KOD-PCNA01(100ng/μL) | KOD-PCNA13(100ng/μL) | KOD-RFC(500ng/μL) | 缓冲液* | |
| 1 | KOD-PCNA、KOD-RFC均未添加 | 0μL | 0μL | 0μL | 1.1μL |
| 2 | KOD-PCNA01(0.6ng/μL) | 0.3μL | 0μL | 0μL | 0.8μL |
| 3 | KOD-PCNA01(0.6ng/μL)+KOD-RFC(4ng/μL) | 0.3 μL | 0μL | 0.4μL | 0.4μL |
| 4 | KOD-PCNA01(0.6ng/μL)+KOD-RFC(8ng/μL) | 0.3μL | 0μL | 0.8μL | 0μL |
| 5 | KOD-PCNA13(0.6ng/μL) | 0μL | 0.3μL | 0μL | 0.8μL |
| 6 | KOD-PCNA13(0.6ng/μL)+KOD-RFC(4ng/μL) | 0μL | 0.3μL | 0.4μL | 0.4μL |
| 7 | KOD-PCNA13(0.6ng/μL)+KOD-RFC(8ng/μL) | 0μL | 0.3μL | 0.8μL | 0μL |
*缓冲液：25mMTris-HCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
4.1.3：PCR程序
以如下的PCR程序对上述反应液进行反应。
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、15sec)30次循环→于4℃保持
4.1.4：电泳
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，将50μL反应液中的10μL用于1％琼脂糖凝胶电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。结果见图37。
4.1.5：结果
结果在图37中给出。在该实验条件下，确认到KOD DNA聚合酶自己就表现出良好的延长扩增(泳道1)。在添加了准野生型KOD-PCNA01的情况下观察到反应受到抑制(泳道2)，增加RFC的添加量时，抑制得以恢复，观察到与未添加的情况同等程度的延长扩增(泳道3、4)。另一方面，添加了KOD-PCNA13的情况下，观察到了与KOD-RFC的添加无关的良好的延长扩增，并且，该效果优于未添加辅助蛋白质的情况或是在KOD-PCNA01中添加KOD-RFC的情况。
4.2：KOD-PCNA对Pyrobest DNA聚合酶的添加效果
作为源自火球菌属的DNA合成酶，以市售的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa Bio社)为对象，利用PCR反应体系对各种PCNA变异体的添加效果进行了研究。Pyrobest DNA聚合酶是源自火球菌属的具有3’→5’核酸外切酶活性(校正活性)的耐热性α型DNA聚合酶。其特点是能够进行等同于源自激烈火球菌的Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶的高精确性的扩增。
4.2.1：模板DNA和反应引物
使用与上述KOD DNA聚合酶的评价同样的模板DNA和引物。
4.2.2：反应液组成
反应液的组成如表26和27所示。
表26
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| F02引物(20pmol/μL) | 0.5μL | 0.2μM |
| F03引物(20pmol/μL) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×附带缓冲液II | 5μL | 1× |
| dNTP Mix(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL) | 0.25μL | 0.025U/μL |
| 辅助蛋白质溶液(参见表27) | 1.3μL | - |
| 无菌水 | 37.2μL | - |
| 合计 | 50μL |
表27
| 辅助蛋白质溶液组成 | KOD-PCNA01(400ng/μL) | KOD-PCNA13(400ng/μL) | KOD-RFC(1400ng/μL) | 缓冲液* | |
| 1 | KOD-PCNA、KOD-RFC均未添加 | 0μL | 0μL | 0μL | 1.3μL |
| 2 | KOD-PCNA01(2.4ng/μL) | 0.3μL | 0μL | 0μL | 1.0μL |
| 3 | KOD-PCNA01(2.4ng/μL)+KOD-RFC(14ng/μL) | 0.3μL | 0μL | 0.5μL | 0.5μL |
| 4 | KOD-PCNA01(2.4ng/μL)+KOD-RFC(28ng/μL) | 0.3μL | 0μL | 1.0μL | 0μL |
| 5 | KOD-PCNA13(2.4ng/μL) | 0μL | 0.3μL | 0μL | 1.0μL |
*缓冲液：25mMTris-HCl pH8.0，50mMNaCl，50％甘油
4.2.3：PCR程序
