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GEGENSTAND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf thermostabile DNA-Polymerasen
und insbesondere auf neue Mutanten der Thermus aquaticus Polymerasen
(Taq DNA-Polymerase).
Die Erfindung richtet sich spezifisch an neuartige kälteempfindliche
Mutanten von Taq DNA-Polymerasen und andere thermostabile DNA-Polymerasen,
die eine Amplifizierung von Polynukleotiden durch eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
katalysieren können
und bei Temperaturen von Zimmertemperatur (25 °C) bis 42 °C im Vergleich mit den gleichen Polymerasen
ohne mindestens eine der Mutationen eine bedeutend verringerte Aktivität aufweisen
können, während bei
der normalen optimalen Temperatur des Enzyms von 65 bis 72 °C eine beinahe
normale Aktivität und
Funktionalität
des Enzyms beibehalten wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich
auch auf Sequenzen von Nuklein- und Aminosäuren, die solche Mutanten von
Taq DNA-Polymerasen codieren sowie Vektorplasmide und Wirtszellen,
die sich für
die Expression solcher DNA-Sequenzen eignen. Ebenfalls hier beschrieben wird
eine verbesserte Methode zur Unterstützung eines automatischen heißen Starts
(Hot Start) für
die Durchführung
einer Amplifikation anhand einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
sowie weiterer genetischer Analysen und Manipulationen unter Verwendung
der DNA-Polymerasen der Erfindung
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Bei
der PCR handelt es sich um eine schnelle und einfache Methode zur
spezifischen Amplifikation einer Ziel-DNA-Sequenz auf eine exponentielle
Art. Saiki, et al. Science 239:487–4391 (1988). Kurz gefasst verwendet
die derzeit verbreitete Methode ein Paar Primer mit Nukleotidsequenzen,
die die DNA ergänzen, die
an die Zielsequenz angrenzt. Die Primer werden mit einer Lösung gemischt,
die die Ziel-DNA enthält
(die Matrize), eine DNA-Polymerase
und dNTPS für
alle vier Deoxynukleotide (Adenosin (A), Tyronsin (T), Cytosin (C)
und Guanin(G)). Das Gemisch wird dann auf eine Temperatur erhitzt,
die ausreicht, um die beiden komplementären DNA-Stränge zu teilen. Das Gemisch
wird dann auf eine Temperatur abgekühlt, die ausreicht, damit sich
die Primer spezifisch zu Sequenzen annealen können, die an das Gen oder die
Sequenz von Interesse angrenzen. Die Temperatur des Reaktionsgemischs
wird dann auf das Optimum für
die thermophile DNA-Polymerase eingestellt, damit die DNA-Synthese
(Extension) stattfinden kann. Diese Temperaturfolge wird dann wiederholt,
um jeden Amplifikationszyklus zu konstituieren. Demnach besteht
eine PCR aus mehreren Zyklen von Schmelzen, Annealen und der Extension
von DNA. Zwanzig Replikationszyklen können eine bis zu einer millionenfachen
Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenz
hervorrufen. Bei einigen Anwendungen wirkt eine einzige Primersequenz
an beiden Enden des Ziels als Primer, wobei der Primer nur effizient
ist, wenn seine Länge nicht
zu lang ist. Bei einigen Anwendungen werden mehrere Primerpaare
zusammen in einem Verfahren eingesetzt, was allgemein als Multiplex-PCR
bekannt ist.
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Die
Fähigkeit,
ein DNA-Molekül
anhand einer PCR zu amplifizieren, findet Anwendung auf unterschiedlichen
Gebieten der Technik, z.B. Mikrobiologie der Umwelt und Nahrungsmittel
(Wernars et al., Appl. Env. Microbiol., 57:1914–1919 (1991); Hill and Keasler,
Int. J. Food Microbiol., 12:67–75
(1991)), klinische Mikrobiologie (Wages et al. J. Med. Virol., 33:58–63 (1991);
Sacramento et al., Mol. Cell Probes, 5:229–240 (1991)), Onkologie (Kumar
and Barbacid, Oncogene, 3:647–651
(1988); McCormick, Cancer Cells, 1:56–61 (1989)), genetische Krankheitsprognose
(Handyside et al., Nature, 344:768–770 (1990)) sowie Blutbanken und
Gerichtsmedizin (Jackson, Transfusion, 30:51–57 (1990)).
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Die
DNA-Polymerase, die aus dem Bakterium der Thermalquellen, Thermus
aquaticus (Taq DNA-Polymerase), gewonnen wird, hat sich bei der
DNA-Amplifikation, DNA-Sequenzierung und bei verwandten Extensionstechniken
der DNA-Primer als hilfreich erwiesen. Die von Lawyer et al., J.
Biol. Chem., 264:6427 (1989), beschriebenen DNA- und Aminosäuresequenzen,
GenBank. J04639, definieren das Gen, das die Thermus aquaticus DNA-Polymerase
und die Enzym Thermus aquaticus DNA-Polymerase codiert, so wie diese
Begriffe hier verwendet werden. Die sehr ähnliche DNA-Polymerase (Tf1
DNA-Polymerase), wie sie vom verwandten Bakterium Thermus flavus
exprimiert wird, wird von den DNA- und Aminosäuresequenzen bestimmt, die
von Akhmetzjanov, A. A. und Vakhitov, V. A., in Nucleic Acids Research
20: 5839 (1992), GenBank. X66105 beschrieben werden. Diese Enzyme
sind für
eine Familie von thermostabilen DNA-Polymerasen einschließlich der
Thermus thermophilus DNA-Polymerase. Diese Enzyme weisen keine a
3'-Exonuclease-Aktivität auf, wie
sie für
Bearbeitungszwecke in mesophilen DNA-Polymerasen wie E. coli DNA-Polymerase
I und Phagen T7, T3, und T4 DNA-Polymerasen effektiv ist. Thermostabile
DNA-Polymerasen mit editierbaren Funktionen sind im Allgemeinen
in thermophilen Archaebakterien wie Pyrococcus furiosus anzutreffen.
Verwandte DNA-Polymerasen dieser Klasse sind allgemein bekannt als
Pfu, Pwo, Pfx, Vent oder Deep Vent.
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Die
Verfügbarkeit
von thermostabilen DNA-Polymerasen, wie Taq DNA-Polymerasen, hat sowohl vereinfachte
wie auch verbesserte PCR. Taq DNA-Polymerase ist bis zu 95 °C stabil
und dank ihrer Verwendung in PCR ist es nicht mehr nötig, nach
jedem thermalen Zyklus wiederholt temperaturempfindliche Polymerasen hinzuzufügen. Die
Taq DNA-Polymerase kann DNA auch bei höheren Temperaturen erweitern,
was unspezifische Härtungen
von Primern zu verhindern scheint und somit die Spezifität und Sensitivität der PCR
verbessert hat.
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Auch
wenn die PCR-Technik bedeutende Fortschritte aufweist, stellt die
Amplifikation von Nicht-Ziel-Oligonukleotiden aufgrund von Nebenreaktionen,
wie Mispriming auf Nicht-Ziel-Hintergrund-DNA, RNA und/oder den
Primern selbst, bedeutende Probleme dar. Das gilt speziell für diagnostische
Anwendungen, bei denen eine PCR in einem Milieu mit komplexer Hintergrund-DNA
durchgeführt
wird, während
die Ziel-DNA möglicherweise
als Einzelexemplar vorliegt (Chou et al., Nucleic Acid Res., 20:1717–1723 (1992)).
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Die
Temperatur, bei der die Taq DNA-Polymerase die höchste Aktivität aufweist,
liegt zwischen 62 °C und
72 °C; sie
weist jedoch auch bei Zimmertemperatur, etwa 25 °C bis 37 °C, eine bedeutende Aktivität auf. Bei
einem normalen oder „kalten
Start" können die
Primer DNA-Extensionen an nicht-spezifischen Sequenzen ausführen, da
nur die Bildung von wenigen Basenpaaren am 3'-Ende eines Primers zu einem stabilen
Primerkomplex führen
kann. Daraus können
sich kompetitive oder hindernde Produkte auf Kosten des gewünschten Produkts
ergeben. Als Beispiel eines hindernden Produkts werden Strukturen
mit nur Primern gebildet, manchmal „Primer Dimer" genannt, die durch
die Aktion der DNA-Polymerase auf Primer, die mit sich selbst gepaart sind,
entstehen, ungeachtet der wahren Zielmatrize. Die Wahrscheinlichkeit
für unterwünschte Wechselwirkungen
zwischen Primern steigt mit zunehmender Anzahl an Primerpaaren sowie
mit einer Multiplex-PCR an. Während
PCR- Zyklen können diese
nicht-spezifischen Extensionsprodukte mit der gewünschten
Ziel-DNA konkurrieren.
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Weiter
wurde bestimmt, dass Nebenreaktionen oft auftreten, wenn alle Reaktanten
bei Umgebungstemperatur vor Beginn des thermalen Zyklus gemischt
werden. Eine Methode zur Verminderung dieser Nebenreaktionen wird „PCR mit
heißem
Start" genannt.
Viele PCR-Analysen,
besonders die aufwändigsten,
profitieren von einem heißen
Start. Etwa 50% aller PCR-Reaktionen weisen ein verbessertes Ergebnis
und/oder eine verbesserte Spezifität auf, wenn ein heißer Start
eingesetzt wird, und in einigen Fällen ist ein heißer Start
absolut notwendig. Zu diesen anspruchsvollen PCR-Analysen gehören jene
mit wenigen Kopien der Ziele (wie 1 HIV-Genom pro 10.000 Zellen),
denaturierte DNA (zu vielen DNA Extraktionsverfahren gehört ein Siedeverfahren,
so dass die Matrize während
der Vorbereitung auf die Reaktion einstrangig ist) oder kontaminierte DNA,
z.B. DNA aus dem Boden oder Kot und/oder DNA mit einem hohen Gehalt
an RNA. Die aktuellen Methoden für
einen heißen
Start sind aber mühsam,
teuer und/oder weisen Fehler auf.
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Eine
PCR mit heißem
Start lässt
sich durch unterschiedliche physikalische, chemische oder biochemische
Methoden erreichen. In einem physikalischen heißen Start dürfen die DNA-Polymerase oder
eine oder mehrere Reaktionskomponenten, die für die DNA-Polymeraseaktivität wichtig sind, mit der DNA
der Probe erst in Kontakt kommen, wenn alle für die Reaktion erforderlichen
Komponenten eine hohe Temperatur erreicht haben. Die Temperatur
muss hoch genug sein, so dass nicht einmal eine teilweise Hybridisierung
der Primer an einer anderen als der gewünschten Stelle in der Matrize
auftreten kann, trotz des gesamten Genoms der Zelle, das für nicht-spezifische
teilweise Hybridisierungen von Primern verfügbar ist. Die Temperatur muss
also hoch genug sein, so dass keine Basenpaarung von Primern an
Stellen der Matrize mit nicht oder beinahe perfekter Homologie auftreten
(oder die Matrize verunreinigen) kann. Die Temperatur für einen
sicheren Start befindet sich normalerweise im Bereich zwischen 50 °C und 75 °C und beträgt typischerweise
etwa 10 °C
mehr als die in der PCR verwendete Temperatur zum Annealen.
