DE69629077T2

DE69629077T2 - Thermostabile DNA Polymerase

Info

Publication number: DE69629077T2
Application number: DE69629077T
Authority: DE
Inventors: Maria Twinsburg Davis; Carl Cleveland Heights Fuller; Bruce Shaker Heights Moffett; John James Cunniff
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-05-31
Also published as: JP3966555B2; EP0745676A1; CA2222744C; GB2301590B; CA2222744A1; DE69629077D1; US5885813A; JPH11507211A; ATE245193T1; EP0745676B1; WO1996038568A1; GB9611218D0; GB2301590A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige thermostabile DNA-Polymerasen, auf die sie codierenden Gene und Vektoren sowie deren Verwendung bei der DNA-Sequenzierung.
In den US-Patenten 4.889.818 und 5.079.352 ist die Isolierung und Expression einer DNA-Polymerase mit der Bezeichnung TaqDNA Polymerase (im Folgenden bezeichnet als Taq) beschrieben. In diesen Patenten wird erwähnt, dass durch die aminoterminale Löschung unter Abwesenheit von ungefähr einem Drittel der Codierungssequenz ein Gen erzeugt wird, das bei der Analyse von Polymerasen sehr aktive ist. Außerdem wird Taq als nützlich für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) bezeichnet.
US-Patent Nr. 5.075.216 beschreibt die Verwendung von Taq bei der DNA-Sequenzierung.
In der internationalen Patentanmeldung WO 92/06/06188 wird eine DNA-Polymerase beschrieben, die eine zu Taq identische Aminosäurensequenz aufweist mit dem Unterschied, dass die N-terminalen Aminosäuren von Taq an Position 235 fehlen und diese Polymerase nicht für die DNA-Sequenzierung verwendet werden kann. Diese DNA-Polymerase ist unter der Bezeichnung Taq bekannt.
US-Patent 4.795.699 beschreibt die Verwendung von DNA-Polymerasen des Typs T7 (T7) für die DNA-Sequenzierung. Diese sind für die DNA-Sequenzierung sehr nützlich, da sie sich durch eine ähnlich effiziente Aufnahme von Dideoxinukleosidthriphosphate (NTPs) wie von Deoxi-NTPs auszeichnen. Andere Polymerasen sind erheblich weniger effizient bei der Aufnahme von Dideoxi-NTPs und müssen deshalb bei Sequenzierungsreaktionen in großen Mengen vorhanden sein.
Beim DOE Contractor-Grantee Workshop (13.–17. November 1994, Santa Fe) sowie bei I. Robert Lehman-Symposium (11. bis 14. November 1994, Sonoma) identifizierte Professor S. Tabor einen Bereich in DNA-Polymerasen, der für die effizientere Aufnahme von Dideoxi-NTPs modifiziert werden kann. Nach seinem Bericht macht das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer einzigen Hydroxy-Gruppe (Thyrosin gegenüber Phenylalanin) an einer hoch konservierten Position von E. coli bei DNA-Polymerase I, T7 und Taq einen mehr als 1000fachen Unterschied hinsichtlich der Fähigkeit zur Unterscheidung von Dideoxy-NTPs. (Siehe auch Europäische Patentanmeldung 94203433.1, veröffentlicht am 31. Mai 1995, Publikation Nr. 0 655 506 A1, die durch Bezugnahme zu einem Teil des vorliegenden Dokuments wird.)
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung besteht in einer DNA-Polymerase mit einer Aminosäuresequenz, die sich dahingehend von Taq unterscheidet, dass die N-terminale Aminosäure an Position 272 fehlt und an Position 667 (im Unterschied zur ursprünglichen Taq) Phenylalanin durch Tyrosin ersetzt ist. Vorzugsweise besitzt die DNA-Polymerase Methionin an Position 1 (das entspricht Position 272 bei Taq) (im Folgenden bezeichnet als FY2). Die vollständige DNA-Sequenz ist als 1 beigefügt (Sequenz-ID Nr. 1). Ebenfalls in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung fallen DNA-Polymerasen, deren Aminosäuresequenzen im wesentlichen der oben stehenden Beschreibung entsprechen und sich ebenfalls durch Thermostabilität und effiziente Aufnahme von Dideoxy-NTPs auszeichnen.
Mit einer im Wesentlichen identischen Aminosäuresequenz ist eine Sequenz gemeint, die zwischen 540 und 582 Aminosäuren enthält, die sich im Vergleich zu Taq konservative Modifikationen in der Anordnung der Aminosäuren auszeichnen, sie sich nicht wesentlich auf die Thermostabilität oder die Fähigkeit zur Aufnahme von Nukleotiden auswirken, d. h. abgesehen von dem Phenylalanin-Tyrosin-Austausch. Zu solchen Veränderungen gehören der Austausch von Aminosäuren gegeneinander, oder von Aminosäuren mit kleinen Seitensträngen durch andere kleine Seitenstränge, z. B. Alanin gegen Valin. In nicht kritischen Bereichen, in denen nach solchen Veränderungen nur geringfügige oder gar keine Aktivitäten auf die Polymeraseaktivität beobachtet werden, sind auch tiefer greifende Modifikationen zulässig.
Die Erfindung umfasst auch DNA-Polymerasen, bei denen zwischen 251 und 293 (vorzugsweise 271 oder 272) der N-terminalen Aminosäuren von Thermus flavus (Tfl) fehlen und Phenylalanin an Position 666 durch Tyrosin ersetzt ist, sowie diejenigen DNA-Polymerasen, denen zwischen 253 und 295 (vorzugsweise 274) der N-terminalen Aminosäuren von Thermus thermophilus (Tth) fehlen und das Phenylalanin an Position 669 (des ursprünglichen Tth) durch Tyrosin ersetzt ist.
Wirkungsvolle Einbindung von Dideoxy-NTPs bedeutet, dass eine Polymerase wenig oder überhaupt keine Unterschiede bei der Einbindung von ddNTPs um Vergleich zu dNTPs macht. Eine entsprechend effiziente Unterscheidung beträgt weniger als 1 : 10 oder besser noch weniger als 1 : 5. Eine solche Unterscheidung kann mit Hilfe der entsprechenden Verfahren gemessen werden.
Eine bevorzugte im Wesentlichen zu der oben beschriebenen identische Aminosäuresequenz ist diejenige, die 562 Aminosäuren enthält und an Position 1 Methionin sowie an Position 2 Alanin aufweist (das entspricht den Positionen 271 und 272 der nativen Taq) (im Folgenden bezeichnet als FY3). Die vollständige DNA-Sequenz findet sich in 2. Diese DNA-Polymerase ist insbesondere für die Expression durch ein von der vorliegenden Erfindung erfasstes Gen gedacht.
