JP2002543795A

JP2002543795A - 核酸合成の感度および特異性の増大のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2002543795A
Application number: JP2000616377A
Authority: JP
Inventors: メクビブアスタッケ，; デブケイ．チャッタージー，; ハリニシャンディリア，
Original assignee: インビトロゲン・コーポレーション
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2002-12-24
Also published as: US20070178489A1; AU5008900A; EP1175501A4; WO2000068411A9; EP1175501A1; WO2000068411A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸分子の合成を増強するためのポリペプチド、組成物および方法に関する。好ましい局面において、本発明は、核酸の合成、配列決定または増幅の阻害もしくは制御に関する。詳細には、本発明は、このような合成の増強における使用のための、二本鎖および／または一本鎖核酸分子、ならびに／あるいは一本鎖／二本鎖核酸分子複合体（例えば、プライマー／テンプレート複合体、二本鎖テンプレート、一本鎖テンプレートまたは一本鎖プライマー）に対する親和性を有するポリペプチドを開示し、より詳細には、ポリメラーゼ活性が減少され、そして必要に応じてエキソヌクレアーゼ活性（３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）が減少されたポリメラーゼ、およびヌクレアーゼ活性が減少されたヌクレアーゼを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、例えば、周囲温度で生じ得る非特異的な核酸合成を減少することに
よって、核酸合成の感度および特異性を増加するための方法に関する。本発明は
また、本発明の方法を実行するための組成物およびポリペプチドに関する。本発
明の方法および組成物は、配列決定、増幅反応、核酸合成およびｃＤＮＡ合成に
おいて使用され得る。

【０００２】本発明はまた、例えば、１つ以上の二本鎖核酸分子および／または一本鎖核酸
分子および／または二本鎖／一本鎖複合体を結合することによって、核酸合成、
配列決定、増幅およびｃＤＮＡ合成を阻害または阻止し得るポリペプチドおよび
組成物に関する。従って、本発明は、このような反応において使用される核酸基
質（例えば、プライマー、テンプレートおよびプライマー／テンプレート複合体
）と結合するかまたは相互作用することによって、核酸合成、配列決定、増幅お
よびｃＤＮＡ合成反応を阻害または阻止し得る。本発明はまた、このような分子
と結合または相互作用することによって、核酸分子（好ましくは、一本鎖分子ま
たは一本鎖含有分子）の分解を阻害または阻止し得るポリペプチドおよび組成物
に関する。このような相互作用は、好ましくは、ヌクレアーゼ、特にエキソヌク
レアーゼそして詳細には一本鎖特異的エキソヌクレアーゼでの核酸分子の分解を
阻止または阻害する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸分
子、ならびにそのような核酸分子を含むベクターおよび宿主に関する。本発明は
また、本発明の組成物またはポリペプチドを含むキットに関する。

【０００３】（発明の背景）ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートの全てまたは一部に相補的なＤＮ
Ａ分子の形成を合成する。プライマーの一本鎖ＤＮＡテンプレートへのハイブリ
ダイゼーション時において、ポリメラーゼは、成長する鎖の３’ヒドロキシル基
にヌクレオチドを連続的に付加して、５’→３’の方向にＤＮＡを合成する。従
って、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチドおよびプ
ライマーの存在下で、新しいＤＮＡ分子（一本鎖ＤＮＡテンプレートの全てまた
は一部に相補的）が合成され得る。

【０００４】中温性ＤＮＡポリメラーゼと高温性ＤＮＡポリメラーゼの両方を使用して、核
酸の形成を合成する。ＰＣＲまたはサイクル配列決定において、中温性ポリメラ
ーゼよりも耐熱性ポリメラーゼを使用することは、よりストリンジェントではな
い温度（例えば、周囲温度）でミスアニーリングされたプライマー末端の伸長か
ら生じる非特異的なＤＮＡ増幅のレベルの減少のため好ましい。しかし、いくつ
かのプライマー配列および特定の実験的条件下について、有意な量の非特異的な
核酸産物の合成が、耐熱性ポリメラーゼの感度を減少し、それぞれのプライマー
セットについて大規模な最適化を必要とする。さらに、周囲温度において高い活
性レベルを有するポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａｎｅａｐｏｌ
ｉｔａｎａ由来のＤＮＡポリメラーゼ）が使用される場合、この問題は増強され
る。

【０００５】生物、組織、または細胞の構造および生理を試験する際に、その遺伝的内容を
決定することがしばしば望ましい。生物の遺伝的枠組みは、生物の体細胞および
生殖細胞に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド塩基の二本鎖配
列にコードされる。ＤＮＡの特定のセグメントの遺伝的内容、すなわち遺伝子は
、その遺伝子がコードするタンパク質の産生時のみ明かにされる。タンパク質を
産生するために、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖（「コード」鎖）の相補的なコピ
ーを、ポリメラーゼ酵素によって産生し、リボ核酸（ＲＮＡ）の特定の配列を生
じる。この特定の型のＲＮＡは、タンパク質の産生のためにＤＮＡ由来の遺伝的
メッセージを含むので、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。

【０００６】所与の細胞、組織または生物において、それぞれ別々の特定のタンパク質をコ
ードする多くのｍＲＮＡ種が存在する。この事実は、組織または細胞における遺
伝的発現を研究することに興味を持つ研究者にとって強力なツールを提供する。
ｍＲＮＡ分子が単離され得、さらに種々の分子生物学的技術によって操作され、
それによって、細胞、組織または生物の全機能の遺伝的内容の解明が可能になる
。

【０００７】遺伝子発現の研究に対する通常のアプローチは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クロ
ーンの産生である。この技術において、生物由来のｍＲＮＡ分子は、生物の細胞
または組織の抽出物から単離される。この単離は、しばしば、チミジン（Ｔ）の
オリゴマーが複合体化されたクロマトグラフィーマトリックス（例えば、セルロ
ースまたはアガロース）を使用する。大部分の真核生物ｍＲＮＡ分子の３’末端
が、アデノシン（Ａ）塩基のストリングを含み、ＡがＴに結合するので、ｍＲＮ
Ａ分子は、組織または細胞抽出物において他の分子および基質から迅速に精製さ
れ得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡコピーが、酵素、逆転
写酵素（ＲＴ）またはＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して作製され
得、これは、一本鎖ｃＤＮＡ分子の産生を生じる。次いで、一本鎖ｃＤＮＡは、
ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、元のｍＲＮＡ（従って、生物のゲノムに含
まれる、このｍＲＮＡをコードする元の二本鎖ＤＮＡ配列）の完全な二本鎖ＤＮ
Ａコピー（すなわち、二本鎖ｃＤＮＡ）に変換され得る。次いでタンパク質特異
的二本鎖ｃＤＮＡがベクターに挿入され得、次いでこれは、宿主細菌、酵母、動
物細胞または植物細胞に導入され、このプロセスは、形質転換またはトランスフ
ェクションと呼ばれる。次いで、宿主細胞は、培養培地において増殖され、目的
の遺伝子または目的の遺伝子の部分を含む（あるいは多くの場合、これらを発現
する）宿主細胞の集団を生じる。

【０００８】この全体のプロセス（ｍＲＮＡの単離からｃＤＮＡのベクター（例えば、プラ
スミド、ウイルスベクター、コスミドなど）への挿入、単離された遺伝子または
遺伝子の部分を含む宿主細胞集団の増殖）は、「ｃＤＮＡクローニング」と呼ば
れる。ｃＤＮＡが多くの異なるｍＲＮＡから調製される場合、生じるｃＤＮＡの
セットは、「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれ、ｃＤＮＡのセットが、供給源の
細胞、組織、または生物に存在する機能的な遺伝的情報を含む遺伝子または遺伝
子の部分の「集団」を表すので、適切な用語である。

【０００９】ｃＤＮＡ分子の合成は、ｍＲＮＡ分子の３’末端においてまたはその近くで開
始し、成長する鎖にヌクレオチドを連続的に付加して５’→３’方向に進行する
。オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してポリＡテールの３’末端でｃＤＮＡ合成
をプライミングすることによって、このｍＲＮＡの３’メッセージが、産生され
るｃＤＮＡ分子において表されることが確実になる。ｃＤＮＡ合成の間の感度お
よび特異性を増加する能力は、さらに代表的なｃＤＮＡライブラリーを提供し、
全長ｃＤＮＡ分子（例えば、全長遺伝子）を有するｃＤＮＡライブラリーの可能
性を増加し得る。このような進歩は、目的の全長遺伝子を見つけ出す確率を非常
に改善する。

【００１０】従って、核酸分子を合成するためのポリメラーゼおよび逆転写酵素の能力を改
良するための方法が必要である。このような進歩は、核酸合成、配列決定、増幅
およびｃＤＮＡ合成に改良を提供する。

【００１１】（発明の要旨）本発明は、上で議論される必要性を満たす。本発明は、特定の条件下で（好ま
しくは、周囲温度で）核酸合成／分解を阻害するか、減少するか、実質的に減少
するかまたは排除するための方法を提供する。好ましい局面において、本発明は
、反応の設定の間、好ましくは、核酸合成についての最適な反応条件が達成され
る前に、核酸合成およびプライマー分解を阻止または阻害する。最適以下の条件
においてまたは反応の設定の間のＤＮＡポリメラーゼ活性のこのような阻害は、
非特異的な核酸合成を阻止するかまたは減少する。一旦、反応の設定が完了し、
最適な条件が達成されると、核酸合成が開始され得る。

【００１２】さらに詳細には、本発明は、二本鎖核酸分子または二本鎖含有核酸分子（例え
ば、二本鎖／一本鎖複合体）を結合する任意のポリペプチド（好ましくは、減少
したポリメラーゼ活性を有するか、実質的に減少したポリメラーゼ活性を有する
かまたはポリメラーゼ活性を有しないポリペプチド）を導入することによって核
酸合成を制御することに関する。このような二本鎖核酸分子は、一本鎖領域（好
ましくは、一つまたは両方の末端において）を含み得るか、相補的な核酸鎖と塩
基対形成されない配列またはヌクレオチドを含み得るか、完全な二本鎖であり得
る。従って、このようなポリペプチドは、このような二本鎖核酸分子（例えば、
プライマー／テンプレート複合体または二本鎖テンプレートのような二本鎖基質
）と結合または相互作用し得、プライマー／テンプレート複合体のような基質と
活性なポリメラーゼまたは逆転写酵素の結合または相互作用を妨げることによっ
て、核酸合成を妨害し得る。好ましい局面において、本発明のポリペプチドは、
核酸合成に必要なポリメラーゼまたは逆転写酵素（または他の成分）を不活化す
ることなく、このポリペプチドの結合活性を優先的に不活化されるか、実質的に
減少されるか、または排除され得る。１つの局面において、本発明のポリペプチ
ドは、熱（温度変化）、ｐＨまたはイオン強度、または当業者によって決定され
得る他の条件によって不活化され得る。

【００１３】別の局面において、本発明は、核酸（特に、一本鎖核酸または一本鎖含有核酸
）に結合する任意のポリペプチド（好ましくは、減少したヌクレアーゼ活性（特
に、３’エキソヌクレアーゼ活性および／または５’エキソヌクレアーゼ活性の
ようなエキソヌクレアーゼ活性）を有するか、実質的に減少したヌクレアーゼ活
性を有するか、またはヌクレアーゼ活性を有さないポリペプチド）を導入するこ
とによって核酸合成を制御することに関する。従って、このようなポリペプチド
は、核酸分子（例えば、一本鎖プライマーまたは一本鎖テンプレートまたは二本
鎖分子のような核酸合成基質）に結合するか、またはそれらと相互作用し得、例
えば、核酸合成基質（例えば、合成反応においてポリメラーゼもしくは逆転写酵
素によって使用されるプライマー／テンプレート複合体基質を形成するための、
テンプレートとのプライマー）の結合または相互作用またはハイブリダイゼーシ
ョンを阻止することによって核酸合成を妨害し得るかか、あるいは合成基質とポ
リメラーゼまたは逆転写酵素の相互作用を阻止し得る。さらに、本発明のポリペ
プチドと核酸分子、特に一本鎖核酸分子（例えば、プライマーおよびテンプレー
トのような一本鎖分子）との相互作用は、存在し得るヌクレアーゼ（例えば、エ
キソヌクレアーゼ）によってこのような分子が分解されることを妨げる。従って
、本発明のポリペプチドは、核酸合成、増幅、および配列決定反応において使用
される基質の分解を阻止するが、本発明のポリペプチドはまた、このような反応
によって産生される生成物の分解を阻止する。例えば、核酸合成、増幅および配
列決定に使用される多くのポリメラーゼは、一本鎖核酸基質または生成物を分解
し得るエキソヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’およ
び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）を有し、核酸合成反応の効率に不利に影
響する。さらに、合成、増幅、および配列決定において使用される反応混合物は
、添加されたヌクレアーゼ（特定の目的または機能のために反応混合物に添加さ
れ得る）あるいは混入したヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅおよ
びエキソヌクレアーゼ、特に一本鎖エキソヌクレアーゼ）を含み得、これらは、
反応混合物において核酸基質または生成物を分解し得る。本発明のポリペプチド
を含むことによって、核酸合成、増幅、および配列決定の前またはその間または
その後に、核酸分子または基質（特に、一本鎖分子または一本鎖含有分子）の分
解を阻止または阻害することが可能である。

【００１４】本発明のポリペプチドは（「阻害性ポリペプチド」と呼ばれ得る）、好ましく
は、二本鎖核酸分子および／または一本鎖核酸分子および／または一本鎖／二本
鎖核酸複合体のような任意の核酸分子と結合または相互作用し、そして任意のポ
リメラーゼ活性および／またはヌクレアーゼ活性を減少するか、実質的に減少す
るか、または排除するように改変または変異されているか、あるいは天然でほと
んどまたは全くポリメラーゼ活性および／またはヌクレアーゼ活性を有さない、
酵素またはタンパク質を含む。例としては、トランスフェラーゼ、リガーゼ、逆
転写酵素、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、制限酵素、ＤＮＡ修復酵素、組換え
タンパク質、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅ
Ｔ１、ＲＮａｓｅＨなど）、ＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ１、ＤＮａｓｅＡな
ど）、エキソヌクレアーゼ（好ましくは、ｐｏｌＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼ
のイプシロンサブユニット（ε）、ｐｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼの３’→５
’および５’→３’エキソヌクレアーゼ、ファミリー（Ｆａｍｉｌｙ）Ａ型ＤＮ
Ａポリメラーゼの３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼ、ファミリー
Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ、ファミリーＣ型ＤＮ
Ａポリメラーゼの３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼサブユニット
のような一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ）、ならびにポリメラーゼ（好ましく
は、中温性ポリメラーゼ）が挙げられる。好ましい例としては、減少したポリメ
ラーゼ活性を有するか、実質的に減少したポリメラーゼ活性を有するか、または
ポリメラーゼ活性を有さず、そして必要に応じて減少したエキソヌクレアーゼ活
性を有するか、実質的に減少したエキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはエ
キソヌクレアーゼ活性を有さない、二本鎖核酸結合活性を有する任意の野生型ま
たは変異体ポリメラーゼまたは逆転写酵素が挙げられる。好ましい例としてはま
た、実質的に減少したエキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはエキソヌクレ
アーゼ活性を有さない、核酸（二本鎖、好ましくは、一本鎖）結合活性を有する
、野生型または変異体エキソヌクレアーゼ（またはＤＮＡポリメラーゼに見出さ
れる３’エキソヌクレアーゼおよび／または５’エキソヌクレアーゼのようなエ
キソヌクレアーゼ活性を有する他の酵素）が挙げられる。