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Eine
physikalische Möglichkeit,
um einen heißen
Start zu erreichen, ist die Verwendung einer Wachsbarriere, wie
die Methode, die in US-Patent Nr. 5.599.660 beschrieben wird. Siehe
auch Hebert et al., Mol. Cell Probes, 7:249–252 (1993); Horton et al.,
Biotechniques, 16:42–43
(1994). Unter Verwendung solcher Methoden wird die PCR-Reaktion in zwei
Lagen vorbereitet, die von einer 1 mm dicken Schicht aus Paraffinwachs getrennt
werden, die bei etwa 56 °C
schmilzt. Es gibt mehrere Methoden, die dazu verwendet werden können, um
die Reaktionskomponenten in zwei Lösungen aufzuteilen. Beispielsweise
wird alle DNA mit 1X-Puffer, aber kein dNTP und kein DNA-Polymerase-Enzym,
in ein Volumen von 25 ml gegeben. Es wird ein Tropfen geschmolzenes
Wachs hinzugegeben und die Röhrchen
werden alle für
eine Minute auf 60 °C
erhitzt, damit das geschmolzene Wachs eine abdichtende Schicht bilden
kann, wonach die Röhrchen
abgekühlt
werden, damit das Wachs erstarren kann. Anschließend wird jeder Reaktion 25
ml eines Gemischs aus 1X-Puffer,
allen dNTP und dem Enzym zugefügt.
Zum Schluss wird 1 Tropfen Öl
hinzugegeben, um insgesamt 4 Ebenen zu schaffen. Wenn das Protokoll
des thermalen Zyklers die Röhrchen
auf den ersten Schmelzschritt erhitzt (etwa 95 °C), schmilzt das Wachs und schwebt,
um sich mit der Ölschicht
zu vermischen, und die beiden wässrigen
Schichten mischen sich durch Konvektion, während die Temperatur wechselt.
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Eine
geläufige
Variation, bei der Wachsbarrieren eingesetzt werden, ist, dass die
Reaktionskomponenten ohne Magnesiumionen zusammengesetzt werden,
so dass das DNA-Polymerase-Enzym
inaktiv ist. Das Magnesiumion wird dann (oder usprünglich)
in einer Wachsperle hinzugefügt.
Ein Problem dieser Wachsmethoden besteht jedoch darin, dass sich
das Wachs nach jedem PCR-Zyklus erhärtet. Dadurch wird die Wiederherstellung
der Probe erschwert, da das Wachs dazu neigt, die Pipetten zu verstopfen,
mit denen die Probe entnommen wird. Selbst wenn die Proben erneut
erhitzt werden, um das Wachs zu schmelzen, besteht dieses Problem.
Ein anderes Problem ist die Kreuzkontaminierung, wenn die Wachsperlen
mit einer Pinzette hinzugegeben werden. Durch einen leichten Kontakt
zwischen der Pinzette und den Röhrchendeckeln
kann die DNA-Matrize bewegt werden, bevor die PCR-Reaktion gestartet
wird.
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Eine
weitere Methode, um eine PCR mit heißem Start einzuleiten, ist
die Verwendung einer DNA-Polymerase, die chemisch, aber reversibel
inaktiviert wurde, wie beispielsweise die AMPLITAQ GOLDTM DNA-Polymerase.
Dieses Enzympräparat,
vertrieben von PE Applied Biosystems, wird den Benutzern in inaktiver
Form geliefert, lässt
sich aber durch Erhitzen reaktivieren. Die erforderlichen Bedingungen
zur Reaktivierung sind für die
DNA der Matrize jedoch sehr hart: Zehn Minuten bei 95 °C und einem
nominalen pH-Wert von 8,3 oder weniger führt zu einer Reaktivierung
von etwa 30% des Enzyms, was ausreicht, um den Start der PCR auszulösen. Siehe
Moretti, et al., BioTechniques 25:716–722 (1998). Da diese Behandlung
die DNA bei etwa jeder tausendsten Base depuriniert, kann dieses
Enzym nicht dazu verwendet werden, um die DNA um mehr als einige
Kilobasen Länge
zu amplifizieren.
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Entsprechend
ist das Enzym am effizientesten, wenn es sich auf die Amplifikation
einer Ziel-DNA mit einer
Länge von
etwa 200 Basenpaaren beschränkt.
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Eine
weitere Methode, um einen heißen
Start hervorzurufen, besteht darin, das Taq DNA-Polymerase-Enzym
mit einem Taq Antikörper
zu kombinieren, bevor es dem Reagenz hinzugefügt wird. Diese Methode verwendet
einen monoklonalen, inaktivierenden Antikörper, der gegen Taq DNA-Polymerase
gezüchtet
wurde. Siehe Scalice et al., J. Immun. Methods, 172: 147–163 (1994);
Sharkey et al., Bio/Technology, 12:506–509 (1994); Kellogg et al.,
Biotechniques, 16: 1134–1137
(1994). Der Antikörper
verhindert zwar die Polymeraseaktivität bei Umgebungstemperatur,
wird aber durch Hitzedenaturierung inaktiviert, wenn die Reaktion
einmal thermozykliert ist, so dass die Polymeraseaktivität aktiviert
wird. Leider sind die für
diese Methode gegenwärtig erhältlichen
Antikörper
nicht sehr effizient und es muss ein 5- bis 10-facher Molüberschuss
verwendet werden, um die Vorteile einer PCR mit heißem Start
erzielen zu können.
Für Klentaq-278,
eine Thermus aquaticus DNA-Polymerase mit gelöschtem Amino-Terminal, die
mit Codon 279 beginnt und bei höheren
Proteingehalten für
lange PCRs (bis zu zehnmal mehr Proteine als Taq DNA-Polymerase) eingesetzt
werden muss, wird der Gehalt an Antikörpern für einen heißen Start sehr hoch und das
denaturierte Antikörperprotein
behält
etwas Inhibition für
längere
PCR-Ziele bei. Der
ursprüngliche
Entwickler der anti-Taq Antikörper
(Kodak, jetzt Johnson & Johnson)
benutzt ein Gemisch aus dreifach monoklonalen Antikörpern, das
effizienter, aber kommerziell nicht erhältlich ist und in langen PCR
nicht getestet wurde.
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Diese
Methoden für
den heißen
Start erfordern eine oft teure Komponente (z.B. anti-Taq Antikörper) im
Reaktionsgemisch und können
unerwünschte
Einschränkungen
auf die Leistung der PCR haben, wie eine relativ kurze Zeitperiode
zwischen der Vorbereitung und der Verwendung eines Reagenz oder
eine geringere Effizienz bei der Amplifikation. Deshalb werden für PCR physikalische
Hot Starts bevorzugt, falls diese durchführbar sind.
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Eine
technisch weniger anspruchsvolle und kostengünstige Möglichkeit besteht darin, den
Reaktionen das Enzym, das Magnesium und/oder die dNTP erst dann
hinzuzufügen,
nachdem die Reaktionen erhitzt wurden. Diese Methode ist jedoch
nicht nur mühsam
und anfällig
für Fehler,
sondern führt
im Allgemeinen auch zu einer Kontaminierung und Kreuzkontaminierung
der PCR-Proben, da die Reagenzröhrchen
im Thermalcycler geöffnet
werden müssen,
wenn sie heiß sind.
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Einige
Anwender glauben, dass sie einen heißen Start durchführen, wenn
sie PCR-Reaktionen
in Röhrchen
auf Eis vorbereiten und die Röhrchen
dann auf einen Thermalcyclerblock geben, der auf 95 °C vorgewärmt wurde.
Auch wenn diese Methode einige Vorteile mit sich bringt, können im
Verlauf der fünfzehn
oder mehr Sekunden, in denen das Röhrchen von 0 °C auf 25 °C erwärmt wird,
einem Primer in jeder Sekunde nur einige wenige Nukleotide zugegeben
werden. Das reicht aus, um eine unerwünschte kompetitive PCR für Reaktionen
auszulösen,
die einen heißen
Start erfordern. Falls das Experiment viele Röhrchen erfordert, werden die
Röhrchen,
die zuerst in den Block gestellt werden, länger auf 95 °C erhitzt
als die Röhrchen,
die später
in den Block gestellt werden, wodurch sich die Proben untereinander
nicht reproduzieren lassen.
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Von
thermophilen DNA-Polymerasen wird allgemein geglaubt, dass sie während ihrer
Evolution ihre mesothermische Aktivität minimierten, um die Aktivität um 70 °C herum zu
optimieren. Laut dieser Vermutung sollte es nicht möglich sein,
deren Aktivitäten
bei Raumtemperatur weiter zu verringern, ohne dabei entweder deren
Aktivitäten
bei hohen Temperaturen oder deren Widerstand gegenüber 95 °C wesentlich
zu beeinträchtigen.
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Anwender
vermuteten jedoch, dass die Möglichkeit
besteht, dass thermostabile DNA-Polymerasen
zu einem „kälteempfindlichen" Phänotyp mutiert
werden könnten,
um die Polymeraseaktivität
bei Raumtemperatur zu verringern, ohne dabei die Aktivität bei der
normalen Extensionstemperatur für
PCR oder die für
den Schmelzschritt jedes PCR-Zyklus erforderliche Thermostabilität zu verletzen.
Solche Mutanten können
die PCR-Amplifikation katalysieren und bei Raumtemperatur eine bedeutend
geringere Aktivität
aufweisen, während
sie bei optimalen Reaktionstemperaturen dennoch beinahe normale
Aktivitäten
aufweisen, verglichen mit DNA-Polymerasen ohne solche Mutanten.
Solche DNA-Polymerasen wären
für die
Möglichkeit
eines Hot Starts hilfreich und könnten
ohne zusätzliche
Schritte oder Protokollabänderungen
vorbereitet, vertrieben und angewendet werden. Durch die Einführung einer
kälteempfindlichen
DNA-Polymerase könnten
Endanwender die Vorteile eines Hot Starts für alle ihre PCR-Analysen genießen, nicht
nur für
Analysen, die bei einem Start bei normaler Raumtemperatur als problematisch
betrachtet werden. Zudem könnten „lange
und genaue" PCR (d.h.
Verwendung längerer
Ziellängen
mit besserer Genauigkeit) die Vorteile eines heißen Starts genießen, ohne
die mühsame
zusätzliche
Sorgfalt oder die zusätzlichen
Schritte, und die menschliche STR-Bestimmung und die Multiplex-PCR
würden
an Verlässlichkeit
und Effizienz gewinnen. Eine solche lange und zuverlässige PCR
wird in Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2216–2220 (1994)
und im US-Patent Nr. 5.436.149 beschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Unter
den vielen Aspekten der Erfindung sticht die Bereitstellung von
kälteempfindlichen
mutanten DNA-Polymerasen heraus, die bei etwa 25 °C bis 37 °C eine bedeutend
verringerte Aktivität
und bei 62 bis 72 °C
eine ähnliche
Polymeraseaktivität
aufweisen, verglichen mit DNA-Polymerasen ohne Mutationen; die Bereitstellung
solcher Mutanten ist wichtig für
PCR-Amplifikationstechniken aus DNA-Matrizen und aus einzelnen Kolonien
von E. coli, einstrangiger (linearer) Amplifikation von DNA, Sequenzierung
von Zyklen, Sequenzierung von Nukleinsäuren bei erhöhten Temperaturen,
DNA-Restriktionsdigestion,
DNA-Kennzeichnung, in vivo Footprinting und auf Primer gerichtete
Mutagenese. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung
rekombinanter Amino- und
Nukleinsäuresequenzen,
Vektoren und Wirtszellen, die zur Exprimierung solcher mutanter
DNA-Polymerasen beitragen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist
die Bereitstellung einer verbesserten Methode für die Durchführung einer
Polymeraseketten-Amplifikation,
die von den neuen DNA-Polymerasen katalysiert wird. Es ist ein weiterer
Aspekt der vorliegenden Erfindung, für PCR-Amplifikationen ab DNA-Matrizen
und ab einzelner Kolonien von E. coli, unter Verwendung von kälteempfindlichen
DNA-Polymerasen
Methoden für
die einstrangige (lineare) Amplifikation von DNA, Sequenzierung
von Zyklen, Sequenzierung von Nukleinsäuren bei erhöhten Temperaturen,
DNA-Restriktionsdigestion,
DNA-Kennzeichnung, in vivo Footprinting und auf Primer gerichtete
Mutagenese bereitzustellen.