Die gereinigten DNA-Polymerasen FY2 und FY3 ergeben beide ein einzelnes Polypeptidband auf SDS-Polyacrylamidgels, im Gegensatz zu der entweder Phenylalanin oder Tyrosin an Position 667 aufweisenden Taq, die auf SDS-Polyacrylamidgels mehrere ähnlich große Polypeptidbande ausbildet.
Eine zweite bevorzugte im wesentlichen identische Aminosäuresequenz ist diejenige, bei der 274 der N-terminalen Aminosäuren von Thermus thermophilus fehlen, die Methionin an Position 1 sowie einen Phenylalanin-Tyrosin-Austausch an Position 396 aufweist (was Position 669 der ursprünglichen Tth entspricht) (im Folgenden bezeichnet als FY4) Eine vollständige DNA-Sequenz liegt als 5 bei (Sequenz-ID Nr. 14) [0014] Die vorliegende Erfindung erfasst auch ein Gen zur Codierung einer von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerase. Um zur Auslösung der Expression der DNA-Polymerase-Aktivität beizutragen, codiert das modifizierte Gen vorzugsweise einen Methioninrückstand an Position 1 der neuen DNA-Polymerase. Zusätzlich codiert das modifizierte Gen in einer der bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung auch Alanin an Position 2 (dies entspricht Position 272 der nativen Taq).
Als einen weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung einen Vektor, in dem das Gen zur Codierung der von dieser Erfindung erfassten Polymeraseaktivität enthalten ist; das bedeutet, der Vektor enthält eine sich von der ursprünglichen Taq unterscheidende Aminosäuresequenz, bei der die N-terminalen Aminosäuren von Position 272 fehlen und an Position 396 (die der Position 667 der Taq entspricht) ein Austausch von Phenylalanin gegen Tyrosin oder eine dazu im wesentlichen identische Aminosäurensequenz vorliegt.
Als noch einen weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle zur Aufnahme des Vektors, in dem das Gen zur Codierung der von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerase-Aktivität enthalten ist; das bedeutet, der Vektor enthält eine sich von der nativen Taq unterscheidende Aminosäuresequenz, bei der die N-terminalen Aminosäuren von Position 272 fehlen und an Position 396 (die der Position 667 der Taq entspricht) ein Austausch von Phenylalanin gegen Tyrosin oder eine dazu im wesentlichen identische Aminosäurensequenz vorliegt.
Die von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen sollten vorzugsweise in gereinigter Form vorliegen. Dabei bedeutet "in gereinigter Form", dass die DNA-Polymerase von einer Mehrheit der Proteine der Wirtszelle isoliert wird, mit denen sie normalerweise verbunden; vorzugsweise stellt die Polymerase mindestens 10% (w/w) eines Präparats dar oder noch besser liegt sie als homogenes Präparat, zum Beispiel in Form einer homogenen Lösung vor. Bevorzugt wird eine DNA-Polymerase, die auf SDS-Polyacrylamidgel ein einzelnes Polypeptidband ausbildet.
Die von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen sind für die Verwendung bei der Sequenzierung bestimmt, vorzugsweise in Verbindung mit einer Pyrophosphatase. Dementsprechend erfasst die vorliegende Erfindung einen Verbund bestehend aus einer von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerase und einer Pyrophosphatase, vorzugsweise einer thermostabilen Pyrophosphatase wie etwa der von Thermoplasma acidophilum. (Schafer, G. und Richter, O. H. (1992) Eur J. Biochem, 209, 351–355)
Die von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen können mit Hilfe der Standardverfahren konstruiert werden. So können zum Beispiel mutagene PCR-Primer konstruiert werden, bei denen der gewünschte Aminosäurenaustausch von Phe nach Tyr in einem Primer enthalten ist. Bei uns waren diese Primer auch mit Restriktionsbereichen versehen, die im Inneren des von uns als DNA-Matrize verwendeten Klons des Taq-Polymerase-Gens von Delta Taq, pWB253, zu finden sind. Mit diesem Primer-Paar ist jedoch die Erzeugung desselben PGR-Produkts aus jedem Klon von Taq oder aus direkt aus Thermus aquaticus isolierter genomischer DNA möglich. Das PCR-Produkt, in dem nur ein Teil des Gens codiert ist, wird dann mit Hilfe der entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut und als Ersetzungssequenz für den Klon von Delta Taq verwendet, der ebenfalls mit diesem Restriktionsenzym verdaut wurde Das resultierende Plasmid wurde von uns als pWB253Y bezeichnet. Das Vorliegen der Mutation kann durch DNA-Sequenzierung des erweiterten Bereichs des Gens nachgewiesen werden.
Weitere Primer können zur Codierung eines Methioninrückstandes am N-Terminus verwendet werden, der sich an der entsprechenden Position bei Taq nicht findet, so dass sich die Sequenz mit dem Aminosäurerückstand 273 fortsetzt. Diese Primer können zusammen mit dem entsprechenden Plasmid, z. B. pWV253Y DNA, als Matrize für die Erweiterung verwendet und das erweiterte Gen in einen Vektor, z. B. pRE2, zur Erzeugung eines Gens, z. B. pRE273Y, zur Codierung der Polymerase (FY2) eingesetzt werden Eine Überprüfung des Gens in seiner Gesamtheit ist im Wege der DNA-Sequenzierung möglich.
Eine verbesserte Expression der von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen innerhalb des pRE2-Expressionsvektors wurde durch die Schaffung weiterer Gene erreicht, pREFY2pref (der ein zu FY2 identisches Protein kodiert) sowie pREFY3pref zur Codierung von FY3. Mit Hilfe eines mutagenen PCR-Primers wurden stumme Veränderungen der Codierungseinheiten (d. h. solche, bei denen die Aminosäure selbst nicht verändert wird) an dem Amino-Terminus des Proteins vorgenommen, die sich nicht auf die Sequenz der Polypeptide auswirken. Diese Modifikationen führten zu einer vermehrten Produktion von FY2-Polymerase. Zusätzlich zu den an pREFY2pref angebrachten stummen Veränderungen der Codierungssequenzen wurde an der zweiten Position eine GCT- Codierungseinheit eingefügt (Sequenz-ID Nr. 2), wie sie häufig bei stark ausgeprägten Genen in E. coli vorkommt. Damit erhält die Sequenz von FY2 eine zusätzliche Sequenz, weswegen wir dem Protein seine eigene Bezeichnung FY3 gegeben haben. Beide Konstrukte erzeugen mehr Enzyme als pRE273Y.