以如下的PCR程序对上述反应液进行反应。
94℃、1min→(98℃、5sec→68℃、1.5min)30次循环→于4℃保持。
4.2.4：电泳
PCR反应结束后，在50μL的PCR反应溶液中添加5μL的10×上样缓冲液(50％甘油、0.4％溴酚兰、0.4％二甲苯青)，混合后，将50μL反应液中的10μL用于1％琼脂糖凝胶电泳。作为电泳标记使用λ/StyI标记物(东洋纺社)。结果见图38。
4.2.5：结果
结果在图38中给出。在该实验条件下，确认到Pyrobest DNA聚合酶自己就表现出延长扩增(泳道1)。在添加了准野生型KOD-PCNA01的情况下观察到反应受到抑制，而确认不到条带(泳道2)，增加RFC的添加量时，抑制得以恢复，观察到与未添加的情况同等程度的延长扩增(泳道3、4)。另一方面，添加了KOD-PCNA13的情况下，即使在不添加KOD-RFC时也观察到良好的延长扩增，该效果显示出优于其他4种条件的延长扩增(泳道5)。
4.3：总结
由上述实验可知，对于具有代表性的2种PCR酶，KOD-PCNA13能够促进PCR反应。并且，该反应不仅不需要RFC，其促进活性还优于同时添加野生型和RFC的情况。上述结果证明，不仅是源自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的PCNA，即使是源自Thermococcus kodakaraensisKOD1菌株的PCNA，通过同样的变异导入也能够获得优异的效果。实验结果显示，本发明对PCNA单体的界面区域的氨基酸残基的限定不仅限于对源自激烈火球菌的PCNA有效，也可以应用于具有同样的结构背景的PCNA。
5.Pfu-PCNA13添加反应时的忠实性测定
对于将Pfu-PCNA13添加于PCR反应中时对模板忠实性的影响，以市售的高忠实度型PCR酶即Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa Bio社制造，下文中有时仅称为“Pyrobest”)为对象进行了研究。Pyrobest为源自火球菌属古细菌的DNA聚合酶，具有3’→5’核酸外切酶活性，其起到校正活性的作用。
忠实性通过测定PCR产物的序列并将其与模板序列进行比对而求出。概况如图39所示。首先，在单独使用Pyrobest或在添加Pfu-PCNA13的条件下进行PCR反应(S511)，对扩增后的DNA断片的末端进行平滑化、磷酸化(S512)，将该断片克隆进质粒载体(S513)，导入至大肠杆菌中，并分离菌落、提取质粒(S514，S515)。用DNA测序仪对各质粒中的插入序列的一部分(500bp)进行测定(S516)，将结果与模板序列进行比对，调查发生错误的次数(S517)。
5.1：PCR反应
5.1.1：PCR酶和Pfu-PCNA13的组合
对于以Pyrobest单独地进行PCR反应的情况和向Pyrobest中添加Pfu-PCNA13进行PCR反应的情况进行了调查。为了与其进行对照，对于单独使用TaKaRa Taq(TaKaRa Bio社制造，下文中有时仅简称为“Taq”)进行的PCR反应也进行了调查。Taq是通常利用的PolI型PCR酶，不具有3’→5’核酸外切酶活性，与保持该活性的α型PCR酶相比，认为其忠实性低。
5.1.2：模板、目标区域
作为PCR反应的模板，使用λDNA(Genbank登录号02459)，以7种区域作调查对象。各区域在λDNA上的位置、大小、用于扩增各区域的引物的组合于表28给出，并且各引物序列于表29给出。
表28
| 断片ID | λDNA扩增区域 | 扩增大小(bp) | 正向引物 | 反向引物 |
| 1 | 17,973-19,022 | 1,050 | F23 | R25 |
| 2 | 19,001-20,050 | 1,050 | F25 | R27 |
| 3 | 23,619-24,654 | 1,036 | F09 | R11 |
| 4 | 24,634-25,696 | 1,063 | F11 | R15 |
| 5 | 26,894-27,492 | 599 | F14 | R04 |
| 6 | 40,460-41,185 | 1,026 | F16 | R17 |
| 7 | 42,532-43,613 | 1,082 | F19 | R21 |
表29
| 引物名称 | 起始位点 | 终止位点 | 引物序列5′＝＝＞3′ | 序列编号 |
| F09 | 23,619 | 23,637 | AGC CTT TGC CTC GCT ATA C | 49 |
| F11 | 24,634 | 24,654 | GCT GCT GAA ACG TTG CGG TTG | 26 |
| F14 | 26,894 | 26,914 | CCA TCT GCT CGT AGG AAT GCC | 50 |
| F16 | 40,460 | 40,479 | GCT ACC AGG GAA GAA CGG GA | 51 |
| F19 | 42,532 | 42,553 | CCA AGA TAG CAC TCG AAC GAC G | 52 |
| F23 | 17,973 | 17,994 | CGA ATC CCA TCT CGG CAA GGA G | 53 |