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Weitere
Aspekte und Funktionen sind teilweise offensichtlich und weiter
unten wird teilweise darauf hingewiesen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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Diese
und weitere Funktionen, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden besser verständlich
unter Betrachtung der folgenden Beschreibungen, Ansprüche und
Zeichnungen, bei denen:
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1 ein
Diagramm des Plasmids pWB329 ist, das die Wildtypsequenz von Klentaq-235
als zweites Gen eines 2-Gen Operons trägt; das erste Gen codiert für NPTII,
das eine Kanamycin-Resistenz aufweist. pWB329 war die Matrize für die mutagene
PCR.
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2 ein
Diagramm des Vektorplasmids pWB302 ist, das nur den Teil des N-Terminals von NPTII und überhaupt
keine Polymerasesequenzen trägt.
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3 ein
Diagramm der Bibliotheksplasmide pWB302mk ist, die als Ergebnis
des Klonens der PCR-mutagenierten Produkte als Bibliothek in das
passende aufgespaltete Vektorplasmid pWB302 hervorgehen.
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4 ein
Foto eines Agarosegels ist, das die Amplifikationsprodukte veranschaulicht,
die aus einer PCR-Amplifikationsreaktion mit normalen und zwei kälteempfindlichen
mutanten DNA-Polymerasen (Cs 1 und Cs 2) der vorliegenden Erfindung
erzielt wurden. Es ist zu beachten, dass für diese PCR-Reaktion das normale Polymerase
Klentaq-278 unter Bedingungen eines kalten oder heißen Starts
nicht gut funktioniert, ein manueller heißer Start es jedoch zum Funktionieren
bringt. Die Bedingungen zur Durchführung der PCR-Reaktion werden
hier angegeben.
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5 ein
Foto eines Agarosegels ist, das die Amplifikationsprodukte veranschaulicht,
die aus einer PCR-Amplifikationsreaktion mit einer normalen (Spuren
3 und 5) und einer kälteempfindlichen
mutanten DNA-Polymerase (Cs 3) (Spuren 2 und 4) der vorliegenden
Erfindung erzielt wurden. Spur 1 enthält eine Standardleiter für das Molekulargewicht.
Die PCR-Reaktionen in den Spuren 2 und 3 wurden anhand manueller Methoden
eines heißen
Starts durchgeführt
und die PCR-Reaktionen in den Spuren 4 und 5 wurden bei Raumtemperatur
(25 °C)
durchgeführt
und zeigen den funktionellen Vorteil der mutanten DNA-Polymerasen
der vorliegenden Erfindung auf. Die Bedingungen zur Durchführung der
PCR-Reaktion werden hier angegeben.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Abkürzungen und Definitionen
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Die
aufgelisteten Abkürzungen
und Begriffe, wie sie hier verwendet werden, sind folgendermaßen definiert:
bp
ist die Abkürzung
für Basenpaare.
Cs
ist die Abkürzung
für kälteempfindlich.
Der Begriff „kälteempfindliches" Enzym wird hier
für ein
Enzym verwendet, das einen Phänotyp
darstellt, bei dem das Enzym unterhalb seiner optimalen Temperatur
eine verringerte Aktivität
aufweist und bei der normalen optimalen Temperatur eine normale
oder beinahe normale Aktivität
aufweist, im Vergleich zur Aktivität seines Wildtypenzyms bei
identischen Temperaturen.
kb ist die Abkürzung für Kilobase (1000 Basenpaare).
nt
ist die Abkürzung
für Nukleotide.
ORF
ist die Abkürzung
für offenes
Leseraster („open
reading frame").
Taq
ist die Abkürzung
für Thermus
aquaticus.
Tf1 ist die Abkürzung
für Thermus
flavus.
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Die
Rückstände der
Aminosäuren
werden hier entsprechend ihrer einzelnen Buchstaben abgekürzt: A steht
für Alanin;
R steht für
Arginin; N steht für
Asparagin; D steht für
Asparaginsäure;
C steht für
Cystein; Q steht für
Glutamin; E steht für
Glutaminsäure;
G steht für
Glycin; H steht für
Histidin; I steht für
Isoleucin; L steht für
Leucin; K steht für
Lysin; M steht für
Methionin; F steht für
Phenylalanin; P steht für
Prolin; S steht für
Serin; T steht für
Threonin; W steht für
Tryptophan; Y steht für
Tyrosin und V steht für
Valin.
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Klentaq-nnn
ist eine Thermus aquaticus DNA-Polymerase mit gelöschtem Amino-Terminal, die mit dem
Codon nnn+1 beginnt, auch wenn das Startcodon und das nächste Codon
aufgrund von Änderungen
in der DNA-Sequenz, um eine angenehme Restriktionsstelle zu schaffen,
möglicherweise
nicht der Wildtypsequenz entsprechen.
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Klentaq-235
ist eine DNA-Polymerase, die im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenzen
aufweist wie die Thermus aquaticus DNA-Polymerase, aber keine N-Terminal 235 Aminosäuren aufweist, ± einem
Rest, wie im US-Patent Nr. 5.616.494 beansprucht und hier zitiert
wird.
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Klentaq-278
ist eine DNA-Polymerase, die im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenzen
aufweist wie die Thermus aquaticus DNA-Polymerase, aber keine N-Terminal 278 Aminosäuren aufweist,
wie im US-Patent Nr. 5.436.149 beansprucht wird. Der allgemeine
oder kommerzielle Name dieser DNA-Polymerase lautet Klentaq 1.
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WT
steht für
Wildtyp (vollständig)
oder die Löschung
von nur drei Aminosäuren
mit keinen weiteren bekannten Veränderungen.
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LA
PCR steht für
Lange und Genaue PCR unter Verwendung eines unausgeglichenen Gemischs
aus zwei DNA-Polymerasen, wie in US-Patent Nr. 5.436.149 beansprucht
wird. ATCC ist die Abkürzung
von American Type Culture Collection.
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„Thermostabil" wird hier definiert
als die Fähigkeit,
für eine
Vielzahl von Minuten Temperaturen von bis zu mindestens 95 °C zu widerstehen,
ohne dabei irreversibel denaturiert zu werden, sowie die Fähigkeit,
DNA bei optimalen Temperaturen zwischen 55 °C und 75 °C zu polymerisieren.
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Verfahren
zur Produktion von Replikatkopien desselben Polynukleotids, wie
PCR oder Klonen von Genen, werden hier zusammenfassend als „Amplifikation" oder „Replikation" bezeichnet. Beispielsweise
kann ein- oder zweistrangige DNA repliziert werden, um eine andere
DNA mit derselben Sequenz zu bilden. RNA kann zum Beispiel anhand
einer auf RNA gerichteten RNA-Polymerase oder durch eine reverse
Transkription der RNA und einer anschließend durchgeführten PCR
repliziert werden. Im letzteren Fall handelt es sich bei der amplifizierten
Kopie der RNA um eine DNA mit der entsprechenden oder homologen
Sequenz.
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Bei
der Polymerase-Kettenreaktion („PCR") handelt es sich um eine Reaktion,
bei der Replikatkopien eines Ziel-Polynukleotids unter Verwendung
von einem oder mehreren Primern und einem Katalysator der Polymerisierung,
wie einer DNA-Polymerase, und speziell eines thermostabilen Polymerase-Enzyms
erzeugt werden. Im Allgemeinen wird bei einer PCR wiederholt ein „Zyklus" aus drei Schritten
durchgeführt: „Schmelzen", bei dem die Temperatur
angepasst wird, so dass sich die DNA in einzelne Stränge auflöst, „Annealen", bei dem die Temperatur
angepasst wird, so dass Oligonukleotid-Primer sich an ihre komplementären Basensequenzen
anpassen können,
unter Anwendung der Basenpaarerkennung, um am einen Ende des Bereichs von
Polynukleotiden einen Duplex zu bilden, der amplifiziert wird; und „Extension" oder „Synthese", die bei derselben
Temperatur wie die Härtung
stattfindet, oder bei der die Temperatur auf eine etwas höhere und
optimalere Temperatur angepasst wird, so dass Oligonukleotide, die
einen Duplex gebildet haben, mit einer DNA-Polyemerase verlängert werden.
Der Zyklus wird dann wiederholt, bis die gewünschte Menge amplifizierter
Nukleotide erreicht ist. Methoden für die PCR-Amplifikation werden in den US-Patenten
Nr. 4.683.195 und 4.683.202 erklärt.
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Bei
der „PCR
mit heißem
Start" handelt es
sich um eine PCR-Methode, die im Allgemeinen zu einer besseren Zuverlässigkeit
führt und
aus Zielen mit niedriger Anzahl Kopien verbesserte Produkte und/oder
sauberere PCR-Produkte bildet. Matrizen-DNA und Primer werden zusammen
vermischt und bei einer Temperatur oberhalb der Schwelle von unspezifischen
Bindungen der Primer an die Matrize gehalten. Alle Komponenten der
PCR-Reaktion werden
der Extensionsreaktion hinzugegeben, außer einem wichtigen Reagenz,
das zurückbehalten
wird. Beim zurückbehaltenen
Reagenz handelt es sich normalerweise um die thermostabile Polymerase
oder das Magnesium, wobei auch die Triphosphate oder die Primer
zurückbehalten
werden können. Unmittelbar
vor Zyklusbeginn wird das zurückbehaltene
Reagenz hinzugefügt,
damit die Reaktion bei einer höheren
Temperatur stattfindet. Aufgrund eines Mangels an nicht spezifischer
Hybridisierung der Primer an die Matrize oder untereinander schreitet
die PCR-Amplifikation als Ergebnis der Reduktion oder Eliminierung
der konkurrierenden Extensionen an Nicht-Ziel-Stellen effizienter
voran.
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„Kalter
Start" und „Start
bei Raumtemperatur" werden
hier abwechselnd verwendet und wenn sie sich auf eine PCR-Amplifikation
beziehen, bedeutet es, dass alle für die Amplifikation notwendigen
Komponenten der PCR-Reaktion der Matrize der Nukleinsäuresequenz
bei 25 °C
hinzugefügt
werden.
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Um
die Temperatur zu beschreiben, bei der die PCR-Amplifikation durchgeführt wird,
bedeutet „warmer
Start", dass alle
für die
Amplifikation notwendigen Komponenten der PCR-Reaktion der Matrize der Nukleinsäuresequenz
bei 30 °C
oder 37 °C
hinzugefügt
werden.