Stumme Veränderungen der Codierungseinheiten wie im Folgenden angegeben führen zu einer erhöhten Proteinproduktion bei E. coli:
Austausch der Codierungseinheit GAA gegen GAG;
Austausch der Codierungseinheit AGG, AGA, CGG oder CGA gegen CGT oder CGC;
Austausch der Codierungseinheit CTT, CTC, CTA, TTG oder TTA gegen CTG;
Austausch der Codierungseinheit ATA gegen ATT oder ATC;
Austausch der Codierungseinheit GGG oder GGA gegen GGT oder GGC.
In der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls vorgesehen. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Molekül an ein Primer-Molekül angehängt, das zur Hybridisierung mit dem DNA-Molekül in der Lage ist, und anschließend werden die verketteten Moleküle in einem Gefäß inkubiert, das mindestens ein Deoxyribonukleotidtriphosphat sowie eine von der vorliegenden Erfindung erfasste DNA-Polymerase enthält. Des weiteren gehört dazu zumindest ein Kettenabbruchsnukleotid für die DNA-Synthese zur Beendigung der DNA-Synthese an einer bestimmten Nukleotidbase. Ferner erfolgt im Rahmen dieses Verfahrens einer Trennung der bei der Inkubationsreaktion entstandenen DNA-Produkte der Größe nach, wobei die Nukleotidbasensequenz des DNA-Moleküls zumindest teilweise bestimmt werden kann.
Bei den bevorzugten Ausgestaltungen erfolgt die Sequenzierung bei Temperaturen oberhalb von 50C, 60C oder 70C.
In den anderen bevorzugten Ausprägungen verfügt die DNA-Polymerase über weniger als 1000, 250, 100, 50, 10 oder sogar 2 Einheiten Exonukleaseaktivität pro mg Polymerase (gemessen nach dem Standardverfahren, siehe unten) und kann Primer mit nur 4, 6 oder 10 Basen verwenden. Die Konzentration aller vier Deoxynucleosidtriphosphate zu Beginn des Inkubationsschrittes reicht damit aus, um die DNA-Synthese bis zur Beendigung durch die Abbruchsubstanz im Gang zu halten.
Bei der zyklischen Sequenzierung ermöglichen die von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen eine Verwendung von deutlich niedrigeren Mengen an Dideoxynukleotiden im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Enzymen. Das bedeutet, dass bei diesem Verfahren die Deoxynukleotide gegenüber allen vier Dideoxynukleotiden bei einer Zyklussequenzierungsaktion sowie bei der Auslösung der Zyklussequenzierungsreaktion im Übermaß vorhanden sind.
Vorzugsweise sollten dNTPs gegenüber den entsprechenden ddNTPs mehr als 2, 5, 10 oder mehr als 100fach in der Überzahl sein.
Ein mit der vorliegenden Erfindung zusammenhängender Aspekt ist ein Kit oder eine Lösung für die DNA-Sequenzierung, die eine von der vorliegenden Erfindung erfasste DNA-Polymerase und ein für diese Reaktion erforderliches Reagens wie etwa dITP, deaza GTP, ein Kettenabbruchmittel wie etwa dNTP sowie eine manganhaltige Lösung oder ein manganhaltiges Pulver und optional eine Pyrophosphatase umfasst.
Ein weiterer mit der Erfindung zusammenhängender Aspekt ist ein Verfahren zur Herstellung der von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen durch eine Nukleinsäuresequenz zur Codierung der modifizierten DNA-Polymerase, die Expression durch eine Wirtszelle und die Auslösung der DNA-Polymerase aus der Wirtszelle.
Noch ein weiterer mit der Erfindung zusammenhängender Aspekt ist ein Verfahren für die Sequenzierung eines DNA-Stranges, das im wesentlichen dem oben beschriebenen Verfahren entspricht und bei dem ein oder mehrere (vorzugsweise 2, 3 oder 4) Deoxyribonukleosidtriphosphate, eine von der vorliegenden Erfindung erfasste DNA-Polymerase und ein erstes Kettenabbruchmittel zum Einsatz kommen. Die DNA-Polymerase sorgt für die Elongation des Primers zu einer ersten Serie von DNA-Produkten, die sich der Länge des elongierten Primers nach unterscheiden, wobei jedes DNA-Produkt über einen Kettenabbruchsstoff am elongierten Ende verfügt und die Anzahl der Moleküle jedes ersten DNA-Produktes für alle DNA-Produkte im wesentlichen gleich sind und sich diese Produkte der Länge nach um nicht mehr als 20 Basen unterscheiden. Bei diesem Verfahren wird in der Hybridisierungslösung auch eine zweites, sich vom ersten unterscheidendes Kettenabbruchmittel verwendet, wobei die DNA-Polymerase zur Erzeugung einer zweiten Serie von DNA-Produkten führt, die sich der Länge des elongierten Primers nach unterscheiden, wobei jedes zweite DNA-Produkt über einen Kettenabbruchstoff am elongierten Ende verfügt. Die Anzahl der Moleküle für jedes zweite DNA-Produkt ist für alle zweiten DNA-Produkte, die sich in der Länge um zwischen 1 und 20 Basen unterscheiden dürfen, im Wesentlichen gleich, unterscheidet sich aber wesentlich von der Anzahl der Moleküle aller ersten DNA-Produkte, deren Länge sich um nicht mehr als 20 Basen von der der besagten zweiten DNA-Produkte unterscheiden darf.
Bei bevorzugten Ausgestaltungen können drei oder vier solcher Kettenabbruchssubstanzen zur Erzeugung von verschiedenen Produkten verwendet werden, wobei die Sequenzierungsreaktion durch ein Magnesiumion oder sogar ein Mangan- oder Eisenion (z. B. in einer Konzentration von 0,05 und 100 mM, vorzugsweise zwischen 1 und 10 mM) ausgelöst wird und die DNA-Produkte entsprechend dem Molekulargewicht in vier oder weniger Gelstränge getrennt werden.
Noch ein weiterer mit der Erfindung zusammenhängender Aspekt bezieht sich auf die Erfindung eines Verfahrens zur Sequenzierung einer Nukleinsäure durch die Kombination eines Oligonukleotid-Primers, einer zu sequenzierenden Nukleinsäure, zwischen einem und vier Deoxyribonukleosidtriphosphaten, einer von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerase und mindestens zwei Kettenabbruchssubstanzen unter Bedingungen, die eine Ausweitung des Oligonukleotid-Primers zu Nukleinsäurefragmenten begünstigen, die einander zu der zu sequenzierenden Nukleinsäure ergänzen. Bei den Kettenabbruchssubstanzen kann es sich zum Beispiel und eine Dideoxynukleotid-Abbruchssubstanz für Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin handeln. Ferner umfasst das Verfahren die Trennung der Nukleidsäurenfragmente der Größe nach sowie die Bestimmung der Nukleinsäuresequenzen. Die Wirkstoffe werden der Stärke nach durch Kennzeichnung der sich durch die Ausdehnung der Primer ergebenden Produkte unterschieden.