| F25 | 19,001 | 19,022 | GCA CTT GCG GTG ACA GTC ACT C | 54 |
| R04 | 27,492 | 27,472 | CCA GTG CAA AGC TTT GTG TGC | 55 |
| R11 | 24,654 | 24,634 | CAA CCG CAA CGT TTC AGC AGC | 56 |
| R15 | 25,696 | 25,677 | CCC AGT AGT ACT GCA AGA GG | 57 |
| R17 | 41,485 | 41,467 | CGT GGT GTA ATT CCC TCG C | 58 |
| R21 | 43,613 | 43,590 | GCT CAC CAG TTC GAT GAT TAA CGG | 59 |
| R25 | 19,022 | 19,001 | GAG TGA CTG TCA CCG CAA GTG C | 60 |
| R27 | 20,050 | 20,029 | GCA TCG CCG GCT GAT TTC TTC G | 61 |
5.1.3：PCR反应液组成
PCR反应液为一般的PCR反应液组成(表30)。使用Pyrobest作PCR酶时，使用作为附带缓冲液的10×Pyrobest缓冲液II(组成未公开)，使用TaKaRa Taq作PCR酶时，使用作为附带缓冲液的10×PCR缓冲液(100mMTris·Cl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2)。添加Pfu-PCNA13时的最终浓度为0.6ng/μL(0.3μL)，未添加的情况下添加等体积(0.3μL)的无菌水。
表30
| 组成 | 添加量 | 最终浓度 |
| λDNA(20ng/μL) | 1.25μL | 0.5ng/μL |
| 正向引物(20pmol/μL) | 0.5μL | 0.2μM |
| 反向引物(20pmol/μL) | 0.5μL | 0.2μM |
| 10×缓冲液1) | 5μL | 1× |
| dNTP混合物(各2.5mM) | 4μL | 0.2mM |
| 酶(5U/μL) | 0.25μL | 0.025U/μL |
| PCNA13溶液或无菌水2) | 0.3μL | 0或0.6ng/μL |
| 无菌水 | 38.2μL | |
| 合计 | 50μL |
1)10×缓冲液：10×Pyrobest缓冲液II(使用Pyrobest DNA聚合酶时)、或10×PCR缓冲液(使用TaKaRa Taq时)
2)PCNA13的原液浓度：100ng/μL
5.1.4：PCR程序
单独使用Pyrobest的情况
(98℃、10sec→68℃、2.5min)30次循环→于4℃保持
使用Pyrobest+Pfu-PCNA13的情况
(98℃、10sec→68℃、1.5min)30次循环→于4℃保持
单独使用Taq的情况
(94℃、30sec→55℃、30sec→72℃、1.5min)30次循环→于4℃保持
5.2：PCR产物的末端平滑化反应、提纯
对由上述PCR反应得到的各PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，进行溴化乙锭染色后，切下含有目标大小的DNA断片的凝胶，使用GFXPCR DNA和凝胶条带提纯试剂盒(Amersham Biosciences公司)按照其操作指南进行凝胶中的DNA断片的提纯。提纯后的DNA断片利用TaKaRaBKL试剂盒(末端平滑磷酸化连接试剂盒)(TaKaRa Bio社制造)按照该试剂盒的操作指南进行末端平滑化-磷酸化反应。
5.3：PCR产物向克隆载体中的插入
对末端平滑化-磷酸化处理后的DNA断片(50ng)和经限制性酶HincII切断及BAP处理后的DNA(pUC118 Hinc II/BAP·TaKaRa Bio社制造)(50ng)进行如下的连接反应。
末端平滑化-磷酸化处理后的DNA断片：50ng
pUC118 Hinc II/BAP：50ng
DNA连接试剂盒V2酶液：5μL
在上述溶液中添加无菌水，调成10μL，于16℃进行60分钟反应。
5.4：大肠杆菌菌落分离、质粒提取
以上述连接产物(3μL)转化100μL大肠杆菌E.coli JM109(TaKaRa Bio社)，将大肠杆菌液涂布在LB琼脂板(含有100μg/mL氨苄青霉素、40μg/mLIPTG、40μg/mL X-GAL)上，于37℃静置培养一夜。将在琼脂板上呈现白色的大肠杆菌菌落在1.5mL的TB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中于37℃整夜振荡培养，按照常规方法制备质粒DNA。
5.5：插入序列的序列
以提取出的质粒为模板，使用DNA测序仪来解析DNA序列。
以所插入的DNA断片(PCR扩增断片)中的500bp的序列为解析对象。
5.6：与原始序列进行比较
结果在表31中给出。表中的用语分别如下所述。
“断片ID”：PCR反应目标区域的识别编号。
“酶，AP”：PCR反应时的酶与Pfu-PCNA13的组合。
“λDNA位置”：表示7种PCR扩增断片中成为解析对象的碱基序列的位置。
“样品”：表示成为序列解析对象的质粒数(即，PCR扩增断片数)。