【００１５】好ましい局面において、本発明のポリペプチドは、エキソヌクレアーゼ活性お
よびポリメラーゼ活性を減少するか、実質的に減少するかまたは排除するように
改変または変異されているか、あるいは天然でエキソヌクレアーゼ活性およびポ
リメラーゼ活性をほとんどまたは全く有さない。従って、好ましい局面において
、このポリペプチドは、１つ以上の二本鎖核酸基質および１つ以上の一本鎖核酸
基質を結合し得るが、これらが、ポリメラーゼ活性をほとんどまたは全く有さず
、エキソヌクレアーゼ活性（例えば、３’→５’および／または５’→３’エキ
ソヌクレアーゼ活性）をほとんどまたは全く有さないので、テンプレートの全て
または一部に相補的な核酸分子の合成がほとんどまたは全く生じない。さらに、
反応混合物中の核酸分子の分解がほとんどまたは全く生じない。従って、このポ
リペプチドは、好ましくは、反応混合物に導入され、ここで、これは、基質（例
えば、プライマー／テンプレート複合体、二本鎖分子および／または一本鎖分子
（例えば、一本鎖プライマーおよび一本鎖テンプレート）と競合的に結合または
相互作用し、それによって、特定の反応条件下でポリメラーゼまたは逆転写酵素
活性を有する１つ以上の酵素の存在下で核酸合成を阻害する。本発明のポリペプ
チドはまた、合成された生成物および／または反応混合物の基質と相互作用する
かまたは結合する能力を有し、それによって、反応混合物中に存在し得るヌクレ
アーゼによる生成物または基質の分解を妨げる。

【００１６】別の局面において、本発明のポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性が減少されて
いるか、実質的に減少されているか、または排除されている、改変または変異さ
れたヌクレアーゼである。本発明のこの局面において、好ましいヌクレアーゼ（
好ましくは、不耐熱性または中温性のヌクレアーゼ）は、エキソヌクレアーゼ、
特に一本鎖特異的エキソヌクレアーゼである。このようなヌクレアーゼは、天然
では核酸と相互作用するかまたは結合し、そして改変および変異は、好ましくは
、ヌクレアーゼの核酸に結合する能力に対してほとんどまたは全く不利な影響を
有するべきではない（しかし、改変または変異は、このような結合／相互作用活
性を高めるために組み込まれ得る）。従って、好ましい局面において、好ましい
一本鎖特異的エキソヌクレアーゼである１つ以上のエキソヌクレアーゼが改変ま
たは変異され、従って１つ以上の核酸基質を結合し得るが、これらは、エキソヌ
クレアーゼ活性をほとんどまたは全く有さないので、このような基質（例えば、
一本鎖テンプレートおよび一本鎖プライマー）を用いる合成を阻止し得る。この
ような合成は、例えば、核酸と活性なポリメラーゼ／逆転写酵素との相互作用を
妨げることによって、そして／または核酸分子の相互作用（例えば、プライマー
／テンプレート複合体を形成するためのハイブリダイゼーション）を妨げること
によって阻止される。このようなポリペプチドはまた、反応において核酸分子の
分解を阻止する。なぜなら、このようなポリペプチドは、このような分子に結合
し、好ましくは、このような分子を他のヌクレアーゼの作用に対して接近不可能
するからである。従って、このようなポリペプチドは、好ましくは、反応混合物
に導入され、ここで、このようなポリペプチドは、このような核酸分子と競合的
に結合するかまたは相互作用し、それによって、ポリメラーゼおよび／またはヌ
クレアーゼ活性を有する１つ以上の酵素の存在下で核酸合成および核酸分解を阻
害する。

【００１７】別の局面において、本発明のポリペプチドは、ポリメラーゼ活性が減少されて
いるか、実質的に減少されているか、または排除されている、改変または変異さ
れたポリメラーゼである。この局面における好ましいポリメラーゼは、ＤＮＡポ
リメラーゼおよび逆転写酵素、特に不耐熱性または中温性のＤＮＡポリメラーゼ
および逆転写酵素である。このようなポリメラーゼは、天然では核酸（好ましく
は、１つ以上の一本鎖領域を、好ましくは一方または両方の末端に有する二本鎖
分子のような核酸合成に使用される核酸基質、例えば、プライマー／テンプレー
ト複合体）と相互作用するかまたはこれと結合し、そして改変および変異は、好
ましくは、このポリメラーゼの核酸に結合する能力に対してほとんどまたは全く
不利な影響を有するべきではない（しかし、改変または変異は、このような結合
／相互作用活性を高めるために組み込まれ得る）。このようなポリペプチドは、
１つ以上の核酸基質を結合し得るが、このようなポリペプチドは、ほとんどまた
は全くポリメラーゼ活性を有さないので、核酸合成に必要なこのような核酸基質
（例えば、プライマー／テンプレート複合体）と結合または相互作用する。従っ
て、このポリペプチドは、反応混合物に好ましくは導入され、ここで、このポリ
ペプチドは、このような基質と競合的に結合または相互作用し、それによって、
ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素の存在下で核酸合成を阻害する。この
ような合成は、例えば、活性なポリメラーゼ／逆転写酵素との核酸の相互作用を
妨げることによって、そして／または核酸分子の相互作用（例えば、プライマー
／テンプレート複合体を形成するためのハイブリダイゼーション）を妨げること
によって阻止される。

【００１８】本発明のポリペプチドによる核酸合成または相互作用／結合の阻害は、好まし
くは、反応条件が変化した場合、例えば、温度が上昇した場合、核酸合成が進行
し得るように、排除されるかまたは減少される。好ましい局面において、この変
化した条件は、二本鎖核酸基質および／または一本鎖核酸基質および／または一
本鎖／二本鎖複合体と相互作用するこのポリペプチドの能力に影響し、基質の放
出および／またはポリペプチドの変性または不活化を引き起こし、この核酸分子
をポリメラーゼ／逆転写酵素活性を有する酵素の対する基質として利用可能にし
、これによって、核酸合成が進行する。

【００１９】従って、本発明は１つ以上の核酸分子を合成するための方法に関し、以下の工
程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸テンプレート（これは、ｃＤＮＡ分子のよ
うなＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子であり得る）を、１つ以
上のプライマー、および１つ以上の本発明のポリペプチドまたは組成物と混合さ
せる工程であって、このポリペプチドまたは組成物は、１つ以上の、二本鎖核酸
基質および／または一本鎖核酸基質および／または一本鎖／二本鎖複合体（例え
ば、テンプレート、テンプレート／プライマー複合体および／またはプライマー
のような核酸合成のための基質）と結合あるいは相互作用し得、ここで、このポ
リペプチドは、ポリメラーゼ活性が、減少されたか、実質的に減少されたか、も
しくはポリメラーゼ活性を有さない、そして／またはヌクレアーゼ活性が、減少
されるか、実質的に減少されるか、またはヌクレアーゼ活性を有さない、工程；
ならびに（ｂ）この混合物を、核酸ポリメラーゼ活性および／またはヌクレアー
ゼ活性を有する１つ以上の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆
転写酵素および／またはヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキ
ソヌクレアーゼ））の存在下、テンプレートの全体または一部に相補的な１つ以
上の第１の核酸分子を合成するに十分な条件でインキュベートする工程。そのよ
うな混合させる工程は、好ましくは、核酸合成を妨げるような条件下および／ま
たは１つ以上の核酸合成基質への本発明のポリペプチドの結合を可能にするよう
な条件下で達成される。好ましい局面において、合成条件は、本発明のポリペプ
チドを不活化または変性させ、このポリペプチドの核酸合成基質への結合を阻害
、減少、実質的に減少または排除するに十分である。そのようなインキュベーシ
ョン条件は、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の核酸合成緩衝液の使用を
含み得る。好ましくは、インキュベーション条件は、本発明のポリペプチドの不
活化および／またはポリペプチドの核酸合成基質への結合の妨害に十分な温度で
あるが、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素または核酸合成反応のための存
在しかつ必要である他の酵素の不活化には不十分な温度で達成される。本発明の
そのようは方法は、必要に応じて、合成された第１の核酸分子の全体または一部
に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するに十分な条件下で、第１の核酸
分子をインキュベートする工程のような、１つ以上のさらなる工程を包含し得る
。そのようなさらなる工程はまた、本明細書中に記載されるような本発明のポリ
ペプチド／組成物の存在下で達成され得る。本発明はまた、本方法によって合成
される核酸分子に関する。

【００２０】より詳細には、本発明は、ＤＮＡ分子を増幅する方法に関し、以下の工程を包
含する：（ａ）第１および第２のプライマー（ここで、第１のプライマーは、こ
のＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端の配列かまたはその近くの配列に相補的であ
り、そして第２のプライマーは、このＤＮＡ分子の第２の鎖の３’末端の配列か
またはその近くの配列に相補的である）を、本発明の１つ以上のポリペプチドま
たは組成物（例えば、二本鎖核酸および／または一本鎖核酸および／または一本
鎖／二本鎖複合体に親和性を有し、そしてポリメラーゼ活性および／またはヌク
レアーゼ活性が、減少されているか、実質的に減少されているか、またはそのよ
うな活性を有さないポリペプチド）と混合させる工程；（ｂ）この第１の鎖に対
してこの第１のプライマーを、そしてこの第２の鎖に対してこの第２のプライマ
ーをハイブリダイズする工程；（ｃ）この第１の鎖の全体または部分に相補的な
第３のＤＮＡ分子およびこの第２の鎖の全体または部分に相補的な第４のＤＮＡ
分子が合成されるような条件下で、この混合物をインキュベートする工程；（ｄ
）この第１と第３の鎖、およびこの第２と第４の鎖を変性させる工程；ならびに
（ｅ）工程（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）を一回以上反復する工程。そのような混
合させる工程は、好ましくは、核酸合成を妨げるような条件下および／または１
つ以上の核酸合成基質への本発明のポリペプチドの結合を可能にするような条件
下で達成される。好ましい局面において、合成条件は、本発明のポリペプチドの
能力を不活化または変性させ、このポリペプチドの核酸合成基質への結合を阻害
、減少、実質的に減少または排除するに十分である。好ましくは、インキュベー
ション条件は、本発明のポリペプチドの不活化および／またはこのポリペプチド
の核酸合成基質への結合の妨害に十分な温度であるが、ポリメラーゼおよび／ま
たは逆転写酵素または核酸合成反応のために存在しかつ必要である他の酵素の不
活化には不十分な温度で達成される。そのようなインキュベーション条件は、１
つ以上のポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチドおよび／または１つ以上の緩衝
化塩の存在下でのインキュベーションを含み得る。本発明はまた、これらの方法
によって増幅される核酸分子に関する。

【００２１】本発明はまた、核酸分子を配列決定するための方法に関し、以下の工程を包含
する（ａ）配列決定される核酸分子を、１つ以上のプライマー、１つ以上の本発
明のポリペプチドまたは組成物、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の終結
因子を混合する工程であって、混合物が形成される、工程；（ｂ）配列決定され
る分子の全体または部分に相補的な分子の集団を合成するに十分な条件下で、こ
の混合物をインキュベートする工程；ならびに（ｃ）この集団を分離する工程で
あって、配列決定される分子の全体または部分のヌクレオチド配列を決定する。
本発明は、より詳細には、核酸分子を配列決定する方法に関し、以下の工程を包
含する：（ａ）本発明のポリペプチドまたは組成物（二本鎖核酸および／または
一本鎖核酸および／または一本鎖／二本鎖複合体に親和性を有し、そしてポリメ
ラーゼ活性および／またはヌクレアーゼ活性が、減少されているか、実質的に減
少されているか、またはそのような活性を有さない）、１つ以上のヌクレオチド
、および１つ以上の終結因子を混合させる工程；（ｂ）第１の核酸分子に対して
プライマーをハイブリダイズする工程；（ｃ）この第１の核酸分子に相補的な核
酸分子のランダムな集団を合成するに十分な条件下で、工程（ｂ）の混合物をイ
ンキュベートする工程であって、ここで、この合成された分子が、第１の分子よ
りもより短い長さであり、そしてここで、この合成された分子がその３’末端に
ターミネーターヌクレオチドを含む；ならびに（ｄ）大きさによってこの合成さ
れた分子を分離する工程であって、その結果、第１の核酸分子のヌクレオチド配
列の少なくとも一部が決定され得る。そのような混合させる工程は、好ましくは
、核酸合成を妨げるような条件下および／または１つ以上の核酸合成基質への本
発明のポリペプチドの結合を可能にするような条件下で達成される。好ましい局
面において、合成条件および／またはハイブリダイゼーション条件は、本発明の
ポリペプチドを不活化または変性させるに十分であり、このポリペプチドの核酸
合成基質への結合を阻害、減少、実質的に減少または排除する。好ましくは、イ
ンキュベーション条件は、本発明のポリペプチドの不活化および／またはポリペ
プチドの核酸合成基質への結合の妨害に十分な温度であるが、ポリメラーゼおよ
び／または逆転写酵素または核酸合成反応のために存在しかつ必要である他の酵
素の不活化には不十分な温度で達成される。このようなターミネーターヌクレオ
チドとしては、ｄｄＮＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰまたはｄｄＣ
ＴＰが挙げられる。そのようなインキュベーション条件は、１つ以上のポリメラ
ーゼおよび／または緩衝化塩の存在下でのインキュベーションを含み得る。

【００２２】本発明はまた、一般的に、核酸分子の分解を妨害または阻害する方法に関する
。好ましくは、そのような方法は、核酸合成、ｃＤＮＡ合成、増幅または配列決
定の間に、反応物または反応混合物中で好ましくは実施される。詳細には、この
方法は以下の工程を包含し得る：（ａ）ヌクレアーゼ活性が、減少されたか、実
質的に減少されたか、またはヌクレアーゼ活性を有さない、改変または変異され
た１つ以上のヌクレアーゼ（好ましくは、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅおよびエキソ
ヌクレアーゼ、そしてより好ましくは一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ）を得る
工程、および（ｂ）ヌクレアーゼ活性を有する１つ以上のヌクレアーゼでのこの
分子の分解を阻害するに十分な条件下で、このヌクレアーゼを１つ以上の核酸分
子と接触させる工程。改変または変異されたヌクレアーゼは、使用される特定の
ヌクレアーゼの特異性に依存して核酸分子と親和性を有し、従って、この核酸分
子と結合または相互作用し得る。従って、本発明のヌクレアーゼが改変され、ヌ
クレアーゼ活性を減少、実質的に減少または排除されているので、これらは、核
酸に結合し得、従って、他のヌクレアーゼのそのような核酸分子との相互作用ま
たは結合を阻害し得る。好ましい局面において、本発明に従って核酸分子を保護
する方法は、インビトロ反応、特に標準的な分子生物学技術において使用される
反応（例えば、核酸合成、増幅、配列決定およびｃＤＮＡ合成）の間に達成され
る。本発明の分解保護方法はさらに、特定の条件下で（例えば、本発明のポリペ
プチドの熱不活化によって）、本発明のポリペプチドを不活化する工程および／
またはこのポリペプチドの核酸分子への結合を阻害する工程を包含し得る。