Während das Verfahren der Gel-Elektrophorese zur Trennung der DNA-Produkte aus einer DNA-Sequenzierungsreaktion weit verbreitet ist, sind unter Experten auch andere in Frage kommende Methoden bekannt. So ist zum Beispiel eine Erfassung der einzelnen Fragmente mittels Laufzeit- Massenspektrometrie, Elektronenmikroskopie sowie mittels Verfahren zur Entdeckung einzelnen Moleküle möglich.
Die Erfindung umfasst auch eine Apparatur zur automatischen DNA-Sequenzierung mit einem Reaktor sowie Reagenzien, mit deren Hilfe aus einem einzigen Primer und einem DNA-Strang mindestens zwei Serien von DNA-Produkten gewonnen werden können. Die einzelnen DNA-Produkte unterscheiden sich dem Molekulargewicht nach und verfügen über eine Kettenabbruchsubstanz am Ende. Zu den Reagenzien gehört eine von der vorliegenden Erfindung erfasste DNA-Polymerase. Die Apparatur umfasst eine Trennvorrichtung zur Trennung der DNA-Produkte in eine Reihe von Bändern entlang der Achse der Trennungsvorrichtung. Ferner gehört dazu eine Vorrichtung zur Untersuchung der Banden, mit der die Position und Stärke jedes einzelnen Bandes nach der Trennung entlang der Achse bestimmt wird, sowie ein Rechner, der die DNA-Sequenz des DNA-Bandes allein anhand der Position und Stärke der Bänder entlang der Achse, jedoch nicht anhand der Wellenlänge des Lichtes bestimmt, das von eventuell in der Trennvorrichtung vorhandenen Markern ausgesendet wird.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der vorliegenden Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung sowie aus dem Patentanspruch hervor.
Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen
Im Folgenden zunächst eine kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Zeichnungen
1–4 zeigen die DNA-Sequenzen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen von FY2, FY3 sowie der DNA-Polymerasen aus T. flavus beziehungsweise Thermus thermophilus. 5 zeigt die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von FY4.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der von der vorliegenden Erfindung erfassten DNA-Polymerasen sowie von deren Verwendung bei der DNA-Sequenzierung.
Präparation der FY-DNA-Polymerasen (FY2 und FY3)
Bakterienstämme
Stämme von E. coli: MV1190 [(sr1-recA)306::Tn10, (lac-proAB), thi, supE, F' (traD36 proAB⁺ lac iq lacZ M15)); DH⁺ [gyrA96, recA1, thi-1, hsdR17, supE44, ⁺]; M5248 [ (bio275, cl857, clll+, N+, (H1))]
PCR
Die Reaktionsbedingungen beruhen auf dem Verfahren nach Barnes (91 Proc. Nat'l.Acad.Sci 2216–2220, 1994) und stellen sich wie folgt dar: 20 mM Tricin pH 8,8, 85 mM KOAc, 200 mM dNTPs, 10% Glycerol, 5% Dimethylsulfoxid, 0,5 mM von jedem Primer, 1,5 mM MgOAc, 2,5 U HotTub (Amersham Life Science Inc.), 0,025 U DeepVent (New England Biolabs), 1–100 ng Ziel-DNA pro 100 ml Reaktion. Die Zyklusbedingungen lauteten 94C 30s, 68C 10m 40s für 8 Zyklen; dann 94C 30s, 68C 12m 20s für 8 Zyklen; dann 94C 30s, 68C 14m 40s für 8 Zyklen.
In vitro-Mutagenese
Die Verdauung der Restriktionsenzyme, die Vorbereitung der Plasmide und andere Manipulationen der DNA in vitro wurden gemäß den Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., Molecular Cloning /Molekulares Klonen) 2. Aufl. Herausg. Cold Spring Harbor Press, 1989). Mit Hilfe von PCR (siehe das oben stehende Protokoll) wurde die Aminosäure Phe an Codierungseinheit 667 der ursprünglichen Taq-DNA-Polymerase (dies entspricht Codierungseinheit 396 von FY2) gegen Tyr ausgetauscht. Oligonukleotid-Primer 1 dGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGG (Sequenz-ID Nr. 3) erstreckt sich über die Nukleotide 954 bis 976 des Codierungsbereiches von Sequenz-ID Nr. 1 einschließlich eines BamHI-Restriktionsbereiches. Der mutagene Oligo-Primer
(Sequenz-ID Nr. 4) ertreckt sich über die Nukleotide 1 178 bis 1421 einschließlich eines NheI-Bereiches und Codierungssequenz 396 von Sequenz-ID Nr. 1. Ein Klon von exo-Taq, aus dem die ersten 235 Aminosäuren gelöscht worden waren, pWB253 mit verschlüsselter DeltaTaq-Polymerase (Barnes, 11 Gene 29–35, 1992), wurde als DNA-Matrize verwendet. Es kann jedoch ebenfalls jeder andere Klon der Taq-Polymerase oder genomische DNA von Thermus aquaticus zur Erweiterung des identischen PCR-Produktes verwendet werden. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI und NheI verdaut und dieses Fragment wurde mit dem durch BamHI/NheI verdauten pWB253-Plasmid verbunden, um das entsprechende Fragment zu ersetzen und daraus pWB253Y zu schaffen, welches die FY1-Polymerase codiert. Für die Transformation und die Induszierung der Proteinexpression wurden Zellen des E. coli-Stammes MV 1 190 verwendet, wobei dieser jedoch durch jeden Wirtstamm mit einem lac-Repressor ersetzt werden kann. Die Ersetzung von Phe durch Tyr im Codierungsbereich wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft.