“碱基”：成为序列解析对象的碱基数。
“ND”：由于测序数据的噪音等导致无法解析的碱基数。
“全部”：“ND”以外的可解析的总碱基数。
“错误”：总碱基数中确认到复制错误的碱基数。
“错误率”：确认到复制错误的碱基数“错误”相对于能够解析的总碱基数“全部”的比例。
表31
| 断片ID | 酶，AP | Pyrobest DNA聚合酶 | Pyrobest DNA聚合酶+Pfu-PCNA13 | TaKaRa Taq | |||||||||
| λDNA位置 | 样品 | 碱基 | 样品 | 碱基 | 样品 | 碱基 | |||||||
| ND | 错误 | 全部 | ND | 错误 | 全部 | ND | 错误 | 全部 | |||||
| 1 | 18,503-19,002 | 93 | 23 | 1 | 46,477 | 89 | 15 | 1 | 44,485 | 92 | 7 | 32 | 45,993 |
| 2 | 19,531-20,030 | 63 | 11 | 0 | 31,489 | 70 | 36 | 0 | 34,964 | 83 | 21 | 22 | 41,479 |
| 3 | 24,135-24,634 | 58 | 17 | 0 | 28,983 | 57 | 9 | 0 | 28,491 | 58 | 14 | 8 | 28,986 |
| 4 | 24,654-25,153 | 80 | 10 | 3 | 39,990 | 85 | 19 | 3 | 42,481 | 77 | 17 | 16 | 38,483 |
| 5 | 26,914-27,413 | 100 | 13 | 0 | 49,987 | 58 | 40 | 0 | 28,960 | 60 | 35 | 10 | 29,965 |
| 6 | 40,966-41,465 | 73 | 8 | 0 | 36,492 | 80 | 28 | 1 | 39,972 | 82 | 41 | 12 | 40,959 |
| 7 | 430,94-43,593 | 125 | 17 | 0 | 62,483 | 50 | 2 | 0 | 24,998 | 86 | 9 | 20 | 42,991 |
| 合计 | 592 | 99 | 4 | 295,901 | 489 | 149 | 5 | 244,351 | 538 | 144 | 120 | 268,856 | |
| 错误率(1/碱基) | 1/73,975 | 1/48,870 | 1/2,240 | ||||||||||
单独使用Pyrobest的情况下，解析592个样品后，得到了相对于合计295,901个碱基发生了复制错误的碱基为4个的结果(错误率为每74kb中1个碱基)。在Pyrobest中添加Pfu-PCNA13的情况下，解析489个样品后，得到了相对于合计244,351个碱基发生了复制错误的碱基为5个的结果(错误率为每49kb中1个碱基)。使用Taq的情况下，解析538个样品后，得到了相对于合计268,856个碱基发生了复制错误的碱基为120个的结果(错误率为每2.2kb中1个碱基)。
以上述3种试验组进行比较，结果观察到，与Taq相比，单独使用Pyrobest和Pyrobest+PCNA13这2种的错误率要低1位数，两组之间的复制忠实度存在明显差异。
另一方面，对于后者的2种反应(单独使用Pyrobest和Pyrobest+PCNA13)之间的比较，虽然错误率存在1.5倍的差异，但复制错误数为4(单独使用Pyrobest)和5(Pyrobest+PCNA13)，未检测出显著性差别。该数据尚未表明是否由于添加了PCNA13而导致忠实度明显不同这一点，但可以认为其所导致的差异较小，至少没有导致忠实度极度恶化。如图14至图16的实施例所示，可以确定的是，PCNA13能够飞跃性地提高作为高忠实度型PCR酶的Pyrobest的延长能，在忠实度方面上，其保持在远远优于作为PolI型PCR酶的Taq的良好水平，从而证明了本发明的PCNA的优异性。
工业实用性
本发明在生物技术相关产业上是有用的，尤其在涉及DNA合成的相关技术中是有用的。
序列表的自由内容
序列编号1：Pfu-PCNA
序列编号2：Pfu-PCNA
序列编号3：引物：Pfu-PCNA-F
序列编号4：引物：Pfu-PCNA-R
序列编号5：引物：Pfu_M73L-F
序列编号6：引物：Pfu_M73L-R
序列编号7：引物：Pfu_D143A-F
序列编号8：引物：Pfu_D143A-R
序列编号9：引物：Pfu_R82C-F
序列编号10：引物：Pfu_R82C-R
序列编号11：引物：Pfu_D143R-F
序列编号12：引物：Pfu_D143R-R
序列编号13：Pfu-RFCL
序列编号14：Pfu-RFCL
序列编号15：引物：RFCL-F引物
序列编号16：引物：RFCL-R引物
序列编号17：Pfu-RFCS
序列编号18：Pfu-RFCS
序列编号19：引物：RFCS-F引物
序列编号20：引物：RFCS-R引物
序列编号21：引物：RFCSF1引物
序列编号22：引物：RFCSF2引物
序列编号23：引物：RFCSR2引物
序列编号24：引物：RFCSR1引物
序列编号25：引物：F02