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Wenn
sich der Begriff auf ein bestimmtes Protein bezieht, wie eine DNA-Polymerase,
bezieht sich der Begriff „isoliert" auf die Vorbereitung
des Proteins, das im Wesentlichen frei ist von Verunreinigungen.
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Wenn
sich der Begriff auf eine bestimmte DNA-Polymerase bezieht, bezieht
sich der Begriff „Polymeraseaktivität" auf die Fähigkeit
der DNA-Polymerase, dNTP oder ddNTPS in eine Extensions-Kettenreaktion mit
einzubeziehen. Wenn sich der Begriff auf mutierte DNA-Polymerasen bezieht,
bedeutet der Begriff „weitgehend ähnliche
Polymeraseaktivität", dass die mutierte
Polymerase mindestens 80% Polymeraseaktivität der unmutierten Polymerase
aufweist. Wenn sich der Begriff auf mutierte DNA-Polymerasen bezieht,
bedeutet der Begriff „weitgehend
reduzierte Polymeraseaktivität", dass die mutierte
Polymerase etwa 20% oder weniger Polymeraseaktivität aufweist
als dieselbe unmutierte Polymerase."„Reverse
Transkription" oder „reverses
Transkribieren" bezieht
sich auf den Vorgang, bei dem RNA durch die Aktion einer Nukleinsäurepolymerase,
wie die reverse Transkriptase, in cDNA konvertiert wird. Methoden
für die
reverse Transkriptase sind in Fachkreisen gut bekannt und beispielsweise
beschrieben in Fredrick M. Ausubel et al. (1995), „Short
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley and Sons, and Michael A. Innis et al. (1990), „PCR Protocols" Academic Press.
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Das „Stoffel-Fragment" bezieht sich auf
eine DNA-Polymerase, die weitgehend dieselbe Aminosäuresequenz
aufweist wie die Thermus aquaticus DNA-Polymerase, aber die aufgrund
einer genetischen Manipulation keine 5' Nucleaseaktivität aufweist, was zu einer Löschung der
N-Terminal 289 Aminosäuren
des Polymerasemoleküls
führt.
Siehe Erlich et al., Science 252:1643 (1991).
-
Die
Begriffe „Thermus
aquaticus DNA-Polymerase" oder „Taq DNA-Polymerase" werden abwechselnd verwendet,
um die hitzebeständigen
DNA-Polymerasen aus dem Bakterium Thermus aquaticus zu bezeichnen,
und umfassen alle Taq Mutationen, egal ob in natürlicher oder synthetischer
Form.
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Die
hier bekannt gegebenen Verfahren, die die Manipulation von Nukleinsäuren beinhalten,
sind Fachpersonen bekannt. Siehe Fredrick M. Ausubel et al. (1995), „Short
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley and Sons, und Joseph Sambrook et al. (1989), „Molecular
Cloning, A Laboratory Manual",
2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
-
Entsprechend
richtet sich die vorliegende Erfindung auf neue mutante DNA-Polymerasen, die
im Vergleich zu nicht-mutanten DNA-Polymerasen bei Raumtemperatur
eine bedeutend verringerte Polymeraseaktivität aufweisen, jedoch bei einer
optimalen Temperatur eine im Wesentlichen ähnliche Polymeraseaktivität aufweisen.
Die mutierten DNA-Polymerasen weisen bei 25 °C etwa 20% oder weniger Polymeraseaktivität und bei
68 °C mindestens
80% Polymeraseaktivität
auf im Vergleich mit denselben nicht-mutierten Polymerasen. Bei
einer bevorzugten Ausführung
weist die mutierte DNA-Polymerase bei 25 °C etwa 10% oder weniger Polymeraseaktivität und bei
68 °C etwa
80% oder mehr Polymeraseaktivität
auf, im Vergleich mit denselben nicht-mutierten Polymerasen; noch
besser ist eine Polymeraseaktivität von 5% oder weniger bei 25 °C und eine
Polymeraseaktivität
von mindestens 80% bei 68 °C
im Vergleich mit denselben nicht-mutierten
Polymerasen. Am meisten bevorzugt sind die mutierten DNA-Polymerasen,
die im Vergleich mit denselben nicht-mutierten Polymerasen etwa
1,5% oder weniger Polymeraseaktivität bei 25 °C und mindestens 80% Polymeraseaktivität bei 68 °C aufweisen.
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In
der einen Ausführung
handelt es sich bei den mutanten DNA-Polymerasen um thermal stabile DNA-Polymerasen.
Das thermostabile Enzym kann aus unterschiedlichen Quellen bezogen
werden und kann ein natives oder rekombinantes Protein sein. Einige
Beispiele für
thermostabile DNA-Polymerasen enthalten u.a. Thermus aquaticus DNA-Polymerase, N-Terminal
Löschungen
der Taq DNA-Polymerase wie z.B. Stoffel-Fragment DNA-Polymerase,
Klentaq-235 und Klentaq-278, Thermus thermophilus DNA-Polymerase,
Bacillus caldotenax DNA-Polymerase, Thermus flavus DNA-Polymerase,
Bacillus stearothermophilus DNA-Polymerase und archaebakterielle
DNA-Polymerasen wie Thermococcus litoralis DNA-Polymerase (auch
unter dem Namen Vent bekannt), Pfu, Pfx, Pwo und Deep Vent. In einer
bevorzugten Ausführung
sind die mutanten DNA-Polymerasen Thermus aquaticus Polymerasen
und noch bevorzugter sind vollständige
oder abgeschnittene Taq DNA-Polymerasen und am meisten bevorzugt
werden Klentaq-235 oder Klentaq-278.
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Kleinere
Variationen, die in die DNA eingeschlossen sind und codieren, werden
sehr geschätzt
sowie die Aminosäuresequenzen,
die hier beschrieben werden, die die Aminosäuresequenzen wie in SEQ ID
NR: 2 dargestellt beibehalten und die keine bedeutenden Auswirkungen
auf die Thermostabilität
der im Umfang dieser Empfindung enthaltenen Polymerase aufweisen.
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Experten
des Fachgebiets sind sich bewusst, dass Modifikationen in der Aminosäuresequenz
eines Peptids, Polypeptids oder Proteins zu gleichen oder möglicherweise
verbesserten Peptiden etc. der zweiten Generation führen können, die
im Vergleich zur ursprünglichen
Aminosäuresequenz ähnliche
oder bessere funktionelle Merkmale aufweisen. Entsprechend führt die
vorliegende Erfindung solche modifizierten Aminosäuresequenzen
herbei. Abänderungen
können
Einfügungen,
Löschungen,
Substitutionen, Abschneidungen, Fusionen, Vermischungen von Sequenzen
von Untereinheiten von Aminosäuren
und ähnliches
enthalten, sofern die aus solchen Modifikationen entstandenen Peptidsequenzen
im Wesentlichen dieselben funktionellen Eigenschaften aufweisen
wie die hier beschriebenen Sequenzen des natürlich vorkommenden Gegenparts. Deshalb
sollten beispielsweise modifizierte Zellmembran durchdringende Peptide
im Wesentlichen dieselben Eigenschaften der transmembranen Translokation
und Internalisierung besitzen wie die Sequenzen des natürlich auftretenden
Gegenparts.
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Ein
Faktor, der bei solchen Änderungen
berücksichtigt
werden kann, ist der hydropathische Index der Aminosäuren. Die
Wichtigkeit des hydropathischen Index der Aminosäuren bei der Übertragung
von interaktiven biologischen Funktionen auf ein Protein wurde von
Kyte und Doolittle diskutiert. Siehe J. Mol. Biol., 157:105–132, (1982).
Es wird allgemein angenommen, dass der relative hydropathische Charakter
von Aminosäuren
zur sekundären
Struktur des entstehenden Proteins beiträgt. Dies wiederum führt zu Interaktionen des
Proteins mit Molekülen
wie Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen etc.
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Aufgrund
der Hydrophobie und der Sättigungsmerkmale
wurde jeder Aminosäure
ein hydropathischer Index wie folgt zugewiesen: Isoleucin (+4,5),
Valin (+4,2), Leucin (+3,8), Phenylalanin (+2,8), Cystein/Cystin (+2,5),
Methionin (+1,9), Alanin (+1,8), Glycin (–0,4), Threonin (–0,7), Serin
(–0,8),
Tryptophan (–0,9),
Tyrosin (–1,3),
Prolin (–1,6),
Histidin (–3,2),
Glutamat/Glutamin/Aspartat/Asparagin (–3,5), Lysin (–3,9) und
Arginin (–4,5).
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Wie
auf diesem Fachgebiet bekannt ist, können gewisse Aminosäuren eines
Peptids oder Proteins für andere
Aminosäuren
mit ähnlichem
hydropatischen Index oder Ergebnis substituiert werden, die zu einem Peptid
oder Protein mit ähnliche
biologische Aktivität
führen,
das also immer noch die biologische Funktionalität beibehält. Bei solchen Änderungen
wird es vorgezogen, wenn Aminosäuren
mit hydropatischen Indizes von ±2 gegeneinander substituiert
werden. Weiter bevorzugt sind Austauschungen, bei denen die Aminosäuren hydropatische
Indizes von +1 aufweisen. Die am meisten bevorzugten Austauschungen
sind Substitutionen unter Aminosäuren
mit hydropatischen Indizes von ±0,5.
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Aminosäuren können auch
aufgrund ihrer Hydrophilität
substituiert werden. Im US-Patent
Nr. 4.554.101 wird gezeigt, dass die größte lokale durchschnittliche
Hydrophilität
eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilität der angrenzenden Aminosäuren reguliert
wird, einer biologischen Eigenschaft des Proteins entspricht. Den
Aminosäuren
wurden die nachstehenden Werte der Hydrophilität wie folgt zugewiesen: Arginin/Lysin
(+3,0), Aspartat/Glutamat (+3,0 ±1), Serin (+0,3), Asparagin/Glutamin
(+0,2), Glycin (0), Threonin (–0,4),
Prolin (–0,5
+1), Alanin/Histidin (–0,5),
Cystein (–1,0),
Methionin (–1,3),
Valin (–1,5),
Leucin/Isoleucin (–1,8),
Tyrosin (–2,3),
Phenylalanin (–2,5)
und Tryptophan (–3,4).
Folglich kann eine Aminosäure
eines Peptids, Polypeptids oder Proteins durch eine andere Aminosäure mit
einer ähnlichen
Hydrophilitätsauswertung substituiert
werden und immer noch ein Protein mit einer ähnlichen biologischen Aktivität produzieren,
also immer noch die korrekte biologische Funktionalität beibehalten.
Bei solchen Änderungen
wird es vorgezogen, wenn Aminosäuren
mit hydropatischen Indizes von ±2 gegeneinander substituiert
werden. Weiter bevorzugt sind Aminosäuren mit hydropatischen Indizes
von ±1
und am meisten bevorzugt sind solche mit hydropatischen Indizes
von ±0,5.
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Wie
oben dargestellt können
Substitutionen von Aminosäuren
in den Peptiden der vorliegenden Erfindung auf der relativen Ähnlichkeit
der Substitutionen der Seitenketten der Aminosäuren beruhen, wie beispielsweise
deren Hydrophobität,
Hydrophilität,
Sättigung,
Größe etc.