Der sich über die Anfangs-Codierungseinheit erstreckende und Restriktionsenzymbereiche aufweisende PCR-Primer 3 dGGAATTCCATATGGACGATCTGAAGCTCTCC (Sequenz-ID Nr. 5) wurde zusammen mit dem Restriktionsbereiche aufweisenden und sich auf die Schlusscodierungseinheit (Codierungseinheit 562 von Sequenz-ID Nr. 1) erstreckenden PCR-Primer 4 dGGGGTACCAAGCTTCACTCCTTGGCGGAGAG verwendet. Dem OCR-Primer 5 dGGAATTCCATATGCTGGAGAGGCTTGAGTTT (Sequenz-ID Nr. 7), der zusammen mit dem oben genannten Primer 4 verwendet wurde, wurden eine Methionin enthaltene Startcodierungseinheit und Sequenzen zur Erkennung der Restriktionsbereiche hinzugefügt. PCR wurde unter Verwendung der oben genannten Primerpaare sowie von Plasmid pWB253Y als Matrize durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe der Restriktionsenzyme NdeI und KpnI verdaut und mit dem NdeI/KpnI-verdauten Vektor pRE2 (Reddi et al. 17 Nucleic Acids Research 14, 473–10, 488, 1989) zur Herstellung des FY1-Polymerase codierenden pRE236Y-Plasmids beziehungsweise des FY2-Polymerase codierenden pRE273Y-Plasmids verbunden. Zellen des E. coli-Stammes DH+ wurden für die primäre Transformation bei dieser sowie bei allen darauffolgenden pRE2-Konstruktionen und Stamm M5248 (c1857) wurde für die Proteinexpression verwendet, obwohl jedes vergleichbare Paar von E. coli-Stämmen, die Träger der cl+ und cl857-Allelen sind, für diesen Zweck verwendet werden können. Alternativ kann jeder rec+ck+-Stamm durch entsprechende chemische Substanzen wie Nalidixinsäure zur Produktion der Polymerase angeregt werden. Die Sequenzen beider Gene wurden überprüft. Es stellte sich heraus, dass pRE273Y im Gegensatz zu pRE253Y oder pRE273Y ein einziges Polypeptidband auf SDS-Polyacrylamidgels erzeugt.
Primer 6 dGGAATTCCATATGCTGGAACGTCTGGAGTTTGGCAGCCTC CTC (Sequenz-ID Nr. 8) und Primer 4 wurden zur Erzeugung eines PCR-Produktes verwendet, welches stumme Veränderungen in die Verwendung der Codierungseinheiten durch FY2 einbringt. Das Produkt wurde mit NdeI/BamHI verdaut und an ein pRE2-Konstrukt angefügt, welches das dritte Ende von FY2 enthält; dadurch entstand pREFY2pref, welches die FY2-Polymerase codiert. Primer 7 dGGAATTCCATATGGCTCTGGAACGTCTGGAGTTTGGCAGCCTCCTC (Sequenz-ID Nr. 9) und Primer 4 wurden zur Erzeugung eines PCR-Produktes verwendet, durch das eine zusätzliche Alanin enthaltende Codierungseinheit eingebracht wird, wie sie für gewöhnlich an der zweiten Position bei hoch expressiven Genen vorkommt. Das mit NdeI/BamHI verdaute Fragment wurde wie oben beschrieben zur Erzeugung von pREFY3 verwendet, welches die FY3-DNA-Polymerase codiert.
Herstellung von FY4-DNA-Polymerase
Bakterienstämme
E. coli-Stämme: DH+ [gyrA96, recAI,, relAI, endAI, thi-1, hsdR17, supE44, +]; M5248 [(bio275, cl857,clll+, N+, (H1))]
PCR
Mit Hilfe der Standardverfahren wurde genomische DNA aus Thermus thermophilus gewonnen. Das DNA-Polymerase-Gen befindet sich bei Thermus thermophilus bekanntermaßen auf einem 3 kilobase A1wN1-Fragment. Zur Anreicherung der Ausbeute an Polymerase-Sequenzen in bestimmten PCR-Reaktionen wurde die genomische DNA vor der PCR mit A1wN1 verdaut und Fragmente von etwa 3 kb wurden mittels Agargel-Elektrophorese für die Verwendung als DNA-Matrize ausgewählt. Die Reaktionsbedingungen lauteten folgendermaßen: 10 mM Tris pH 8,3; 50 mM KCl, 800 M dNTPs, 0,001% Gelatine, 10 M von jedem Primer, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 U Tth, 0,025 U DeepVent (New England Biolabs) pro 100 l Reaktionsgemisch. Die Zyklusbedingungen lauteten 94C 2 min, dann 35 Zyklen 94C 30s, 55C 30s, 72C 3 min, gefolgt von 72C über 7 min.
In vitro-Mutagenese
Die Verdauung der Restriktionsenzyme, die Vorbereitung der Plasmide und andere in vitro-Manipulationen der DNA wurden gemäß den Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., 1989). Das Plasmid pMR1 wurde für die Codierung einer exonukleasefreien Polymerase konstruiert, mit für die für die Expression in E. coli optimierten Codierungseinheiten am 5. Ende (Sequenz-ID Nr. 10). Primer 8 (Sequenz-ID Nr. 10) (GGAATTCCATATGCTGGAACGTCTGGAATTCGGCAGCCTC) wurde in Verbindung mit Primer 9 (Sequenz-ID Nr. 11) (GGGGTACCCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTC) zur Herstellung eines PCR-Produktes aus genomischer Tth-DNA verwendet, welches mittels der Restriktionsenzyme NdeI und KpnI verdaut und in das mit den gleichen Enzymen verdaute Plasmid pRE2 (Reddi et al., 1989, Nucleic Acids Research 17, 10473–10488) eingesetzt wurde.
Zur Erzielung der gewünschten F396Y-Mutation wurden zwei PCR-Produkte aus chromosomaler Tth-DNA hergestellt. Der oben erwähnte Primer 8 wurde in Verbindung mit Primer 10 (Sequenz-ID Nr. 12) (GGGATGGCTAGCTCCTGGGAGAGCCTATGGGCGGACAT GCCGTAGAGGACGCCG TAGTTCACCA) zur Erzeugung eines Teils des Gens verwendet, das den F/Y-Aminosäurenaustausch sowie eine stumme Veränderung zur Erzeugung eines NheI-Restriktionsbereiches enthält. Primer 11 (Sequenz-ID Nr. 13) (CTAGCTAGCCATCCCCTA CGAAGAAGCGGTGGCCT) wurde in Verbindung mit dem oben beschriebenen Primer 9 zur Erzeugung eines Teils des Gens aus dem eingebrachten NheI-Bereich an der Stopp-Codierungseinheit am 3. Ende der Codierungseinheit verwenden. Das PCR-Produkt aus Primer 8 und 10 wurde mit NdeI und NheI verdaut und das PCR-Produkt aus Primer 9 und 11 wurde mit NheI und KpnI verdaut. Diese wurden in den Expressionsvektor pRE2 eingebracht, der wiederum mit NdeI und KpnI verdaut wurde, um das Plasmid pMR5 zu erzeugen. Bei pMR5 wurde festgestellt, dass dieses Plasmid zusätzlich zu den erwünschten Veränderungen auch eine von der PCR verursachte störende Veränderung enthielt, welche zu einer Aminosäuresubstitution K234R führte. Zur Eliminierung dieser Substitution wurde Plasmid pMR8 hergestellt, welches das AfllI/BamHI-Fragment von PMRS durch das entsprechende Fragment aus pMRI ersetzt. Eine Darstellung der mit Plasmid pMR8 codierten FY4-Polymerase (Sequenz-ID Nr. 14) findet sich in 5.
