DE60029927T2

DE60029927T2 - Thermostabiles enzym welches die genauigkeit thermostabiler dna polymerasen erhöht - zur verbesserung der in vitro nucleinsäuresynthese und amplifikation

Info

Publication number: DE60029927T2
Application number: DE60029927T
Authority: DE
Inventors: Waltraud Ankenbauer; Frank Laue; Harald Sobek; Michael Greif
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-09-28
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2020-09-28
Also published as: CA2351634C; RU2260055C2; CA2351634A1; NO20012561L; EP1088891A1; ATE335825T1; NO20012561D0; CN1185347C; EP1088891B1; CN1343254A; IL143141A0; NZ511759A; US20060078928A1; WO2001023583A2; ES2269189T3; DE69923180T2; ATE286981T1; WO2001023583A3; EP1144653B1; JP2003510084A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Molekularbiologie und genauer gesagt auf Nukleotidsynthese. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine im wesentlichen reine thermostabile Exonuklease, die Klonierung und Expression einer thermostabilen Exonuklease III in E. coli und ihre Verwendung in Amplifikationsreaktionen. Die Erfindung ermöglicht die hochgenaue Amplifikation von DNA unter Bedingungen, welche die Dekontamination von Übertrag („Carry Over") und die Synthese langer Produkte gestattet. Die Erfindung kann für eine Vielzahl von industriellen, medizinischen und forensischen Zwecken eingesetzt werden.
Hintergrund der Erfindung
Die in vitro Nukleinsäuresynthese wird routinemäßig mit DNA-Polymerasen mit oder ohne zusätzliche Polypeptide durchgeführt. DNA-Polymerasen sind eine Familie von Enzymen, die bei der DNA-Replikation und Reparatur beteiligt sind. Ausgiebige Forschung ist bezüglich der Isolation von DNA-Polymerasen aus mesophilen Mikroorganismen wie etwa E. coli durchgeführt worden. Siehe beispielsweise Bessman et al. (1959), J. Biol. Chem. 223: 171–177, und Buttin und Kornberg (1966), J. Biol. Chem. 241: 5419–5427.
Auch ist Forschung an Isolation und Reinigung von DNA-Polymerasen aus Thermophilen, wie etwa Thermus aquaticus, durchgeführt worden. A. Chien et al. (1976), J. Bacteriol. 127: 1550–1557 offenbaren die Isolation und Reinigung einer DNA-Polymerase mit einem Temperaturoptimum von 80°C aus dem Thermus aquaticus YTI-Stamm. Das US-Patent Nr. 4,889,818 offenbart eine gereinigte thermostabile DNA-Polymerase aus T. aquaticus, Taq-Polymerase mit einem Molekulargewicht von etwa 86.000 bis 90.000 Dalton. Zusätzlich offenbart die europäische Patentanmeldung 0 258 017 Taq-Polymerase als bevorzugtes Enzym zur Verwendung im PCR-Verfahren.
Die Forschung hat aufgezeigt, dass, während Taq-DNA-Polymerase eine 5'-3'-Polymerase-abhängige Exonukleasefunktion hat, die Taq-DNA-Polymerase keine 3'- 5'-Exonuklease III-Funktion besitzt (F. C. Lawyer et al. (1989), J. Biol. Chem., 264: 6427–6437; Bernad A., et al. (1989) Cell 59: 219). Die 3'-5'-Exonuklease III-Aktivität von DNA-Polymerasen wird üblicherweise als "Proofreading"-Aktivität (Gegenleseaktivität) bezeichnet. Die 3'-5'-Exonuklease III-Akivität entfernt Basen, die am 3'-Ende eines Primer-Template-Duplex falsch eingepasst sind. Die Anwesenheit der 3'-5'-Exonuklease-Aktivität kann vorteilhaft sein, da sie zu einem Steigern der Zuverlässigkeit der Replikation von Nukleinsäuresträngen und zur Elongation von vorzeitig beendeten Produkten führt. Da Taq DNA-Polymerase nicht in der Lage ist, nicht passende Primerenden zu entfernen, ist sie für Baseneinbaufehler anfällig, was ihren Einsatz bei gewissen Anwendungen unerwünscht macht. Beispielsweise ist der Versuch, ein amplifiziertes Gen zu klonieren, problematisch, da jede Kopie des Gens einen Fehler aufgrund von zufälligen Misseinbauereignissen enthalten kann. Abhängig vom Zyklus, in dem dieser Fehler auftritt (z.B. in einem frühen Replikationszyklus), könnte die gesamte amplifizierte DNA die fehlerhaft eingebaute Base enthalten, was somit zu einem mutierten Genprodukt führt.
Es sind im Stand der Technik mehrere thermostabile DNA-Polymerasen bekannt, die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zeigen, wie B-Typ-Polymerasen aus thermophilen Archaebacteria, die für hochgenaue DNA-Amplifikation verwendet werden. Thermostabile Polymerasen, die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zeigen, können aus Pyrococcus isoliert oder geklont werden (Gereinigte thermostabile Pyrococcus furiosus DNA-Polymerase, E. Mathur, Stratagene, WO 92/09689, US 5,545,552 ; gereinigte thermostabile DNA-Polymerase aus Pyrococcus species, D. G. Comb et al., New England Biolabs, Inc., EP 0 547 359 ; Organization and nucleotide sequence of the DNA Polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus, T. Uemori et al. (1993), Nucl. Acids Res., 21: 259–265), aus Pyrodictium spec. (Thermostabile Nukleinsäurepolymerase, D. H. Gelfand, F. Hoffmann-La Roche AG, EP 0 624 641 ; Gereinigte thermostabile Nukleinsäurepolymerase und DNA-Codiersequenzen aus Pyrodictium species, D. H. Gelfand, Hoffmann-La Roche Inc., US 5,491,086 ), aus Thermococcus (z.B. Thermostabile DNA-Polymerase aus Thermococcus spec. TY, F. Niehaus et al., WO 97/35988; Gereinigte Thermococcus barossii-DNA-Polymerase, R. A. Luhm, Pharmacia Biotech, Inc., WO 96/22389; DNA-Polymerase aus Thermococcus barossii mit mittlerer Exonuklease-Aktivität und besserer Langzeitstabilität bei hoher Temperatur, die für DNA-Sequenzierung, PCR etc. nützlich ist, O. B. Dhennezel, Pharmacia Biotech Inc., WO 96/22389; Eine gereinigte thermostabile DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralis zur Verwendung bei DNA-Manipulationen, D. G. Comb, New England Biolabs, Inc., US 5,322,785 , EP 0 455 430 ; Rekombinante thermostabile DNA-Polymerase aus Archaebacteria, D. G. Comb, New England Biolabs, Inc., US 5,352,778 , EP 0 547 920 , EP 0 701 000 ; Neu isolierte thermostabile DNA-Polymerase, die aus Thermococcus gorgonarius erhalten wurde. B. Angerer et al., Boehringer Mannheim GmbH, WO 98/14590.
Eine andere Möglichkeit, PCR in Anwesenheit einer Gegenlesefunktion zu verleihen, ist die Verwendung einer Mischung von Polymeraseenzymen, wobei eine Polymerase solch eine Gegenleseaktivität zeigt (z.B. Thermostabile DNA-Polymerase mit verbesserter Thermostabilität und verbesserter Länge und Effizienz der Primerextension, W. M. Barnes, US 5,436,149 , EP 0 693 078 ; Neue Polymerasezusammensetzungen und Verwendung derselben, J. A. Sorge, Stratagene, WO 95/16028 und Amplifikation langer Nukleinsäuresequenzen durch PCR, Cheng, S., EP 0 669 401 ). Es ist übliche Praxis, eine Formulierung einer thermostabilen DNA-Polymerase zu verwenden, die eine Hauptkomponente zumindest einer thermostabilen DNA-Polymerase umfasst, der 3'-5'-Exonuklease-Aktivität fehlt und eine Nebenkomponente, die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zeigt, z.B. Taq-Polymerase und Pfu DNA-Polymerase. Bei diesen Mischungen wird die Prozessivität durch das pol I-Typ-Enzym wie die Taq-Polymerase verliehen, und die Gegenlesefunktion durch die thermostabile B-Typ-Polymerase, wie Pfu. Hochgenaue DNA-Synthese ist ein wünschenswerter Parameter bei der Nukleinsäureamplifikation, ein anderes wichtiges Merkmal ist die Möglichkeit der Dekontamination.
Die Polymerasekettenreaktion kann ein einzelnes Molekül über 1 Milliarden mal amplifizieren. Somit können selbst kleinste Mengen an Kontaminanten amplifiziert werden und zu einem falsch-positiven Resultat führen. Solche Kontaminanten sind oft Produkte von verschiedenen PCR-Amplifikationen (Übertragskontamination). Daher haben Forscher Verfahren entwickelt, um solch eine Kontamination zu vermeiden.
Die Prozedur stützt sich auf die Substitution von TTP durch dUTP während der PCR-Amplifikation, um Uracil-enthaltende DNA (U-DNA) herzustellen. Das Behandeln nachfolgender PCR-Reaktionsmischungen mit Uracil-DNA-Glycosylase (UNG) vor der PCR-Amplifikation führt dazu, dass kontaminierende Nukleinsäure abgebaut wird und nicht zur Amplifikation geeignet ist. dUTP kann leicht durch polI-Typ thermostabile Polymerasen, aber nicht durch B-Typ-Polymerasen eingebaut werden (G. Slupphaug et al. (1993), Anal. Biochem. 211: 164–169). Der niedrige Einbau von dUTP durch B-Typ-Polymerasen beschränkt ihre Verwendung in Laboratorien, in denen dieselbe Art von Template wiederholt durch PCR-Amplifikation analysiert wird.