Beispielhafte Substitutionen, die unterschiedliche der vorangehenden
Merkmale berücksichtigen,
um konservative Veränderungen
der Aminosäuren
zu erzielen, die zu stillen Veränderungen
innerhalb der vorliegenden Peptide etc. führen, können von anderen Mitgliedern
der Klasse gewählt
werden, zu der die natürlich
vorkommende Aminosäure
gehört.
Aminosäuren
lassen sich in die nachstehenden vier Gruppen aufteilen: (1) saure
Aminosäuren,
(2) basische Aminosäuren,
(3) neutrale polare Aminosäuren
und (4) neutrale nicht-polare Aminosäuren. Zu den repräsentativen
Aminosäuren dieser
unterschiedlichen Gruppen gehören
u.a.: (1) saure (negativ geladene) Aminosäuren wie Asparaginsäure und
Glutaminsäure,
(2) basische (positiv geladene) Aminosäuren wie Arginin, Histidin
und Lysin, (3) neutrale polare Aminosäuren wie Glycin, Serin, Threonin,
Cystein, Cystin, Tyrosin, Asparagin und Glutamin sowie (4) neutrale
nicht-polare Aminosäuren
wie Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan
und Methionin. Es ist zu beachten, dass Änderungen, von denen keine
Vorteile erwartet werden, ebenfalls hilfreich sein können, wenn
sie zur Produktion von funktionalen Sequenzen führen.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf Sequenzen von Amino-
und Nukleinsäuren,
die solche mutanten DNA-Polymerasen codieren, sowie Vektorplasmide
und Wirtszellen, die sich für
die Expression solcher DNA-Sequenzen eignen. Bevorzugte Wirtszellen
für die
Expression solcher DNA-Sequenzen, die die mutanten DNA-Polymerasen
codieren, sind Bakterienzellen, Insektenzellen, Hefe, Pflanzenzellen
und Wirbeltierzellen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung sind die DNA-Polymerasen, die von
den in den Plasmiden pWB329Cs 1 und pWB329Cs 2 enthaltenen Polynukleotid-Sequenzen
codiert werden und entsprechend dem Abkommen von Budapest über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zum Zweck von Patentverfahren vom 23. August 1999 an die American
Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas,
VA 20110-2209, USA hinterlegt wurden. Diese Stränge tragen die Bezeichnung PTA-596
bzw. PTA-597. Zur Klärung
wird die hier beschriebene ATCC Hinterlegung Nr. PTA-596 in der
ATCC Hinterlegung als ein E. coli K-12 Bakterienstamm identifiziert,
der das künstliche
Plasmid pWB329Cs 1 enthält, während PTA-596
korrekter als ein an Cs 1 ligiertes künstliches Plasmid pWB302 beschrieben
wird, wie es in den Beispielen 1–4 beschrieben steht. In ähnlicher
Weise wird die ATCC Hinterlegung Nr. PTA-597 als ein E. coli K-12
Bakterienstamm identifiziert, der das künstliche Plasmid pWB329Cs 2
enthält,
während
PTA-597 korrekter als ein an Cs 2 ligiertes künstliches Plasmid pWB302 beschrieben
wird, wie es in den Beispielen 1–4 beschrieben steht.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist die DNA-Polymerase, die von der
im Plasmid pWB302Cs 3 enthaltenen Polynukleotid-Sequenz codiert
wird. Diese DNA-Polymerase enthält
drei Substitutionen von Aminosäuren,
wie in Tabelle 3 angegeben, von denen mindestens eine wichtig für den kälteempfindlichen
Phänotyp ist.
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Anwendungen
der mutanten DNA-Polymerasen
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Die
vorliegende Erfindung stellt mutante DNA-Polymerasen bereit, die
für unterschiedliche
PCR-Amplifikationstechniken, wie die Amplifikation von DNA-Matrizen
und von einzelnen Kolonien von E. coli, einstrangiger (linearer)
Amplifikation von DNA, Sequenzierung von Nukleinsäuren, DNA-Restriktionsdigestion, DNA-Kennzeichnung,
Nachweis von Mutationen und an Primer gerichtete Mutagenese, hilfreich
sind.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch an Verfahren zur Amplifikation
einer bestimmten Nukleinsäuresequenz,
vorzugsweise von DNA oder RNA, die folgende Schritte umfassen: (a)
falls die Nukleinsäuresequenz
doppelstrangig ist, Aufteilen der Nukleinstränge oder Schmelzen aller Strukturen
der Stränge
der Matrizen, (b) Behandeln der einfachen Stränge mit Oligodeoxyribonukleotid-Primern
unter solchen Bedingungen, dass von jedem Primer ein Extensionsprodukt
synthetisiert wird, unter Verwendung einer mutierten DNA-Polymerase der vorliegenden
Erfindung, deren Extensionsprodukt zu jedem DNA-Strang komplementär ist, (c) Trennen
der Primer-Extensionsprodukte von den Matrizen, auf denen sie synthetisiert
wurden, um einstrangige Moleküle
zu produzieren, und (d) mindestens eine Wiederholung der Schritte
b und c.
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Die
mutanten DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung können auch
verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen
von doppel- und einstrangigen PCR-Matrizen zu sequenzieren. Eine
solche Sequenzierungsmethode erfordert vier Gemische, die alle aus
Nukleinsäuresequenzen
bestehen, einen Primer, der zur Nukleinsäuresequenz hybridisieren wird,
eine gekennzeichnete dNTP und drei nicht gekennzeichnete dNTP, die
mutante DNA-Polymerase
und ein Nukleotid zur Terminierung. Jedes der vier Gemische enthält eine
andere Terminierungs-ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP. Die Sequenz
der Nukleinsäuresequenz
kann durch Trennen der Amplifikationsprodukte jedes Gemischs anhand
von Gel-Elektrophorese und Visualisierung der gekennzeichneten dNTP
anhand von Audioradiographie bestimmt werden. Bei einer geläufigen Alternative ist
die Kennzeichnung auf den ddNTP eingeschlossen, wobei jedes eine
unterschiedliche Kennzeichnung aufweist und alle in einer Reaktion
eingeschlossen sind, und als eine, anstatt vier einzelne Elektrophorese-Proben analysiert
werden. Die vorliegende Erfindung richtet sich weiter an Verfahren
zur Kennzeichnung von DNA unter Verwendung der neuen mutanten DNA-Polymerasen, um die
gekennzeichneten DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Eine Nukleotidsequenz
kann gekennzeichnet werden, wenn ein gekennzeichnetes Nukleotid
zur Verfügung
steht, das eine Reporter-Einheit aufweist, die das gekennzeichnete
Nukleotid mit der Matrize der Nukleinsäuresequenz verbindet, die gekennzeichnete
Nukleinsäuresequenz
anhand einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der mutanten
DNA-Polymerasen dieser Erfindung amplifiziert und die gekennzeichnete
Nukleinsäuresequenz
nachweist. Das gekennzeichnete Nukleotid kann im DNA-Primer enthalten
sein. Beispiele für
die unterschiedlichen Reporter-Einheiten sind Radionukleotide, Fluorophore
oder Fluorochrome, Peptide, Antikörper, Antigene, Vitamine und
Steroide.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch an Verfahren zu in-vivo-Footprinting
unter Verwendung der mutanten DNA-Polymerase zur Amplifikation der
DNA. Im Allgemeinen erfordert eine Analyse der Interaktion der Proteine
von entweder DNA oder RNA beim in-vivo-Footprinting zuerst eine
Modifizierung der Nukleinsäuren
durch das Footprinting-Reagenz in situ. Footprinting-Reagenzien
werden je nach Veränderungsgrad
der Reaktivität
einer Nukleinsäure
gegen den modifizierenden Agenten nach der Interaktion mit dem bindenden Protein
von Interesse gewählt.
Die Modifizierungen werden dann visualisiert (d.h. die Analyse der
Reaktivität jedes
Nukleotids der Sequenz von Interesse), normalerweise durch PCR.
Siehe Grange et al., Methods, (1997) 11:151–63. Entsprechend wird eine
LM-PCR verwendet,
um Modifikationen in den DNA-Molekülen zu visualisieren, und eine
RL-PCR, um Modifikationen
in den RNA-Molekülen
zu visualisieren. Bei der LM-PCR wie auch bei der RL-PCR wird ein
Linker an die unbekannten 5'-Enden
ligiert, die aus der Analyse des in-vivo-Footprinting entstehen
und die Region von Interesse exponentiell amplifizieren. In der
LM-PCR wird ein stumpfes doppelstrangiges Ende unter Verwendung
eines genspezifischen Primers und einer DNA-Polymerase geschaffen. Dann
wird ein teilweise doppelstrangiger DNA-Linker mit einem stumpfen
Ende unter Verwendung einer DNA-Ligase an die stumpfen Enden ligiert.
Der Strang, auf den der Linker ligiert wurde, dient dann als Matrize für die PCR-Amplifikation. Ähnlich wird
bei der RL-PCR unter Verwendung einer RNA-Ligase ein einstrangiger RNA-Linker
auf die 5' P-Enden
aller RNA-Moleküle
ligiert. Dann wird unter Verwendung einer reversen Transkriptase
eine cDNA-Kopie der Sequenz von Interesse synthetisiert, wodurch
Matrizen für
die PCR-Amplifikation geschaffen werden. Zum Schluss werden die
amplifizierten Produkte aus LM-PCR und RL-PCR gekennzeichnet und
für die
Analyse sequenziert.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch an Verfahren der auf Primer
ausgerichteten Mutagenese unter Verwendung der mutanten DNA Polymerasen,
um die mutierten Nukleinsäuresequenzen
zu amplifizieren, die innerhalb der Ziel-DNA-Sequenz Ersatzmutationen
aufweisen. Beim Verfahren der auf Primer ausgerichteten Mutagenese
wird eine Nukleinsäuresequenz
mit zwei mutierten Primern kontaktiert, wobei jede Mutation im Vergleich
zur Matrizensequenz eine Fehlanpassung ist, mit der neuen mutierten
DNA-Polymerase amplifiziert
und die amplifizierten Produkte werden wieder annealt. Die sich
aus der Verwendung der fehlangepassten mutierten Primer ergebenden
amplifizierten Nukleinsäuremoleküle weisen
fehlangepasste Basen und doppelstrangige Regionen mit einem mutierten
Strang auf. Siehe Innis et al., „PCR Protocols", Academic Press,
1990, Seite 177–183.
-
Die
vorliegende Erfindung richtet sich weiter an Verfahren zur DNA-Restriktionsdigestion
unter Verwendung der neuen mutanten DNA-Polymerasen, um die DNA
zu amplifizieren. Die mutanten DNA-Polymerasen werden in der DNA-Restriktionsdigestion
verwendet, um die 3'-Enden
zu erweitern, die aus der Digestion mit Restriktionsenzymen zum
Zweck der Produktion von 5' klebrigen
Enden entstehen. Zum Verfahren gehören Trennen der digestierten
DNA-Stränge,
Kontaktieren jedes 3'-Endes
der getrennten Nukleinsäuremoleküle mit Oligodeoxyribonukleotid-Primern,
Erweitern der 3'-Enden unter Verwendung
der neuen mutanten DNA-Polymerasen, um stumpfe Enden zu schaffen,
und Härtung
der DNA-Stränge
mit den neu synthetisierten 3'-Enden
auf dessen komplementären
Strang.