Bei dieser sowie bei allen darauffolgenden pRE2-Konstruktionen wurden für die primäre Konstruktion Zellen des E. coli-Stammes DH+ und für die Proteinexpression Stamm M5248 (c1857) verwendet, obwohl jedes vergleichbare Paar von E. coli-Stämmen, die Träger der c1+ und c1857-Allelen sind, für diesen Zweck verwendet werden können. Alternativ kann jeder rec+cl+-Stamm durch entsprechende chemische Substanzen wie Nalidixinsäure zur Produktion der Polymerase angeregt werden.
Proteinsequenzierung
Die Bestimmung der aminoterminalen Proteinsequenzen wurde im Biotechnischen Labor der W. M. Keck Foundation, New Haven, Connecticut, durchgeführt.
Reinigung der Polymerasen
Eine 1-Liter-Kultur 2X LB (2% Bactotrypton, 1% Bacto Yeast-Extrakt, 0,5% MaCl) + Casamino-Säuren + 20 mM KPO₄ pH 7,5 + 50 g/ml Ampicillin wurde mit einer Glycerolbrühe des entsprechenden Zellenstammes geimpft und bei 30C unter Rühren zum Wachsen gebracht, bis sich die Zellen in der langen Phase befanden (0,7–1,0 OD₅₉₀). 9 Liter 2X LB + 0,2% Casamino-Säuren + 20 mM KPO4 pH 7,5 + 0,05 Mazu Anti Foam wurden mit einem Liter der sich in der langen Phase befindlichen Zellen in 10 Liter Microferm-Fermentierer (New Brunswick Scientific Co.) geimpft. Dann wurden die Zellen bei 30C unter 15 psi Druck und einer Rührgeschwindigkeit von 350–450 Umdrehungen/ Minute sowie einer Luftstromgeschwindigkeit von 14.000 cc/Minute zum Wachsen gebracht. Nachdem OD₅₉₀ 1,5–2,0 erreicht hatte erfolgte eine Anregung der Kulturen durch eine Erhöhung der Temperatur auf 40–42C für 90–120 Minuten. Danach wurden die Kulturen auf eine Temperatur unter 20C abgekühlt und die Zellen durch Zentrifugierung in einer Sorvall RC-3B-Zentrifuge bei einer Drehgeschwindigkeit von 5000 Umdrehungen/Minute sowie einer Temperatur von 4C 15–20 Minuten lang geerntet. Die geernteten Zellen wurden bei einer Temperatur von –80C gelagert.
Die gefrorenen Zellen wurden in kleine Teile aufgespalten und in vorgewärmtem (90–95C) Lösungspuffer (20 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Tween 20, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM PMSF) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden dann schnell auf 80C erhitzt und bei 80C 20 Minuten lang unter ständigem Rühren inkubiert. Danach wurde die Suspension schnell auf Eis gekühlt. Die Zellrückstände wurden mittels Zentrifugierung unter Verwendung einer Sorvall GSA-Zentrifuge bei einer Geschwindigkeit von 10.000 Umdrehungen/Minute 20 Minuten lang bei einer Temperatur von 4C entfernt. Die NaCl-Konzentration der Aufschwemmung wurde auf 300 mM angepasst. Danach wurde die Probeflüssigkeit über eine Diethylaminoethylzellulose-Säule (Whatman DE-52) geführt, die zuvor mit Puffer A (20 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 20, 0,1% Nonidet P-40, 300 mM NaCl, 10% Glycerol, 1 mM DTT) ins Gleichgewicht gebracht worden war und die Polymerase wurde im Durchfluss aufgefangen. Dann wurde die Probeflüssigkeit zu einer NaCl-Konzentration von 100 mM aufgelöst und über eine Heparin-Sepharose-Säule geführt. Die Auslösung der DNA-Polymerase aus der Säule erfolgte mit Hilfe eines NaCl-Gradienten (100–500 mM NaCl). Danach wurde die Probeflüssigkeit einer Dialyse gegen Puffer B (20 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 20, 0,1% Nonidet P-40, 10 mM KCl, 10% Glycerol, 1 mM DTT) unterzogen und entsprechend den Bedürfnissen weiter verdünnt, um die Leitfähigkeit der Probeflüssigkeit auf die Leitfähigkeit von Puffer B herabzusenken. Dann wurde die Probeflüssigkeit über eine Diethylaminoethylsäule (Waters DEAE 15 HR) geführt und mit einem 10–500 mM KCl-Gradienten eluiert. Danach wurde die Polymerase mit der gleichen Menge Endpuffer (20 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P-40, 100 mM KCl, 50% Glycerol, 1 mM DTT) aufgelöst und einer Dialyse gegen den Endpuffer unterzogen.
Versuch zur Exonukleaseaktivität
Für den Versuch zur Exonukleaseaktivität wurden 5 ul (25–150 Einheiten) DNA-Polymerase mit 5 ug eines markierten [³H]-pBR322 PRC-Fragments (1,6 × 10⁴ cpm/ug DNA) in 100 ul eines Reaktionspuffers aus 20 mM tris HCl PH 8,5, 5 mM MgCL₂, 10 mM KCl eine Stunde lang bei 60C inkubiert. Nach diesem Zeitintervall wurde die Versuchsflüssigkeit mit 200 ul eines 1 : 1-Gemisches aus DNA aus Lachsspermien mit 2 mM EDTA und 20% TCA mit 2% Natriumpyrophosphat versetzt. Die Versuchsflüssigkeit wurde für 10 Minuten auf Eis gestellt und dann mit 12,000 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Quantifizierung der säurelöslichen Radioaktivität in 200 ul der Flüssigkeit erfolgte mit Hilfe der Flüssigkeitsszintillationszählung. Eine Einheit Exonukleaseaktivität wurde definiert als die Menge des Enzyms, die als Katalysator für insgesamt 10 nmol Nukleotid bei 30 min. und 60C wirkte.