Thermostabile DNA-Polymerasen, die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zeigen, wurden auch aus Eubakterienstämmen wie Thermotoga isoliert (Thermophile DNA-Polymerasen aus Thermotoga neapolitana, M. R. Slater et al., Promega Corporation, WO 96/41014; Geklonte DNA-Polymerase aus Thermotoga neapolitana und Mutanten derselben, A. J. Hughes et al., Life Technologies, Inc., WO 96/10640; Gereinigtes thermostabiles Nukleinsäure-Polymeraseenzym aus Termotoga maritima, D. H. Gelfand et al., CETUS Corporation, WO 92/03556). Diese Enzyme haben eine starke 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, die in der Lage ist, falsch-eingebaute oder nicht-passende Basen zu eliminieren. Eine genetisch veränderte Version dieses Enzyms ist kommerziell als ULTma erhältlich, eine DNA-Polymerase, die ohne zusätzliche Polypeptide für den PCR-Prozess verwendet werden kann. Dieses Enzym ist fähig, falsch-eingebaute Basen zu entfernen, dUTP einzubauen, aber die Genauigkeit ist aus unbekannten Gründen nicht höher als die der Taq-Polymerase (Accuracy of replication in the polymerase chain reaction, R. S. Diaz et al., Braz. J. Med. Biol. Res. (1998) 31: 1239–1242; PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostabile DNA polymerases, J. Cline et al., Nucleic Acids Res. (1996) 24: 3546–3551).
Für eine hochgenaue DNA-Synthese ist eine andere Alternative zur Verwendung von B-Typ-Polymerasen oder Mischungen, die sie enthaften, die Verwendung von thermophilem DNA-Polymerase III-Holoenzym, einem Komplex aus 18 Polypeptidketten. Diese Komplexe sind identisch mit den bakteriellen chromosomalen Replikasen und umfassen alle Faktoren, die zur Synthese eines DNA-Strangs von mehreren 100 Kilobasen oder gesamten Chromosomen notwendig sind. Die 10 verschiedenen Untereinheiten dieses Enzyms, von denen einige in mehreren Kopien vorhanden sind, können durch rekombinante Techniken hergestellt, rekonstituiert und zur in vitro-DNA-Synthese verwendet werden. Als eine mögliche Verwendung dieser Komplexe wird die PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren von mehreren Tausend bis Hunderttausenden von Basenpaaren vorgeschlagen. (Aus thermophilen Organismen abgeleitetes Enzym, das als chromosomale Replikase dient und Gewinnung und Verwendungen desselben, O. Yurieva et al., The Rockefeller University, WO 98/45452; Neuartiges thermophiles Polymerase III-Holoenzym, C. McHenry, ENZYCO Inc., WO 99/13060).
Das Ziel gemäß dieser Erfindung war es, ein hochgenaues PCR-System zu entwickeln und es weiter verbessert bereitzustellen, das vorzugsweise gleichzeitig in der Lage ist, dUTP einzubauen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein thermostabiles Enzym, das 3'-Exonuklease-Aktivität zeigt, aber keine Polymerase-Aktivität, bereitgestellt, während dieses Enzym die Genauigkeit eines Amplifikationsprozesses verbessert, wenn es einem zweiten thermostabilen Enzym, das Polymerase-Aktivität zeigt, zugegeben wird. Das bereitgestellte erste Enzym kann fehlgepaarte Primerenden ausschneiden, um dem zweiten Enzym, das Polymerase-Aktivität zeigt, z.B. Taq-Polymerase, zu gestatten, während eines Prozesses der Synthetisierung von DNA zu reassoziieren und die Elongation wieder aufzunehmen. Das erste Enzym ist in der Lage, als Gegenleseenzym mit einem zweiten, Polymerase-Aktivität zeigenden Enzym zu kooperieren. Es wurde gefunden, dass das Enzym, das für diese Aufgabe geeignet ist, z.B. eine thermostabile Exonuklease III ist. Es wird eine Exonuklease III bevorzugt, die von 3' nach 5'-Richtung arbeitet und 5' des Phosphats spaltet, was eine 3'-Hydroxylgruppe zurücklässt und die idealerweise nur bei doppelsträngiger DNA arbeitet. Die 3'-5'-Exonukleasefunktionen von DNA-Polymerasen sind auf Doppel- und Einzelstrang-DNA aktiv. Die letztere Aktivität kann zu Primerdegradierung führen, was bei PCR-Ansätzen unerwünscht ist. Es wird bevorzugt, dass das Enzym bei 70°C bis 80°C aktiv ist, stabil genug ist, um die Denaturierungszyklen zu überstehen, und bei niedrigeren Temperaturen inaktiv ist, um die PCR-Produkte nach Abschluss des PCR-Prozesses undegradiert zu lassen. Diese Merkmale zeigende Enzyme können aus thermophilen Eubakterien oder verwandte Enzyme aus thermophilen Archaea gewonnen werden. Genome von drei thermostabilen Archaebacteria sind sequenziert, Methanococcus jannaschii (Complete Genome Sequence of the Methanogenic Aryhaeon, Methanococcus jannaschii, C. J. Bult et al. (1966), Science 273: 1058–1072), Methanobacterium thermoautotrophicum (Complete genomic sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum ΔH: Functional Analysis and Comparatice Genomics, D. R. Smith et al., J. of Bacteriology (1997) 179: 7135–7155) and Archaeoglobus fulgidus (The complete genome sequence of the hyperthermophilic, sulfate-reducing archaeon Archaeoglobus fulgidus, H. P. Klenk et al. (1997) Nature 390: 364–370).
Insbesondere wird ein aus Archaeoglobus fulgidus erhältliches Enzym bereitgestellt, das den Abbau von einem nicht-passenden Ende von Primern oder Polynukleotiden in 3'- zu 5'-Richtung bei doppelsträngiger DNA katalysiert. Das die aus Archaeoglobus fulgidus (Afu) erhältliche thermostabile Exonuklease codierende Gen wurde geklont, in E. coli exprimiert und isoliert. Das Enzym ist unter bei PCR-Reaktionen verwendeten Inkubations- und Temperaturbedingungen aktiv. Das Enzym unterstützt DNA-Polymerasen wie Taq beim Durchführen der DNA-Synthese bei niedrigen Fehlerraten und der Synthese von Produkten von mehr als 3 kb auf genomischer DNA – wobei der obere Bereich von Produkten durch Taq-Polymerase synthetisiert wird – bei guten Ausbeuten mit oder ohne in der Reaktionsmischung vorhandenem dUTP. Vorzugsweise wurden 50 bis 500 ng von aus Afu erhältlicher Exonuklease III pro 2,5 Einheiten von Taq-Polymerase verwendet, um eine optimale PCR-Leistung zu ergeben. Noch bevorzugter ist die Verwendung von 67 ng bis 380 ng von aus Afu erhältlicher Exonuklease III pro 2,5 Einheiten Taq-Polymerase in der PCR-Reaktion.
Der Vorteil der Verwendung des ersten Enzyms im Vergleich mit anderen Enzymen liegt darin, dass das erste Enzym vorzugsweise an doppelsträngiger DNA aktiv ist. Das thermostabile Enzym dieser Erfindung kann für jeglichen Zweck verwendet werden, bei dem eine solche Enzymaktivität notwendig oder gewünscht ist. Insbesonders wird das Enzym in Kombination mit einer thermostabilen DNA-Polymerase in der als PCR bekannten Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verwendet, um nicht-passende Primerenden zu entfernen, die zu vorzeitigen Abbrüchen führen, um Primerenden bereitzustellen, die effektiver durch die Polymerase verlängert werden, um Baseninkorporationsfehler zu korrigieren und um die Polymerase in die Lage zu versetzen, lange PCR-Produkte herzustellen.
Somit ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung, die ein erstes, eine 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigendes thermostabiles Enzym und die ein zweites, Polymerase-Aktivität zeigendes Enzym umfasst, während die Genauigkeit eines Amplifikationsprozesses durch die Verwendung dieser Zusammensetzung im Vergleich zur Verwendung des zweiten Enzyms allein verbessert wird. Das die 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigende thermostabile Enzym beinhaltet auch geeignete Enzyme, die eine verminderte DNA-Polymerase-Aktivität oder gar keine solche Aktivität zeigen. Eine verminderte DNA-Polymerase-Aktivität bedeutet gemäß dieser Erfindung weniger als 50% der Aktivität eines Enzyms, das DNA-Polymerase-Aktivität zeigt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform fehlt dem zweiten Enzym der erfinderischen Zusammensetzung die Gegenlesaktivität. Insbesondere bevorzugtest ist das zweite Enzym Taq-Polymerase.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur DNA-Synthese, das eine Mischung verwendet, die ein erstes, 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigendes thermostabiles Enzym und ein zweites, Polymerase-Aktivität zeigendes thermostabiles Enzym umfasst. Gemäß diesem Verfahren werden vorzeitig abgebrochene Ketten durch Degradierung von 3' nach 5' getrimmt. Nicht-passende Enden irgendeines Primers oder des wachsenden Strangs werden gemäß diesem Verfahren entfernt.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren gemäß der obigen Beschreibung, bei dem dUTP in der Reaktionsmischung vorhanden ist und TTP teils oder ganz ersetzt. Es wird bevorzugt, dass gemäß diesem Verfahren Uracil DNA-Glykosylase (UDG oder UNG) zum Abbau von kontaminierenden Nukleinsäuren verwendet wird.
Vorzugsweise erzeugt gemäß diesem Verfahren die Mischung eines