【００２３】本発明はまた、本発明のポリペプチド、および本発明のポリペプチドを含む組
成物、ならびに本発明のポリペプチドをコードする核酸分子、これらの核酸分子
を含むベクター（これは、発現ベクターであり得る）、およびこれらの核酸分子
またはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、ポリペプチドを生成す
る方法に関し、この方法は、宿主細胞によるこのポリペプチドの生成を好む条件
下で上記の宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチドを単離する工程を
包含する。本発明はまた、このような方法によって生成されるポリペプチドに関
する。

【００２４】本発明はまた、核酸分子の合成、配列決定および増幅における使用のためのキ
ットに関し、このキットは、１つ以上の本発明のポリペプチドまたは組成物を含
む１つ以上の容器を含む。本発明のこれらのキットは、必要に応じて、以下から
なる群より選択される１つ以上のさらなる構成成分を含み得る：１つ以上のヌク
レオチド、１つ以上のテンプレート、１つ以上のポリメラーゼ（例えば、高温性
または中温性ＤＮＡポリメラーゼ）および／または逆転写酵素、１つ以上の適切
な緩衝液、１つ以上のプライマー、１つ以上の終結因子（例えば、１つ以上のジ
デオキシヌクレオチド）、および本発明の方法を実行するための指示書。本発明
はまた、本発明に従って核酸分子の分解を妨害または阻害する一般的な方法にお
ける使用のためのキットに関する。そのようなキットは、本発明の組成物に対す
る１つ以上のポリペプチドを含む、１つ以上の容器を含み得る。これらのキット
は、必要に応じて、以下からなる群より選択される１つ以上のさらなる構成成分
を含み得る：１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のテンプレート、１つ以上のポ
リメラーゼ（例えば、高温性または中温性ＤＮＡポリメラーゼ）および／または
逆転写酵素、１つ以上の適切な緩衝液、１つ以上のプライマー、１つ以上の終結
因子、および本発明の方法を実行するための指示書。

【００２５】本発明はまた、核酸分子の合成、配列決定および増幅における使用のための組
成物、ならびにそのような合成、配列決定および増幅反応を実行するために作製
された組成物に関する。本発明はまた、本発明の合成、配列決定および増幅反応
の実行の間またはその後に作製された組成物に関する。本発明のそのような組成
物は、本発明の１つ以上の阻害ポリペプチドを含み得、そしてさらに、以下から
なる群より選択される１つ以上の構成成分を含み得る：１つ以上のヌクレオチド
、１つ以上のプライマー、１つ以上のテンプレート、１つ以上の逆転写酵素、１
つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の緩衝液、１つ以上の緩衝化塩および本
発明の方法に従って作製された１つ以上の合成核酸分子。本発明はまた、核酸分
子の分解を妨害または阻害する方法における使用のための組成物、およびそのよ
うな方法を実行するために作製された組成物に関する。本発明はまた、核酸分子
の分解に対して保護をするそのような方法を実行する間またはその後に作製され
た組成物に関する。本発明のそのような組成物は、本発明の１つ以上の阻害ポリ
ペプチドを含み得、そしてさらに、以下からなる群より選択される１つ以上の構
成成分を含み得る：１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のプライマー、１つ以上
のテンプレート、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上のポリメラーゼ（ＤＮＡポリ
メラーゼおよび逆転写酵素）、１つ以上の緩衝液、１つ以上の緩衝化塩、および
本発明のこの方法に従って作製された１つ以上の合成核酸分子。

【００２６】本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および発明の詳細な説明ならび
に特許請求の範囲を考慮して、当業者に明らかである。

【００２７】（発明の詳細な説明）（定義）以下の説明において、組換えＤＮＡ技術に使用される多くの用語が、広範に使
用される。明細書および特許請求の範囲（このような用語を与えられる範囲を含
む）に関して、より明確であり一貫した理解を提供するために、以下の定義を提
供する。

【００２８】（プライマー）本明細書中に使用される場合、「プライマー」は、核酸分子の
増幅または重合の間にヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される、一
本鎖オリゴヌクレオチドをいう。

【００２９】（テンプレート）用語「テンプレート」は、本明細書中に使用される場合、増
幅、合成または配列決定される、二本鎖または一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／
またはＤＮＡ）をいう。二本鎖分子の場合、第１の鎖および第２の鎖を形成する
ための鎖の分解は、好ましくは、これらの分子が増幅、合成、または配列決定さ
れ得る前に実施されるか、あるいは、二本鎖分子は、直接テンプレートとして使
用され得る。一本鎖テンプレートに関して、テンプレートの一部に相補的なプラ
イマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いで１つ以上のポリメラーゼ
が、このテンプレートの全体または一部に相補的な核酸分子を合成し得る。ある
いは、二本鎖テンプレートに関して、１つ以上のプロモーター（例えば、ＳＰ６
、Ｔ７またはＴ３プロモーター）は、１つ以上のポリメラーゼと組合せて使用さ
れ、テンプレートの全体または一部に相補的な核酸分子を作製し得る。本発明に
従って新規に合成された分子は、本来のテンプレートに等しい長さかまたはそれ
よりも短い長さであり得る。

【００３０】（組込み）用語「組込み」は、本明細書中に使用される場合、ＤＮＡおよび／
もしくはＲＮＡ分子またはプライマーの部分になることを意味する。

【００３１】（増幅）本明細書中に使用される場合、「増幅」は、ポリメラーゼの使用によ
って、ヌクレオチド配列のコピー数を増加するための任意のインビトロ方法に関
する。核酸増幅は、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ分子またはプライマーへのヌ
クレオチドの組込みを生じ、それによってテンプレートの全体または一部に相補
的な新規分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さら
なる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書中に
使用される場合、１つの増幅反応は、多く回の複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反
応としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１回のＰ
ＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の分解および合成の５〜１００「サイクル」からなり得
る。

【００３２】（ヌクレオチド）本明細書中で使用される場合「ヌクレオチド」は、塩基−糖
−リン酸塩の組み合わせをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮ
Ａ）のモノマーユニットである。用語ヌクレオチドとしては、リボヌクレオシド
三リン酸ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸塩（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、またはそれらの誘導体）が挙げられる。このような誘導体としては、例えば
［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ（ｄｅａｚａ）−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄ
ＡＴＰ、およびヌクレオチド誘導体が挙げられ、それらを含む核酸分子にヌクレ
アーゼ耐性を与える。用語ヌクレオチドはまた、本明細書中で使用される場合、
ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を
いう。ジデオキシヌクレオシド三リン酸塩の例示された例としては、ｄｄＡＴＰ
、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、こ
れらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、非標識であり得る
か、または周知技術によって検出可能に標識され得る。検出可能な標識としては
、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素
標識が挙げられる。

【００３３】（オリゴヌクレオチド）「オリゴヌクレオチド」は、共有結合的に連結された
ヌクレオチド配列を含む合成分子または天然分子をいう。これらのヌクレオチド
は、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの３’位置と、隣接
するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの５’位置との間のリン酸
ジエステル結合によって結合される。

【００３４】（ハイブリダイゼーション）用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブ
リダイズする」は、二本鎖分子を得るための２つの相補的な一本鎖核酸分子（Ｒ
ＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基対形成をいう。本明細書中で使用される場合
、２つの核酸分子はハイブリダイズされ得るが、塩基対形成は、完全に相補的で
はない。従って、ミスマッチの塩基は、２つの核酸分子のハイブリダイゼーショ
ンを妨げない。ただし、当該分野で周知の適切な条件が使用される。

【００３５】（ユニット）用語「ユニット」は、本明細書中で使用される場合、酵素の活性
をいう。例えば、ＤＮＡポリメラーゼをいう場合、１ユニットの活性は、標準的
に準備されたＤＮＡ合成条件下で３０分間、酸不溶性物質（すなわち、ＤＮＡま
たはＲＮＡ）に、１０ナノモルのｄＮＴＰを取り込む酵素の量である。

【００３６】（ベクター）プラスミド、ファージミド、コスミドまたはファージのＤＮＡあ
るいは他のＤＮＡ分子であり、これらのＤＮＡ分子は宿主細胞中で自律的に複製
可能であり、そして１または小数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特
徴付けられる。この認識部位で、このようなＤＮＡ配列が、ベクターの本質的な
生物学的機能の損失なしに決定可能な様式で切断され得る。そしてこの部位内で
、ＤＮＡはスプライシングされ得、その複製およびクローニングが起こる。クロ
ーニングベクターは、このクローニングベクターで形質転換された細胞の同定に
おける使用に適切なマーカーをさらに含み得る。例えば、マーカーは、テトラサ
イクリン耐性またはアンピシリン耐性である。

【００３７】（発現ベクター）クローニングベクターに類似のベクターであるが、宿主への
形質転換後、ベクターにクローン化された遺伝子の発現を増強し得るベクターで
ある。このクローン化された遺伝子は、特定の制御配列（例えば、プロモーター
配列）の制御下に、通常、配置される（すなわち作動可能に連結される）。

【００３８】（組換え宿主）任意の原核微生物または真核生物微生物であって、この微生物
は、発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のＤＮＡ分子内に所望のク
ローン化された遺伝子を含む。用語「組換え宿主」はまた、宿主の染色体または
ゲノムに、所望の遺伝子を含むように遺伝的に操作された、これらの宿主細胞を
含むことを意味する。

【００３９】（宿主）任意の原核微生物または真核生物微生物であって、この微生物は、複
製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のＤＮＡ分子のレシピ
エントである。このＤＮＡ分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複
製起点を含み得るが、これらに限定されない。

【００４０】（プロモーター）ＤＮＡ配列であって、遺伝子の５’領域として一般的に記載
され、開始コドンの近傍に位置する。プロモーター領域で、隣接する遺伝子の転
写が開始される。

【００４１】（遺伝子）ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配
列である。このＤＮＡ配列は、プロモーターおよび構造遺伝子、ならびにタンパ
ク質の発現に関連する他の配列を含む。

【００４２】（構造遺伝子）メッセンジャーＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列であって、メッ
センジャーＲＮＡは、次いで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳
される。

【００４３】（作動可能に連結される）本明細書中で使用される場合、発現は、構造遺伝子
によってコードされるポリペプチドの発現の開始を制御するために配置されたプ
ロモーターを意味する。

【００４４】（発現）発現は、遺伝子がポリペプチドを産生するプロセスである。遺伝子の
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリ
ペプチドへの翻訳を含む。

【００４５】（実質的に純粋）本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋」は、所望の
精製タンパク質またはポリペプチドを意味し、本質的に、所望のタンパク質また
はポリペプチドと結合する細胞性夾雑物の混入は本質的にない。混入している細
胞性成分としては、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ
、または望ましくないＤＮＡポリメラーゼ酵素が挙げられ得るが、これらに限定
されない。

【００４６】（耐熱性）本明細書中で使用される場合、「耐熱性」は、熱による不活化に耐
性であるポリメラーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素）を
有するポリペプチドをいう。例として、５’→３’方向でプライマーを伸長する
ことによって一本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分子の形成を、ＤＮＡ
ポリメラーゼは合成する。中温性ＤＮＡポリメラーゼについてのこの活性は、熱
処理によって不活化され得る。例えば、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ活性は、９０
℃の温度に３０秒間、酵素を曝露することによって完全に不活化される。本明細
書中で使用される場合、耐熱性ポリメラーゼ活性は、中温性ポリメラーゼよりも
熱不活化により耐性である。しかし、耐熱性ポリメラーゼは、熱不活化に完全に
耐性である酵素をいうことを意味せず、従って、熱処理は、ある程度までポリメ
ラーゼ活性を減少し得る。耐熱性ポリメラーゼはまた、代表的に、中温性ポリメ
ラーゼより高い最適温度を有する。

【００４７】（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
」は、当該分野で周知の酵素学的活性である。この活性は、しばしばＤＮＡポリ
メラーゼと関連し、そして、ＤＮＡ複製の「編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）」または正
確なメカニズムと関連すると考えられる。

【００４８】「ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少した」
は、本明細書中で以下のいずれかとして定義される：（１）対応する非変異、野
生型酵素の約１０％または１０％未満の、好ましくは約１％または１％未満の３
’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異または修飾されたポリメラーゼ、
または（２）約１ユニット／ｍｇタンパク質、または好ましくは約０．１ユニッ
ト／ｍｇタンパク質または０．１ユニット／ｍｇタンパク質未満の３’→５’エ
キソヌクレアーゼ比活性を有するポリメラーゼ。３’→５’エキソヌクレアーゼ
の活性のユニットは、６０分間３７℃で１０ナノモルの基質末端を可溶化する活
性の量として定義される（「ＢＲＬ１９８９Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＆Ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅＧｕｉｄｅ」第５頁に記載されるように、末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によって、［³Ｈ］ｄＴＴＰで標識されたλ
ＤＮＡ３’末端のＨｈａＩフラグメントを用いてアッセイされた）。タンパク
質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９７６
）の方法によって測定される。比較手段として、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２によっ
てコードされる天然の野生型Ｔ５−ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）またはＴ５
−ＤＮＡは、約１０ユニット／ｍｇタンパク質の比活性を有するが、ｐＴＴＰＱ
１９−Ｔ５−２（Ｅｘｏ−）（Ｕ．Ｓ．５，２７０，１７９）によってコードさ
れるＤＮＡポリメラーゼは、約０．０００１ユニット／ｍｇタンパク質の比活性
を有するか、非改変酵素の非活性の０．００１％を有する（１０５倍の減少）。

【００４９】（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
」はまた、当該分野で周知の酵素学的活性である。この活性はしばしば、ＤＮＡ
ポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩおよびＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ）に関連する。

【００５０】「ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少した」
は、本明細書中で以下のいずれかのように定義される：（１）対応する非変異の
野生型酵素の約１０％または１０％未満の、または好ましくは約１％または１％
未満の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異または改変されたポリメ
ラーゼ、または（２）約１ユニット／ｍｇタンパク質未満の、または好ましくは
約０．１ユニット／ｍｇタンパク質または０．１ユニット／ｍｇタンパク質未満
の５’→３’エキソヌクレアーゼ比活性を有するポリメラーゼ。

【００５１】３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方は、配列決定ゲル
で観察され得る。活性な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、伸長するプライ
マーの５’末端からヌクレオチドを除去することによって配列決定ゲルに非特異
的ラダーを産生する。配列決定ゲルにおける放射標識されたプライマーの分解に
続いて、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が測定され得る。従って、これらの
活性の相対量は、例えば、野生型ポリメラーゼと変異または改変されたポリメラ
ーゼの比較によって、従来的な実験のみで決定され得る。