Nutzen bei der DNA-Sequenzierung
Beispiel 1: DNA-Sequenzierung mit FY-Polymerasen (z. B. FY2 und FY3)
Die folgenden Bestandteile wurden in ein Mikrozentrifugen-Reagenzglas (0,5 ml) gegeben: 0,4 pmol M13-DNA (z. B. M13mp18, 1,0 g); 2 l Reaktionspuffer (260 mM Tris-HCl, pH 9,5 65 mM MgCL₂), 2 l Markierungsnukleotidgemisch (jeweils 1,5 M dGTP, dCTP und dTTP); 0,5 l (5 Cl) [a^–33P]dATP (etwa 2000 Cl/mmol); 1 1–40 Primer (0,5 M; 0,5 pmol/l 5'GTTTTCCCAGTCACGAC-3'); 2 l einer Mischung aus 4 U/l FY-Polymerase und 6,6 U/ml inorganischer Thermoplasma acidophilum-Pyrophosphatase (32 U/l Polymerase und 53 U/ml Pyrophosphatase in 20 mMTris (pH 8,5), 100 mM KCl; 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5% TWEEN-20 und 50% Glycerol, 8fach verdünnt in Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, l mM 2-Mercaptoethanol, 0,5% TWEEN-20, 0,5% NP-40)) sowie Wasser im Gesamtvolumen von 17,5 l. Diese Bestandteile (die Markierungsreaktionslösung) wurden miteinander vermischt und das Reagenzglas wurde für 5 Minuten in ein Wasserbad mit einer konstanten Temperatur von 45C gestellt.
Vier Reagenzgläser wurden mit den Buchstaben A, C, G und T beschriftet und mit 41 des entsprechenden Kettenabbruchgemisches gefüllt: ddA-Kettenabbruchgemisch [jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1,5 M ddATP); ddT-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1,5 M ddTTP); ddC-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1m5 M ddCTP); ddG-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1,5 M ddGTP).
Die Markierungsreaktion wurde gleichmäßig zwischen den vier Reagenzgläsern mit der Kettenabbruchssubstanz verteilt (4 l auf jedes Reagenzglas) und fest verschlossen.
Die vier Reagenzgläser wurden für 5 Minuten in ein Wasserbad mit einer konstanten Temperatur von 72C gestellt. Dann wurden 41 einer Stopplösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromophenolblau, 0,05% Xylencyanol FF) zu jedem Reagenzglas hinzu gegeben und die Reagenzgläser vor Auftragen des Inhalts auf ein Sequenzierungsgel (8% Acrylamid, 8,3 M Urea) kurz auf 70–80C erhitzt. Für die Autoradiogramme war eine Belichtungszeit von 18–36 Stunden auf Kodak XAR-5-Film oder Amersham Hyperfilm MP erforderlich. Die Ergebnisse des Sequenzierungsvorganges stellten sich als hochwertig mit einheitlichen Bandintensitäten dar. Die Bandintensitäten waren erheblich einheitlicher als die von ähnlichen Protokollen unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase oder Taq DNA-Polymerase.
Beispiel 2: Zyklische DNA-Sequenzierung mit FY-Polymerasen
Die folgenden Bestandteile wurde in ein für die Verwendung in einem Thermozykler (z. B. DNA-Thermozykler der Firma Perkin-Elmer) geeignetes Zentrifugen-Reagenzglas gegeben: 0,05 pmol oder mehr M13-DNA (z. B. M13mp 18, 0,1 g) oder 0,1 g doppelsträngige Plasmid-DNA (z. B. pUC19); 2 l Reaktionspuffer (260 mM Tris-HCl, pH 9,5 65 mM MgCl₂); 1 l 3,0 M dGTP; 1 l 3,0 M dTTP; 0,5 l (5 Cl) [–33P] dATP (etwa 2000 Ci/mmol); 1 1–40 Primer (0,5 M; 0,5 pmol/l 5'GTTTTCCCAGTCACGAC-3'); 21 aus einer Mischung, die 4 U/l FY-Polymerase und 6,6 U/ml anorganische Pyrophosphatase von Thermoplasma acidophilum (32 U/l Polymerase und 53 U/ml Pyrophosphatase in 20 mM Tris (pH 8,5), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5% TWEEN-20 und 50% Glycerol, 8fach verdünnt in einem Verdünnungspuffer (10 mM Tris-Hcl pH 8,0, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 TWEEN-20, 0,5% NP-40)) und Wasser in einem Gesamtvolumen von 17,5 1 enthielt.
Diese Bestandteile (Markierungsreaktionsmischung) wurden miteinander vermischt und mit 10 1 leichtem Mineralöl (Amersham) überzogen. Das Reagenzglas wurde in den Thermozykler gegeben und 30–100 Zyklen (mehr als 60 Zyklen sind nicht notwendig) von 45C für 1 Minute bis 95C für 0,5 Minuten gefahren. (Die Temperaturzyklen können nach Wunsch von 55 bis 95C gefahren werden.) Bei beträchtlich höheren bzw. niedrigeren Schmelztemperaturen des Primers können die Temperaturen entsprechend angepasst werden; in der Regel vertragen sich diese Temperaturen jedoch gut mit allen Primer-Matrizen-Kombinationen. Dieser Schritt kann in etwa 3 Minuten pro Zyklus abgeschlossen werden.
Vier Reagenzgläser wurden mit den Buchstaben A, C, G und T beschriftet und mit 41 des entsprechenden Kettenabbruchgemisches gefüllt: ddA-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1,5 M ddATP); ddT-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1,5 M ddTTP); ddC-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1m5 M ddCTP); ddG-Kettenabbruchgemisch (jeweils 150 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1,5 M ddGTP). Den Reagenzgläsern mit der Kettenabbruchmischung wird kein weiteres Enzym zugeführt. Das durch den vorausgegangenen Schritt (die Markierung) eingebrachte Enzym reicht aus.
Die Reaktionsmischung für die zyklische Kennzeichnungsreaktion wurde gleichmäßig zwischen den vier Reagenzgläsern mit der Kettenabbruchmischung verteilt (4 l auf jedes Reagenzglas) und dann mit 10 l leichtem Mineralöl überzogen.
Die vier Reagenzgläser wurden in den Thermozykler gegeben und 30– 200 Zyklen (mehr als 60 Zyklen sind nicht erforderlich) von 95C für 15 Sekunden, 55C für 30 Sekunden und 72C für 120 Sekunden gefahren. Aus praktischen Gründen wurde dieser Schritt über Nacht durchgeführt; andere Zeiten und Temperaturen sind aber ebenfalls geeignet.