– ersten, 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine Polymerase-Aktivität zeigenden thermostabilen Enzyms und
– eines zweiten, Polymerase-Aktivität zeigenden thermostabilen Enzyms PCR-Produkte mit niedrigeren Fehlerraten im Vergleich zu durch das zweite, enzymhemmende Polymerase-Aktivität zeigende Enzym in Abwesenheit des ersten 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigenden thermostabilen Enzyms hergestellten PCR-Produkte. Das Verfahren, in welchem die Mischung des ersten, 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigenden thermostabilen Enzyms und eines Polymerase-Aktivität zeigenden thermostabilen zweiten Enzyms PCR-Produkte von größerer Länge im Vergleich zu PCR-Produkten zeigt, die durch die zweite, Polymerase-Aktivität zeigendes Enzym in Abwesenheit des ersten, 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigenden thermostabilen Enzyms, erzeugt. Weiterhin ist das erste, 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigende thermostabile Enzym mit der Exonuklease III von E. coli verwandt, aber gemäß diesem Verfahren thermostabil. Eine weitere Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist das Verfahren, bei dem PCR-Produkte mit stumpfen Enden erhalten werden.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Erhalten des erfindungsgemäßen thermostabilen, 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine Polymerase-Aktivität zeigenden Enzyms und Mittel und Materialien zur Herstellung dieses Enzyms, wie beispielsweise Vektoren und Wirtszellen (z.B. DSM Nr. 13021).
Die folgenden Beispiele werden für den Zweck des Illustrierens, nicht Beschränkens der vorliegenden Erfindung angeboten.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des die DNA-Polymerase aus Exonuklease III von Archaeoglobus fulgidus kodierenden Gens.
2: Widerstand gegenüber Hitzedenaturierung der rekombinanten Exonuklease III von Archaeoglobus fulgidus, exprimiert in E. coli, wie in Beispiel V beschrieben.
Spur 1: Inkubation bei 50°C
Spur 2: Inkubation bei 60°C
Spur 3: Inkubation bei 70°C
Spur 4: Inkubation bei 80°C
Spur 5: Inkubation bei 90°C
Spur 6: E. coli-Wirtszellextrakt, nicht mit dem, Afu-Exonuklease III-codierenden Gen transformiert
Spur 7: Exonuklease III von E. coli
Spur 8: Molekulargewichtsmarker
3: Exonuklease-Aktivität von Afu-Exonuklease III auf DNA-Fragmente, wie in Beispiel VI beschrieben.
Spur 1: 10 Einheiten E. coli-Exonuklease III, Inkubation bei 37°C
Spur 2: 50 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 3: 100 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 4: 150 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 5: 100 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 6: 200 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 7: 300 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 8: 250 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 9: 750 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 10: 1 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 11: 500 ng Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 12: 1 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 13: 1,5 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 14: 1,5 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 15: 3 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 16: 4,5 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 17: 7,6 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 18: 15,2 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 19: 22,8 μg Afu-Exonuklease III, Inkubation bei 72°C
Spur 20: keine Exonuklease zugegeben
4: Prinzip des Fehlpassungskorrektur-Assays
5: Korrektur nicht-passender Primer in der PCR, wie in Beispiel VII beschrieben.
Spur 1: DNA-Molekulargewichtsmarker V (ROCHE Molecular Biochemicals Nr. 821705)
Spur 2: G:A nicht passender Primer, Amplifikation mit Taq DNA-Polymerase
Spur 3: dasselbe wie in Spur 2, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 4: G:A nicht passender Primer, Amplifikation mit Expand HiFi PCR-System
Spur 5: dasselbe wie in Spur 4, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 6: G:A nicht passender Primer, Amplifikation mit Taq-Polymerase/Afu-Exonuklease III
Spur 7: dasselbe wie in Spur 6, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 8: G:A nicht passender Primer, Amplifikation mit Tgo DNA-Polymerase
Spur 9: dasselbe wie in Spur 8, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 10: G:T nicht passender Primer, Amplifikation mit Taq-DNA-Polymerase
Spur 11: dasselbe wie in Spur 10, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 12: G:T nicht passender Primer, Amplifikation mit Expand HiFi-PCR-System
Spur 13: dasselbe wie in Spur 12, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 14: G:T nicht passender Primer, Amplifikation mit Taq-Polymerase/Afu-Exonuklease III
Spur 15: dasselbe wie in Spur 14, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 16: G:T nicht passender Primer, Amplifikation mit Tgo-DNA-Polymerase
Spur 17: dasselbe wie in Spur 16, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 18: DNA-Molekulargewichtsmarker V
Spur 19: DNA-Molekulargewichtsmarker V
Spur 20: G:C nicht passender Primer, Amplifikation mit Taq-DNA-Polymerase
Spur 21: dasselbe wie in Spur 20, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 22: G:C nicht passender Primer, Amplifikation mit Expand HiFi-PCR-System
Spur 23: dasselbe wie in Spur 22, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 24: G:C nicht passender Primer, Amplifikation mit Taq-Polymerase/Afu-Exonuklease III
Spur 25: dasselbe wie in Spur 24, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 26: G:C nicht passender Primer, Amplifikation mit Tgo-DNA-Polymerase
Spur 27: dasselbe wie in Spur 26, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 28: CG:AT nicht passender Primer, Taq-DNA-Polymerase
Spur 29: dasselbe wie in Spur 28, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 30: CG:At nicht passender Primer, Expand HiFi-PCR-System
Spur 31: dasselbe wie in Spur 2, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 32: CG:AT nicht passender Primer, Taq-Polymerase/Afu-Exonuklease III
Spur 33: dasselbe wie in Spur 2, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 34: CG:AT nicht passender Primer, Amplifikation mit Tgo-DNA-Polymerase
Spur 35: dasselbe wie in Spur 2, aber nachfolgend mit BsiEI gespalten
Spur 36: DNA-Molekulargewichtsmarker V.
6A: Fehlerraten verschiedener Polymerasen in PCR
6B: Verbesserung der Genauigkeit durch in der PCR-Mischung vorhandene Afu-Exonuklease III, wie in Beispiel VIII beschrieben.
Das Verhältnis von blauen zu weißen Kolonien wurde geblottet und verschiedene Mischungen von Taq-DNA-Polymerase und Afu-Exonuklease III (Taq/Exo 1:30, Taq/Exo 1:20, Taq/Exo 1:15, Taq/Exo 1:12,5, Taq/Exo 1:10 entsprechend 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, gemischt mit 125 ng, 175 ng, 250 ng, 375 ng bzw. 500 ng Afu-Exonuklease III) wurden im Vergleich mit Taq-DNA-Polymerase (Taq), Expand HiFi-PCR-System (HiFi) und Pwo DNA-Polymerase (Pwo) getestet.
7: Einbau von dUTP durch die Taq-DNA-Polymerase/Afu-Exonuklease III-Mischung, wie in Beispiel IX beschrieben.
Spur 1: DNA-Molekulargewichts-Marker XIV (Roche Molecular Biochemicals Nr. 1721933)
Spur 2: Amplifikation mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase
Spur 3: Amplifikation mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III
Spur 4: Amplifikation mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 250 ng Afu-Exonuklease III
Spur 5: Amplifikation mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 375 ng Afu-Exonuklease III
Spur 6: Amplifikation mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 500 ng Afu-Exonuklease III
8: Abbau von dUTP enthaltenen PCR-Produkten durch Uracil-DNA-Glycosylase, wie in Beispiel IX beschrieben.
Spur 1: DNA-Molekulargewichtsmarker XIV (Roche Molecular Biochemicals Nr. 1721933)