【００５２】（減少されたヌクレアーゼ活性）減少されたヌクレアーゼ活性を有するポリペ
プチドは、ヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ、エキ
ソヌクレアーゼなど）を含み、ここで核酸分子（例えば、一本鎖および二本鎖の
核酸分子）を分解する能力が減少された。減少された活性を有するエキソヌクレ
アーゼ（例えば、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ）が好ましいが、エンドヌク
レアーゼは、本発明によって意図される。ポリペプチドのヌクレアーゼ活性は、
任意の手段（化学的または物理的処理または改変（例えば、温度（例えば熱不活
化）、イオン強度（塩またはｐＨ）、酵素学的処理（プロテイナーゼ）、および
遺伝的な改変および変異）を含む）によって減少され得る。遺伝的改変または変
異は、周知技術によって、目的のヌクレアーゼをコードする核酸分子（遺伝子）
への変異または改変の導入によって好ましくは達成され、その結果、核酸の発現
は、減少されたヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼを生じる。Ｍｏｎｋ，Ｍ
．およびＫｉｎｒｏｓｓＪ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０９，９７１−９
７８，１９７２およびＫｉｎｇｂｕｒｙ，Ｄ．およびＨｅｌｉｎｓｉ，Ｄ．，Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１１４，１１１６，１１２４，１９７３を参照の
こと。好ましくは、ヌクレアーゼ活性は、対応する未処理または非改変エキソヌ
クレアーゼと比較して、少なくとも３０％減少され、より好ましくは少なくとも
約５０％減少され、そして最も好ましくは少なくとも約７５％より多く減少され
る。このような改変および変異は、周知技術によって作製される点変異、置換お
よび欠失変異（またはそれらの組み合わせ）を含み得る。さらに、レベルまたは
ヌクレアーゼ活性を決定するため、本明細書中に記載されるアッセイおよび当該
分野で公知のアッセイは、減少されたヌクレアーゼ活性を有する所望のクローン
を選択するために使用され得る。

【００５３】他の変異は、本発明のヌクレアーゼに導入され得、所望の方法で、（例えば、
一本鎖核酸または他の核酸分子に対してのその親和性、その温度感受性（例えば
、一本鎖核酸分子または他の核酸分子（例えば、一本鎖プライマーまたは他の核
酸分子）に対する本発明のヌクレアーゼの結合または相互作用を阻害または妨げ
るために必要とされる温度を下げるために）機能を増強する。

【００５４】（実質的に減少されたヌクレアーゼ活性）実質的に減少されたヌクレアーゼ活
性を有するポリペプチドは、任意のヌクレアーゼ（対応する未処理、非改変また
は野生型の酵素の約２０％または２０％未満の、より好ましくは約１５％または
１５％未満の、さらにより好ましくは約１０％または１０％未満の、および最も
好ましくは約１％または１％未満の、ヌクレアーゼ活性を有する）として本明細
書中で定義される。このようなポリペプチドを作製するための改変または変異は
、周知技術によって作製される点変異、置換および欠失変異（またはそれらの組
み合わせ）を含み得る。

【００５５】（減少したポリメラーゼ活性）減少したポリメラーゼ活性を有するポリペプチドには、一本鎖核酸テンプレー
トに対して相補的な核酸分子の形成を合成する能力が減少された、ポリメラーゼ
または逆転写酵素が挙げられる。ポリペプチドのポリメラーゼ活性は、化学的ま
たは物理的な処理または改変を含む任意の手段（例えば、温度（例えば、熱不活
化）、イオン強度（塩またはｐＨ）、酵素的処理（プロテイナーゼ）、および遺
伝子改変または変異）によって減少され得る。遺伝子改変または変異は、好まし
くは、変異体または改変体を、周知の技術によって、目的のポリペプチドまたは
ポリメラーゼをコードする核酸分子（遺伝子（単数または複数））に導入するこ
とによって達成され、その結果、核酸の発現により、減少したポリメラーゼ活性
を有するポリメラーゼまたはポリペプチドが生じる。Ｍｏｎｋ，Ｍ．およびＫｉ
ｎｒｏｓｓＪ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０９，９７１−９７８，１９７
２、およびＫｉｎｇｂｕｒｙ，Ｄ．およびＨｅｌｉｎｓｉ，Ｄ．Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ１１４，１１１６，１１２４，１９７３を参照のこと。好まし
くは、ポリメラーゼ活性は、未処理または未改変のポリペプチドと比較して、約
３０％減少され、より好ましくは、少なくとも５０％減少され、そして最も好ま
しくは、少なくとも７５％より多く減少される。このような改変体または変異体
には、周知の技術により作製される、点変異体、置換体、および欠失変異体（ま
たはそれらの組み合わせ）が挙げられ得る。さらに、本明細書中に記載され、当
該分野で公知の、ポリメラーゼ活性のレベルを決定するためのアッセイが、減少
したポリメラーゼ活性を有する所望のクローンを選択するために使用され得る。

【００５６】他の変異体は、所望の様式で、機能（例えば、二本鎖核酸に対する親和性、温
度感受性（例えば、プライマー／テンプレートのような二本鎖核酸分子へのポリ
ペプチドの結合または相互作用を阻害または阻止するのに必要な温度を下げるた
め）を高めるため、またはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、３
’から５’および／または５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性）を減少する
ために、本発明のポリペプチドに導入され得る。例えば、変異体Ｇ５２２Ｄは、
温度感受性ＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼを提供する。このような変異体ポリメ
ラーゼは、３７℃以下の一定の温度で不活化または変性され得る。対応する変異
は、任意の他のタンパク質または酵素（例えば、逆転写酵素またはポリメラーゼ
）において作製されて、本発明で使用するための二本鎖核酸分子を結合する温度
感受性タンパク質または酵素を提供し得る。

【００５７】（実質的に減少したポリメラーゼ活性）実質的に減少したポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、対応する未変異
か、未改変かまたは野生型の酵素のポリメラーゼ活性の、約２５％または約２５
％未満、より好ましくは、約２０％または２０％未満、より好ましくは、約１５
％または１５％または未満、さらにより好ましくは、約１０％または１０％未満
、そして最も好ましくは、約１％または１％未満の活性を有する任意のポリペプ
チド（例えば、ポリメラーゼまたは逆転写酵素）として、本明細書中で定義され
る。このようなポリペプチドを作製する改変体または変異体には、周知の技術に
よって作製される点変異体、置換体、および欠失変異体（またはそれらの組み合
わせ）が挙げられ得る。

【００５８】上記のように、他の変異体は、所望の様式で、機能（例えば、二本鎖核酸に対
する親和性、温度感受性（例えば、テンプレートへのポリペプチドの結合を阻害
または防止するのに必要な温度を下げるため）を高めるため、またはポリメラー
ゼのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、３’から５’および／または５’から３
’のエキソヌクレアーゼ活性）を減少するために、本発明のポリペプチドに導入
され得る。さらに、変異または改変されたポリペプチドのポリメラーゼ活性は、
本明細書中以下で記載される方法、または当該分野で公知の任意の他の方法によ
って決定され得る。実質的に減少したポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは
、二本鎖核酸をさらに結合し得る。

【００５９】本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ技術、ならびに分子生物学および
細胞生物学の分野で使用される他の用語は一般に、適用可能な分野の当業者に理
解される。

【００６０】（阻害性ポリペプチド）本発明のポリペプチドは、二本鎖核酸（すなわち、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／
ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ／ＤＮＡ、ＰＮＡ／ＲＮＡ、ＬＮＡ／ＤＮＡ、
もしくはＬＮＡ／ＲＮＡ）、および／または一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡもしく
はＤＮＡ、またはＰＮＡもしくはＬＮＡ）、および／または一本鎖／二本鎖核酸
複合体（またはそれらの組み合わせ）に対する親和性を有する種々のポリペプチ
ド（タンパク質および酵素を含む）を含む。このようなポリペプチドは、このよ
うな核酸分子に結合するか、またはこのような核酸分子に対する親和性を有する
任意のタンパク質または酵素由来であり得る。このようなタンパク質および／ま
たは酵素の例には、リガーゼ、ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ
ポリメラーゼ）、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ
（例えば、一本鎖特異的ヌクレアーゼおよび二本鎖ヌクレアーゼ）、エンドヌク
レアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、逆転写酵素、転写因子、トポイソメラーゼ
、ＤＮＡ修復酵素（ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳなど）、組換えタンパク質（Ｉｎｔ、レ
ソルバーゼ、Ｃｒｅ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐなど）、ＤＮＡ複製酵素（ヘリカーゼおよ
びメチラーゼ）などが挙げられるが、これらに限定されない。認識されるように
、他のポリペプチド（天然、非天然、改変されたものなど）が、本発明に従って
選択および使用され得る。このような選択は、二本鎖および／または一本鎖およ
び／または一本鎖／二本鎖核酸複合体の核酸結合研究、ならびに／あるいは核酸
合成阻害アッセイによって達成され得る。本発明のポリペプチドを誘導する際に
使用される好ましいタンパク質および酵素には、ポリメラーゼ、または逆転写酵
素もしくはヌクレアーゼ（特にエキソヌクレアーゼ）が挙げられる。ポリメラー
ゼまたは逆転写酵素が使用されるような場合において、タンパク質または酵素は
、好ましくは、このようなタンパク質または酵素のポリメラーゼ活性を減少する
か、実質的に減少するか、または排除するために、改変または変異される。他方
で、使用されるタンパク質または酵素が、もともとポリメラーゼ活性をほとんど
かまたは全く有さない場合、このような改変または変異は不必要であり得る。エ
キソヌクレアーゼ活性ドメインを有するポリメラーゼは、好ましくは、このよう
なエキソヌクレアーゼ活性（５’から３’および／または３’から５’のエキソ
ヌクレアーゼ活性）を、減少するか、実質的に減少するか、または排除するため
に、改変または変異される。ヌクレアーゼが使用されるような場合、タンパク質
または酵素は、好ましくは、このようなタンパク質または酵素のヌクレアーゼ活
性を、減少するか、実質的に減少するか、または排除するために、改変または変
異される。他方で、使用されるタンパク質または酵素が、もともとヌクレアーゼ
活性をほとんどかまたは全く有さない場合、このような改変または変異は不必要
であり得る。

【００６１】本発明のポリペプチドおよび組成物を誘導するために使用されるＤＮＡポリメ
ラーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ
、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ^TM）Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ^TMＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ
ＫＯＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌ
ｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃ
ｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａ
ｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕ
ｓｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｒ
ｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｂｒｏｃｋｉａｎｕ
ｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ^TM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ
．ｃｏｌｉｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、および一般に、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩＩ、Ｆａｍｉｌｙ
Ａ、ＦａｍｉｌｙＢ、およびＦａｍｉｌｙＣ型のＤＮＡポリメラーゼ、な
らびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられるが、これらに限定され
ない。ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６、ならびにそれら
の変異体、改変体および誘導体）はまた、本発明に従って使用され得る。上記の
ポリメラーゼのいずれかが改変され、その結果、それらがポリメラーゼ活性をほ
とんどかまたは全く有さず、かつ必要に応じてエキソヌクレアーゼ活性をほとん
どかまたは全く有さないことが好ましい。ＤＮＡ親和性を増加する変異体は、Ｐ
ｏｌｅｓｋｙら、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１４５７９−１
４５９１に記載されている。上記のポリペプチドを、所望の目的のために変化さ
せることは、当業者の範囲内である。

【００６２】本発明において使用された核酸ポリメラーゼは、中温性または高温性であり得
、そして好ましくは、中温性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼとして
は、ＰｏｌＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼ（およびこれらのそれぞれのクレ
ノウフラグメント）、このファミリーのいずれかは、生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉ
ｄｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ．ｌ
ａｃｔｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．
ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｎａｔｉｓ、ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＬ５、
ｐｈｉ−Ｃ３１、Ｔ７、Ｔ３、Ｔ５、ＳＰ０１、ＳＰ０２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＭＩＰ−１由来のミトコンドリア、ならびに真核生物Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓ、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ａｓｔａｔｋｅ，Ｍ．ら、１９９８
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８、１４７−１６５）から単離され得る）、なら
びに任意の供給源から単離されたＦａｍｉｌｙＡ、ＦａｍｉｌｙＢ、Ｆａｍ
ｉｌｙＣおよびｐｏｌＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、およびその変異体、誘
導体または改変体などが挙げられる。本発明の方法および組成物において使用さ
れ得る好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、
Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶＥＮＴ^TMＤＮＡポリ
メラーゼおよびＤＥＥＰＶＥＮＴ^TMＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその変異体、
改変体および誘導体が挙げられ、これらは、好ましくは改変され、その結果、よ
り温度感受性になり、そして減少したポリメラーゼ活性、実質的に減少したポリ
メラーゼ活性を有するか、またはポリメラーゼ活性を有さず、そして必要に応じ
て、減少したエキソヌクレアーゼ活性、実質的に減少したエキソヌクレアーゼ活
性を有するか、またはエキソヌクレアーゼ活性を有しない（米国特許第５，４３
６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８
８号；米国特許第５，０７９，３５２号号；米国特許第５，６１４，３６５号；
米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許
第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＷＯ９２／０６
１８８；ＷＯ９２／０６２００；ＷＯ９６／１０６４０；Ｂａｒｎｅｓ，
Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ
．ら、ＰＣＲＭｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａ
ｍａｎ，Ｊ．−Ｍ，ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２（１５）：３２５
９−３２６０（１９９４））。

【００６３】ポリメラーゼ活性を減少、実質的に減少、または排除することにおいて、所望
の結果を提供する目的のポリペプチドのポリメラーゼドメイン中の任意の１つま
たは多数の変異が、使用され得る。多くのポリメラーゼ（特に、ＰｏｌＩＦａ
ｍｉｌｙ（ＴｙｐｅＡ）ポリメラーゼ）の配列は、公知であり、そしてこのよ
うなポリメラーゼのポリメラーゼドメイン、およびバクテリオファージＲＢ６
９ポリメラーゼのポリメラーゼドメイン（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、１９９７、Ｃｅｌ
ｌ８９，１０８７−１０９９）は、決定されている（表１、以下）。その他の
ポリメラーゼに関して、当業者は、利用可能な配列アライメントデータを用いて
ポリメラーゼドメインに対応する領域を容易に見出し得る（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、
１９９７、Ｃｅｌｌ８９、１０８７−１０９９；Ｈｏｐｆｎｅｒ，Ｋ．ら、１
９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６，３６００−３６０５；
Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ，Ｄ．およびＩｔｏ，Ｊ．，１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１，７８７−８０２）。

【００６４】

【表１】さらに、温度感受性（ｔｓ）変異体が、本発明に従って使用され得る。Ｔｓ変
異体は、当該分野で周知のアッセイによって（例えば、上昇した温度でのポリメ
ラーゼ活性の存在または非存在を決定することによって）同定され得る。Ｅ．ｃ
ｏｌｉｔｓ変異体由来のポリメラーゼは同定され、そしてその配列は、Ｇ５４
４Ｄ変異を示した。配列アライメントを用いることによって、他のＰｏｌＩフ
ァミリーポリメラーゼ由来のこのアミノ酸を同定し得（表２）、そしてこの位置
に対応する位置でｔｓ変異体を作製するために用い得る。ポリメラーゼに温度感
受性を付与する任意のその他のアミノ酸を有するポリメラーゼは、本発明におい
て意図される。