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Konstruktion
der mutanten Taq DNA-Polymerasen
-
Die
kälteempfindlichen
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung werden durch eine systematische
Mutation einer thermostabilen DNA-Polymerase gewonnen. Im Allgemeinen
gehören
zur Produktion einer mutierten DNA-Polymerase folgende Schritte:
Erhalten und Mutieren einer Polynukleotid-Sequenz, die die DNA-Polymerase
codiert, Bereitstellen eines DNA-Segments, das die mutierten Polynukleotide
enthält,
die die rekombinante DNA-Polymerase codiert, Einsetzen des DNA-Segments,
das die rekombinanten DNA-Polynukleotide in einen Expressionsvektor
codiert, der verwendet wird, um eine Wirtszelle umzusetzen, sowie
Screenen, um Varianten mit den gewünschten Eigenschaften zu identifizieren.
-
Mutationen
der Polynukleotidsequenz können
mit unterschiedlichen Methoden erreicht werden, die Experten des
Fachgebiets gut bekannt und für
die Erfindung nicht bedenklich sind. Zu den Mutationsmethoden gehören u.a.
die chemische Mutation, Insertionsmutation, Deletionsmutation, gezielt
gerichtete Mutation, zufällige
Mutation, fehleranfällige
PCR, auf Oligonukleotide ausgerichtete Mutation und ähnliche.
Das sich daraus ergebende mutierte Gen codiert eine rekombinante,
thermostabile DNA-Polymerase.
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Bei
einem bevorzugten Verfahren wird die Polynukleotid-Sequenz, die
die thermostabile Thermus aquaticus DNA-Polymerase codiert, vorzugsweise
Klentaq-235, durch eine zufällige
Mutagenese der Polynukleotid-Sequenz, vorzugsweise durch eine „fehleranfällige" PCR-Technik, mutiert.
Die fehleranfällige
PCR bedient sich Polymerisationsbedingungen von geringer Genauigkeit,
um zufällig
einen niedrigen Gehalt an Punktmutationen innerhalb einer Polynukleotidsequenz
herbeizuführen,
und kann verwendet werden, um ein Gemisch von Fragmenten von unbekannter
Sequenz zu mutagenieren. Siehe z.B. Leung et al., (1989) Technique, 1:11–15; Caldwell
et al. (1992) PCR Methods Applic., 2:28–33; Gram et al.,(1992) Proc.
Natl. Acad. Sci., 89:3576–3580;
Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226:889–896. Die mutierten Polynukleotid-Sequenzen
werden in Expressionsvektoren eingesetzt, die für die Transformation von E.
coli eingesetzt werden. Die Varianten werden dann gescreent und
es werden die Varianten mit den gewünschten Eigenschaften der Kälteempfindlichkeit
ausgewählt.
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Im
Allgemeinen gehören
zur Vorbereitung einer Expressionsbibliothek das Verdauen der Nukleotidsequenzen,
die die mutierte DNA-Polymerase codieren, und ein Vektor mit Restriktionsenzymen,
die für
die Stelle spezifisch sind, sowie das Zusammenligieren des Vektors
und der mutierten Fragmente mit der sich ergebenden Einfügung der
mutierten Sequenz neben den gewünschten
Kontroll- und Expressionssequenzen. Der eingefügte Vektor hängt teilweise
vom gewünschten
Wirtszelltyp für
die Verwendung in der Genexpression ab. Normalerweise wird ein wirtskompatibles
Plasmid eingesetzt, das Gene für
Marker wie Ampicillin oder Tetracyclin-Resistenz aufweist und auch
passende Promoter- und Terminator-Sequenzen aufweist.
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Spezifische
Nukleotid-Sequenzen im Vektor werden von ortsspezifischen Restriktionsenzymen
wie NcoI und HindIII gespalten. Nachdem der Vektor optional mit
alkalischer Phosphatase behandelt wurde, werden der Vektor und das
Zielfragment zusammenligiert, wodurch die Zielcodons an ihrer Stelle
neben den gewünschten
Kontroll- und Expressionssequenzen
eingesetzt werden.
-
Der
DNA-Vektor wird dann mit einem Verfahren, das unter dem Namen Transformation
oder Transfektion allgemein bekannt ist, in die Wirtszellen eingefügt. Die
Transformation der entsprechenden Wirtszellen wird anhand bekannter
Methoden des Fachgebiets durchgeführt. Die transformierten Wirtszellen
werden unter günstigen
Bedingungen kultiviert, um die Produktion der rekombinanten DNA-Polymerase
durch Expression des Gens und der darauffolgenden Proteinproduktion
in der kompatiblen transformierten Wirtszelle hervorzurufen. Die
Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsmethoden
hängen
von der verwendeten Wirtszelle zur Expression des Gens ab.
-
Eine
Wirtszelle wird anhand eines speziell für diese Wirtszelle bestimmten
Protokolls transformiert. Für E.
coli, produziert eine Behandlung mit Kalzium die Transformation,
Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110 (1972). Bakterien,
z.B. unterschiedliche Bakterienstämme von E. coli und Hefe, z.B.,
Bierhefe, werden häufig
als Wirtszellen für
die Expression von DNA-Polymerase verwendet, auch wenn Techniken
zur Verwendung komplexerer Zellen bekannt sind. Siehe, z.B. Verfahren
zur Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Beschreibung von Depicker,
A., et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:561.
-
Als
Alternative und mit einer größeren Effizienz
wird anhand der Methode von Dower et al. eine Elektroporation von
salzlosen E. coli durchgeführt,
(1988), Nucleic Acids Research 16:6127–6145. Nach der Transformation
werden die transformierten Wirtszellen von anderen Bakterien, je
nach übernommenen
Merkmalen des Expressionsvektors, wie Ampicillin-Resistenz, ausgewählt und die transformierten
Bakterienkolonien weiter auf die Fähigkeit gescreent, hohe Grade
an Isopropylthiogalactosid (IPTG)-induzierter thermostabiler DNA-Polymeraseaktivität zu verursachen.
Kolonien von transformierten E. coli werden dann in großen Mengen herangezüchtet und
die Expression der DNA-Polymerase wird zur Isolation und Purifikatioin
induziert.
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Die
exprimierte thermostabile DNA-Polymerase wird dann anhand unterschiedlicher
Methoden, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, isoliert
und auf die gewünschten
Merkmale untersucht. Auch wenn unterschiedliche Techniken zur Purifikation
bekannt sind, enthalten alle die Schritte der Spaltung der E. coli
Zellen, Inaktivierung und Entfernung von nativen Proteinen und Präzipitation
der Nukleinsäuren.
Die DNA-Polymerase wird unter Berücksichtigung von Merkmalen
wie Gewicht (Zentrifugation), Größe (Dialyse, Gelfiltrationschromatographie)
oder Veränderungen
(Ionenaustauschchromatographie) getrennt. Generell werden Kombinationen
aus diesen Techniken zusammen im Purifikationsverfahren angewendet.
-
Die
nachstehenden Beispiele dienen zur Illustration, jedoch nicht zur
Einschränkung,
der vorliegenden Erfindung.
-
BEISPIELE
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Beispiel 1: Konstruktion
des pWB329
-
pWB250,
das ein NPTII Gen enthält
(aus dem Transposon Tn5), wurde mit HindIII digestiert. Nach einer
Digestion von 90 Minuten mit HindIII wurde dem Gemisch alkalische
Phosphatase aus Kälbereingeweiden (2
Einheiten pro 1001) für
weitere 30 Minuten bei 37 °C
hinzugefügt.
Das Plasmid pWB253 (siehe US-Patent Nr. 5.616.494) wurde mit NcoI
und einer Einheit des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I in Gegenwart von
50 mM aller 4 NTP während
30 Minuten bei 37 °C
digestiert. Die pWB250-Einlage wurde dann in den Vektor pWB253 ligiert,
um pWB329 zu produzieren, das ein kanR Gen (NPTIII) enthält, welches
sich stromaufwärts
des Klentaq-235 Gens im pWB253 befindet. pWB329 wurde als die Matrizen-DNA
verwendet, um die mutagenierten Sequenzen mit nicht-mutagenen PCR
im Beispiel 2 zu erweitern.
-
Beispiel 2: Mutagenese
von Klentaq235
-
Eine
fehleranfällige
PCR wurde unter Verwendung von Klentaq-278 als der katalysierenden
DNA-Polymerase, ohne Korrektor, und mit 0,5 mM Mn2+ zusätzlich zu
den 7,0 mM Mg2+ Ion in einer Reaktion mit
einem PCR-Puffer aus 250 :1 aus jedem dNTP, 50 mM Tris pH 8,55,
16 mM Ammoniumsulfat durchgeführt.
Die Matrizen-DNA bestand aus der Polynukleotid-Sequenz, die die
Klentaq-235 DNA-Polymerase (Plasmid pWB253; siehe US-Patent Nr.
5.616.494) oder genomische DNA aus Thermus aquaticus codierte. Die
in der Reaktion der Mutagenese verwendeten Primer waren KT85 GCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGA
(SEQ ID NR: 7) und Klentaq32 GCG AAG CTT ACT ACT CCT TGG CGG AGA
GCC AGT CC (SEQ ID NR: 8). KT85 wie auch Klentaq32 umspannen das
Klentaq-235 der Hälfte
des C-Terminals (Plasmid pWB253; siehe US-Patent Nr. 5.616.494)
und konzentrieren die Mutagenese auf den Teil des Enzyms, von dem
man weiß,
dass dort die katalytischen Funktionen für eine DNA-Polymerase enthalten
sind.
-
Die
Reaktionen der Mutagenese wurden in dreifacher Ausführung mit
drei unterschiedlichen Mengen von Polymerasen durchgeführt. Für 15 Zyklen
von mutagener PCR (bezeichnet als m15) wurde eine Matrize von 10,
20 und 30 ng pWB253 in einem Volumen von 100 :1 benutzt. Für 20 und
25 Zyklen von mutagener PCR (bezeichnet als m20 bzw. m25) wurde
eine Matrize von 1, 2 und 3 ng Genom-DNA aus Thermus aquaticus in
einem Volumen von 100 :1 benutzt. Die Bedingungen für die mutagenen
PCR-Zyklen betrugen 60 Sekunden bei 95 °C und 7 Minuten bei 65 °C.
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Die
Produkte der Reaktionen der Mutagenese m15, m20 und m25 wurden dann
als Primer verwendet und unter Verwendung einer nicht-mutagenen
PCR-Reaktion von hoher Genauigkeit mit pWB329 als Matrize erweitert.
Der andere in diesen Reaktionen verwendete Primer war Oligonukleotid
4468 GGA TCT CGT CGT GAC CCA TGG CGA TGC CTG CTT GCC (SEQ ID NR:
9), der die NcoI-Stelle im NPTII-Gen umspannt.
-
Die
dreifachen Reaktionen der PCR-Mutagenese (m15, m20 und m25) wurden
gepoolt und mit PEG präzipitiert.
Primer-Oligonukleotide 4468 (SEQ ID NR: 9) und 1-2 ng Plasmid pWB329
wurden jedem gesamten Pellet in 200 :1 PCR-Puffer zugegeben, das
250 :M jedes dNTP, 50 mM Tris pH 9,2, 16 mM Ammoniumsulfat, 3,5
mM MgCl2, 100:g/ml BSA enthielt. Jede Reaktion
wurde auf zwei Röhrchen
aufgeteilt (Röhrchen
A und B) und 20 PCR-Zyklen
wurden mit folgenden Zyklus-Parametern durchgeführt: 70 Sekunden bei 96 °C, 30 Sek.
bei 64 °C
und 7 Minuten bei 65 °C.