Spur 2: 1 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III und nachfolgender UNG- und Hitzebehandlung erhaltenen Amplifikationsprodukt
Spur 3: 2 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III und nachfolgender UNG- und Hitzebehandlung erhaltenen Amplifikationsprodukt
Spur 4: 3 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III und nachfolgender UNG- und Hitzebehandlung erhaltenen Amplifikationsprodukt
Spur 5: 4 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III und nachfolgender UNG- und Hitzebehandlung erhaltenen Amplifikationsprodukt
Spur 6: 5 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III und nachfolgender UNG- und Hitzebehandlung erhaltenen Amplifikationsprodukt
Spur 7: 5 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III ohne nachfolgende UNG- oder Hitzebehandlung erhaltenen Amplifikationsprodukt
Spur 8: 5 μl des mit Taq-DNA-Polymerase und 125 ng Afu-Exonuklease III ohne UNG- aber mit Hitzebehandlung
Spur 9: DNA-Molekulargewichtsmarker XIV (roche Molecular Biochemicals Nr. 1721933)
9: Wirkung von Afu-Exonuklease III auf die PCR-Produktlänge. Die Taq-DNA-Polymerase/Afu-Exonuklease III-Mischung wurde an humaner genomischer DNA analysiert, wie in Beispiel X beschrieben.
Spur 1: 9,3 kb tPA-Fragment mit Taq/Exo III-Mischung
Spur 2: 9,3 kb tPA-Fragment mit Taq-Pol.
Spur 3: 12 kb tPA-Fragment mit Taq/Exo III-Mischung
Spur 4: 12 kb tPA-Fragment mit Taq-Pol.
Spur 5: 15 kb tPA-Fragment mit Taq/Exo III-Mischung
Spur 6: 15 kb tPA-Fragment mit Taq-Pol.
10: Thermostabile Exonuklease III kann durch eine Polymerase-Mutante mit verminderter Polymerase-Aktivität, aber erhöhter 3'-Exonuklease-Aktivität ersetzt werden, wie in Beispiel XI beschrieben.
Spur 1: Molekulargewichtsmarker
Spur 2: Reaktion 1, Taq-Polymerase, 4,8 kb-Fragment
Spur 3: Reaktion 2, Taq-Polymerase plus Tag-Polymerasemutante, 4,8 kb-Fragment
Spur 4: Reaktion 3, keine Taq-Polymerase, Tag-Polymerasemutante, 4,8 kb-Fragment
Spur 5: Reaktion 4, Taq-Polymerase plus Afu ExoIII, 4,8 kb-Fragment
Spur 6: Reaktion 5, Taq-Polymerase, 9,3 kb-Fragment
Spur 7: Reaktion 6, Taq-Polymerase plus Tag-Polymerasemutante, 9,3 kb-Fragment
Spur 8: Reaktion 7, keine Taq-Polymerase, Tag-Polymerasemutante, 9,3 kb-Fragment
Spur 9: Reaktion 8, Taq-Polymerase plus TagAfu ExoIII, 9,3 kb-Fragment
Spur 10: Molekulargewichtsmarker
11. Afu Exonuklease III ist an linearer Einzelstrang-DNA nicht aktiv, wie in Beispiel XII beschrieben.
Spur 1: Afu ExoIII, keine Inkubation
Spur 2: Afu ExoIII, 1 h bei 65°C
Spur 3: Afu ExoIII, 2 h bei 65°C
Spur 4: Afu ExoIII, 3 h bei 65°C
Spur 5: Afu ExoIII, 4 h bei 65°C
Spur 6: Afu ExoIII, 5 h bei 65°C
Spur 7: Reaktionspuffer ohne Enzym, keine Inkubation
Spur 8: Reaktionspuffer ohne Enzym, 5 h bei 65°C
Spur 9: Molekulargewichtsmarker
12: Vergleich von Afu Exonuklease III mit thermostabiler Polymerase vom B-Typ bei Primer-degradierender Aktivität, wie in Beispiel XIII beschrieben.
Spur 1: Molekulargewichtsmarker
Spur 2: 1 u Tgo, vorinkubiert (Reaktion 1)
Spur 3: 1,5 u Tgo, vorinkubiert (Reaktion 2)
Spur 4: 1 u Tgo, nicht vorinkubiert (Reaktion 3)
Spur 5: 1,5 u Tgo, nicht vorinkubiert (Reaktion 4)
Spur 6: 1 u Tgo, vorinkubiert in Abwesenheit von dNTPs (Reaktion 5)
Spur 7: 1,5 u Tgo, vorinkubiert in Abwesenheit von dNTPs (Reaktion 6)
Spur 8: 1 u Tgo, nicht vorinkubiert in Abwesenheit von dNTPs (Reaktion 7)
Spur 9: 1,5 u Tgo, nicht vorinkubiert in Abwesenheit von dNTPs (Reaktion 8)
Spur 10: 1 u Tgo, vorinkubiert in Abwesenheit von dNTPs, supplementiert mit zusätzlichem Primer (Reaktion 9)
Spur 11: 1,5 u Tgo, vorinkubiert in Abwesenheit von dNTPs, supplementiert mit zusätzlichem Primer (Reaktion 10)
Spur 12: Taq-Polymerase, vorinkubiert (Reaktion 11)
Spur 13: Taq plus 37,5 ng Afu Exo III, vorinkubiert (Reaktion 12)
Spur 14: Taq plus 75 ng Afu Exo III, vorinkubiert (Reaktion 13)
Spur 15: Taq-Polymerase, nicht vorinkubiert (Reaktion 14)
Spur 16: Taq plus 37,5 ng Afu Exo III, nicht vorinkubiert (Reaktion 15)
Spur 17: Taq plus 75 ng Afu Exo III, nicht vorinkubiert (Reaktion 16)
Spur 18: Molekulargewichtsmarker
Beispiel I
Isolierung von kodierenden Sequenzen
Das hier bevorzugte thermostabile Enzym ist eine aus Archaeoglobus fulgidus VC-16-Stamm (DSM Nr. 4304) erhältliche, extrem thermostabile Exodesoxyribonuklease. Der Stamm wurde aus marinen hydrothermalen Systemen an der Vulkan-Insel und Stufe "di Nerone", Neapel, Italien (K. O. Stetter et al., Science (1987) 236: 822–824) isoliert. Dieser Organismus ist ein extrem thermophiles, Schwefel-metabolisierendes Archaebacterium mit einem Wachstumsbereich zwischen 60° und 95°C mit Optimum bei 83°C (H. P. Klenk et al., Nature (1997) 390: 364–370). Die Genomsequenz ist in der TIGR-Datenbank hinterlegt. Das vermutlich Exonuklease III (xthA)-kodierende Gen hat die Zugriffsnummer AF0580.
Das scheinbare Molekulargewicht der aus Archaeoglobus fulgidus erhältlichen Exodesoxyribonuklease beträgt etwa 32.000 Dalton, wenn mit Proteinstandards bekannten Molekulargewichts verglichen (SDS-PAGE). Das exakte Molekulargewicht des thermostabilen Enzyms der vorliegenden Erfindung kann aus der kodierenden Sequenz des Archaeoglobus fulgidus Exodesoxyribonuklease III-Gens bestimmt werden.
Beispiel II
Klonierung des die Exonuklease III aus Archaeoglobus fulgidus kodierenden Gens
Etwa 6 ml Zellkultur von DSM Nr. 4304 wurden zur Isolierung chromosomaler DNA aus Archaeoglobus fulgidus verwendet.
Die folgenden Primer wurden mit Restriktionsstellen entworfen, die mit multiplen Klonierungsstellen des gewünschten Expressionsvektors kompatibel und zum N- und C-Terminus des Archaeoglobus fulgidus Exonuklease III-Gens komplementär waren:
SEQ ID NO: 1 N-Terminus (BamHI-Stelle):
SEQ ID NO: 2 C-Terminus (PstI-Stelle):
Als erstes wurden die Zellen durch wiederholte Zentrifugation in einem 2 ml Eppendorf-Röhrchen bei 5000 U/min gesammelt. Die DNA-Isolierung kann mit jeglichem beschriebenen Verfahren zur Isolierung aus bakteriellen Zellen durchgeführt werden. In diesem Fall wurde die Archaeoglobus fulgidus-Genom-DNA mit dem High Pure^TM PCR Template Preparation Kit (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1796828) isoliert. Mit diesem Verfahren wurden etwa 6 μg chromosomale DNA mit einer Konzentration von 72 ng/μl erhalten.
Die PCR wurde mit den oben beschriebenen Primern im Expand High Fidelity PCR System (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1732641) und mit 100 ng Archaeoglobus fulgidus Genom-DNA pro Röhrchen in vier identischen Isolierungen durchgeführt. Die PCR wurde mit den folgenden Bedingungen durchgeführt:
1 × 94°C, 2 min;
10 × 94°C, 10 s; 54°C, 30 s; 68°C, 3 min;
20 × 94°C, 10 s; 54°C 30 s; 68°C 3 min mit 20 s-Zyklusverlängerung für jeden Zyklus;
1 × 68°C, 7 min.
Nach Zugabe von MgCl₂ zu einer Endkonzentration von 10 mM wurde das PCR-Produkt mit BamHI und Pst, jeweils 10 Einheiten, bei 37°C für 2 h gespalten. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem niedrigschmelzenen Agarosegel getrennt. Nach Elektrophorese wurden die geeigneten Bänder ausgeschnitten, die Gelblöcke kombiniert, geschmolzen, die DNA-Fragmente durch Agaroseverdau isoliert und mit EtOH präzipitiert. Das getrocknete Pellet wurde in 30 μl H₂O verdünnt.
Der geeignete Expressionsvektor, hier pDS56_T, wurde mit demselben Restriktionsenzym verdaut, das für das Insert verwendet wurde und mit demselben Verfahren gereinigt.
Nach Ligation von Insert und Vektor mit dem Rapid DNA Ligation Kit (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1635379) wurde das Plasmid in den Expressionswirt E. coli 392 pUBS520 (U. Brinkmann et al. (1989) Gene 85: 109–114) transformiert.
Plasmid-DNA der Transformanten wurde unter Verwendung des High Pure^TM Plasmid Isolation Kit (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1754777) isoliert und durch Restriktionsverdau mit BamHI und PstI und Agarosegel-Elektrophorese charakterisiert.