【００６５】

【表２】好ましくは、本発明のポリペプチドは、クレノウフラグメントのようなＰｏｌ
Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼを含む（Ｊｏｙｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．（１９
８２）２５７：１９５８−１９６４；Ｐｏｌｅｓｋｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．（１９９０）２６５：１４５７９−１４５９１を参照のこと）。このクレノ
ウフラグメントは、この酵素に変異を導入することによってそのポリメラーゼ活
性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を減少するように改変され得る。例
えば、Ｄ３５５Ａは、３’→５’活性を１０，０００分の１に減少する（Ｄｅｒ
ｂｙｓｈｉｒｅら、１９９１、ＥＭＢＯＪ．１０、１７−２４）。ポリメラー
ゼ活性に影響し得る特定の残基が、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのポリ
メラーゼドメインにおいて同定されているが（例えば、いくつか例を挙げると、
Ａｒｇ７５４、Ｌｙｓ７５８、Ｐｈｅ７６２、Ｔｙｒ７６６、Ｈｉｓ７３４、Ｇ
ｌｎ８４９、Ｈｉｓ８８１、Ｇｌｕ８８３、Ａｓｐ７０５、Ａｓｐ８８２、Ａｒ
ｇ６６８、およびＧｌｕ７１０）、欠失変異または挿入変異もまた、使用され得
る。ポリメラーゼ活性は、そのポリメラーゼドメインにおいて１つ以上の残基を
改変することによって減少されるが、欠失変異および挿入変異もまた使用され得
る。さらに、ポリメラーゼドメイン内またはポリメラーゼドメイン外のその他の
残基、あるいはサブドメインの欠失は、ポリメラーゼ活性に影響し得、そして本
発明において有用である。クレノウフラグメントにおけるＤ８８２Ａ変異は、ポ
リメラーゼ活性を１０００分の１に減少し、一方、ＤＮＡ親和性は、１５倍上昇
する（Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１４５
７９−１４５９１）。さらに、クレノウフラグメント誘導体の変異体はまた、温
度感受性にされ得る。その他のポリメラーゼにおけるこれらの部位に対応する変
異は、ポリメラーゼ活性の減少、ＤＮＡ親和性の上昇、エキソヌクレアーゼ活性
の減少、および／またはポリメラーゼへの温度感受性の付与の目的のために作製
され得る。

【００６６】本発明のポリペプチドの誘導に使用する逆転写酵素は、逆転写酵素活性を有す
る任意の酵素を含む。このような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レ
トロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウ
イルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７
−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５
，１８８号）、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍ
ａＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）ならびにそれらの
変異体、改変体または誘導体（例えば、ＷＯ９７／０９４５１およびＷＯ９
８／４７９１２を参照のこと）が挙げられるが、それらに限定されない。本発明
において使用される好ましい酵素としては、減少したＲＮａｓｅＨ活性、また
は実質的に減少したＲＮａｓｅＨ活性を有するか、あるいはＲＮａｓｅＨ活
性が排除された酵素が挙げられる。「ＲＮａｓｅＨ活性の実質的に減少した」
酵素によって、対応する野生型またはＲＮａｓｅＨ⁺酵素（例えば、野生型モ
ロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイル
ス（ＡＭＶ）逆転写酵素またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素）のＲ
ＮａｓｅＨ活性の約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、１０％未満ま
たは５％未満、そして最も好ましくは、約２％未満の活性を有する酵素を意味す
る。任意の酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、種々のアッセイ（例えば、米国特許第
５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
．Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣ
ＵＳ１４（５）：９１（１９９２）において記載されるアッセイ（この参考文
献の全ての開示は、本明細書中で参考として完全に援用される））によって決定
され得る。本発明における使用のための特に好ましいポリペプチドとしては、Ｍ
−ＭＬＶＨ^-逆転写酵素、ＲＳＶＨ^-逆転写酵素、ＡＭＶＨ^-逆転写酵素、
ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）Ｈ^-逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽球症関連ウイル
ス）Ｈ^-逆転写酵素およびＨＩＶＨ^-逆転写酵素（５，２４４，７９７およびＷ
Ｏ９８／４７９１２を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
しかし、ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少されている、リボ核酸分子からＤＮ
Ａ分子を産生し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素が、本発
明の組成物、方法およびキットにおいて同等に使用され得ることは当業者に理解
される。本発明における使用のための好ましい酵素としては、ポリメラーゼ活性
が減少されたか、または実質的に減少されている酵素が挙げられる。ポリメラー
ゼ活性のこのような減少は、好ましくは、標準的な技術を用いる目的の逆転写酵
素のポリメラーゼドメインにおける任意の１つまたは多数の変異または改変によ
って達成される。例えば、ＷＯ９８／４７９１２；およびＳｈｉｈ−Ｆｏｎｇ
ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．（１９９５）２３：８０３−８１０を
参照のこと。

【００６７】本発明のポリペプチドおよび組成物を誘導するために使用されるヌクレアーゼ
としては、ヌクレアーゼ活性を有する任意のタンパク質または酵素が挙げられる
が、好ましくは一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが挙げられる。本発明のこのよ
うなエキソヌクレアーゼとしては、多くのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｆａｍ
ｉｌｙＡ型ＤＮＡポリメラーゼ、ＦａｍｉｌｙＢ型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｆ
ａｍｉｌｙＣ型ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（
例えば、ε（ｅｐｉｓｏｌｉｎ）サブユニット）、およびｐｏｌＩ型ＤＮＡポ
リメラーゼ）由来の任意のエキソヌクレアーゼ（３’→５’エキソヌクレアーゼ
および５’→３’エキソヌクレアーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない
。本発明において使用されるその他のエキソヌクレアーゼとしては、ｅｘｏＩ
、ｅｘｏＩＩ、ｅｘｏＩＶ、ｅｘｏＶ、ｅｘｏＶＩＩ、ｅｘｏ３１、
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのε（ｅｓｐｓｉｌｏｎ）サブユニット、Ｔ４ｅｘ
ｏＩＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアー
ゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ＲＥＣＪエキソヌク
レアーゼ、酵母由来のｅｘｏＩＩ、酵母由来のｅｘｏＶ、ホスホジエステラ
ーゼ、哺乳動物ｅｘｏＶＩＩ、酵母由来のｅｘｏＩＶ、およびＮｅｕｒｏｓ
ｐｏｒａｃｒａｓｓａ由来のエキソヌクレアーゼが挙げられる。一本鎖エキソ
ヌクレアーゼおよび二本鎖エキソヌクレアーゼの例は、例えば、ＤＮＡｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ（第２版）（Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒ
，ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ
Ｃｏ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２）において見出され得る。本発明のこのよ
うなヌクレアーゼ／エンドヌクレアーゼとしては、一本鎖核酸および／または二
本鎖核酸を切断する、任意のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の
ＲｅｃＢＣＤエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩ、エンドヌクレアーゼ
ＩＩおよびエンドヌクレアーゼＶＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌク
レアーゼＩＶ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ由来の小球菌エンドヌクレアーゼ
、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａエンドヌクレアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙ
ｚａｅ由来のＳ１−ヌクレアーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ
由来のＰ１−ヌクレアーゼ、ＭｕｎｇヌクレアーゼＩ、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａ
ｓｅＩＩ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＥｎｄｏＲ、ＥｃｏＫ（Ｉ型酵素）お
よびＥｃｏＲＩ（ＩＩ型酵素）のような制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＵＶｅ
ｎｄｏ（ｅｎｄｏＶ）のような修復エンドヌクレアーゼならびにＲＮａｓｅＨ
のようなリボヌクレアーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。一本鎖ヌ
クレアーゼ／エンドヌクレアーゼおよび二本鎖ヌクレアーゼ／エンドヌクレアー
ゼの例は、例えば、ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（第２版）（Ａ．Ｋｏｒｎ
ｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版
、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２）にお
いて見出され得る。本発明において使用されるヌクレアーゼとしてはまた、ＲＮ
ａｓｅおよびＤＮａｓｅが挙げられる。例えば、Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、第２版、
Ｓ．Ｍ．Ｌｉｎ，Ｒ．Ｓ．Ｌｌｏｙｄ、およびＲ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９９
３を参照のこと。本発明において使用され得るＲＮａｓｅの例としては、ＲＮａ
ｓｅＡ、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＣＬ３、ＲＮａｓｅＰｈｙＭ、ＲＮ
ａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＴ２およびＲＮａｓｅＩＩＩが挙げられる。本発
明において使用され得るＤＮａｓｅの例としては、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａ
ｓｅＩＩが挙げられる。

【００６８】ヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少、または排除することにおいて、所望
の結果が提供される目的のポリペプチドのヌクレアーゼ活性ドメインにおける任
意の１つまたは多数の変異が、使用され得る。多くのヌクレアーゼまたはヌクレ
アーゼドメインの配列は公知であり、そしてそのエキソヌクレアーゼドメインが
、決定されている（以下の表３）。その他のヌクレアーゼに関して、当業者は、
利用可能な配列またはアライメントデータを用いてヌクレアーゼドメインに対応
する領域を容易に見出し得る。

【００６９】

【表３】＊推定３’→５’エキソドメインを有するが、測定可能な３’→５’エキソヌク
レアーゼ活性は有しない（配列および構造の比較から推論される）ポリメラーゼ
。アスタリスクで示した各配列は、検出可能な３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するための必須な触媒残基が欠失している。

【００７０】さらに、当業者は、当該分野において周知の技術を用いて、目的のヌクレアー
ゼまたは酵素内にランダム変異を作製し、この酵素またはタンパク質の活性（例
えば、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性または目的のその他の活性）を不活
化し得る。

【００７１】本発明のポリペプチドは、好ましくは、合成、配列決定または増幅反応におい
てポリメラーゼもしくは逆転写酵素の存在下でのこのような合成、配列決定また
は増幅を妨害または阻害するのに十分な最終濃度で本発明の組成物および方法に
おいて使用される。ポリメラーゼまたは逆転写酵素に対する本発明の阻害性ポリ
ペプチドの割合は、使用されるポリメラーゼまたは逆転写酵素およびポリペプチ
ドに依存して変化し得る。合成、配列決定または増幅反応のためのポリメラーゼ
／逆転写酵素に対する阻害性ペプチドのモル比は、約０．００１〜１００：１；
０．０１〜１０００：１；０．１〜１０，０００：１；１〜１００，０００：１
；１〜５００，０００：１または１〜１，０００，０００：１の範囲であり得る
。当然、本発明において使用するための適切なポリメラーゼ／逆転写酵素に対す
るこのような阻害性ポリペプチドのその他の適切な比は、当業者に明らかである
か、または慣用的な実験だけで決定される。

【００７２】（核酸合成の方法）本発明のポリペプチドおよび組成物は、核酸の合成のための方法において使用
され得る。特に、本発明のポリペプチドおよび組成物が、非特異的な核酸合成（
特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応において）を減少する
ことが発見された。従って、本発明のポリペプチドおよび組成物は、核酸分子（
例えば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）分子およびＲＮＡ分子）の合成を必要とする
任意の方法において使用され得る。本発明のポリペプチドまたは組成物が、有利
に使用され得る、方法としては、「ホットスタート」合成または増幅（ここで、
この反応は、この阻害性ポリペプチドが不活化または変性される温度よりも低い
温度でセットアップされ、次いでこの反応を、温度を上昇することによって開始
し、この阻害性ポリペプチドを不活化または変性し、従って、核酸合成または増
幅を開始することを可能にする）を含む、核酸合成方法、核酸増幅方法が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００７３】本発明のこの局面に従う核酸合成方法は、１つ以上の工程を包含する。例えば
、本発明は、（ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、１つ以上のプライマーおよ
び本発明の上記のポリペプチドならびにポリメラーゼ活性または逆転写活性を有
する１つ以上の酵素と混合し、混合物を形成する工程；（ｂ）核酸合成を阻害す
るのに十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程；および（ｃ）こ
のテンプレートの全てまたは一部に相補的である１つ以上の第１の核酸分子を作
製するのに十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程を包含する、
１つ以上の核酸分子を合成するための方法を提供する。本発明のこの局面に従っ
て、この核酸テンプレートは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮ
Ａライブラリー）、またはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）であり得る。ｐ
Ｈ、温度、イオン強度、およびインキュベーション時間のような合成を可能にす
るのに十分な条件は、当業者に従って最適化され得る。

【００７４】さらに、本発明における使用のためのポリメラーゼ活性を有する酵素は、例え
ば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ
、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）
から、市販により入手可能であり得る。本発明における使用のための、逆転写酵
素活性を有する酵素は、例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ
．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、Ｓｉｇｍａ（ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ
、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から市販に
より入手可能であり得る。あるいは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性を有
する逆転写酵素は、当業者に周知の、天然のタンパク質を単離および精製するた
めの標準的な手順に従って、その天然のウイルスまたは細菌の供給源から、単離
され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（
１９７９）を参照のこと）。さらに、このようなポリメラーゼ／逆転写酵素は、
当業者が熟知している組換えＤＮＡ技術によって、調製され得る（例えば、Ｋｏ
ｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：２６５（１
９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．、およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３３７２−３３７６（１９８８
）を参照のこと）。ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有する酵素の例と
しては、ポリメラーゼ活性または逆転写酵素活性を排除するための変異／改変を
含まない、本願に記載される任意のものが挙げられ得る。

【００７５】本発明によれば、投入またはテンプレートの核酸分子またはライブラリーは、
天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官または生物）から得られる核酸
分子の集団から調製され得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原
核生物の細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉ
ｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの属の種のものを含む、細菌細胞）
であっても真核生物の細胞（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物および他の寄
生生物、ならびに昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｓｐｐ．細胞）、線虫（
特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ細胞）、および哺乳動物
（特に、ヒト細胞）を含む動物を含む）であってもよい。

【００７６】一旦、出発の細胞、組織、器官または他のサンプルが得られると、当該分野に
おいて周知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ１５：６８
７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．、およびＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ
．、およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．、Ｇｅｎｅ２５：２６３−２６９（１９
８３）を参照のこと）により、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍ
ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ）の分子）が単離され得るか、またはｃＤＮＡ分
子もしくはライブラリーがそれから調製され得る。

【００７７】本発明の好ましい局面の実施において、上記のように得られる核酸テンプレー
ト（これは好ましくは、ＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子もしくはポリＡ＋Ｒ
ＮＡ分子のようなＲＮＡ分子である）を、１つ以上の上記の本発明の阻害性のポ
リペプチドまたは組成物と混合して混合物を形成することにより、第一の核酸分
子が合成され得る。核酸テンプレートの全てまたは一部と相補的である、第一の
核酸分子の合成は、好ましくは、反応の温度を上昇させ、そして本発明の阻害性
ポリペプチドを変性または不活化し、これによって核酸合成基質（例えば、二本
鎖プライマー／テンプレートハイブリッド、ならびに一本鎖プライマーおよびテ
ンプレート）を遊離させ、そして投入核酸分子またはテンプレート核酸分子の逆
転写（ＲＮＡテンプレートの場合）および／または重合を優先させた後に、達成
される。このような合成は好ましくは、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄ
ＮＴＰ）、またはこれらの誘導体）の存在下で達成される。

【００７８】もちろん、本発明の阻害性のポリペプチド、組成物および方法が有利に使用さ
れ得る、核酸合成の他の技術が、当業者に容易に明らかである。

【００７９】（増幅および配列決定の方法）本発明の他の局面において、本発明の阻害性のポリペプチドおよび組成物が、
核酸分子を増幅または配列決定するための方法において、使用され得る。本発明
のこの局面による、核酸増幅方法は、１工程逆転写酵素増幅反応（例えば、１工
程ＲＴ−ＰＣＲ）または２工程逆転写酵素増幅反応（例えば、２工程ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）として当該分野において一般的に公知の方法において、逆転写酵素活性を有
する１つ以上のポリペプチドの使用をさらに包含し得る。長い核酸分子（すなわ
ち、約３〜５Ｋｂ長より大）の増幅のためには、ＷＯ９８／０６７３６およびＷ
Ｏ９５／１６０２８に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼの組合せが使用さ
れ得る。