Sechs 1 der Reaktionsflüssigkeit wurden (unter Vermeidung von Öl) entfernt, 31 Stopplösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromophenolblau, 0,05% Xylencyanol FF) hinzugefügt und die Mischung unmittelbar vor dem Auftragen auf ein Sequenzierungsgel kurz auf 70–80C erhitzt. Die Autoradiogramme erforderten eine Belichtungszeit von 18–36 Stunden auf Kodak XAR-5-Film oder Amersham Hyperfilm MP. Das Ergebnis des Sequenzierungsvorganges stellte sich als hochwertig mit einheitlichen Bandintensitäten dar. Die Bandintensitäten waren erheblich einheitlicher als die von ähnlichen Protokollen unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase oder Taq DNA-Polymerase.
Beispiel 3: Sequenzierung mit Hilfe von dGTP-Analogen zur Eliminierung vom Kompressionsartefakten
Für jede der beiden in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Sequenzierungsmethoden kann als Ersatz Für dGTP in den Markierungs- und Kettenabbruchgemischen 7-Deaza-2'deoxy-GTP in exakt der gleichen Konzentration wie dGTP verwendet werden. Diese Ersetzung führt zu einer erheblichen Reduzierung des Aufkommens von sekundären Strukturen auf den Gels. Ebenso kann 2'-Deoxyinosinetriphosphat als Ersatz für dGTP verwendet werden; die Konzentration muss jedoch 10 Mal so hoch sein wie die entsprechende Konzentration an dGTP. Die Ersetzung von dITP durch dGTP ist sogar noch effektiver bei der Eliminierung von Kompressionsartefakten als 7-deaza-dGTP.
Beispiel 4: Andere Seauenzierungsmethoden unter Verwendung von FY-Polymerasen
FY-Polymerasen wurden für die Verwendung bei vielen anderen Arten von Sequenzierungsmethoden angepasst, einschließlich der Verwendung von fluoreszierenden Primern und Fluoreszenz-Dideoxy-Abbruchsubstanzen für die Sequenzierung mit Hilfe des ABI 373A-DNA-Sequenzierungsinstruments.
Beispiel 5: SDS-Polyacrylamidgel-Phorese
Proteinproben wurden auf einem 14 × 16 mm 7,5 oder 10% Acrylamidgel ausgebreitet. (Bei den Gels handelte es sich vorwiegend um 10% Polyacrylamidgels auf einem 14 × 16 mm Hoefer-Apparat. Andere Größen, Apparaturen und Prozentwerte bei den Gelen sind ebenfalls akzeptabel. Ähnliche Ergebnisse können bei der Verwendung eines Pharmacia Phast-Gelsystems mit SDS 8–25%-Gradientengels erzielt werden. Verwendet wurden Reagenzien in Reagensreinheit sowie ultrareine Reagentien.) Das Schichtungsgel besteht bestand aus 4% Acrylamid (30 : 0,8, Acrylamid : Bisacrylamid), 125 mM Tris-HCl ph 6,8 und 0,1% Natriumdodecylsulfat. Das Lösungsgel bestand aus 7,5 oder 10%igem Acrylamid (30 : 0,8, Acrylamid : Bisacrylamid), 375 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,1 Natriumdodecylsulfat. Der Laufpuffer bestand aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin uns 0,1% Natriumdodecylsulfat. Der 1 X Probenpuffer bestand aus 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 025% Natriumdodecylsulfat, 10% Glycerol, 0,1 M Dithiothreitol, 0,1% Bromophenolblau und 1 mM EDTA. Jeder Probe wurde ein 1/ 4-Volumen des 5X Probenpuffers hinzugefügt. Die Proben wurden vor dem Aufbringen auf das Gel etwa fünf Minuten in dem Probenpuffer auf 90–1000 erhitzt. Eine 1,5 mm dicke Gelschicht wurde für 1 bis 3 Stunden konstant mit 50–100 mA unter Strom gesetzt (bis sich das Bromophenolblau nah an der Unterseite der Gelschicht befand. Das Gel wurde mit 0,025% Coomassie-Blau R250 in 50% Methanol, 10% Essigsäure eingefärbt und in einer Lösung von 5% Methanol und 7% Essigsäure wieder entfärbt. Abbildungen von dem Gel wurden durch Fotografieren des Gels, durch Trocknen des Gels zwischen Zellulosefilmblättern oder durch Trocknen des Gels auf Filterpapier unter Vakuumbedingungen angefertigt.
Andere Ausgestaltungen sind in den folgenden Ansprüchen enthalten.
AUFLISTUNG DER SEQUENZEN

Claims

Enzymatisch aktive thermostabile DNA-Polymerase mit zwischen 540 und 582 Aminosäuren, der im Vergleich zur Taq DNA-Polymerase N-terminale Aminosäuren fehlen, und die ein Tyrosin anstelle eines Phenylalanins in der Position äquivalent zur Position 667 der Taq DNA-Polymerase besitzt, wobei der Polymerase die 5' zu 3' Exonucleaseaktivität fehlt, und wobei die Polymerase mindestens 95% Identität mit der Aminosäuresequenz zu der DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, Thermus flavus oder Thermus thermophilus besitzt, und wobei die Polymerase eine einzelne Polypeptidbande auf einem SDS-Polyacrylamidgel bildet.
Polymerase nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der Polymerase weniger als 3 konservative Aminosäureaustausche, im Vergleich zu einer DNA-Polymerase der genannten Thermus Species, besitzt.
Polymerase nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der Polymerase weniger als 3 zusätzliche Aminosäuren, im Vergleich zu einer der DNA-Polymerasen der genannten Thermus Species, an deren N-Terminus besitzt.
Polymerase nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Seq Id No 1, Seq Id No 2 oder Seq Id No 14.
Gereinigte Nukleinsäure, welche für die DNA-Polymerase nach irgendeinem der Ansprüche 1–4 kodiert.
Verfahren zur Sequenzierung von DNA, umfassend den Schritt der Bildung von Kettenabbruch-Fragmenten des zu sequenzierenden DNA-Templates mittels einer DNA-Polymerase nach irgendeinem der Ansprüche 1–4, in Gegenwart mindestens eines Kettenabbruchmittels und einem oder mehreren Nucleotidtriphosphaten und Bestimmen der Sequenz der DNA aufgrund der Größen der Fragmente.
Kit für die Sequenzierung von DNA, umfassend eine DNA-Polymerase nach irgendeinem der Ansprüche 1–4, sowie eine Pyrophophatase.
Kit nach Anspruch 7, wobei die Pyrophophatase thermostabil ist.
Apparatur zur DNA-Sequenzierung mit einem Reaktor, umfassend eine DNA-Polymerase nach irgendeinem der Ansprüche 1–4 und einen Bandenseparator.