Positive E. coli pUBS520 ExoIII-Transformanten wurden in Glycerin-Kultur bei –70°C gelagert. Die Sequenz des die Exonuklease III codierenden Gens wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Sie wird in 1 gezeigt.
Klonierung und Expression von Exonuklease III aus Archaeoglobus fulgidus und anderen thermophilen Organismen kann durch andere Techniken unter Verwendung konventionellen Fachwissens durchgeführt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Lab., 1989).
Beispiel III
Expression von rekombinanter Afu-Exonuklease III
Der Transformant aus Beispiel 1 wurde in einem Inkubator in einem reichen, die geeigneten Antibiotika enthaltenden Medium kultiviert. Zellen wurden bei einer optischen Dichte von [A₅₄₀] von 5,5 durch Zentrifugation geerntet und eingefroren, bis sie gebraucht wurden, oder durch Behandlung mit Lysozym lysiert, um ein Rohzellextrakt zu erzeugen, das die Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III-Aktivität enthielt.
Das die Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III-Aktivität enthaltende Rohextrakt wird durch das in Beispiel IV beschriebene Verfahren oder durch eine andere Reinigungstechnik, wie Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Hydrophob-Wechselwirkungs-Chromatographie gereinigt.
Beispiel IV
Reinigung von rekombinanter Afu-Exonuklease III
E. coli pUBS520 ExoIII (DSM Nr. 134021) aus Beispiel I wurde in einem 10 l-Inkubator in Trypton (20 g/l) Hefeextrakt (10 g/l), NaCl (5 g/l) und Ampicillin (100 mg/l) enthaltenden Medium bei 37°C gezogen, mit IPTG (0,3 mM) in der mittelexponentiellen Wachstumsphase induziert und für zusätzliche 4 h inkubiert. Etwa 45 g Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und bei –70°C gelagert. 2 g Zellen wurden aufgetaut und in 4 ml Puffer A (40 mM Tris/HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA; 7 mM 2-Mercaptoethanol; 1 mM Pefabloc SC) suspendiert. Die Zellen wurden unter Rühren durch Zugabe von 1,2 mg Lysozym für 30 min bei 4°C und Zugabe von 4,56 mg Natriumdesoxycholat für 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 20 min bei 0°C lysiert. Das Rohextrakt wurde auf 750 mM KCl eingestellt, für 15 min bei 72°C erhitzt und zum Entfernen denaturierten Proteins zentrifugiert.
Eine Heiztemperatur bis zu 90°C ist ebenfalls möglich, ohne die Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III zu zerstören (Denaturierung). Der Überstand wurde gegen Puffer B dialysiert (Puffer A mit 10% Glycerin), der auf 10 mM MgCl₂ eingestellt war, und auf eine Blue Trisacryl M-Säule (SERVA, Nr. 67031) mit der Abmessung 1 × 7 cm und 5,5 ml Bettvolumen gegeben, die mit Puffer B äquilibriert war. Die Säule wurde mit 16,5 ml Puffer B gewaschen und das Exonukleaseprotein wurde mit einem 82 ml Lineargradienten von 0 bis 3 M NaCl im Puffer B eluiert. Die Säulenfraktionen wurden auf Archaeoglobus fulgidus-Exodesoxyribonukleaseprotein durch Elektrophorese auf 10 bis 15% SDS-PAGE-Gradientgelen untersucht. Die aktiven Fraktionen, 16,5 ml, wurden zusammengeführt, mit Aquacide II (Calbiochem Nr. 17851) konzentriert und gegen den Lagerungspuffer C (10 mM Tris/HCl, pH 7,9; 10 mM 2-Mercaptoethanol; 0,1 mM EDTA; 50 mM KCl; 50% Glycerin) dialysiert. Nach Dialyse wurden Thesit und Nonidet P40 zu einer Endkonzentration von jeweils 0,5% zugegeben. Diese Präparation wurde bei –20°C gelagert.
Die erhaltene Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III war bis 95% rein, wie durch SDS-Gelelektrophorese abgeschätzt. Die Ausbeute betrug 50 mg Protein pro 2,3 g Zellmasse (Nassgewicht).
Beispiel V
Thermostabilität rekombinierter Exonuklease III aus Archaeoglobus fulgidus
Die Thermostabilität der Exonuklease III aus Archaeoglobus fulgidus, kloniert wie im Beispiel I beschrieben, wurde durch Analysieren der Widerstandsfähigkeit für eine Hitzedenaturierung bestimmt. Nach Lyse, wie im Beispiel III beschrieben, wurden 100 μl Rohextrakt bei 15.000 U/min für 10 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde in fünf neue Eppendorf-Röhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden für 10 min bei fünf verschiedenen Temperaturen von 50°C, 60°C, 70°C, 80°C und 90°C inkubiert. Nach Zentrifugation wie oben beschrieben wurden die Aliquots der Überstände durch Elektrophorese auf 10 bis 15% SDS-PAGE-Gradientengelen analysiert. Wie in 2 gezeigt, war die Menge an Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III-Protein nach Inkubation bei 90°C dieselbe wie die der bei niedrigeren Temperaturen behandelten Proben. Es gab keinen detektierbaren signifikanten Verlust durch Hitzedenaturierung. Aus diesem Ergebnis kann gefolgert werden, dass die Halbwertszeit bei 90°C mehr als 10 min beträgt.
Beispiel VI
Aktivität der Afu-Exonuklease III
Die Exonuklease III katalysiert die schrittweise Entfernung von Mononukleotiden von den 3'-Hydroxytermini von Duplex-DNA (G. S. Rogers und B. Weiss (1980) Methods Enzymol. 65: 201–211). Eine begrenzte Anzahl von Nukleotiden wird bei jedem Bindeereignis entfernt. Das bevorzugte Substrat sind stumpfe oder zurückgesetzte 3'-Termini. Das Enzym ist an Einzelstrang-DNA nicht aktiv und 3'-vorragende Termini sind gegenüber einer Spaltung resistenter. Der DNA-Molekulargewichts-Marker VI (ROCHE Molecular Biochemicals, Nr. 1062590) besteht aus BglI verdautem pBR328, der mit HinfI verdautem pBR328 gemischt ist. Die Produkte des HinfI-Verdaus haben 3'-zurückgesetzte Termini, und es wird erwartet, dass sie bevorzugten Substrate des Abbaus durch Exonuklease III sind, die Produkte der BglI-Spaltung haben 3'-vorragende Enden mit 3 Basen Überhängen und sollten gegenüber einer Spaltung durch Exonuklease III resistenter sein.
Serienverdünnungen von Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III aus Beispiel III wurden für 2 h bei 72°C mit 0,5 μg DNA-Molekulargewichtsmarker VI (ROCHE Molecular Biochemicals Nr. 1062590) in 25 μl des nachfolgenden Inkubationspuffers inkubiert: 10 mM Tris/HCl, pH 8,0; 5 mM MgCl₂; 1 mM 2-Mercaptoethanol; 100 mM NaCl mit Paraffinüberschichtung. 10 Einheiten Exonuklease III aus E. coli (ROCHE Molecular Biochemicals, Nr. 779709) wurde als Kontrolle eingeschlossen. Die Kontrollreaktion wurde bei 37°C durchgeführt. Nach Zugabe von 5 μl Stopplösung (0,2% Agarose, 60 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10% Glycerin, 0,01% Bromphenolblau) wurden die Mischungen auf 1% Agarosegel aufgetrennt. Das Ergebnis ist in 3 gezeigt. Afu-Exonuklease III unterscheidet zwischen zwei verschiedenen Arten von Substrat. Das bevorzugte Substrat sind die Fragmente mit 3'-zurückgesetzten Enden (z.B. 1766 bp-Fragment), und die 3'-überhängenden Enden (z.B. 2176 bp-, 1230-bp, 1033 bp-Fragmente) sind gegenüber einem Abbau resistenter. Bei höheren Mengen von Protein wird das Substrat in einem ähnlichen Ausmaß wie in Spur 1 abgebaut, wo die Produkte von Exonuklease III von E. coli analysiert wurden. Mit wachsenden Mengen von Afu-Exonukleaseprotein blieb nur wenig DNA-Substrat (Spuren 15 bis 19) zurück, die Retardierung der verbleibenden Fragmente kann auf die DNA-Bindeproteine als Verunreinigungen der Präparation zurückzuführen sein.
Beispiel VII
Korrektur nicht-passender Primer in PCR mit Afu-Exonuklease III
Die Reparatureffizienz der Afu-Exonuklease III/Taq-Polymerase-Mischung während der PCR wurde mit 3'-terminal nicht-passenden Primern getestet, wobei das Prinzip der Analyse in 4 gezeigt wird. Für eine PCR-Amplifikation werden Sätze von Primern verwendet, in welchen der Vorwärts-Primer ein oder zwei Nukleotide am 3'-Ende aufweist, die mit der Template-DNA keine Basenpaare bilden können. Die Excision des nicht-passenden Primerendes und die Amplifikation des reparierten Primers erzeugt ein Produkt, das nachfolgend mit der Restriktionsendonuklease BsiEI gespalten werden kann, während das aus dem nicht-passenden Primer stammende Produkt gegenüber einer Spaltung resistent ist.
Die verwendeten Primersequenzen:

1. Reverse:
2. Vorwärts 1 (g:a Fehlpassung):
3. Vorwärts 2 (g:t Fehlpassung):
4. Vorwärts 3 (g:c Fehlpassung):
5. Vorwärts 4 (2-Basen-Fehlpassung):

Die PCR wurde unter Verwendung von 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1435094), 0,25 μg Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III aus Beispiel III, 10 ng DNA aus Bakteriophage λ, 0,4 μM jedes Primers, 200 μM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 9,2, 16 mM (NH₄)₂SO₄ durchgeführt. Die PCR wurde in einem Volumen von 50 μl PCR unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
1 × 94°C, 2 min;
40 × 94°C, 10 s; 60°C, 30 s; 72°C, 1 min;
1 × 72°C, 7 min;
Die Funktion der Exonuklease/Taq-Polymerase-Mischung wurde mit Kontrollen von 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase, 0,3 Einheiten Tgo-DNA-Polymerase (ROCHE Diagnostics GmbH) und mit 0,75 μl Expand^TM High Fidelity PCR-System (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1732641) verglichen. Wie durch erfolgreichen Verdau der PCR-Produkte mit BsiEI angezeigt, zeigte die A. fulgidus-Exonuklease III eine Korrekturaktivität aller beschriebenen Fehlpassungen mit einer Effektivität von 90 bis 100% (5). Die Taq-DNA-Polymerase zeigte wie erwartet keine Korrekturaktivität, während die Tgo-DNA-Polymerase mit ihrer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität ebenfalls vollständig korrigierte. Das Expand High Fidelity PCR-System zeigt nur bei der Zweibasen-Fehlpassung 100% Korrekturaktivität. Die anderen Fehlpassungen wurden mit einer Effektivität von ungefähr 50% repariert.
Beispiel VIII
Genauigkeit der Afu-Exonuklease III/Taq-DNA-Polymerase-Mischungen im PCR-Prozess
Die Genauigkeit von Afu-Exonuklease III/Taq-DNA-Polymerase-Mischungen im PCR-Prozess wurde in einer Analyse, die auf der Amplifikation, Zirkularisation und Transformation des pUC19-Derivats pUCIQA17 basierte, das ein funktionelles lacI^q-Allel enthält (B. Frey und B. Suppmann (1995) Biochemica 2: 34–35) bestimmt. PCR-abgeleitete Mutationen in lacI führen zu einer Derepression der Expression von LacZα und der nachfolgenden Bildung eines funktionellen Iβ-Galactosidaseenzyms, das leicht auf X-Gal-Indikatorplatten detektiert werden kann. Die Fehlerraten von Taq-Polymerase/Afu-Exonukleasemischungen, die mit diesem lacI-basierten PCR-Genauigkeitstest bestimmt wurden, wurden im Vergleich zur Taq-DNA-Polymerase und dem Expand HiFi-PCR-System (ROCHE Molecular Biochemicals) und der Pwo-DNA-Polymerase (ROCHE Molecular Biochemicals) als Kontrollen bestimmt.
Das Plasmid pUCIQ17 wurde durch Verdau mit DralI linearisiert, um als Substrat für die Amplifikation mit den getesteten Enzymen zu dienen.
Beide verwendeten Primer haben ClaI-Stellen an ihren 5'-Enden:
SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 9
Die Länge des sich ergebenden PCR-Produktes beträgt 3493 Basenpaare.
Die PCR wurde in einem Endvolumen von 50 μl in Anwesenheit von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM Tris HCl, pH 8,5 (25°C), 12,5 mM (NH₄)₂SO₄, 35 mM KCl, 200 μM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 125 ng, 175 ng, 250 ng, 375 ng bzw. 500 ng Afu-Exonuklease III durchgeführt.
Die Zyklusbedingungen waren wie folgt:
Nach der PCR wurden die PCR-Produkte PEG-präzipitiert (W. M. Barnes (1992) Gene 112: 229), die DNA mit ClaI geschnitten und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Die isolierte DNA wurde unter Verwendung des Rapid DNA Ligation Kit (ROCHE Molecular Biochemicals) ligiert und die Ligationsprodukte wurden in E. coli DH5α transformiert und auf TN Amp X-Gal-Platten ausplattiert. Der mit dem sich ergebenden Plasmid pUCIQ17 (3632 bp) transformierte α-komplementierende E. coli Stamm DH5α zeigt weiße (lacI⁺)-Kolonien auf TN-Platten (1,5% Bacto-Trypton, 1% NaCl, 1,5% Agar), die Ampicillin (100 μg/ml) und X-Gal (0,004% G/V) enthalten. Mutationen führen zu blauen Kolonien.
Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden blaue und weiße Kolonien ausgezählt. Die Fehlerrate (f) pro Basenpaar wurde mit einer rearrangierten Gleichung berechnet, wie von Keohavong und Thilly (P. Keohavong und W. Thilly (1989) PNAS USA 86: 9253) veröffentlicht, berechnet: f = InF/d × b bpwobei F der Anteil weißer Kolonien ist:

F: = weiße (lacI+) Kolonien/Gesamtkoloniezahl;
d: die Anzahl von DNA-Duplikationen ist:
2^d: = Ausgangs-DNA/Eingangs-DNA;
und b: die effektive Zielgröße des (1080 bp) lacI-Gen ist, welche gemäß Provost et al. (Provost et al. (1993) Mut. Res. 288: 133) 349 Basenpaare beträgt.

Die in den 6A und 6B gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass die Anwesenheit thermostabiler Exonuklease III in der Reaktionsmischung zu niedrigeren Fehlerraten führt. Abhängig vom Verhältnis von Polymerase zu Exonuklease sinkt die Fehlerrate. Die mit der optimalsten Taq-Polymerase/afu-Exonuklease III-Mischung erzielte Genauigkeit (4,4 × 10^–6) liegt in einem ähnlichen Bereich wie die der Taq/Pwo-Mischung (Expand HiFi; 2,06 × 10^–6). Die Bewertung der optimalen Pufferbedingungen wird die Genauigkeit weiter verbessern. Das Verhältnis zwischen Polymerase und Exonuklease muss optimiert werden. Hohe Mengen an Exonuklease reduzieren die Produktausbeute, wobei sie anscheinend die Amplifikationseffizienz senken (Taq/Exo 1:10 entsprechend 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 500 ng Afu-Exonuklease III).
Die Genauigkeit dieses Systems kann weiterhin unter Verwendung üblichen Fachwissens weiter optimiert werden, z.B. durch Ändern der Pufferkomponenten, Optimieren der Konzentration der einzelnen Komponenten oder Ändern der Zyklusbedingungen.
Beispiel IX
Einbau von dUTP in Anwesenheit von Afu-Exonuklease III während der PCR
Die Afu-Exonuklease/Taq-Polymerase-Mischung wurde auf DNA-Synthese mit einem vollständig durch dUTP ersetzten TTP getestet. Der Vergleich von entweder TTP oder UTP-Einbau wurde in der PCR unter Verwendung von 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 0,125 μg, 0,25 μg, 0,375 μg und 0,5 μg Archaeoglobus fulgidus-Exonuklease III aus Beispiel III auf native humane genomische DNA als Template unter Verwendung des β-Globingen als Ziel bestimmt. Die folgenden Primer wurden verwendet:
Die PCR wurde in 50 μl Volumen bei den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
1 × 94°C, 2 min;
40 × 94°C, 10 s; 60°C, 30 s; 72°C, 1 min;
1 × 72°C, 7 min;
Aliquots der PCR-Reaktion wurden auf Agarosegelen aufgetrennt. Wie in 7 gezeigt, ist eine DNA-Synthese in Anwesenheit von dUTP mit bis zu 375 ng Afu-Exonuklease III möglich. Der dUTP-Einbau kann weiterhin durch Uracil-DNA-Glycosylase-Behandlung (ROCHE Diagnostics GmbH, Nr. 1775367) von Aliquots aus den PCR-Reaktionsprodukten für 30 min bei Raumtemperatur und nachfolgender Inkubation für 5 min bei 95°C, um die Polynukleotide an den Apurinstellen zu spalten, was zum vollständigen Abbau der Fragmente führt, bewiesen werden. Die Analyse der Reaktionsprodukte durch Agarosegel-Elektrophorese wird in 8 gezeigt.
Beispiel X:
Wirkung von Afu-Exonuklease III auf die PCR-Produktlänge
Taq-Polymerase ist in der Lage, PCR-Produkte bis zu 3 kb Länge auf genomischen Templates zu synthetisieren. Um die Fähigkeit der Taq-Polymerase/Afu-Exonuklease-Mischung zur Synthese längerer Produkte abzuschätzen, wurde die Enzymmischung an humaner Genom-DNA als Template mit drei Paaren von Primern analysiert, die dafür entworfen waren, Produkte von 9,3 kb, 12 kb und 15 kb Länge zu amplifizieren. Das verwendete Puffersystem stammte aus dem Expand Long Template PCR- System (ROCHE Molecular Biochemicals Katalog-Nr. 1 681 834). Die Reaktionen wurden in 50 μl Volumen mit 250 ng humaner Genom-DNA, 220 ng jedes Primers, 350 μM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 62,5 ng Afu-Exonuklease bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
Der für die Amplifikation der verwendeten tPA-Gene spezifische Primer:
Primer 7a vorwärts:
Primer 14a revers:
Primer 1 vorwärts:
Primer 2 revers:
Primer 3 revers:
Wie in 9 gezeigt, ist es möglich, Produkte von zumindest 15 kb Länge mit der Taq-Polymerase/Afu-Exonuklease-Mischung zu synthetisieren.
Beispiel XI
Thermostabile Exonuclease III kann durch eine Polymerase-Mutante mit verminderter Polymerase-Aktivität, aber gesteigerter 3'-Exonuclease-Aktivität ersetzt werden.
DNA-Polymerase aus Thermococuss aggregans (Tag) beschrieben von Niehaus F., Frey B. und Antranikian G. in WO97/35988 oder in Gene (1997) 204 (1–2), 153–8 mit einem Aminosäure-Austausch an Position 385, in dem Tyrosin durch Asparagin ersetzt war (Boehlke et al., unterbreitet zur Publikation, und Europäische Patentanmeldung 00 105 155.6) zeigt nur 6,4% der Polymerase-Aktivität, aber 205% der Exonuclease-Aktivität der Wildtyp-DNA-Polymerase Dieses Enzym wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Erfindung nicht auf Exonuclease-III-artige Enzyme beschränkt ist, sondern auch andere Arten von Enzymen, die eine 3'-Exonuclease-Aktivität beitragen, beinhaltet.
Reaktionen wurden in 50 μl Volumen mit 200 ng humaner genomischer DNA, 200 μM dNTP, 220 ng jedes Primers und Expand HiFi Puffer inkl. Mg⁺⁺ für Reaktionen 1–4 oder Expand Long Template Puffer 1 für Reaktionen 5–8 (10) durchgeführt. Um ein 4,8 kb-Fragment des tPA-Gens zu amplifizieren, wurden Primer tPA 7a vorwärts (5'-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3', SEQ ID NO.: 12) und tPA 10 revers (5'-GAT GCG AAA CTG AGG CTG GCT GTA CTG TCT C-3', SEQ ID NO.: 17) in den Reaktionen 1–4 verwendet. Um ein 9,3 kb-Fragment des tPA-Gens zu amplifizieren, wurde Primer tPA 7a vorwärts und tPA 14a revers (5'-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C-3', SEQ ID NO.: 13) in den Reaktionen 5–8 verwendet. 2,5 Einheiten Taq-Polymerase wurden den Reaktionen 1,2,4,5,6 und 8 zugegeben, nicht in Reaktionen 3 und 7, die als Negativ-Kontrollen verwendet wurden. Es wurden 11 ng Taq-Polymerase-Mutante den Reaktionen 2,3,6 und 7 zugegeben, 150 ng Afu Exonuclease III wurden den Reaktionen 4 und 8 zugegeben.

Das für die Reaktionen 1–4 verwendete Zyklusprogramm:

1 ×	94°C, 2 Min.
10 ×	94°C, 10 Sek.
	62°C, 30 Sek.
	68°C, 4 Min.
20 ×	94°C, 10 Sek.
	62°C, 30 Sek.
	68°C, 4 Min., plus Zyklusverlängerung von 20 Sek. pro Zyklus
1 ×	68°C für 7 Min.

Für Reaktionen 5–8:

1 ×	94°C, 2 Min.
10 ×	94°C, 10 Sek.
	65°C, 30 Sek.
	68°C, 8 Min.
20 ×	94°C, 10 Sek.
	65°C, 30 Sek.
	68°C, 8 Min., plus Zyklusverlängerung von 20 Sek. pro Zyklus
1 ×	68°C für 7 Min.