序列编号26：引物：F11
序列编号27：引物：F24
序列编号28：引物：R03
序列编号29：引物：R14
序列编号30：引物：R16
序列编号31：KOD-PCNA
序列编号32：KOD-PCNA
序列编号33：引物：KOD-PCNA-F
序列编号34：引物：KOD-PCNA-R
序列编号35：引物：KOD_M73L-F
序列编号36：引物：KOD_M73L-R
序列编号37：引物：KOD_E143R-F
序列编号38：引物：KOD_E143R-R
序列编号39：KOD-RFCL
序列编号40：引物：KOD-RFCL-F
序列编号41：引物：KOD-RFCL-R
序列编号42：KOD-RFCS
序列编号43：引物：KOD-RFCS-F
序列编号44：引物：KOD-RFCS-R
序列编号45：引物：RFCS-Nde-F
序列编号46：引物：RFCS-Sal-R
序列编号47：引物：RFCS-Ex2-F
序列编号48：引物：RFCS-Ex1-R
序列编号49：引物F09
序列编号50：引物F14
序列编号51：引物F16
序列编号52：引物F19
序列编号53：引物F23
序列编号54：引物F25
序列编号55：引物R04
序列编号56：引物R11
序列编号57：引物R15
序列编号58：引物R17
序列编号59：引物R21
序列编号60：引物R25
序列编号61：引物R27
序列编号62：引物：Pfu_D143K-F
序列编号63：引物：Pfu_D143K-R
序列编号64：引物：Pfu_D143H-F
序列编号65：引物：Pfu_D143H-R
序列编号66：引物：Pfu_R109E-F
序列编号67：引物：Pfu_R109E-R
序列编号68：引物：Pfu_D147R-F
序列编号69：引物：Pfu_D147R-R
序列编号70：引物：Pfu_E139A-F
序列编号71：引物：Pfu_E139A-R
序列编号72：引物：Pfu_E139R-F
序列编号73：引物：Pfu_E139R-R
Claims (10)
1.一种变异型PCNA单体，其是PCNA的单体，
在单体的N末端区域与其他单体的C末端区域形成为界面而形成多聚体的情况中，构成所述多聚体的一个单体和另一个单体的所述界面区域中，形成单体相互的分子间相互作用的部位上的氨基酸残基由电荷上相互排斥的氨基酸残基构成，并且，
所述变异型PCNA单体在单体的状态下或是形成多聚体的状态下具有促进DNA复制的活性；
其中，所述PCNA单体为序列编号2或32所述的氨基酸序列的情况下，其是第143位或第147位的氨基酸残基被替换为其他氨基酸残基的氨基酸序列，并且，所述第143位的氨基酸残基被替换的情况下，所述第143位的氨基酸残基被替换为精氨酸或赖氨酸，所述第147位的氨基酸残基被替换的情况下，所述第147位的氨基酸残基被替换为精氨酸；
选自下述组(i)的至少1个以上的氨基酸残基和选自下述组(ii)的1个以上的氨基酸残基由电荷上相互排斥的氨基酸残基构成，
(i)第82位、第84位和第109位的氨基酸残基组、
(ii)第139位、第143位和第147位的氨基酸残基组。
2.如权利要求1所述的变异型PCNA单体，其中，其是在序列编号2或32所述的氨基酸序列中进一步将第73位的氨基酸残基替换为亮氨酸后的序列。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的PCNA单体所具有的氨基酸序列。
4.一种转化体，其导入了权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种变异型PCNA的制造方法，其特征在于，利用培养基对权利要求4所述的转化体进行培养，使该转化体和/或培养基中累积PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体。
6.一种DNA复制用试剂，其含有权利要求1或2所述的PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体。
7.一种DNA复制用试剂盒，其包括权利要求6所述的试剂。
8.如权利要求7所述的DNA复制用试剂盒，其包括PCR用的试剂。
9.一种DNA的复制方法，其特征在于，在权利要求1或2所述的PCNA单体和/或由所述单体构成的多聚体以及DNA聚合酶的存在下进行DNA合成反应。
10.如权利要求9所述的DNA的复制方法，其中，所述DNA的合成反应为PCR。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005195530 | 2005-07-04 | ||
| JP195530/2005 | 2005-07-04 | ||
| PCT/JP2006/313337 WO2007004654A1 (ja) | 2005-07-04 | 2006-07-04 | 変異型ｐｃｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101213295A CN101213295A (zh) | 2008-07-02 |
| CN101213295B true CN101213295B (zh) | 2011-12-14 |
Family