Beim Zyklus 12 dieser End-PCR wurden dem Röhrchen B jeder PCR-Reaktion
24 pmol des Primer Klentaq32 (SEQ ID NR: 8) für die gepoolten m 15, m20 und
m25 hinzugegeben. Dieser Zusatz wirkte sich auf den Endgewinn der
2kb mutagenisierten PCR-Zielfragmente aus. Jede PCR-Reaktion wurde
zweimal mit PEG präzipitiert,
um alle dNTP und Primer zu entfernen.
-
Das
führte
zur Produktion der gesamten DNA-Polymerase Klentaq-235 zusammen
mit einem Teil des C-Terminus der NPTII (Kanamycin-Resistenz). Der
NPTII-Teil ermöglichte
die Wahl für
PCR-Produkte während des
Klonens in den Vektor pWB302 für
die Produktion von Expressionsbibliotheken der mutierten Polymerasen in
E. coli. Die Bibliotheken wurden aus jedem Grad der Mutagenesen
wie in Beispiel 3 beschrieben vorbereitet und auf DNA-Polymeraseaktivitäten wie
im Beispiel 4 beschrieben untersucht.
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Beispiel 3: Vorbereitung
der mutagenisierten Bibliothek pWB302mk
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Die
Pellets, die die mutierten DNA-Sequenzen enthalten, wurden im Restriktionsenzym-Puffer
NaTMS (50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,9, 10 mM MgCl2,
10 mM Mercaptoethanol) resuspendiert und mit NcoI und HindIII während 100
Minuten bei 37 °C
digestiert. Der Expressionsvektor pWB302 (2) zum Klonen
des mutagenisierten PCR-Produkts wurde wie in Barnes, WM, Gene 112:29–35 (1992)
beschrieben, konstruiert. pWB302 ist in Wirklichkeit eine Löschung des
pWB305 (Genbank Accession No. M86847; Barnes 1992) zwischen den
Stellen SnaB1 und NcoI. pWB302 wurde mit NcoI, HindIII und alkalischer
Phosphatase digestiert. Die digestierte Ziel-DNA und das digestierte
pWB302 wurden durch routinemäßige Phenolextraktion
und Ethanolpräzipitation
deproteiniert und bei einer Konzentration von ungefähr 0,2 :g/:l
resuspendiert. Die Ligase-Reaktionen enthielten 32,5 :1 Wasser,
5 :1 nur klebrigen T4 Ligase-Puffer (40 :M rATP, 20 mM Tris pH 7,9,
5 mM MgCl2, 10 mM DTT), 10 :1 Ziel-DNA,
2,5 :1 Vektor und 1 :1 T4 DNA-Ligase. 10 :1 wurden für die Gelprobe „vor der
Ligase" entfernt.
Die Ligasereaktionen wurden 24 Stunden bei 5 °C inkubiert. 10 :1 wurden für die Gelprobe „nach der
Ligase" entfernt.
Das verbleibende Gemisch wurde unter Verwendung von Ethanol präzipitiert.
Die Proben „vor
der Ligase" und „nach der
Ligase" wurden auf
einem Agarosegel analysiert, um eine sachgemäße Ligation der Produkte der
Mutagenese in pWB302 zu versichern.
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Die
in den pWB302 Vektor eingesetzte Bibliothek der mutierten DNA-Sequenzen
wird hier als pWB302mk gekennzeichnet. Die Region zwischen den Primern
KT85 (SEQ ID NR: 7) und Klentaq32 (SEQ ID NR: 8) enthält die mutagenisierten
Sequenzen. In diesem System werden die mutierten Polymerase-Gene
mit bescheidenen Gehalten als zweites Gen in einem künstlichen
Operon, das kann (NPTII) als erstes Gen hat, exprimiert und ein
kleiner Teil des kann ist auf einer amplifizierten DNA, die geklont
wird, eingeschlossen. Somit wird die Wahl des KanR gewährleistet,
so dass sich keine der daraus resultierenden Bibliothekskolonien als
leerer Vektor erweist.
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Beispiel 4: Identifizierung
von kälteempfindlichen
Mutanten
-
Mutanten
mit dem gewünschten
Phänotyp
wurden vorläufig
mit einem Test für
Einzelkolonien identifiziert. Beim Test für DNA-Polymerase aus Einzelkolonien,
der von den Anwendern benutzt wird, handelt es sich um eine Modifizierung
der Methode von Sagner et al., Gene, 97:119–123, 1991. Unter Verwendung
eines Replikators mutierten die E. coli-Kolonien, die Polymerase-Gene enthielten,
entsprechend der oben beschriebenen Methoden und wuchsen unter Standardbedingungen
auf Nitrozellulosefilter bei einer Dichte von bis zu 384 pro 8 X
12 cm Filter (Größe der Mikrotiterplatte).
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Die
Filter, die die Kolonien enthielten, wurden mit einem minimalen
Volumen von Reaktionspuffer mit 50 mM Tris-HCl pH 7,9, 16 mM Ammoniumsulfat,
2,5 mM Magnesiumchlorid und 0,5% Triton X-100 belegt. Die Filter
wurden dann bei 68 °C
15 Minuten erwärmt,
um die endogenen E. coli-DNA-Polymerasen und weitere hitzeempfindliche
Mutanten von Klentaq-235 zu deaktivieren.
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Die
Filter wurden dann mit einem minimalen Volumen (2 ml) von Reaktionspuffer
mit 20–40
mM aller vier dNTP und einem Mikrocurie von alpha-32P-dATP
unterstützt
und entweder bei einer niedrigen Temperatur (37 °C oder 42 °C) oder bei einer hohen Temperatur (68 °C) inkubiert.
Um die Signale für
den Vergleich zwischen den beiden Temperaturen anzupassen, wurden
die Proben der niedrigen Temperatur 4-5-mal länger inkubiert als die Proben
der hohen Temperatur. Bei einem alternativen Verfahren wurde ein
Screening bei einer niedrigen Temperatur von 25 °C durchgeführt. Bei einem Screening bei
einer Temperatur von 25 °C
ist es allen Experten des Fachgebiets klar, dass die für die Ausgleichung
der Signale zwischen den Bedingungen bei hoher und niedriger Temperatur
erhöhte
Inkubationszeit erhöht
werden muss. Nach der Beimischung wurden die Filter mit 5% TCA und
1% PPi gewaschen und einem Röntgenfilm
oder Phospoimager ausgesetzt, bis die Wildtypsignale für jede Testtemperatur
einfach erkennbar waren. Es wurde eine weitere Angleichung der Signale
der Inkubation bei niedriger Temperatur an die Signale der Inkubation
bei normal hoher Temperatur für nicht-mutierte
Kolonien erhalten, indem die Expositionszeiten des letzten Röntgenfilms
angepasst wurden.
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Die
Kolonien wurden anhand der Unterschiede der Signalstärke, die
aus den unterschiedlichen Bedingungen der hohen und niedrigen Temperaturen
hervorgingen, ausgewählt.
Speziell wurden Kolonien ausgewählt,
die kein nachweisbares Signal bei Bedingungen niedriger Temperaturen
produzierten, die ein volles Signal mit dem Wildtyp produzierten,
aber die ein Signal produzierten, das sich mit dem unter kontrollierten, nicht-mutierten Kolonien
unter Bedingungen von hohen Temperaturen vergleichen lässt. Anhand
dieser Kriterien wurden drei Kolonien ausgewählt, die die größte Kälteempfindlichkeit
aufweisen, und mit Cs 1, Cs 2 und Cs 3 bezeichnet.
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E.
coli-Bakterienstämme,
die das an Cs 1 ligierte Plasmid pWB302 enthalten, wurden als pWB329Cs 1
bezeichnet und an Cs 2 ligiertes pWB302 wurde als pWB329Cs 2 bezeichnet
und entsprechend dem Abkommen von Budapest über die internationale Anerkennung
der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren
vom 23. August 1999 an die American Type Culture Collection (ATCC),
10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA hinterlegt.
Diese Stämme
haben die Kennzeichnung ATCC-Hinterlegung
Nr. PTA-596, bzw. PTA-597. Zur Klärung wird die hier beschriebene
ATCC-Hinterlegung
Nr. PTA-596 in der ATCC-Hinterlegung als ein E. coli K-12 Bakterienstamm
identifiziert, der ein künstliches
Plasmid pWB329Cs 1 enthält,
während
PTA-596 korrekter als ein an Cs 1 ligiertes künstliches Plasmid pWB302 beschrieben
wird, wie es in den Beispielen 1–4 beschrieben steht. In ähnlicher
Weise wird die ATCC Hinterlegung Nr. PTA-597 als ein E. coli K-12 Bakterienstamm
identifiziert, der das künstliche
Plasmid pWB329Cs 2 enthält, während PTA-597
korrekter als ein an Cs 2 ligiertes künstliches Plasmid pWB302 beschrieben
wird, wie es in den Beispielen 1–4 beschrieben steht.
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Das
als pWB329Cs 1 bezeichnete Plasmid, das bei der ATCC als PTA-596
hinterlegt wurde (an Cs 1 ligiertes Plasmid pWB302), enthält eine
Polynukleotid-Sequenz, die eine DNA-Polymerase codiert, die die
in Tabelle 1 aufgeführten
Mutationen aufweist. Die Positionen der DNA-Sequenz und der Aminosäuresequenz sind
entsprechend der DNA-Sequenz
und der Aminosäuresequenz
der vollständigen
Wildtyp Taq DNA-Polymerase nummeriert, wie in SEQ ID NR: 1 und 2
gezeigt wird.
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Tabelle
1: Kälteempfindliche
mutante DNA-Polymerase 1
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Das
als pWB329Cs 2 bezeichnete Plasmid, das bei der ATCC als PTA-597
hinterlegt wurde (an Cs 2 ligiertes Plasmid pWB302), enthält eine
Polynukleotid-Sequenz, die eine DNA-Polymerase codiert, die die
in Tabelle 2 aufgeführten
Mutationen aufweist. Die Positionen der DNA-Sequenz und der Aminosäuresequenz sind
entsprechend der DNA-Sequenz
und der Aminosäuresequenz
der vollständigen
Wildtyp Taq DNA-Polymerase nummeriert, wie in SEQ ID NR: 1 und 2
gezeigt wird.
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Tabelle
2: Kälteempfindliche
mutante DNA-Polymerase 2
-
p
WB302Cs 3 (an Cs 3 ligiertes Plasmid pWB302mk), enthält eine
Polynukleotid-Sequenz,
die eine DNA-Polymerase codiert, die die in Tabelle 3 aufgeführten Mutationen
aufweist. Die Positionen der DNA-Sequenz und der Aminosäuresequenz
sind entsprechend der DNA-Sequenz und der Aminosäuresequenz der vollständigen Wildtyp
Taq DNA-Polymerase
nummeriert, wie in SEQ ID NR: 1 und 2 gezeigt wird.
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Tabelle
3: Kälteempfindliche
mutante DNA-Polymerase 3
-
Unter
Verwendung der Verfahren zur Purifikation für Klentaq-235 und Klentaq-278,
wie sie in den US-Patenten 5.616.494 und 5.436.149 erklärt (und
hier zitiert) werden, wurden die Kolonien erweitert, mit IPTG induziert,
die Zellen lysiert und die mutierten DNA-Polymerasen Cs 1, Cs 2 und Cs 3 purifiziert.