Die PCR-Produkte wurde auf einem 1% Agarose-Gel analysiert, das Ethidium-Bromid enthielt (10). Diese Daten zeigen, dass Taq-Polymerase in der Lage ist, das 4,8 kb-Fragment zu amplifizieren, aber bei niedriger Ausbeute. Die Kombination von Taq-Polymerase mit Taq-Polymerase-Mutante oder Afu-Exo-III für zu einem starken Anwachsen in der Produktausbeute. Das Taq-Polymerase-Mutanten-Enzym selbst ist nicht in der Lage, dieses Produkt zu synthetisieren.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem 9,3 kb-System erhalten. Bei Verwendung von Taq-Polymerase alleine ist kein Produkt detektierbar. In Kombination mit der Tag-Polymerase-Mutante oder Afu-Exo-III wird das erwartete PCR-Produkt bei hoher Ausbeute erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Taq-Polymerase nicht in der Lage ist, DNA-Fragmente mehrerer kb aus genomischer DNA zu amplifizieren und die Hypothese von Barnes (Barnes W. M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2216–2220) zu unterstützen, das die Längenbeschränkung für die PCR-Amplifikation durch eine niedrige Effizienz der Extension an den Orten des Einbaus von fehlgepaarten Basenpaaren verursacht wird. Nach Entfernen des fehlgepaarten Nukleotids am Primer-Ende ist Taq-Polymerase in der Lage, die DNA-Synthese wieder aufzunehmen. Die komplettierte Nukleinsäurekette als Volllängenprodukt kann dann als Template für die Primer-Bindung in nachfolgenden Zyklen dienen.
Beispiel XII
Die Afu-Exo-III ist nicht aktiv an linearer Einzelstrang-DNA.
Die Reaktionen wurden in 50 μl Volumen mit 270 ng Afu-Exo-III, 5 μg eines 49-Mer-Oligonukleotids in Expand HiFi PCR-Puffer mit MgCl₂ durchgeführt und für 0, 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden bei 65°C inkubiert. Nach Zugabe von 10 μl Proteinase-K-Lösung (20 mg/ml) wurden die Proben für 20 Min. bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einen 3,5% Agarose-Gel analysiert, das Ethidium-Bromid enthielt.
Das Ergebnis ist in 11 dargestellt. Es zeigt, dass die Nukleinsäure dieselbe Größe in allen Spuren hat. Das erhaltene Produkt nach Inkubation für bis 5 Stunden (Spur 6) mit Afu-Exo-III hat dieselbe Größe wie die Kontrollen (Spuren 1, 7 und 8). Weder eine signifikante Reduzierung der Intensität des Volllängen-Oligonukleotids noch ein von degradierten Produkten herrührender Schmier kann beobachtet werden.
Beispiel XIII
Vergleich von Afu-Exonuclease-III mit einer thermostabilen B-Typ-Polymerase in primer-degradierender Aktivität.
Von thermostabilen B-Typ-Polymerasen wird berichtet, dass sie Einzel- und Doppelstrang-Nuklease-Aktivität aufzuweisen (Kong H. et al. (1993) Journal Biol. Chem. 268: 1965–1975). Diese Aktivität ist in der Lage, Primer-Moleküle unabhängig davon zu degradieren, ob sie mit dem Template hybridisiert sind oder einzelsträngig sind. Der Ersatz einer thermostabilen B-Typ-Polymerase durch eine thermostabile Exonuclease in der Reaktionsmischung kann in Bezug auf die Stabilität von einzelsträngigem Primer oder anderen Nukleinsäuren, die in der Reaktionsmischung vorliegen, vorteilhaft sein.
Um bezüglich primer-degradierender Aktivität zu testen, wurden Reaktionsmischungen ohne Template-DNA für eine Stunde bei 72°C inkubiert, dann wurde DNA zugegeben und es wurde eine PCR durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit Reaktionen verglichen, die Tgo-Polymerase als ein Beispiel für eine thermostabile B-Typ-Polymerase enthielten (Angerer B. et al. WO 98/14590). Als Kontrolle wurden dieselben Mischungen ohne vorherige Inkubation verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2:
Als Ziel für die Amplifikation wurde ein Fragment des p53-Gens ausgewählt, der verwendete Primer war: p53I 5'-GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3' (SEQ ID NO.: 18) und p53II 5'-TGG AAA CTT TCC ACT TGA T-3' (SEQ ID NO.: 19). Die PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Volumen durchgeführt.
Die Reaktions-Nummern 1–10 enthielten 200 ng humaner genomischer DNA, 40 pmol jedes Primers, 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 17,5 mM (NH₄)₂SO₄, 1,25 mM MgCl₂, 0,5% Tween, 2,5% DMSO, 250 μg/ml BSA und eine Einheit (Reaktions-Nr. 1, 3, 5, 7 und 9) oder 1,5 Einheiten (Reaktions-Nr. 2, 4, 6, 8 und 10) Tgo-Polymerase und 200 μM dNTPs.
Die Reaktions-Nr. 11 bis 16 enthielten 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, Expand HiFi-Puffer mit Mg++, 40 pmol Primer, 200 μM dNTPs, 100 ng menschlicher genomischer DNA. Die Reaktions-Nr. 12 und 15 enthielten 37,5 ng Afu-Exo-III, Reaktions-Nr. 13 und 16 enthielten 75 ng Afu-Exo-III.
Wie in Tabelle 2 beschrieben, wurden die Reaktionen 1, 2, 5, 6 und 11 bis 13 für eine Stunde bei 72°C in Abwesenheit von Template-DNA inkubiert. Die Template-DNA wurde zugegeben, bevor die PCR gestartet wurde. Die Reaktionen 5, 6, 9 und 10 wurden in Abwesenheit von Nukleotiden präinkubiert, die Reaktionen 9 und 10 wurden mit zusätzlich 40 pmol Primer nach dem Vorinkubationsschritt ergänzt. Aufgrund der 5'-Exonuclease-Aktivität von Taq-Polymerase wurde das Enzym nach Vorinkubation den Reaktionen 11 bis 13 zugegeben. PCR-Bedingungen:

1 × 94°C, 2 Min.

35 × 94°C, 10 Sek.

55°C, 30 Sek.

72°C, 4 Min.

1 × 72°C, 10 Min.
Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Agarose-Gel analysiert und mit Ethidium-Bromid gefärbt (12).
Wenn Tgo-Polymerase mit dem Primer in Abwesenheit von Template-DNA inkubiert wurde (Reaktionen 1, 2, 5 und 6) und mit den entsprechenden Reaktionen ohne Vorinkubation (3, 4, 7 und 8) verglichen wurden, war ein klarer Unterschied feststellbar. Die Vorinkubation führt zu stark vermindertem PCR-Produkt, offensichtlich betreffend zumindest eine essentielle Komponente, am wahrscheinlichsten den PCR-Primer. Extrazugabe von 40 pmol PCR-Primer (Reaktionen 9 und 10) nach dem Vorinkubationsschritt führten zu starken Signalen mit Intensitäten, die mit der Kontrollreaktion vergleichbar waren, die nicht vorinkubiert war. Dies zeigt, dass Tgo-Polymerase, eine thermostabile B-Typ-Polymerase, PCR-Primer in Abwesenheit von Template degradiert, egal ob dNTPs anwesend sind oder nicht.
Die bei den Reaktionen 12 und 13 erhaltenen PCR-Produkte, in denen der Primer mit Afu-Exonuclease-III vor Zugabe von Template-DNA und Taq-Polymerase vorinkubiert war, ergaben ähnliche Banden wie die, die bei den Reaktionen 15 und 16 beobachtet wurden, in denen kein Vorinkubationsschritt verwendet wurde. Aus den ähnlich starken Bandenintensitäten kann geschlossen werden, dass wenig oder keine Degradierung von Primer auftrat und dass Einzelstrang-Oligonukleotide schlechte Substrate für Afu-Exonuclease-III sind. Aus den starken Banden-Intensitäten oder verbesserten Ausbeuten von PCR-Produkten kann gefolgert werden, dass das Enzym die Genauigkeit eines Amplifikationsprozesses verbessert.
SEQUENZLISTE

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein erstes thermostabiles Enzym, das 3'-Exonukleaseaktivität, aber keine DNA-Polymeraseaktivität zeigt, und ein zweites thermostabiles Enzym, das DNA-Polymeraseaktivität zeigt, wobei die Genauigkeit eines Amplifikationsprozesses durch die Verwendung der Zusammensetzung im Vergleich zur Verwendung des einzelnen zweiten Enzyms verbessert ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das erste Enzym aus Archeoglobus fulgidus gewinnbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei dem zweiten Enzym Proof-Reading-Aktivität fehlt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das zweite Enzym Taq-Polymerase ist.
Verfahren zum Herstellen oder Amplifizieren von DNA unter Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei vorzeitig beendete Ketten durch Abbau von 3' nach 5' beschnitten werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei unpassende Enden entweder eines Primers oder des wachsenden Strangs entfernt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei dUTP anstelle von TTP in der Reaktionsmischung vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei Uracil-DNA-Glycosylase (UNG) zum Abbau kontaminierender Nukleinsäuren verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Mischung – eines ersten thermostabilen Enzyms, das 3'-Exonukleaseaktivität, aber keine DNA-Polymeraseaktivität zeigt, und – eines zweiten thermostabilen Enzyms, das Polymeraseaktivität zeigt, PCR-Produkte mit niedrigerer Fehlerrate im Vergleich zu PCR-Produkten, die durch das die Polymerase-Aktivität zeigende zweite Enzym in Abwesenheit des ersten thermostabilen Enzyms, dass die 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine Polymerase-Aktivität zeigt, hergestellt werden, herstellt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Mischung des ersten thermostabilen Enzyms, das 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigt, und des zweiten thermostabilen Enzyms, das DNA-Polymerase-Aktivität zeigt, PCR-Produkte von größerer Länge im Vergleich zu PCR-Produkten herstellt, die durch das die DNA-Polymerase-Aktivität zeigende zweite Enzym in Abwesenheit des ersten thermostabilen Enzyms, das die 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigt, hergestellt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei das erste thermostabile Enzym, das die 3'-Exonuklease-Aktivität, aber keine DNA-Polymerase-Aktivität zeigt, mit der aus E. coli gewonnenen Exonuklease III verwandt ist, jedoch thermostabil ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 12, wobei PCR-Produkte mit stumpfen Enden erhalten werden.