【００８０】本発明のこの局面による増幅方法は、１以上の工程を包含し得る。例えば、本
発明は、以下の工程を包含する、核酸分子を増幅するための方法を提供する：（
ａ）核酸テンプレートを、１つ以上の本発明の阻害性のポリペプチドまたは組成
物と混合して、混合物を形成する工程；および（ｂ）この混合物を、ポリメラー
ゼ活性を有する酵素が、テンプレートの全てまたは一部と相補的である核酸分子
を増幅することを可能とするに十分な条件下で、インキュベートする工程。好ま
しい局面において、合成を優先させる条件は、本発明の阻害性ポリペプチドを不
活化または変性する。本発明はまた、このような方法により増幅された核酸分子
を提供する。

【００８１】核酸分子またはフラグメントを増幅および分析するための一般的方法は、当業
者に周知である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，
２０２号；および同第４，８００，１５９号；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら編、ＰＣ
ＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．お
よびＧｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．編、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲ
ＣＰｒｅｓｓ（１９９４）を参照のこと）。例えば、本発明に従って使用され
得る増幅方法としては、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４
，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号
；ＥＰ０６８４３１５）、ならびに核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；
米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ０３２９８２２）が挙げられる。

【００８２】代表的に、これらの増幅方法は、以下の工程を包含する：（ａ）核酸サンプル
を、１つ以上の本発明の阻害性ポリペプチドもしくは組成物、１つ以上の核酸ポ
リメラーゼ活性を有するポリペプチドと、１つ以上のプライマー配列の存在下で
接触させる工程、および（ｂ）好ましくはＰＣＲまたは等価な自動化増幅技術に
よって、この核酸サンプルを増幅して、増幅された核酸フラグメントのコレクシ
ョンを生成する工程、ならびに（ｃ）必要に応じて、好ましくはゲル電気泳動に
よって、この増幅された核酸フラグメントを大きさで分離し、そして例えば核酸
結合色素（例えば、エチジウムブロマイド）でゲルを染色することによって、核
酸フラグメントの存在についてこのゲルを分析する工程。

【００８３】本発明の方法による増幅または合成に続いて、増幅または合成された核酸フラ
グメントを、さらなる使用または特徴付けのために、単離し得る。この工程は、
通常、任意の物理的または生化学的手段（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動
、クロマトグラフィー（サイジングクロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、および免疫クロマトグラフィーを含む）、密度勾配遠心分離およ
び免疫吸着が挙げられる）によって、増幅または合成された核酸フラグメントを
大きさで分離することにより、達成される。ゲル電気泳動による核酸フラグメン
トの分離が、特に好ましい。なぜなら、これは、多数の核酸フラグメントの高感
度な分離の、迅速かつ再現性の高い手段を提供し、そして核酸のいくつかのサン
プルにおけるフラグメントの、直接的な同時の比較を可能にするからである。別
の好ましい実施形態において、このアプローチを拡張して、これらのフラグメン
トまたは本発明の方法により増幅もしくは合成された任意の核酸フラグメントを
、単離および特徴付けし得る。従って、本発明はまた、本発明の増幅または合成
の方法により産生される、単離された核酸分子に関する。

【００８４】この実施形態において、１つ以上の増幅または合成された核酸フラグメントが
、標準的な技術（例えば、電気溶出または物理的切除）に従って、同定のために
使用されたゲル（上記を参照のこと）から除去される。次いで、この単離された
独自の核酸フラグメントを、種々の原核生物（細菌）細胞または真核生物（酵母
、植物またはヒトおよび他の哺乳動物を含む動物）細胞のトランスフェクション
または形質転換に適した標準的なヌクレオチドベクター（発現ベクターを含む）
に、挿入し得る。あるいは、本発明の方法により産生された核酸分子を、例えば
、配列決定（すなわち、核酸フラグメントのヌクレオチド配列の決定）、以下に
記載の方法および当該分野において標準的な他の方法（例えば、米国特許第４，
９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号を参照のこと、これらは、Ｄ
ＮＡ配列決定の方法に関する）によって、さらに特徴付け得る。

【００８５】本発明による、核酸配列決定の方法は、１以上の工程を包含し得る。例えば、
本発明は、以下の工程を包含する、核酸分子の配列決定のための方法を提供する
：（ａ）配列決定される核酸分子を、１つ以上のプライマー、１つ以上の上記本
発明の阻害性ポリペプチドもしくは組成物、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上
の終止薬剤（例えば、ジデオキシヌクレオチド）、およびポリメラーゼ活性を有
する１つ以上の酵素と混合して、混合物を形成する工程；（ｂ）この混合物を、
配列決定される分子の全てまたは一部に相補的である分子の集団を合成するため
に十分な条件下で、インキュベートする工程；ならびに（ｃ）この集団を分離し
て、配列決定される分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する工程。
本発明の阻害性のポリペプチドまたは組成物を使用し得る、核酸配列決定技術と
しては、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号に開
示されるもののような、ジデオキシ配列決定方法が挙げられる。

【００８６】（ベクターおよび宿主細胞）本発明はまた、１つ以上の本発明の阻害性ポリペプチド（例えば、本明細書中
に記載するようなクレノウ誘導体）をコードする核酸分子を含む、ベクターに関
する。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主
細胞、および好ましくは、このような遺伝子を含む組換えベクターを含む宿主細
胞、ならびにこれらのベクターおよび宿主細胞を使用する、本発明のポリペプチ
ドの産生のための方法に関する。このような宿主細胞は、好ましくは、遺伝子操
作されており、そして組換えポリペプチドの産生のために使用される。

【００８７】本発明において使用されるベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドで
あり得、そして好ましくは、プラスミドである。目的のポリペプチドをコードす
る核酸に対するシス作動性制御領域を含むベクターが、好ましい。適切なトラン
ス作動性因子は、宿主により供給されても、相補的なベクターにより供給されて
も、または宿主への導入の際にベクター自体により供給されてもよい。

【００８８】この点に関する特定の好ましい実施形態において、ベクターは、本発明の核酸
分子によりコードされるポリペプチドの特異的発現を提供する；このような発現
ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る。このようなベクタ
ーのうちで特に好ましいものは、温度および栄養性添加物のような容易に操作可
能な環境因子により誘導可能なベクターである。

【００８９】本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体、エピソーム、およびウ
イルスに由来するベクター（例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージ
由来のベクター）、ならびにこれらの組合せに由来のベクター（例えば、コスミ
ドおよびファージミド）が挙げられる。

【００９０】ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰ_Lプロモー
ター、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター）に作動可能に
連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。遺伝
子融合構築物は、転写開始部位、終止部位、および転写領域においては、翻訳の
ためのリボソーム結合部位を、さらに含む。この構築物により発現される、成熟
転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリヌクレオチドの、最初に翻
訳開始コドンを、そして末端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡま
たはＵＡＧ）を含む。

【００９１】発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このよ
うなマーカーとしては、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養のための、テ
トラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性遺伝子が挙げられる。

【００９２】本発明において使用するために好ましいベクターのうちでは、Ｑｉａｇｅｎか
ら入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
から入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ
；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３；ならびにＰｈａｒｍａｃ
ｉａから入手可能なｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、
ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５
が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。

【００９３】適切な宿主細胞の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｓｐｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐｐ．
およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞が挙げ
られるが、これらに限定されない。宿主細胞として好ましいものは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉであり、そして特に好ましいものは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ＢおよびＳｔｂ
ｌ２であり、これらは市販されている（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）。

【００９４】（ペプチド産生）上記のように、本発明の方法は、上記核酸分子またはベクターを宿主細胞に挿
入し、そして宿主細胞によって目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を発現することによる、任意の長さの任意のポリペプチドの産生に適している
。形質転換された宿主細胞を産生するための、核酸分子またはベクターの、宿主
細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エ
レクトロポレーション、形質導入、化学的にコンピテントな細胞の形質転換、感
染または他の方法により、実施され得る。このような方法は、多くの標準的な実
験室手引書（例えば、Ｄａｖｉｓら、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓＩｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載されている。一旦、形質
転換された宿主細胞が得られると、この細胞は、任意の生理学的に適合性の条件
のｐＨおよび温度のもとで、宿主細胞の増殖を支持する炭素、窒素、および必須
無機物の同化可能な供給源を含む任意の適切な栄養培地中で、培養され得る。組
換えポリペプチドを産生する培養条件は、宿主細胞を形質転換するために使用さ
れるベクターの型によって、変動する。例えば、特定の発現ベクターは、組換え
ポリペプチドの産生を生じる遺伝子発現を開始するために、特定の温度での細胞
増殖、または細胞増殖培地への特定の化学物質もしくは誘導薬剤の添加を必要と
する調節領域を含む。従って、用語「組換えポリペプチドを産生する条件」とは
、本明細書中において使用する場合に、いずれか１つのセットの培養条件に限定
されることを意味しない。上記宿主細胞およびベクターのための適切な培養培地
および条件は、当該分野において周知である。宿主細胞中での産生に続いて、目
的のポリペプチドは、いくつかの技術により単離され得る。目的のポリペプチド
を宿主細胞から遊離させるために、細胞が溶解または破壊される。この溶解は、
細胞を低張性溶液に接触させること、リボザイムのような細胞壁破壊酵素で処理
すること、超音波処理、高圧での処理、または上記方法の組合せにより、達成さ
れ得る。当業者に公知の、細菌細胞の破壊および溶解の他の方法もまた、使用さ
れ得る。

【００９５】破壊に続いて、ポリペプチドは、複雑な混合物中の粒子を分離するために適し
た任意の技術により、細胞の破片から分離され得る。次いで、このポリペプチド
は、周知の単離技術によって、精製され得る。精製のための適切な技術としては
、硫酸アンモニウムまたはエタノールによる沈殿、酸抽出、電気泳動、免疫吸着
、アニオン交換またはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ
フィー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高性能ＬＣ（ＨＰＬＣ）、高速ＬＣ
（ＦＰＬＣ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。

【００９６】（キット）本発明はまた、核酸分子を合成、増幅、または配列決定する際に使用するため
の、キットを提供する。本発明のこの局面によるキットは、１つ以上の容器（例
えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）を含み得、これは、１つ以上の本発
明の阻害性のポリペプチドおよび／または組成物を収容し得る。

【００９７】本発明のキットは、以下の成分のうちの１つ以上を含み得る：（ｉ）１つ以上
の本発明のポリペプチドまたは組成物、（ｉｉ）１つ以上のポリメラーゼおよび
／または逆転写酵素、（ｉｉｉ）１つ以上の適切な緩衝液、（ｉｖ）１つ以上の
ヌクレオチド、および（ｖ）１つ以上のプライマー；（ｖｉ）１つ以上のテンプ
レート、ならびに（ｖｉｉ）本発明の方法を実施するための指示書。

【００９８】（組成物）本発明はまた、本発明の合成、増幅または配列決定の方法を実施するため、お
よび本発明のヌクレアーゼ保護方法を実施するために調製される、組成物に関す
る。さらに、本発明は、本発明のこのような方法の実施の間または後に作製され
る組成物に関する。好ましい局面において、本発明の組成物は、１つ以上の本発
明の阻害性ポリペプチドを含む。このような組成物は、さらに、以下からなる群
から選択される１つ以上の成分を含み得る：（ｉ）１つ以上のポリメラーゼおよ
び／または逆転写酵素、（ｉｉ）１つ以上の適切な緩衝液、（ｉｉｉ）１つ以上
のヌクレオチド、（ｉｖ）１つ以上のテンプレート、（ｖ）１つ以上のプライマ
ー、（ｖｉ）１つ以上のテンプレート／プライマー複合体、ならびに（ｖｉｉ）
本発明の合成、増幅または配列決定の方法により作製される、１つ以上の核酸分
子。

【００９９】本発明はまた、１つ以上の核酸分子と結合または複合体化した本発明のポリペ
プチドを含む組成物、ならびにこのような組成物中に見出されるかまたは本発明
の方法の間に作製されるポリペプチド／核酸分子複合体に関する。

【０１００】本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適合が
明らかであり、そして本発明の範囲またはそのあらゆる実施形態から逸脱するこ
となくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。ここで、本
発明を詳細に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照することにより、さ
らに明白に理解される。この実施例は、例示のみの目的で本明細書中に組み込ま
れ、そして本発明を限定することは、意図されない。

【０１０１】（実施例）以下の材料および方法を、下記の実施例において使用した。

【０１０２】（クローニングおよびタンパク質調製）Ｉ）変異体Ａは、そのポリメラーゼドメインにて１つの変異（Ｄ８８２Ａ）な
らびにその３’→５’エキソヌクレアーゼドメインにて２つの置換（Ｄ３５５Ａ
およびＥ３５７Ａ）を保有する、クレノウフラグメント誘導体を示す：Ｄ８２２
Ａは、このポリメラーゼ活性を６００分の１に減少させる（Ｐｏｌｅｓｋｙら、
１９９０、前出）。Ｄ３５５ＡおよびＥ３５７Ａの組み合わせ変異は、３’→５
’エキソヌクレアーゼ活性を、バックグラウンドレベルまで減少させる。

【０１０３】ＩＩ）変異体Ｂは、そのポリメラーゼドメインにて１つの変異（Ｄ８８２Ｎ）
ならびにその３’→５’エキソヌクレアーゼ遺伝型にて上記のような２つの置換
を保有する、クレノウフラグメント誘導体を示す。Ｄ８８２Ｎは、そのポリメラ
ーゼ活性を１００００分の１に減少させる（Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０、前出
）。

【０１０４】ＩＩＩ）変異体Ｃは、そのポリメラーゼドメインにて二重変異（Ｋ７５８Ａお
よびＤ８８２Ａ）ならびにその３’→５’エキソヌクレアーゼドメインにて２つ
の置換を保有する、クレノウフラグメント誘導体を示す。個々の置換Ｄ８８２Ａ
およびＫ７５８Ａの各々は、それぞれ、そのポリメラーゼ活性を約６００分の１
に減少させる（Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０；Ａｓｔａｔｋｅら、１９９５、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１９４５〜１９５４）。

【０１０５】ＩＶ）変異体Ｄは、温度感受性バックグラウンド（ｐｏｌＡ１２）−において
変異体Ａから誘導される、変異体クレノウフラグメント誘導体を示す。

【０１０６】報告されている耐熱性逆転写酵素は、鳥類（ａｖａｉｎ）逆転写酵素（ＲＴ）
の点変異誘導体であり、５５℃にて安定である（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ^TM ＩＩ；
例えば、ＷＯ９８／４７９１２もまた参照のこと）。本発明者らはここに、以
下の表現型を示すクレノウフラグメントの変異体誘導体の使用を提案する：不活
性なポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＤＮＡ基質またはＤＮＡ／ＲＮＡ基質に結合する、
そしてＲＴ触媒性ＤＮＡ合成を弱めないために、３７℃より上で不安定である。
この目的は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの間の逆転写酵素またはポリメラーゼに
よる非特異的ＤＮＡ合成のレベルを減少するように、このような「ＰＣＲ試薬」
を組み込むことである。