ID=37604515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006800244616A Active CN101213295B (zh) | 2005-07-04 | 2006-07-04 | 变异型pcna |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8003346B2 (zh) |
| EP (1) | EP1918370B1 (zh) |
| JP (1) | JP5308027B2 (zh) |
| KR (1) | KR20080031255A (zh) |
| CN (1) | CN101213295B (zh) |
| WO (1) | WO2007004654A1 (zh) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5258512B2 (ja) * | 2008-10-30 | 2013-08-07 | 株式会社日立製作所 | エキソヌクレアーゼ活性増強ｄｎａポリメラーゼ変異体 |
| CA3131328C (en) | 2012-10-16 | 2023-10-24 | Dna Polymerase Technology, Inc. | Inhibition-resistant polymerases |
| CN104059905B (zh) * | 2013-03-18 | 2020-04-21 | 胡振新 | 室温扩增dna的方法 |
| JP6428997B2 (ja) * | 2013-08-06 | 2018-11-28 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
| JP6326893B2 (ja) * | 2013-08-06 | 2018-05-23 | 東洋紡株式会社 | 変異型ｐｃｎａ |
| JP6332609B2 (ja) * | 2013-08-06 | 2018-05-30 | 東洋紡株式会社 | 変異型ｐｃｎａ |
| JP6489017B2 (ja) * | 2013-08-06 | 2019-03-27 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
| WO2015019952A1 (ja) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
| JP6638399B2 (ja) * | 2014-02-17 | 2020-01-29 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅の正確性を向上させる方法 |
| JP6968536B2 (ja) * | 2014-11-28 | 2021-11-17 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅試薬 |
| WO2016084880A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 東洋紡株式会社 | Ｐｃｎａ単量体 |
| JP6519173B2 (ja) * | 2014-12-25 | 2019-05-29 | 東洋紡株式会社 | Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来変異型ＰＣＮＡ |
| WO2016104272A1 (ja) * | 2014-12-25 | 2016-06-30 | 東洋紡株式会社 | Ｐｃｒ方法 |
| WO2016183294A1 (en) | 2015-05-12 | 2016-11-17 | Dna Polymerase Technology, Inc. | Mutant polymerases and uses thereof |
| KR102145921B1 (ko) | 2017-01-03 | 2020-08-28 | 엘지이노텍 주식회사 | 인덕터 및 이를 포함하는 emi 필터 |
| US12018294B2 (en) | 2018-07-13 | 2024-06-25 | Takara Bio Inc. | DNA polymerase mutant suited to nucleic acid amplification from RNA |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1324823A (zh) * | 2000-05-19 | 2001-12-05 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——增殖细胞核抗原(pcna)13和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CN1183253C (zh) * | 1997-06-26 | 2005-01-05 | 宝生物工程株式会社 | Dna聚合酶相关因子 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5338671A (en) | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| US5436149A (en) | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