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Beispiel 5: PCR Amplifikation
unter Verwendung von Cs 1 und Cs 2
-
Um
zu bestimmen, ob die kälteempfindlichen
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung unter Startbedingungen
bei Raumtemperatur ähnliche
Ergebnisse liefern wie die unter Verwendung herkömmlicher thermostabiler Polymerasen
bei Bedingungen eines Hot Starts erzielten Ergebnisse, wurden Cs
1 und Cs 2 mit Klentaq-278 unter Bedingungen eines kalten Starts,
warmen Starts, und manuellen heißen Starts verglichen. Die
Reaktionen wurden ohne Magnesium in Volumen von 50 ml in 1X TAT
Puffer gestartet, der 50 mM Tris-HCl pH 9,2, 16 mM Ammoniumsulfat,
0,1% Tween 20 enthält.
Die Matrize bestand aus 5 ng humaner genomer DNA. Ein ml (etwa 0,7
:g) von entweder Cs 1 Polymerase, Cs 2 Polymerase oder Klentaq-278
wurde pro 50 ml Reaktionsgemisch verwendet. Jede 50 ml Reaktion
enthielt auch 250 mM der Mg2+-freien dNTP.
Für die Bedingungen
eines kalten oder warmen Starts wurde vor einer 30-minütigen Vorinkubation
bei der Testtemperatur von 25, 30 oder 37 °C Magnesiumchlorid (auf einen
Endgehalt von 3,5 mM) hinzugegeben. Um einen manuellen heißen Start
zu schaffen, wurde die Reaktion bei 30 °C ohne Magnesium vorinkubiert
und das Magnesiumchlorid während
des Zeitraums (ungefähr
5–7 Minuten)
hinzugefügt,
in dem alle Reaktionen bei 68 °C vor
dem ersten PCR-Zyklus inkuzier wurden. Die Zyklusbedingungen setzten
sich aus 45 Zyklen bei 92 °C während 40
Sekunden, 67 °C
während
30 Sekunden und 68 °C
während
2 Minuten zusammen.
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Es
wurden zwei Zielsequenzen von unterschiedlicher Größe amplifiziert.
Es wurden die Sequenz des humanen Tyrosinhydroxylase-Gens (TH01),
das aus 250 bp besteht und die Sequenz des humanen Chemokin-Rezeptors
5 (CCR5), der aus 513 bp besteht, amplifiziert. Die verwendeten
Primer-Sets sind wie folgt:
THO 1-1:
GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT
(SEQ ID NR: 3)
THO 1-2:
ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG (SEQ
ID NR: 4)
CCR5-D5:
AGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTT (SEQ
ID NR: 5)
CCR5-D3
GATGATGGGGTTGATGCAGCAGTGCGTCAT (SEQ
ID NR: 6)
-
Präziser ausgedrückt, wurden
für die
kalt gestartete PCR 5 ml 35 mM MgCl2 zu
den 45 ml des Reaktionsgemischs hinzugegeben und bei Raumtemperatur
(etwa 25 °C)
während
30 Minuten vorinkubiert. Für
die warm gestartete PCR wurde dasselbe Verfahren wie beim Start
bei Raumtemperatur eingesetzt, außer dass die 30-minütige Vorinkubation
bei 30 °C
stattfand. Bei der PCR mit heißem
Start wurde das Reaktionsgemisch von 45 ml ohne Mg++ bei
30 °C während 30
Minuten vorinkubiert. Nach 2–4
Minuten der ersten Aufwärmung (68 °C) wurden
jedem Reaktionsgemisch 5 ml des 35 mM MgCl2 hinzugegeben.
Nach den Zyklen wurden die aus der Amplifikation entstandenen Produkte
mit Standardverfahren isoliert, die Experten des Fachgebiets bestens
vertraut sind. Siehe z.B. Innis et al. (1990) „PCR Protocols, A Guide to
Methods and Applications", Academic
Press, Inc.
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Die
Amplifikationsprodukte wurden anhand der Elektrophorese mit Agarosegel
und einer Äthidiumbromidfärbung visualisiert.
Fünfzehn
bis achtzehn ml der Amplifikationsprodukte wurden in jede Vertiefung
des 1,4% Agarosegels, wie in 4 gezeigt,
gegeben. Die Vertiefungen des Agarosegels enthalten Amplifikationsprodukte,
die unter der in Tabelle 4 dargestellten Bedingungen gewonnen wurden.
Eine Leiter für
das Molekulargewicht von 100 bp wurde in die Vertiefung 1 geladen.
Die Elektrophorese wurde so lange ausgeführt, bis der Farbstoff sich
5–7 cm
bewegt hatte.
-
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Wie
aus 4 hervorgeht, produzierten zwei der kälteempfindlichen
Polymerasen der vorliegenden Erfindung, Cs 1 und Cs 2, scharfe Banden
unter den Bedingungen für
entweder einen kalten Start (Cs 1 in den Spuren 2 und 5; Cs 2 in
den Spuren 3 und 6), warmen Start (Cs 1 in den Spuren 8 und 11;
Cs 2 in den Spuren 9 und 12) oder einen heißen Start (Cs 1 in den Spuren
14 und 17; Cs 2 in den Spuren 15 und 18). Dagegen führte die
Verwendung des Standard Klentaq-278 nur unter den Bedingungen eines
manuellen heißen
Starts zur Bildung scharfer Banden (Spuren 16 und 19). Aus unbekannten
Gründen
war die Effizienz der Amplifikation von größeren CCRS-Zielsequenzen bei
der Verwendung von kälteempfindlichen
Polymerasen beim Start bei Raumtemperatur wie auch beim warmen Start
geringer als die für
THO1 beobachtete. Selbst bei der geringeren Effizienz sind die mit
den kälteempfindlichen
Polymerasen der vorliegenden Erfindung erzielten Ergebnisse besser
als die mit Klentaq-278 erzielten Ergebnisse.
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Beispiel 6: PCR-Amplifikation
unter Verwendung von Cs 3
-
Um
zu bestimmen, ob die Cs 3 mutante Polymerase der vorliegenden Erfindung
unter den Bedingungen eines kalten Starts ähnliche Ergebnisse liefert
wie die unter Verwendung herkömmlicher
thermostabiler Polymerasen bei Bedingungen eines heißen Starts
erzielten Ergebnisse, wurde die Cs 3 Polymerase mit Klentaq-278
unter Bedingungen eines kalten Starts und eines manuellen heißen Starts
verglichen. Es wurde der humane Ziel-Chemokin-Rezeptor 5 (CCR5), der 513 bp enthält, amplifiziert.
PCR wurde durchgeführt
unter Verwendung von CCR5-D5 (SEQ ID NR: 5) und CCR5-D3 (SEQ ID
NR: 6) als Primer für
35 Zyklen, wobei gleiche Mengen (80 ng pro 100 ul) von Klentaq-278
und Cs 3 Polymerase verwendet wurden. Alle Reaktionen enthielten
1,3 M Betain und Mg++-freie dNTP.
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Um
einen manuellen heißen
Start herbeizuführen,
wurden die PCR Proben bei 30 °C
während
30 Minuten vor der Amplifikation vorinkubiert und die Reaktionen
während
10 Minuten auf 68 °C
erwärmt.
Die Reaktionen 3 und 4 wurden bei 30 °C während 30 Minuten ohne Magnesium
in 45 ml Volumen von 1,11 X TAT Puffer (1X = 50 mM Tris-HCl pH 9,2,
16 mM Ammoniumsulfat, 0,1 % Tween 20) vorinkubiert. Dann wurde jedem
Reaktionsgemisch während
des Zeitraums, in dem alle Reaktionen bei 68 °C vor dem ersten PCR Zyklus inkubiert
wurden, normalerweise nach 2–4
Minuten der ersten Aufwärmung
von 5–7
Minuten auf 68 °C
5 ml des 35 mM MgCl2 hinzugefügt. Für die kalt
gestartete PCR wurden 5 ml des 35 mM dem Reaktionsgemisch hinzugegeben
und bei Raumtemperatur (etwa 25 °C)
während
30 Minuten vorinkubiert. Amplifikationen wurden unter den folgenden
Zyklusbedingungen für
heiße
und kalte Starts durchgeführt:
45 Zyklen bei 92 °C
während
40 Sekunden, 67 °C
während
30 Sekunden und 68 °C
während
2 Minuten.
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Nach
den Zyklen wurden die aus der Amplifikation entstandenen Produkte
mit Standardverfahren isoliert, die Experten des Fachgebiets bestens
vertraut sind. Siehe z.B. Innis et al. (1990) „PCR Protocols, A Guide to
Methods and Applications",
Academic Press, Inc.
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Die
amplifizierten CCR5-Produkte wurden anhand der Elektrophorese mit
Agarosegel und einer Äthidiumbromidfärbung visualisiert.
Fünfzehn
bis achtzehn ml der amplifizierten CCR5-Produkte wurden in die Vertiefungen
1–4 des
1,4% Agarosegels, wie in 5 gezeigt, gegeben. Die Vertiefungen
des Agarosegels enthalten Amplifikationsprodukte, die unter der
in Tabelle 5 dargestellten Bedingungen gewonnen wurden. Eine Leiter
für das Molekulargewicht
von 100 bp wurde in die Vertiefung 1 geladen. Die Elektrophorese
wurde so lange ausgeführt,
bis der Farbstoff sich 5–7
cm bewegt hatte.
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Wie
aus 5 hervorgeht, führte die Verwendung der Cs
3 Polymerase zur Produktion von scharfen Banden bei den Bedingungen
eines kalten Starts (Spur 4) oder eines heißen Starts (Spur 2). Dagegen
führte die
Verwendung des Standard Klentaq-278 nur unter den Bedingungen eines
manuellen heißen
Starts zur Bildung scharfer Banden (Spuren 3).
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Verwendung der kälteempfindlichen
Polymerasen der vorliegenden Erfindung die Nebenreaktionen, die
bei herkömmlichen
thermostabilen Polymerasen auftreten, beseitigen und die mit einer
PCR mit heißem
Start einhergehenden Vorteile bieten, ohne jedoch die mit PCR mit heißem Start
einhergehenden potenziellen Fehler und Kontaminationsprobleme aufzuweisen.
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Angesichts
der detaillierten Beschreibung der Erfindung und der oben vorgestellten
Beispiele kann angenommen werden, dass die unterschiedlichen Aspekte
der Erfindung erreicht werden.
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Es
ist zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung anhand von Illustrationen
und Beispielen detailliert beschrieben wurde, um andere Experten
des Fachgebiets mit der Erfindung, deren Prinzipien und deren praktischen
Anwendung vertraut zu machen. Die spezifischen Ausführungen
der vorliegenden Erfindung, so wie sie dargelegt sind, gelten weder
als vollständig,
noch begrenzen sie die Erfindung, und Experten des Fachgebiets erkennen,
dass es angesichts der oben genannten Beispiele und genauen Beschreibungen
viele Alternativen, Modifikationen und Varianten gibt. Während aus
einigen der oben genannten Beispielen und Beschreibungen Schlussfolgerungen
daraus gezogen werden können,
wie die Erfindung funktionieren könnte, haben die Erfinder keine
Absicht, sich durch diese Schlussfolgerungen und Funktionen binden
zu lassen, sondern erwähnen
diese nur als mögliche
Erklärungen.
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