【０１０７】（Ｄ８２２Ａ点変異、Ｄ８８２Ｎ点変異およびＫ７５８Ａ点変異の操作）Ｋ７５８Ａ点変異、Ｄ８２２Ａ点変異およびＤ８８２Ｎ点変異を、部位特異的
変異誘発（ＳＤＭ）により操作した。一本鎖ＤＮＡを、２つの点変異Ｄ３５５Ａ
およびＥ３５７Ａを含むクレノウフラグメントがマルチクローニング部位に挿入
されたプラスミドｐＴｒｃＮ２から作製した。この単一点変異体を操作するため
のＳＤＭに使用したオリゴヌクレオチドは、以下であった：Ｄ８８２Ａ置換用

【０１０８】

【化１】（配列番号１）（ＳｐｈＩ部位を作製した（太字イタリック体））。

【０１０９】Ｄ８８２Ｎ置換用

【０１１０】

【化２】（配列番号２）（ＡｐａＬＩ部位を作製した（太字イタリック体））。

【０１１１】Ｋ７５８Ａ置換用

【０１１２】

【化３】（配列番号３）（ＰｓｔＩ部位を作製した（太字イタリック体））。

【０１１３】下線のコドンは、これらの変異を保有する位置を示す。二重置換Ｋ７５８Ａお
よびＤ８８２Ａを保有する変異体（変異体Ｃ）は、対立遺伝子交換を行うことに
より作製した。この構築物は、７５８位のアミノ酸についてのコドンの下流に単
一のＭｕｎＩ部位を有し、そして終止コドンの下流に単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位
を有した。この構築物Ｋ７５８ＡからのＭｕｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
を、両方の置換を保有している構築物を作製するために、Ｄ８８２Ａ構築物から
の対応するフラグメントで置換した。遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔｒｃプロモー
ターの制御下にあった。

【０１１４】この構築物各々を、タンパク質発現のレベルについて以下の通りに分析した：
一晩培養物を、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含有するＣｉｒｃｌｅＧ
ｒｏｗ（ＣＧ）（Ｂ１０１０、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にて３０℃で増殖させ
た（２ｍｌ）。４０ｍｌのＣＧ＋Ａｍｐ₁₀₀に、この一晩培養物のうちの１ｍｌ
を添加し、そしてこの培養物がＯ．Ｄ．約１．０（Ａ₅₉₀）に達するまで、３７
℃で増殖させた。この培養物を２つの２０ｍｌアリコートに分け、そして第１の
アリコート（非誘導）を３７℃で維持した。もう一方のアリコートに、ＩＰＴＧ
を最終濃度２ｍＭまで添加し、そしてこの培養物を３７℃でインキュベートした
。３時間後、この培養物を、卓上遠心分離機中で４℃にて、３５００ｒｐｍで２
０分間遠心分離した。その上清を注ぎ出し、そして細胞ペレットを−７０℃にて
貯蔵した。そしてその発現タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この
細胞ペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ、
１０ｍＭのｂ−ＭＥを含有する緩衝液１ｍｌ中に再懸濁し、そして超音波処理（
ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ）した。１００ｍｌのサンプルを総タンパク質の分析
用に維持し、残りを４℃で遠心分離した。その上清を可溶性タンパク質の分析用
に使用した。サンプル（０．１Ａ₅₉₀単位と等価な量）を、Ｔｒｉｓ−グリシ
ンＳＤＳ緩衝液中でｂ−ＭＥの存在下で、４〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−グリシンゲ
ル上に分画した。

【０１１５】そのタンパク質の発現を増加させるために、クレノウフラグメントの変異誘導
体を、１ｐＬプロモーターの制御下にサブクローニングした。ｐＴｒｃＮ２構築
物をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、その末端を野生型クレノウフラグメントによ
り充填した。最後に、この構築物をＮｄｅＩで消化し、そして約１８００ｂｐの
フラグメントを、ＮｄｅＩおよびＳｍａＩで既に消化したベクターｐＲＥＩ（Ｒ
ｅｄｄｙら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．（１９８９）１７：１０４７
３〜１０４８８）にサブクローニングした。使用したこの構築物用の宿主は、Ｄ
Ｈ１０Ｂ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、ＭＤ）であった。この宿主は、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性プラスミ
ド上にｃ１リプレッサーを保有する、ＲＮａｓｅＩが欠損した宿主であった。
タンパク質発現のレベルを、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

【０１１６】（クレノウフラグメントの変異体の過剰産生および精製）細胞を、振盪フラスコにて大スケールで増殖させた。ｐＴｒｃＮ２構築物につ
いて、グリセロール種を使用して、２０ｍｌのＣＧ＋Ａｍｐ₁₀₀に接種した。次
いで、この培養物を３０℃で一晩増殖させた。この一晩培養物のうちの１０ｍｌ
を５００ｍＬのＣＧ＋Ａｍｐ₁₀₀混合物に添加し、そして３７℃でインキュベー
トした。細胞増殖後（Ａ₅₉₀が約１．２）、この培養物をＩＰＴＧ（２ｍＭ最終
濃度）で誘導し、そしてさらに３時間増殖させた。その細胞を遠心分離によって
収集し、そして−７０℃で貯蔵した。

【０１１７】ｐＲＥ１構築物について、グリセロール種を使用して、２０ｍｌのＣＧ＋Ａｍ
ｐ₁₀₀＋Ｃｍ₃₀に接種した。次いで、この培養物を３０℃で一晩増殖させた。こ
の一晩培養物のうちの７．５ｍｌを５００ｍＬのＣＧ＋Ａｍｐ₁₀₀＋Ｃｍ₃₀に混
合物に添加し、そして３０℃でインキュベートした。Ａ₅₉₀が約１．２である細
胞密度にて、４２℃に１時間配置することによってこの培養物を誘導し、次いで
３７℃でインキュベートした。最後に、その細胞を遠心分離によって収集し、そ
して−７０℃で貯蔵した。

【０１１８】全ての工程を、他のように記載しない限り、４℃または氷上で実行した。この
組換えプラスミドを含む細胞（約３グラム）を融解し、そして超音波処理緩衝液
中に懸濁した（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、０．１ＭＫＣｌ、１ｍＭ
Ｎａ₂ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴおよび０．１ｍＭＰＭＳＦ中で、細胞：緩衝
液＝１：５）。この細胞懸濁物を、総細胞画分の８０％より多くが割れるまで（
Ａ₅₉₀測定により決定される）、超音波処理した。ＫＣｌ溶液（２Ｍ）を添加し
て、ＫＣｌ濃度を０．２Ｍまで増加させた。この後、一定に攪拌しながらＰｏｌ
ｙｍｉｎＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（１／９容積の５％ｖ／
ｖストック）を滴下し、そしてその懸濁物を約２０分間攪拌した。次いで、この
サンプルを１０，０００ｒｐｍにてさらに２０分間遠心分離し、そしてその上清
を硫酸アンモニウム沈殿により分画した。４０〜５５％硫酸アンモニウムにより
沈殿した画分を、２０ｍＭＫＰＯ₄ ｐＨ７．０、０．１ＭＫＣＬ、１．５
Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＴを含む緩衝
液（これはまた、Ｂｕｔｙｌ６５０Ｓカラムでの洗浄および勾配にて使用する
緩衝液である）２０ｍｌ中に再懸濁した。このタンパク質サンプルをＢｕｔｙｌ６５０Ｓカラム（Ｔｏｘｏｌｔａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｐ
Ａ）にローディングし、そしてクロマトグラフし、そして直線勾配（２０ｍＭ
ＫＰＯ₄ ｐＨ７．０、２０％グリセロール、０．１ＭＫＣｌ、１ｍＭＮａ₂ ＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＴ）により溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析し、そして変異体クレノウフラグメントを含む画分をプールした。

【０１１９】そのタンパク質溶液を、緩衝液［２０ｍＭＫＰＯ₄ ｐＨ６．８、０．１ＭＫＣＬ、１ｍＭＤＴＴおよび０．１ｍＭＰＭＳＦ］に対して一晩透析し、
次いでヒドロキシアパタイトカラム（ＡＩＣ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）上でクロマ
トグラフし、２０ｍＭから２５０ｍＭまでのリン酸の直線勾配を使用して溶出し
た。変異体クレノウフラグメントを含む画分をプールし、そしてカチオン交換カ
ラム（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＳｕｌｆａｔｅ（ＥＭＳｅｐａｒａｔｉ
ｏｎｓ、ＷａｋｅｆｉｅｌｄＲＩ））上にローディングした。このカラムを緩
衝液［２０ｍＭＫＰＯ₄ ｐＨ６．５、０．１ＭＫＣＬ、１ｍＭＤＴＴお
よび０．１ｍＭＰＭＳＦ］で平衡化および洗浄し、そして０．１Ｍから０．７
５ＭまでのＫＣｌの直線勾配を使用して溶出した。変異体クレノウフラグメント
を含む画分をプールし、そして緩衝液［５０ｍＭＫＰＯ₄ ｐＨ７．０、０．
１ＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴおよび５０％グリセロール］に対して透析した。

【０１２０】（実施例１）ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ^TM ＩＩＲＮａｓｅ欠損変異体逆転写酵素（ＲＴ
）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能、またＷＯ
９８／４７９２１を参照のこと）のＤＮＡポリメラーゼ活性を、変異Ｄ３５５Ａ
、Ｄ３５７Ａ、Ｋ７５８ＡおよびＤ８８２Ａを保有するクレノウフラグメントの
存在下および非存在下で、室温および５０℃にて決定した。このポリメラーゼア
ッセイについてのＤＮＡ基質は、３４／６０マーのプライマー／テンプレートで
あった。このプライマー鎖の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用
して、³²Ｐで標識した。

【０１２１】ＲＴ／クレノウフラグメント溶液（異なる比）をｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ₂の
存在下でＤＮＡ基質の溶液に添加することによって、重合反応を開始した。この
ＤＮＡの反応濃度は、０．５ｎＭ〜２ｎＭであり、４つのｄＮＴＰ各々が１ｍＭ
であり、［ＭｇＣｌ₂およびＫＣｌ］が７．５ｍＭであった。各反応条件につい
て、ＲＴの濃度は１９０ｎＭに維持したが、クレノウフラグメントの濃度は、１
０μＭ〜０の範囲であった。４つの異なる比のＫＦ−ＲＴ混合物を、ＤＮＡポリ
メラーゼ活性の有効な阻害について試験した。この反応を、各測定について１分
および６分で停止した。

【０１２２】ＲＴ活性は、本発明者らの反応条件下で、ＲＴに対して５倍（以上）過剰のク
レノウフラグメントの存在下で、室温で阻害された。しかし、５０℃にて、ＲＴ
は、５０倍過剰のＫＦの存在下でさえ、有意なＤＮＡ合成により検出されるＤＮ
Ａ基質について競合した（図１）。

【０１２３】位置置換を保有するクレノウフラグメント変異体誘導体を、実験条件下で上記
の変異によりそのクレノウがそのポリメラーゼ活性に関して不活性になることを
確認するために、ポリメラーゼ活性についてアッセイした。室温にて、２０分間
のインキュベーションの後でさえ、些細な量のポリメラーゼ活性しか存在しなか
った。

【０１２４】（実施例２）Ｔａｑ、Ｔｎｅ、およびＫＯＤの高温性ＤＮＡポリメラーゼの活性を、変異体
クレノウフラグメントの存在下および非存在下で、実施例１に記載されたのと同
じＤＮＡ基質を使用して、室温、５５℃および７２℃にて測定した。このアッセ
イについて、単一のクレノウフラグメント／活性ＤＮＡポリメラーゼ比のみをア
ッセイした。このクレノウフラグメントは、室温でそのポリメラーゼ活性を阻害
するように過剰に存在した。

【０１２５】３つのＤＮＡポリメラーゼのうちの１つを（クレノウフラグメントの存在下ま
たは非存在下で）ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ₂の存在下でＤＮＡ基質の溶液に添加
することによって、重合反応を開始した。このＤＮＡの基質濃度は、０．５ｎＭ
〜２ｎＭであり、４つのｄＮＴＰ各々が２００μＭであり、［Ｍｇ²⁺］が２ｍＭ
であった。この重合反応を、室温および５５℃での測定について１分および４分
で停止し、そして７２℃での測定について１分のみで停止した。

【０１２６】これら高温性酵素の各々のポリメラーゼ活性は、室温ではクレノウフラグメン
トにより有意に抑制された。７２℃では、クレノウは、このポリメラーゼ活性の
有効なインヒビターではなかった。

【０１２７】（実施例３）ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を、一本鎖
の３４マーＤＮＡ基質を使用して測定した。このエキソヌクレアーゼ指向性（ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ）のＤＮＡ消化を、クレノウフラグメント（変異体Ｃ）の存在下
および非存在下で、室温、３７℃および７２℃にて測定した。このオリゴヌクレ
オチド基質の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して³²Ｐで標識
した。

【０１２８】ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼをクレノウフラグメントおよびＭｇＣｌ₂の存在
下で３４マー基質の溶液に添加することによって、エキソヌクレアーゼ反応を開
始した。コントロール反応（図３；パネルＡを参照のこと）について、クレノウ
フラグメントは存在しなかった。各反応について、ＤＮＡ基質の反応濃度は、９
ｎＭであり、そしてＭｇＣｌ₂が約２ｍＭであった。ＴｎｅＤＮＡポリメラー
ゼの濃度は６０ｎＭであったが、クレノウフラグメントの濃度は、０から２０μ
Ｍまで変化した。

【０１２９】ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、クレノ
ウフラグメントの存在下で、室温および３７℃にて有意に阻害された。

【０１３０】理解を明確にする目的のために、例示および実施例によりここに本発明をいく
らか詳細に十分に記載してきたが、広範かつ等価な範囲の条件、処方および他の
パラメーター内で本発明を改変または変更することによって、本発明の範囲また
はその任意の特定の実施形態に影響することなく本発明が実施され得ること、な
らびにこのような改変または変更が添付の特許請求の範囲内の包含されることが
意図されることが、当業者には明らかである。

【０１３１】本明細書中にて言及される刊行物、特許および特許出願すべてが、本発明が関
連する分野の当業者のレベルを示し、かつ個々の刊行物、特許または特許出願が
特に個別に参考として援用されることが示されるのと同じ程度に、本明細書中に
て参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、周囲温度での、Ｅ．ｃｏｌｉのポリメラーゼＩの不活化クレノウフラ
グメント（ｐｏｌ^-およびｅｘｏ^-）誘導体を用いた、逆転写酵素（ＲＴ）によっ
て触媒されるＤＮＡ重合反応の阻害を示す。Ｐは、ＤＮＡプライマー（３４マー
）の位置を示し、そしてＦ．Ｌ．は、完全に伸長された生成物（６０マー）であ
る。パネルＡおよびＢは、それぞれ周囲温度および５０℃における、クレノウフ
ラグメント誘導体の濃度の関数としての、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ^TM（逆転写
酵素のＲＮａｓｅＨ欠失変異体）によって触媒されるＤＮＡポリメラーゼ反応
を示す。反応混合物中のクレノウフラグメント：ＲＴの割合は：ａと示されるレ
ーンに関しては、クレノウフラグメントは添加されず；ｂでは、５２：１；ｃで
は、２６：１；ｄでは、５．２：１、そしてｅでは１：１であった。各タンパク
質条件に関して、反応は、インキュベーションの１および６分後に停止した。パネルＡおよびＢに示される、阻害ポリメラーゼ活性に使用されたクレノウフ
ラグメントの変異体誘導体の残渣のポリメラーゼ活性を、パネルＣに示す。３つ
の時点（左から右に１、５および２０分）は、変異Ｋ７５８ＡおよびＤ８８２Ａ
（ｐｏｌ^-）ならびにＤ３５５ＡおよびＥ３５７Ａ（ｅｘｏ^-）を保有する変異体
クレノウフラグメントによって触媒されるポリメラーゼ反応を示す。