| AU6385800A (en) | 1999-07-30 | 2001-02-19 | Stratagene | Archaeal replication accessory factors and methods of use |
| JP2002360261A (ja) * | 2001-06-11 | 2002-12-17 | Toyobo Co Ltd | Ｄｎａポリメラーゼ関連因子 |
| DE60231901D1 (de) * | 2001-11-14 | 2009-05-20 | Toyo Boseki | Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon |
-
2006
- 2006-07-04 CN CN2006800244616A patent/CN101213295B/zh active Active
- 2006-07-04 JP JP2007524080A patent/JP5308027B2/ja active Active
- 2006-07-04 EP EP06767854.0A patent/EP1918370B1/en active Active
- 2006-07-04 WO PCT/JP2006/313337 patent/WO2007004654A1/ja active Application Filing
- 2006-07-04 US US11/994,437 patent/US8003346B2/en active Active
- 2006-07-04 KR KR1020087000193A patent/KR20080031255A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1183253C (zh) * | 1997-06-26 | 2005-01-05 | 宝生物工程株式会社 | Dna聚合酶相关因子 |
| CN1324823A (zh) * | 2000-05-19 | 2001-12-05 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——增殖细胞核抗原(pcna)13和编码这种多肽的多核苷酸 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| JP特开2002-360261A 2002.12.17 |
| JP特表2003-506048A 2003.02.18 |
| M Kitabayashi et al.Gene cloning and polymerase chain reactionwithproliferatingcell nuclear antigen fromThermococcuskodakaraensisKOD1.Biosci.Biotechnol.Biochem66 10.2002,66(10),2194-2200. |
| M Kitabayashi et al.Gene cloning and polymerase chain reactionwithproliferatingcell nuclear antigen fromThermococcuskodakaraensisKOD1.Biosci.Biotechnol.Biochem66 10.2002,66(10),2194-2200. * |
| SHIGEKI MATSUMIYA ET AL.Crystal structure of an archaeal DNA slidingclamp:Proliferatingcell nuclear antigen from Pyrococcusfuriosus.Protein Science10 1.2001,10(1),17-22. |
| SHIGEKI MATSUMIYA ET AL.Crystal structure of an archaeal DNA slidingclamp:Proliferatingcell nuclear antigen from Pyrococcusfuriosus.Protein Science10 1.2001,10(1),17-22. * |
| SHIGEKI MATSUMIYA ET AL.Intermolecular ion pairs maintain the toroidalstructureofPyrococcus furiosus PCNA.Protein Science12 4.2003,12(4),823-830. |
| SHIGEKI MATSUMIYA ET AL.Intermolecular ion pairs maintain the toroidalstructureofPyrococcus furiosus PCNA.Protein Science12 4.2003,12(4),823-830. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090209003A1 (en) | 2009-08-20 |