【図２】図２は、周囲温度における、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（５’から３’ｅｘｏ^-；Ｄ１３
７Ａ）およびＫＯＤ高温性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡポリメ
ラーゼ反応の、Ｅ．ｃｏｌｉのポリメラーゼＩの不活化クレノウフラグメント（
ｐｏｌ^-およびｅｘｏ^-）誘導体による阻害を示す。Ｐは、ＤＮＡ基質（プライマ
ー）の位置を示し、そしてＦ．Ｌ．は、完全に伸長された生成物である。ａ、ｂ
およびｃで標識されたレーンは、それぞれ、周囲温度、５５℃および７２℃での
反応温度を示す。周囲温度および５５℃での反応に関して、その反応は、３０秒
および２分で停止させ、一方、７２℃では重合開始後３０秒でのみ停止させた。
３つのポリメラーゼ各々に関して、左のパネルは、過剰のクレノウフラグメント
の存在下で触媒された重合に関するパネルであり、一方、右のパネルは、クレノ
ウフラグメントの非存在下で触媒された反応に関するパネルである。

【図３】図３は、Ｔｎｅ（ｐｏｌ⁺、３’から５’エキソヌクレアーゼ⁺および５’から
３’エキソヌクレアーゼ^-）の存在下で、変異クレノウフラグメント（ｐｏｌ^-お
よびｅｘｏ^-）を用いた一本鎖プライマーの分解の阻害を示す。図３は、周囲温
度および３７℃での、Ｅ．ｃｏｌｉのポリメラーゼＩの不活化クレノウフラグメ
ント誘導体（Ｋ７５８Ａ、Ｄ８８２Ａ、Ｄ３５５ＡおよびＥ３５７Ａ）を用いた
、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ（５’ｅｘｏ^-／Ｄ１３７Ａ）によって触媒され
る３’から５’エキソヌクレアーゼ反応の阻害を示す。Ｐは、ＤＮＡ基質（３４
マー）の位置を示す。レーンＣ（左のレーン）は、標識されたオリゴヌクレオチ
ド基質のコントロールレーンである。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、クレノウフ
ラグメントの変化する濃度での、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼによって触媒され
る３’から５’エキソヌクレアーゼ反応を示す。パネルＡは、クレノウフラグメ
ントの非存在下での反応を示し；パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれ、５μＭ、
１０μＭおよび２０μＭのクレノウフラグメントの存在下での反応を示す。各反
応条件に関して、ＤＮＡ基質およびＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ濃度は、それぞ
れ、９ｎＭおよび６０ｎＭに維持された。３４マーの基質のエキソヌクレアーゼ
消化は、周囲温度、３７℃および７２℃で測定した。各反応条件に関して、消化
は、Ｔｎｅの添加による反応開始後、５および２０分で停止した。各温度での反
応のサブパネルの左および右のレーンは、５および２０分で急冷された反応を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/99 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＰＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シャンディリア，ハリニアメリカ合衆国メリーランド 21774，ニューマーケット，トゥエインドライブ 6115 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 4B024 AA11 AA20 BA10 BA80 CA01 CA02 CA04 CA11 CA12 CA20 DA01 DA06 DA12 EA04 GA11 GA25 HA01 HA03 HA11 HA19 HA20 4B050 CC04 FF09E GG01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR48 QR62 4B065 AA26X AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA02 BA16 BB06 BD01 BD14 CA29 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸合成を阻害するための組成物であって、１以上の二本鎖
核酸分子および／または１以上の一本鎖核酸分子、ならびに／あるいは一本鎖／
二本鎖核酸複合体に結合し得るかまたはそれらに対する親和性を有するポリペプ
チドを含む、組成物。
【請求項２】前記ポリペプチドが、減少されたかまたは実質的に減少され
たポリメラーゼ活性を有するか、あるいはポリメラーゼ活性を有さない、請求項
１に記載の組成物。
【請求項３】前記ポリペプチドが、減少されたか、または実質的に減少さ
れたエキソヌクレアーゼ活性を有するか、あるいはエキソヌクレアーゼ活性を有
さない、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】前記エキソヌクレアーゼ活性が、３’→５’エキソヌクレア
ーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性からなる群より選択される、
請求項３に記載の組成物。
【請求項５】前記ポリペプチドが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラ
ーゼ、逆転写酵素、複製酵素、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌク
レアーゼ、転写因子、組換えタンパク質、ＤＮＡ修復酵素、制限酵素、構造タン
パク質、トポイソメラーゼまたはそれらの組み合わせから誘導される、請求項１
に記載の組成物。
【請求項６】前記ポリメラーゼまたは逆転写酵素が、ポリメラーゼ活性を
減少するか、実質的に減少するか、または排除する改変あるいは変異を含む、請
求項５に記載の組成物。
【請求項７】前記改変または変異が、ポリメラーゼドメイン中にある、請
求項６に記載の組成物。
【請求項８】前記ポリペプチドが、不耐熱性である、請求項１に記載の組
成物。
【請求項９】前記ポリペプチドの結合または親和性が、核酸合成のための
条件下で阻害されるか、減少されるか、実質的に減少されるか、または排除され
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】前記ポリペプチドが、核酸合成のための条件下で不活化ま
たは変性される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】前記ポリペプチドが、ｐｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼから
誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】核酸ポリメラーゼ活性を有する１以上の酵素をさらに含む
、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】前記酵素が、高温性である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】前記高温性酵素が、核酸合成のための条件下でポリメラー
ゼ活性を維持する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】前記核酸ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素からなる群より選択される、請求
項１３に記載の組成物。
【請求項１６】前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ、ＴｍａＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＶＥＮＴ^TM ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ^TM ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｔＤＮＡポリメラーゼ
、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請
求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】前記逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写
酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素およびＨＩＶ逆
転写酵素、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択さ
れる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】前記逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少さ
れている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】核酸分子を合成するための方法であって、以下：ａ．少なくとも１つの核酸テンプレートを１以上の請求項１に記載のポリペプ
チドと混合し、混合物を形成する工程；およびｂ．該テンプレートの全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子を合成するの
に十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項２０】核酸合成を妨げる条件下、および／または１以上の核酸合
成基質への前記ポリペプチドの結合を可能にする条件下で、前記混合する工程が
達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記ポリペプチドを不活化または変性するのに十分な条件
下、および／あるいは前記１以上の核酸合成基質への該ポリペプチドの結合を、
阻害するか、減少するか、実質的に減少するか、または排除するのに十分な条件
下で、前記第１の核酸分子の合成が達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】１以上のヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する１以上
のポリペプチド、および１以上のプライマーからなる群より選択される、少なく
とも１つの成分の存在下で、前記合成が達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】前記基質が、二本鎖核酸テンプレート／プライマー複合体
、一本鎖テンプレートおよび一本鎖プライマーからなる群より選択される、請求
項１９に記載の方法。
【請求項２４】前記第１の核酸分子を、該第１の核酸分子の全てまたは一
部に相補的な第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下でインキュベートする
工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】請求項１９に記載の方法に従って作製された、核酸分子。
【請求項２６】核酸分子を増幅するための方法であって、以下：ａ．少なくとも１つの核酸テンプレートを、１以上の請求項１に記載のポリペ
プチドと混合する工程；およびｂ．該テンプレートの全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子を増幅するの
に十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項２７】核酸増幅を妨げる条件下、および／または１以上の核酸増
幅基質への前記ポリペプチドの結合を可能にする条件下で、前記混合する工程が
達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記ポリペプチドを不活化または変性するのに十分な条件
下、および／あるいは前記１以上の核酸合成基質への前記ポリペプチドの結合を
、阻害するか、減少するか、実質的に減少するか、または排除するのに十分な条
件下で、前記増幅工程が達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】１以上のヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する１以上
のポリペプチド、および１以上のプライマーからなる群より選択される、少なく
とも１つの成分の存在下で、前記合成が達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】前記基質が、二本鎖核酸テンプレート／プライマー複合体
、一本鎖テンプレートおよび一本鎖プライマーからなる群より選択される、請求
項２６に記載の方法。
【請求項３１】請求項２６に記載の方法に従って増幅された、核酸分子。
【請求項３２】核酸分子を配列決定するための方法であって、以下：ａ．配列決定する少なくとも１つの核酸分子を、１以上の請求項１に記載のポ
リペプチドおよび１以上の終結因子と混合し、混合物を形成する工程；ｂ．配列決定する該分子の全てまたは一部に相補的な分子の集団を合成するの
に十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程；およびｃ．該集団を分離して、該配列決定する分子の全てまたは一部のヌクレオチド
配列を決定する工程を包含する、方法。
【請求項３３】合成を妨げるのに十分な条件下、および／または１以上の
核酸配列決定基質への前記ポリペプチドの結合を可能にするのに十分な条件下で
、前記混合する工程が達成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記ポリペプチドを不活性化または変性するのに十分な条
件下、および／あるいは前記１以上の核酸配列決定基質への前記ポリペプチドの
結合を、阻害するか、減少するか、実質的に減少するか、または排除するのに十
分な条件下で、前記配列決定する分子の全てまたは一部に相補的な分子の集団の
前記合成が達成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】１以上のヌクレオチド、ポリメラーゼ活性を有する１以上
のポリペプチド、および１以上のプライマーからなる群より選択される、少なく
とも１つの成分の存在下で、前記合成が達成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】前記基質が、配列決定する二本鎖分子／プライマー複合体
、配列決定する一本鎖分子および一本鎖プライマーからなる群より選択される、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】１以上の請求項１に記載のポリペプチドを含む、核酸分子
の合成における使用のためのキット。
【請求項３８】請求項３７に記載のキットであって、１以上のヌクレオチ
ド、１以上のＤＮＡポリメラーゼ、１以上の逆転写酵素、１以上の適切な緩衝液
、１以上のプライマーおよび１以上の終結因子からなる群より選択される、１以
上の成分をさらに含む、キット。
【請求項３９】ポリメラーゼ活性を減少するか、実質的に減少するか、ま
たは排除するように改変もしくは変異された、阻害性ポリペプチド。
【請求項４０】エキソヌクレアーゼ活性を減少するか、実質的に減少する
か、または排除するように改変もしくは変異された、阻害性ポリペプチド。
【請求項４１】請求項３９または請求項４０に記載のポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む、ベクター。
【請求項４２】請求項４１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】請求項３９または請求項４０に記載のポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む、宿主細胞。
【請求項４４】ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：ａ．請求項４２に記載の宿主細胞を培養する工程：ｂ．前記遺伝子を発現させる工程；およびｃ．該宿主細胞から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、方法。
【請求項４５】核酸分子を合成する方法であって、以下：ａ．少なくとも１つの核酸テンプレートを、核酸合成を妨げるかまたは阻害す
るのに十分な条件下で、１以上の請求項３９および／または請求項４０に記載の
ポリペプチドと混合する工程；ならびにｂ．該テンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子の合成を可能にする
のに十分な、該ポリペプチドを不活化または変性するのに十分な条件下で、該混
合物をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項４６】ＤＮＡ分子を配列決定する方法であって、以下：ａ．配列決定する第１のＤＮＡ分子に、１以上のヌクレオチド、１以上の請求
項３９および／または請求項４０に記載のポリペプチド、ならびに少なくとも１
つの終結因子を、核酸合成を妨げるかまたは阻害するのに十分な条件下で提供す
る工程；ｂ．該第１のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子の無作為集団の合成を可能にす
るのに十分な、該ポリペプチドを不活化または変性するのに十分な条件下で、工
程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であって、該合成されたＤＮＡ分子
は、該第１のＤＮＡ分子より短い長さであり、かつ該合成されたＤＮＡ分子は、
その５’末端でターミネーターヌクレオチドを含む、工程；およびｃ．該合成されたＤＮＡ分子をサイズによって分離し、その結果、該第１のＤ
ＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定し得る、工程を包含する、方法。
【請求項４７】二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するための方法であって、以下：ａ．第１のプライマーおよび第２のプライマー、ならびに１以上の請求項３９
および／または請求項４０に記載のポリペプチドを、該ポリペプチドが核酸分子
の合成を妨げるかもしくは阻害するような条件下で提供する工程であって、該第
１のプライマーは、該ＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端または３’末端近辺の配
列に相補的であり、かつ該第２のプライマーは、該ＤＮＡの第２の鎖の３’末端
または３’末端近辺に相補的である、工程；ｂ．該第１のプライマーを該第１の鎖に、そして該第２のプライマーを該第２
の鎖にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした分子を形成する工程；ｃ．該第１の鎖に相補的な第３のＤＮＡ分子および該第２の鎖に相補的な第４
のＤＮＡ分子の合成を可能にするのに十分な、該ポリペプチドを不活化または変
性するのに十分な条件下で、該ハイブリダイズした分子をインキュベートする工
程；ｄ．該第１および第３の鎖、ならびに該第２および第４の鎖を変性させる工程
；ならびにｅ．工程（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）を、１回以上繰り返す工程を包含する、方法。
【請求項４８】ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法であって、以下：ａ．１以上のｍＲＮＡテンプレートを、１以上の請求項３９および／または請
求項４０に記載のポリペプチドと混合する工程；およびｂ．該テンプレートの全てまたは一部に相補的なｃＤＮＡ分子を合成するのに
十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項４９】ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法であって、以下：ａ．核酸合成を妨げるかもしくは阻害するのに十分な条件下で、１以上のｍＲ
ＮＡテンプレートを、１以上の請求項３９および／または請求項４０に記載のポ
リペプチドと混合する工程；ならびにｂ．該テンプレートの全てまたは一部に相補的なｃＤＮＡ分子の合成を可能に
するのに十分な、該ポリペプチドを不活化または変性するのに十分な条件下で、
該混合物をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項５０】核酸分子を増幅するための方法であって、以下：ａ．核酸増幅を妨げるかもしくは阻害するのに十分な条件下で、少なくとも１
つの核酸テンプレートを、１以上の請求項３９および／または請求項４０に記載
のポリペプチドと混合する工程；ならびにｂ．該テンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子の合成を可能にする
のに十分な、該ポリペプチドを不活化または変性するのに十分な条件下で、該混
合物をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項５１】核酸分子の分解を妨げるための方法であって、以下：ａ．減少されたかまたは実質的に減少されたヌクレアーゼ活性を有するか、あ
るいはヌクレアーゼ活性を有さない、１以上の改変または変異されたヌクレアー
ゼを得る工程；およびｂ．該ヌクレアーゼを、１以上の核酸分子と、ヌクレアーゼ活性を有する１以
上のヌクレアーゼによる該分子の分解を妨げるのに十分な条件下で接触させる工
程を包含する、方法。
【請求項５２】前記ポリペプチドが、１以上の核酸分子に結合されている
、請求項１に記載の組成物。