| JP5308027B2 (ja) | 2013-10-09 |
| EP1918370B1 (en) | 2014-04-16 |
| KR20080031255A (ko) | 2008-04-08 |
| CN101213295A (zh) | 2008-07-02 |
| US8003346B2 (en) | 2011-08-23 |
| EP1918370A4 (en) | 2009-01-21 |
| JPWO2007004654A1 (ja) | 2009-01-29 |
| WO2007004654A1 (ja) | 2007-01-11 |
| EP1918370A1 (en) | 2008-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101213295B (zh) | 变异型pcna | |
| US5405774A (en) | DNA encoding a mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermus species sps17 | |
| EP0550687B1 (en) | 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable dna polymerases | |
| US5455170A (en) | Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05 | |
| DE69836779T2 (de) | Mutierte chimäre DNS-Polymerasen | |
| AU777229B2 (en) | Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases-for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro | |
| EP0550696B1 (en) | Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermosipho africanus | |
| CN1482240B (zh) | 具有削弱的3′-5′核酸外切酶活性的热稳定性的或热激活性的dna聚合酶分子 | |
| DE60112746T2 (de) | Kälteempfindliche dna-polymerasemutanten | |
| CN1259957B (zh) | 产生由多个亚单位组成的aslv逆转录酶的方法 | |
| CN1590543B (zh) | 热稳定的Taq聚合酶片断 | |
| CN101649307B (zh) | 改良多聚核苷酸合成的成分 | |
| JPH06343466A (ja) | 熱安定性核酸ポリメラーゼ | |
| EP0986651A1 (en) | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof | |
| WO1998035060A9 (en) | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof | |
| US20160122393A1 (en) | Polypeptides having nucleic acid binding activity | |
| WO2009155464A2 (en) | Mutated and chemically modified thermally stable dna polymerases | |
| US20020076768A1 (en) | Modified thermostable DNA polymerase | |
| US20110086387A1 (en) | Mutant nanoarchaeum equitans a523r dna polymerase and its use | |
| JP3487394B2 (ja) | 改変された耐熱性ｄｎａポリメラーゼおよびその用途 | |
| TW200418984A (en) | Thermostable ribonuclease H | |
| CN114574464B (zh) | 高保真dna聚合酶突变体及其应用 | |
| JP3463780B2 (ja) | 核酸増幅用ｄｎａポリメラーゼ組成物 | |
| Martinez et al. | Genetic characterization and chromosomal location of a single locus GT microsatellite from Atlantic salmon. | |
| JPH0870873A (ja) | 新規ｄｎａ断片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |