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Gegenstand
der Erfindung sind archaeale DNA-Polymerase-Varianten und ihre Verwendung
bei der Amplifikation von DNA.
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Die
Polymerasekettenreaktion (PCR) stellt ein Verfahren dar, wobei eine
DNA-Sequenz selektiv amplifiziert werden kann, um eine ohne weiteres
analysierbare große
Probe zu produzieren. Eine Lösung,
enthaltend die zu amplifizierende DNA, zusammen mit freien Basen,
einem Polymerase-Enzym und Primern, die an gegenüberliegenden Enden der beiden
Stränge
des zu replizierenden DNA-Segments binden, wird erhitzt, um die
Bindungen zwischen den DNA-Strängen
zu sprengen. Wenn die Lösung
abkühlt,
binden die Primer an die getrennten Stränge und die Polymerase baut
durch das Verbinden freier Basen mit den Primern einen neuen Strang
auf, wobei ein neuer Strang hergestellt wird, der ausschließlich auf
das gewünschte
Segment beschränkt
ist. Die PCR ermöglicht,
dass aus einem kleinen DNA-Stück
in mehreren Stunden Milliarden von Kopien produziert werden können.
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Für dieses
Verfahren sind hitzestabile Polymerasen erforderlich, und eine der
am häufigsten
verwendeten stellt die Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus
dar. Dieses Enzym besitzt jedoch keine 3'-5'-Exonuklease-III-Funktion,
auf die allgemein als auf „Proofreading-Aktivität" verwiesen wird.
Diese Funktion entfernt Basen, die am 3'-Ende eines Primer-Matrizen-Duplex zu
einem Mismatch führen.
Die Unfähigkeit von
Taq-DNA-Polymerase, diese Funktion auszuführen, führt dazu, dass sie zu Baseninkorporationsfehlern neigt.
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Archaeale
DNA-Polymerasen sind wärmestabil
und weisen „Proofreading"-Aktivität auf. Native
archaeale DNA-Polymerasen werden jedoch durch Desoxyuracil inhibiert.
Archaeale DNA-Polymerasen besitzen eine für Uracil spezifische „Read-ahead"-Funktion. Diese
Matrizenprüfaktivität scannt
die Matrize vor der Replikationsgabel auf die Anwesenheit von Uracil
und hält
die Polymerisation auf, wenn Uracil begegnet wird. Die Anwesenheit
von Desoxyuracil in DNA führt
folglich dazu, dass die Amplifikation aufgehalten wird, wenn native archaeale
DNA-Polymerasen verwendet werden. Dies stellt einen schwerwiegenden
Nachteil dar, da die repetitiven Erhitzungs- und Abkühlungszyklen
einer durch PCR zu amplifizierenden DNA-Probe zu einer partialen, thermisch
induzierten Desaminierung von dCTP (einer in die neu amplifizierte
DNA inkorporierten Komponente) zu dUTP (das in DNA inkorporiert
werden kann) und Desaminierung von Desoxycytidin in der DNA zu Desoxyuracil
führen.
Dies kann dazu beitragen, dass die nativen archaealen DNA-Polymerasen
für PCRs
ungeeignet sind, insbesondere für
die, die die Prävention
einer „Carry-over"-Kontamination betreffen,
wenn die PCR mit dUTP anstelle mit dTTP durchgeführt wird.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung modifizierter
archaealer DNA-Polymerasen, die nicht den Nachteil aufweisen, durch
Desoxyuracil inhibiert zu werden und die in Polymerasekettenreaktionen
besonders nützlich
sind.
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Demgemäß stellt
ein erster erfindungsgemäßer Aspekt
eine Variante der archaealen DNA-Polymerase mit einer modifizierten
Aminosäuresequenz
von einer Wildtyp-Aminosäuresequenz
dar, wobei die modifizierte Sequenz in den Amino-terminalen Aminosäuren vorhanden
ist, die eine Uracilbindende Tasche in der Wildtyp-Polymerase umfassen,
wobei die Variante der Polymerase im Vergleich zu arachaealen DNA-Polymerasen
des Wildtyps eine reduzierte Affinität zu Uracil aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf Forschungsarbeiten (siehe die
Beispiele), die von den Erfindern durchgeführt wurden, mit denen eine
Uracil-bindende Tasche in archaealen DNA-Polymerasen identifiziert wurde.
Sie erkannten, dass diese Tasche zur Bereitstellung von erfindungsgemäßen Varianten
der Polymerasen, die – wie
hierin beschrieben – nützlich sein
könnten,
verändert
werden könnte.
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Die
Variante der archaealen DNA-Polymerase kann eine Modifikation einer
archaealen DNA-Polymersase der B-Familie darstellen. So kann sich
die Variante zum Beispiel von jedweder einen der in 1 gezeigten
vierzehn archaealen DNA-Polymerasen der B-Familie herleiten. Die
Variante kann sich zum Beispiel von Polymerasen herleiten, die in
Folgendem gefunden werden: Pyrococcus furiosus (Pfu-Pol), Thermococcus gorgonarius
(Tgo-Pol), Thermococcus litoralis (Tli-Pol), Thermococcus sp. 9°N-7 (9°N-7-Pol),
Desulfurococcus, Stamm Tok (DTok-Pol), Pyrobaculum islandicum (Pis-Pol),
Archaeoglobus fulgidus (Afu-Pol), Sulfolobus acidocaldarius (Sac-Pol),
Sulfurisphaera ohwakuensis (Soh-Pol), Sulfolobus solfataricus (Sso-Pol),
Pyrodictium occultum (Poe-Pol) oder Aeropyrum pernix (Ape-Pol).
Es wird erkannt werden, dass die Variante sich auch von jedweder
anderen archaealen DNA-Polymerase der B-Familie herleiten könnte.
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Es
ist bevorzugt, dass sich die Variante von Pyrococcus furiosus (Pfu-Pol)
herleitet. Erfindungsgemäß verwendetes
Pfu-Pol weist die folgende Aminosäuresequenz auf.
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Die
erfindungsgemäß verwendete
Pfu-Pol enthält
an der Stellung 2 ein zusätzliches
A. Diese zusätzliche
Aminosäure
wurde inkorporiert, weil sie die Proteinexpression verbessert, ohne
sich auf die Eigenschaften des Enzyms auszuwirken. Die echte Wildtyp-Pfu-Pol
beginnt MILDVDY. Die Sequenz des echten Wildtyps ist wie folgt dargestellt:
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Demgemäß beginnen
bevorzugte erfindungsgemäße Mutanten
MAILDVDY oder MILDVDY.
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Es
wurde erfindungsgemäß gefunden
(siehe Beispiel 1), dass eine Uracil-bindende Tasche der Wildtyp-Polymerase
einen Teil des ssDNA-Matrizen-Bindungsspalts der Polymerase (den
sogenannten Spalt T) bildet. Die Uracil-bindende Tasche umfasst überdies
Aminosäuren
aus zwei konservierten Regionen der Polymerasen: Region A und Region
B, die durch eine nicht konservierte Region getrennt sind. In der
archaealen Polymerase von Pyrococcus furiosus (Pfu-Pol) wird Region
A durch die Aminosäuren
I – 40
und Region B durch die Aminosäuren
78 – 130
gebildet. Hoch konservierte Reste in diesen beiden Regionen bilden
die hoch geordnete Uracil-bindende Tasche. Wie in 1 erläutert, weisen
andere Archaea ähnliche
Regionen A und B in ihren entsprechenden Polymerasen auf. Zur Bildung
der Varianten der archaealen DNA-Polymerase werden bevorzugt eine
oder mehr der Aminosäuren
in den Regionen A und/oder B verändert.
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1 erläutert ein
Sequenz-Alignment der N-terminalen Domänen von verschiedenen archaealen
Polymerasen. In 1 weisen mit (1) gekennzeichnete
Aminosäuren
eine 90%ige oder größere Identität auf, (2) weist
eine 80- bis 90%ige Identität
und (3) eine 60- bis 80%ige Identität auf. Bei den beiden hoch
konservierten Regionen, die Uracil-bindende Taschen bilden, handelt
es sich um die folgenden: Region A, Aminosäuren 1 – 40 in Pfu-Pol (und entsprechenden
Regionen in den anderen Polymerasen); und Region B, Aminosäuren 78 – 131 in
Pfu-Pol (und entsprechenden Regionen in den anderen Polymerasen).
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Es
ist bevorzugt, dass die Variante durch Änderung von einer der in 1 im
Block schattierten (1, 2 oder 3) Aminosäuren gebildet wird. Die Änderung
kann zum Beispiel im folgenden Motiv zum Ausdruck kommen: E – – I – F/Y – – – Y – – D.
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Die Änderung
kann aus einer Substitution, Deletion oder Addition bestehen. Einer
der Invarianten Reste kann verändert
sein oder andere Reste in Regionen A und/oder B darstellen, die
sich auf die Konformation der Uracil-bindenden Tasche auswirken.
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Man
ist erfindungsgemäß der Ansicht,
dass Reste 7, 36, 37, 90 – 97
und 112 – 119
in Pfu-Pol für
die Uracil-Bindung besonders wichtig sind. Bevorzugt wird mindestens
einer dieser Reste verändert,
um die Konformation der Tasche zu bewirken und dadurch ihre Uracil-bindende
Fähigkeit
zu reduzieren. Die Mutation in Pfu-Pol besteht bevorzugter aus einer Änderung
in den Aminosäuren
Y7, Y37, V93, I114 oder P115. Die Änderung besteht bevorzugter
aus Y7A, Y37A, V93Q, V93R, I114R, I114Q oder P115Δ. Eine am
bevorzugtesten Pfu-Pol-Mutation stellt V93Q dar.
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Beispiele
von bevorzugten Pfu-Pol-Varianten weisen die folgenden Aminosäuresequenzen
auf:
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(a)
Pfu-Pol Y7A (Y8A)
(SEQ
ID NO:3)
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(b)
Pfu-Pol Y37A (Y38A)
(SEQ
ID NO:4)
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(c)
Pfu-Pol V93Q (V94Q)
(SEQ
ID NO:5)
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(d)
Pfu-Pol V93R (V94R)
(SEQ
ID NO: 6)
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(e)
Pfu-Pol I114R (I115R)
(SEQ
ID NO:7)
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(f)
Pfu-Pol I114Q (I115Q)
(SEQ
ID NO: 8)
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Es
wird erkannt werden, dass die vorstehend aufgelisteten bevorzugten
Mutanten eine Alanin-(A)-Insertion an Stellung 2, die nicht im Wildtyp
gefunden wird, umfassen. Demzufolge können solche Mutanten als Y8A-,
Y38A-, V94Q-, V94R-, I115R- und I115Q-Mutanten der MAILDVDY-Form
von Pfu-Pol bezeichnet werden und entsprechen Y7A-, Y37A-, V93Q-,
V93R-, I114R- und I114Q-Mutanten des echten Wildtyps (MILDVDY).
Y7A-, Y37A-, V93Q-, V93R-, I114R- und I114Q-Mutanten des echten
Wildtyps (MILDVDY) stellen auch bevorzugte erfindungsgemäße Mutanten
dar.
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Es
wird erkannt werden, dass äquivalente
Reste in anderen archaealen Polymerasen mutiert sein können (siehe 1).
So bleiben zum Beispiel Y7A, Y37A, V93Q, V93R, I114R, I114Q und
P115Δ bevorzugte Mutanten
in Tgo-Pol, DTok-Pol und 9°N-7-Pol.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die für eine wie vorstehend definierte
Variante der archaealen DNA-Polymerase kodieren.
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Beispiele
bevorzugter Mutanten-Gene weisen die folgenden DNA-Sequenzen auf:
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(a)
Pfu-Pol Y7A (Y8A)
(SEQ
ID NO:9)
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(b)
Pfu-Pol V93Q (V94Q)
(SEQ
ID NO:10)
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(c)
Pfu-Pol P115Δ (P116Δ)
(SEQ
ID NO:11)
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Es
wird erkannt werden, dass die bevorzugten Mutanten, die durch die
vorstehend aufgelisteten DNA-Sequenzen kodiert sind, ein Codon für ein Alanin
(A) umfassen, das an Stellung 2 insertiert ist, das im Wildtyp nicht
gefunden wird. Demzufolge können
solche Mutanten als Y8A-, Y38A- und P116Δ-Mutanten der MAILDVDY-Form
von Pfu-Pol bezeichnet werden und entsprechen Y7A-, Y37A- und P115Δ-Mutanten
des echten Wildtyps (MILDVDY).
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Es
wird auch erkannt werden, dass DNA-Sequenzen für andere bevorzugte Mutanten
anhand der vorstehend erwähnten
Aminosäuresequenzen
ohne weiteres offensichtlich sind. Demzufolge stellen DNA-Moleküle, die
Y7A-, Y37A-, V93A-, I114R-, I114Q- und P115Δ-Mutanten des echten Wildtyps
(MILDVDY) kodieren, auch bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuren dar.
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Die
wie vorstehend definierten Varianten der Polymerasen sind besonders
nützlich
für PCRs,
da sie wärmestabil
sind, eine „Proofreading"-Fähigkeit
aufweisen, aber durch die Anwesenheit von dUTP nicht aufgehalten
werden.
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Demzufolge
stellt ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ein Kit bereit,
das für
die Polymerasekettenreaktionen, umfassend zu amplifizierende DNA,
freie Basen, Primer und eine Variante der archaealen DNA-Polymerase
mit einer modifizierten Aminosäuresequenz
von einer Wildtyp-Aminosäuresequenz
bereitstellt, wobei die modifizierte Sequenz sich in den Amino-terminalen
Aminosäuren
befindet, die eine Uracil-bindende Tasche in der Wildtyp-Polymerase
umfassen, die Variante der Polymerase im Vergleich zur Wildtyp-Polymerase
eine reduzierte Affinität
zu Uracil aufweist.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiter ein Verfahren zum Amplifizieren von DNA,
umfassend die Schritte von: (i) Denaturieren eines DNA-Doppelstrangs
durch Erhitzen einer Lösung,
enthaltend die DNA, freie Oligonukleotide, Primer und eine Variante
der archaealen DNA-Polymerase mit einer modifizierten Aminosäuresequenz
einer Wildtyp-Aminosäuresequenz,
wobei sich die modifizierte Sequenz in den Amino-terminalen Aminosäuren befindet,
die eine Uracil-bindende Tasche in der Wildtyp-Polymerase umfassen,
wobei die Variante der Polymerase im Vergleich zur Wildtyp-Polymerase
eine reduzierte Affinität
zu Uracil aufweist; (ii) Reduktion der Temperatur der Lösung zur
Bewirkung von Annealing des Primers und der DNA und (iii) Erhitzen
der Lösung
zur Bewirkung der Verlängerung
der DNA durch die Variante der Polymerase.
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Die
Fähigkeit
der Varianten der DNA-Polymerase, DNA in Anwesenheit von dUTP zu
amplifizieren, resultiert darin, dass sie für die PCR, die sich dUTP anstelle
von dTTP, zum Beispiel bei der Prävention der Kontamination von
Proben, zunutze macht, besonders geeignet ist.
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Ein
bevorzugtes Protokoll zum Durchführen
der PCR unter Verwendung der Varianten der Polymerasen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist wie folgt: Die PCR kann unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden:
100 μl Volumen,
20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X100, 100 μg/ml BSA,
je 250 μM
dATP, dGTP, dCPT und entweder 250 μM dTTP oder 250 μM dUTP, 2,5
Einheiten DNA-Polymerase überschichtet
mit 40 μl
Mineralöl
(1 Einheit Polymerase wird als die Enzymmenge definiert, die 10
nmol dATP in mit Säure
präzipitierbares
Material unter Verwendung eines auf aktivierter Kalbthymus-DNA basierenden
Assays (4) in 30 min bei 72 °C
inkorporiert). 5 ng zu amplifizierende Matrizen-DNA werden verwendet
und die Konzentration der Forward- und Reverse-Primer (je 18 Basen
lang) beträgt
0,3 μM.
Jede PCR bestand aus 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 2 min bei 52 °C und 4,5
min bei 72 °C.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun weiter mittels der folgenden Beispiele
erläutert,
worin Beispiel 1 die Uracil-bindende Tasche von Archaea-Polymerasen,
insbesondere der hyperthermophilen Archaea, Pyrocoocus furiosus
(Pfu-Pol) untersucht und Beispiel 2 die Wirkung der Mutagenese von
Resten in und um die Uracil-bindende Tasche der archaealen DNA-Polymerasen
und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen untersucht,
worin:
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1 ein
Aminosäuresequenz-Alignment
der archaealen DNA-Polymerasen der B-Familie, die den Resten 1 – 130 der
Polymerase von Pyrococcus furiosus entspricht, erläutert. Kandidaten
wurden unter Verwendung einer WUBLAST-Recherche (European Bioinformatics
Institute, http://www.ebi.ac:uk/ebi_home.html) auf Homologe von
Pfu-Pol identifiziert. Es wurde eine zusätzliche ENTREZ-Recherche der
SWISSPROT-Datenbank auf DNA-Polymerasen der B-Familie durchgeführt [Genbank (http://www.ncbi.nhn.nih.gov/)].
Es wurden unter Verwendung von ClustalX (Version 1.81) Sequenz-Alignments
generiert [J. D. Thompson et al., Nucl. Acids Res. 24, 4876 (1997)].
Die Organismen und die Zugriffsnummern für die DNA-Polymerasesequenzen
waren: Pyrococcus furiosus (Pfu) (P80061), Thermococcus gorgonarius
(Tgo) (pdb 1D5A), Pyrococcus kodakaraensis (PKOD) (gi/13399597),
Desulfurococcus, Stamm Tok (DTok), Thermococcus sp. 9°N-7 (9°N-7) (Q56366),
Thermococcus litoralis (Tli) (AAA72101.1), Methanococcus voltae
(Mvo) (P52025), Pyrobaculum islandicum (Pis) (AAF27815.1), Archaeoglobus
fulgidus (Agu) (O29753), Cenarchaeaum symbiosum (Csy) (AAC62712.1),
Sulfolobus acidocaldarius (Sac) (P95690), Sulfurisphaera ohwakuensis
(Soh) (BAA23994.1), Sulfolobus solfataricus (Sso) (P26811), Pyrodictium
occultum (Poc) (BAA07579.1) und Aeropyrum pernix (Ape) (NP_148473.1);
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2A: der Matrizen-Bindungsspalt T (21)
von Tgo-Pol darstellt, der die Anwesenheit einer Tasche zeigt. B:
die N-terminale Domäne
von Tgo-Pol mit Aminosäuren
darstellt, die die in Spacefill gezeigte Tasche bilden: Y7; P36/Y37;
Aminosäuren
90 – 97
(22); Aminosäuren
112 – 116
(23). Es werden α-Helices
(24) und β-Faltblätter (25)
gezeigt. C: Aminosäuresequenzen
von den N-terminalen Domänen
von Tgo-Pol (obere Sequenz (SEQ ID NO:12)) und RB69-Pol (untere
Sequenz (SEQ ID NO:13)). Aminosäuren,
die die Tasche in Tgo-Pol (und den entsprechenden Resten in RB69-Pol)
bilden, sind unterstrichen und entsprechen den in Panels B und E
identifizierten Aminosäuren.
Zylinder stellen α-Helices
und Pfeile β-Faltblätter dar.
Die Aminosäuresequenzen
weisen eine minimale Homologie auf und wurden unter Verwendung von
struktureller Homologie aligned. D: strukturelles Alignment der
N-terminalen Domänen
von Tgo-Pol und RB69-Pol. Es wird das Insert in Tgo-Pol gezeigt
(26). Diese strukturelle Überlagerung
wurde zur Generierung des in C gezeigten Aminosäure-Aligmnents verwendet. E:
die N-terminale Domäne
von RB69-Pol. Spacefilled Aminosäuren
(V8, Q10); Reste 65 – 72
(27); Reste 84 – 89
(28); P35/S36, die weitgehend hinter den Resten 84 – 89 liegen)
entsprechen denen in Tgo-Pol (in Panel B ersichtlich), die die Tasche
bilden. Sowohl V8 als auch Q10 befinden sich in der Nähe der Position
von Tgo-Pol Y7. α-Helices
(24) und β-Faltblätter (25)
sind ersichtlich. Modelle von Bildern/strukureller Homologie wurden
unter Verwendung des Schweizer Modells [N. Guex, M. C. Peitsch,
Electrophoresis 18, 2714 (1997)] (http://www.expasy.ch/spdbv/),
POV-Ray (C. Cason, POV-Ray fur Windows, Version 3.1g (1999)] (http://www.povray.org)
und Rasmol [R. Sayle, J. F. Milner-White, Trends Biochem. Sci. 20, 374
(1995)] gezeigt;
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3:
Modellieren von Pyrimidinen in die N-terminale Domänentasche
von Tgo-Pol unter Verwendung von Web Lab Viewer Pro [Molecular Simulations
Inc., Web Lab Viewer Pro (Version 4.0) (2000)] (http://www.msi.com).
Schraffierte Linien stellen Wasserstoffbindungen dar, außer dass
sterische Überlappungen
(Clashes) identifiziert werden (31). Uracil bildete vier Enzym-Base-Wasserstoffbindungen
und keine Überlappungen.
Cytosin und Thymin ergaben weniger Wasserstoffbindungen und/oder Überlappungen.
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Für 4A und B: Primer-Verlängerungsreaktionen unter Verwendung
eines mit 5'-32P-markierten 24-mer-Primers (5'GGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGC-3' (SEQ ID NO:14))
(2,5 nM) annealt an eine 44-mer-Matrize (5'-GGAGACAAGCTTG(U/T)ATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCTAAAA-3' (SEQ ID NO:15))
(5 nM). Der Primer hybridisiert mit dein unterstrichenen Abschnitt
der Matrize, um ein Uracil (Thymin in Kontrollen) sieben Basen vom
Primer-Matrizen-Übergang
entfernt zu platzieren (H. H. Hogrefe, C. J. Hansen, B. R. Scott,
K. B. Nielson, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 99, 596 (2002)). In Anwesenheit
der vier dNTPs waren alle Pfu-Pol-Varianten in der Lage, die Kontrollmatrize,
der Uracil mangelt, vollständig
zu kopieren, wobei der markierte 24-mer-Primer in ein 44 Basen langes
Produkt (A) umgewandelt wurde. Mit Uracil in der Matrize hielt das
Wildtyp-Enzym (WT) die Polymerisation auf (H. H. Hogrefe, C. J.
Hansen, B. R. Scott, K. B. Nielson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
99 596 (2002)), wobei sich ein trunkiertes Produkt (B) ergibt. Der
Pfeil (41) zeigt den bedeutenden Pause-Ort an, von dem (unter Verwendung
von Standards, nicht erläutert),
gezeigt wird, dass er vier Basen vor dem Uracil auftritt. Mit Y7A,
V93Q und P115Δ wurden
einige Produkte voller Länge beobachtet
(Mengen: V93Q > P115Δ > Y7A), was auf Durchlesen
des Matrizenstrang-Uracils (Panel B) hindeutet. Mit Y37A, Y37F und
P115F wurde kein Produkt voller Länge gesehen (etwas Material,
das sich teilweise an der „Uracil
induzierten Pause" vorbei
verlängerte),
war mit Y7A, Y37A und Y37F ersichtlich). Die ersten und zweiten
Lanes enthalten stardardmäßiges 24-mer
und 44-mer. C und D: PCR-Reaktionen. In der Kontroll-PCR mit den
vier normalen dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) ergaben alle Pfu-Pol-Varianten
(und Taq-Pol) das erwartete PCR-Produkt, ca. 2 Kilobasen lang (C).
Wenn dUTP dTTP ersetzte, produzierte Taq-Pol ein 2-kBasen-Fragment
(D). Mit den meisten Pfu-Pol-Varianten (WT, Y37A, Y37F und P115F)
wurde kein PCR-Produkt gesehen (D). Drei Pfu-Pol-Mutanten produzierten
ein PCR-Produkt (Mengen: V93Q > P115Δ > Y7A) (2x bzw. 4 x
Beladungen wurden zur Sichtbarmachung mit P115Δ und Y7A verwendet). Alle PCR-Reaktionen
wurden unter identischen Bedingungen mit keiner Optimierung durchgeführt; dies
trägt wahrscheinlich
für Kontaminanten
mit niedrigerem Gewicht Rechnung, die in einigen Lanes gesehen wurden.
Die Marker (wichtige Größen sind
angezeigt) wurden von Promega bezogen;
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5:
Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Polymerase von Thermus aquaticus
(Taq-Pol) und Polymerase von Pyrococcus furiosus (Pfu-Pol) (Wildtyp
und zwei Mutanten, V93Q und V93R). Ein DNA-Fragment (ca. 1 Kilobase
lang) aus dem Plasmid pET-17b(Pfu-Pol) wurde amplifiziert. Bedingungen:
20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % (v/v) Triton X100 und 0,1 mg/ml
Rinderserumalbumin. Jede Reaktion enthielt je 250 μM dATP, dGTP
und dCTP. Die Reaktionen 1 – 4
enthielten 250 μM
TTP; Reaktionen 5 – 8
250 μM dUTP.
Es wurden 2,5 Einheiten der Polymerase verwendet. Zyklus 1 × 10 Minuten
bei 94 °C;
30 × 1
Minute bei 94 °C/2
Minuten bei 42 °C/1
Minute bei 72 °C;
1 × 10
Minuten bei 72 °C.
Die Pfu-Pol-Mutanten V93Q und V93R ergeben eine höhere Ausbeute
des PCR-Produkts (Lanes 3, 4) als die Wildtyp-Pfu-Pol (Lane 2),
wenn TTP verwendet wird. Wildtyp-Pfu-Pol ergibt mit dUTP kein PCR-Produkt
(Lane 6), wohingegen Pfu-Pol-Mutanten V93Q und V93R ein Produkt
ergeben (Lanes 7, 8) [Lane 1 = Taq-Pol mit TTP; Lane 2 = Wildtyp-Pfu-Pol
mit TTP; Lane 3 = Pfu-Pol V93Q mit TTP; Lane 4 = Pfu-Pol V93R mit
TTP; Lane 5 = Taq-Pol mit dUTP; Lane 6 = Wildtyp-Pfu-Pol mit dUTP;
Lane 7 = Pfu-Pol V93Q mit dUTP; Lane 8 = Pfu-Pol V93R mit dUTP] [M
= 100-bp-Ladder; Mb = 1-kb-Ladder].
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BEISPIEL 1
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Kristallstrukturen
sind für
fünf DNA-Polymerasen
der B-Familie bekannt: eine virale, die übrigen vier archaeal. Die erste
aufzulösende
Struktur war für
die Polymerase (RB69-Pol) des Bakteriophagen RB69 (J. Wang et al.,
Cell 89, 1087 (1997)); eine Struktur mit Primer-Matrize wurde auch
bestimmt (M. C. Franklin, J. J. Wang, T. A. Steitz, Cell 105, 657
(2001)). In jüngerer
Zeit wurde die Struktur einer archaealen DNA-Polymerase der B-Familie
vom hyperthermophilen Archaeon Thermococcus gorgonarius (Tgo-Pol)
berichtet (K. P. Hopfner et al., Structure 7, 1189 (1999)). Drei
andere archaeale Polymerasestrukturen, Desulfurococcus, Stanzen
Tok (DTok-Pol) (Y. Zhao et al., Structure 7, 1189 (1999)), Thermococcus
sp. 9°N-7
(9°N-7-Pol)
(A. C. Rodriguez, H.-W. Park, C. Mao, L. S. Beese, J. Mol. Biol.
299, 447 (200)) und Pyrococcus kodakaraensis KOD1 (KOD1-Pol) (H.
Hashimoto et al., J. Mol. Biol. 306, 469 (2001)), wurden anschließend aufgelöst. Nur
Apoenzymstrukturen sind für
die Archaea bekannt. Alle fünf
Polymerasen der B-Familie enthalten fünf distinkte Domänen, die
N-terminale Domäne,
die Exonuklease- oder „Editing"-Domäne und drei
Domänen
mit aktivem Polymerase-Ort. Die Faltung der fünf Domänen bildet drei distinkte Spalte
(„Clefts"), die sich von einem
zentralen Loch erstrecken. Zwei (als Spalte D und T bezeichnet)
sind, auf jeder der beiden Seiten des zentralen Lochs ca. 180 ° relativ
zueinander orientiert. Die Struktur von RB69-Pol, enthaltend eine
Primer-Matrize, deutet darauf hin, dass Spalt D die doppelsträngige Primer-Matrize
bindet und Spalt T die einsträngige
Matrize bindet (M. C. Franklin et al., vorstehend). Die drei Polymerase-Domänen bilden
Spalt D, wohingegen Spalt T von der Exonuklease-Domäne und der
N-terminalen Domäne
gebildet wird. Der dritte Spalt steht senkrecht zu den anderen beiden
und stellt den 3'-5'-Exonuklease/Editing-Spalt
dar.
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Die
Untersuchung von Spalt T im Fall von Tgo-Pol (die anderen archaealen
Polymerasen ergeben ähnliche
Ergebnisse) ließ die
Anwesenheit einer Tasche erkennen, die sich auf einer Oberfläche einer
nach der Außenkante
der Polymerase exponierten Seite befindet (2A).
Der Ort dieser Tasche, in der Bindungsregion des Matrizenstranges,
ca. vier Basen vom Primer-Matrizen-Übergang entfernt, macht es
zu einem eindeutigen Kandidaten für die Erkennung von Uracil.
Die Tasche besteht aus Aminosäuren,
die lediglich in der N-terminalen Domäne anwesend sind. Aminosäuren aus
vier Regionen dieser Domäne,
die sich räumlich
dicht zusammen befinden, werden zum Assemblieren der putativen Uracil-Bindungstasche
verwendet. Diese Aminosäuren
sind in 2B (eine strukturelle Darstellung
der N-terminalen Domäne)
und unterstrichen in 2C (die Aminosäuresequenz
der N-terminalen Domäne)
erläutert.
Die Funktion von Y7, das am Eingang der Tasche sitzt, ist obskur.
Es könnte
einen Deckel bilden, der sich nach der Bindung schließt, wobei
der Einschluss (und folglich die hohe Affinität) von Uracil gewährleistet
wird. Die Base der Tasche (in 2B deutlich
sichtbar als P36/Y37) wird durch Y37 gebildet, durch P36 am Beginn
eines β-Faltblatts
orientiert und durch K84 „unter" Y37 getragen. Eine
Seite der Tasche wird durch die Aminosäuren 90 – 97, gebildet, die in einer α-Helix anwesend
sind. Ein Prolin (P94) biegt die α-Helix,
wobei eine gebogene Wand gebildet wird (2B).
Die andere Seite umfasst die Reste 110 – 116; Aminosäuren in
einer Loop-Region (110 – 114)
oder am Beginn einer zweiten α-Helix
(115 – 116).
Diese α-Helix
beginnt mit Aminosäuren
P115 und F116. Das Prolin scheint eine kritische Rolle zu spielen,
wobei es sicherstellt, dass P115 und F116 zum Bilden eines Teils
der gebogenen Wand der Tasche fähig
sind (2B).
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Die
virale Polymerase von RB-69 weist 61 % Aminosäure-Identität mit dein Bakteriophagen T4-Pol auf.
Das N-Terminal von RB69-Pol ist außerdem identisch mit einer
Struktur für
ein N-terminales Fragment von T4-Pol (J. Wang, P. Yu, T. C. Lin,
W. H. Konigsberg, T. A. Steitz, Biochemistry 35, 8110 (1996)). Es
wurde bereits zuvor nachgewiesen, dass T4-Pol die Polymerisation
als Reaktion auf das Uracil im Matrizenstrang nicht aufhielt (M.
A. Greagg et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 96, (1999)); die Unfähigkeit
Uracil zu erkennen, würde auch
für RB69-Pol
erwartet werden. Dies steht im Gegensatz zu Tgo-Pol, das die Polymerisation
aufhält,
wenn man dem Uracil Matrizenstrang begegnet (M. A. Greagg et al.,
vorstehend). Tgo-Pol wird auch durch Uracil-enthaltende DNA inhibiert
(R. S. Lasken, D. M. Schuster, A. Rashtchian, J. Biol. Chem. 271,
17692 (1996)); ein nicht mit viralen Enzymen bemerktes Merkmal.
Wenn deshalb die mit Tgo-Pol gesehene Tasche zum Uracil-Nachweis
verwendet wird, sollte sie für
die viralen Enzyme abwesend sein. Die N-terminalen Domänen von Tgo-Pol
und RB69-Pol zeigen eine erhebliche strukturelle Homologie (2D); die in der Nähe von perfektem Alignment
von sekundären
strukturellen Elementen wird, trotz des fast vollständigen Mangels
an Aminosäuresequenzhomologie,
beobachtet (2C). Der einzige signifikante
Unterschied stellt die Anwesenheit eines Aminosäure-Inserts (in 2D ersichtlich) im archaealen Enzym dar.
Detaillierte Vergleiche weisen jedoch auf Unterschiede in den beiden
Polymerasen hin (2E). Mit Tgo-Pol
kann Y7 als ein Deckel wirken und Y36 bildet die Base der Tasche;
in RB-69 werden diese Reste mit Valin/Glutamin (beide diese Aminosäuren in RB69-Pol
befinden sich in der Nähe
von Y7 von Tgo-Pol und es ist nicht klar, welche den exakten Ersatz
darstellt) bzw. Serin ersetzt. Auf ähnliche Weise verwendet Tgo-Pol
eine Prolin-enthaltende abgeknickte α-Helix (Reste 90 – 97) zur
Bildung einer Wand der Tasche. In RB69-Pol mangelt der entsprechenden α-Helix (Reste 65 – 74) das
Prolin; deshalb ist die Helix gerade und bildet keine gute Wand.
Ein wichtiges Merkmal beinhalten jedoch P115 und F116, die einen
Teil einer der Wände
der Tasche mit Tgo-Pol bilden. Im Fall von RB69 fehlt das Prolin
und dies führt
zum entsprechenden Phenylalanin (F88), das in die Tasche fällt und
sie vollkommen ausfüllt.
Wie aus 1E ersichtlich ist, bedeutet
dies, dass dein viralen Enzym eine Uracil-bindende Tasche fehlt
(P35/S36 sind weitgehend undeutlich). Die Unterschiede zwischen
den viralen und archaealen Enzymen, die auf feinen Änderungen
an einigen wenigen Aminosäuren
basieren, stellen überzeugende
Hinweise bereit, dass die N-terminale Tasche für den Uracil-Nachweis verantwortlich
ist.
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Es
war möglich,
Uracil in die Tasche von Tgo-Pol zu modellieren (3A).
Die vorteilhafteste Orientierung produziert vier Wasserstoffbindungen
zwischen dem Protein und Uracil. In allen Fällen verwendet das Protein
die Peptidhauptkette für
die Bildung der Wasserstoffbindung. Die Interaktionen umfassen die
folgenden: I114 (Peptid-NH) an die C2=O-Gruppe von Uracil; E111
(Peptid =O) an N3H von Uracil; Y37 (Peptid =O) an -N3H von Uracil
und (Peptid -NH) an C4=O von Uracil (3A).
An der gleichen Stellung wie Uracil überlagertes Cytosin bildet
nur eine Wasserstoffbindung (I114 (Peptid -NH) an C2 =O von Uracil)
und die 4-NH2-Gruppe überlappt mit den Atomen der
Hauptkette von Y37 (Peptid =O und -NH) (3B).
Diese Überlappung
konnte durch Umpositionierung des Cytosins gemildert werden, aber
nur auf Kosten der einen H-Bindung, was zu keinen Interaktionen
zwischen der Base und dem Protein führte. An der Uracil-Stellung überlagertes
Thymin konnte den größten Teil
der Wasserstoffbindungen der Proteinbase bilden (die Interaktionen waren
identisch mit dem Uracil, außer
dass die Bindung von Y37 (Peptid -NH) an -N3H-Wasserstoff von Uracil/Thymin
nicht gebildet wurde). Kritisch ist, dass die C5-CH3-Gruppe
eine schwerwiegende sterische Überlappung
mit den Kanten der cyclischen P36-Seitenkette und dem Ring von F116
aufwies, wodurch die Bindung der Base in der Tasche verhindert wurde
(3C). Die Tasche ist folglich für die Bindung
von Uracil hoch spezifisch und dazu in der Lage, gegen „normale" DNA-Pyrimidine zu
diskriminieren.
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Für die N-terminalen
Domänen
der vierzehn archaealen DNA-Polymerasen der B- Familie wurde ein Aminosäuresequenz-Alignment
durchgeführt
(1); acht stammten von der Crenarchaea und sechs
von der Euryarchaea. Bei zwölf
der Polymerasen handelte es sich entweder um Thermophile oder Hyperthermophile, eine
war mesophil (Methanococcus voltae (Mvo)) und eine war psychrophil
(Cenarchaeaum symbiosum (Csy)). Zwei hoch konservierte Regionen
(A und B), die die meisten der Aminosäuren enthalten, die die Uracil-bindende
Tasche bilden, sind ersichtlich. Viele der Aminosäuren, die
die Uracil-bindende Tasche umfassen (2B und 2C) sind hoch konserviert; besonders die
Uracil enthaltenden Reste (3A). Folglich
zeigen P36, Y37, E111 und I114 eine 100%ige Identität. Der mögliche Taschendeckel,
Y7, weist auch eine 100%ige Konservierung auf. Mehrere andere wichtige Aminosäuren, z.
B. V93 (die eine Seite der Tasche auskleidet). P115 und F116 (die
die andere Seite der Tasche auskleiden) lassen einen hohen Konservierungsgrad
erkennen.
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BEISPIEL 2
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Zum
Testen der Fähigkeit
der Mutantenpolymerasen bei der Erkennung von Uracil wurde von drei
Assays Gebrauch gemacht. Die Primer-Verlängerungsreaktionen (M.A. Greagg
et al., vorstehend) messen die Fähigkeit
einer Polymerase, einen Primer durch Uracilbasen im Matrizenstrang
zu verlängern.
Wie erwartet waren sowohl die Wildtyp- als auch die Mutantenenzyme
dazu in der Lage, eine Kontrollmatrize, der es an Uracil mangelt,
vollkommen zu kopieren (4A). Wie zuvor
bereits beobachtet wurde (M. A. Greagg et al., vorstehend), hielt
das Wildtyp-Enzym die Polymerisation vier Basen oberstromig vom
Matrizenstrang-Uracil auf, was zu einem trunkierten Produkt führte (4B). Y37A, Y37F und P115F verhielten sich
auf ähnliche
Weise wie der Wildtyp. Drei der Mutantenenzyme, V93Q, P115Δ und Y7A,
produzierten jedoch ein Produkt voller Länge, wenn Uracil anwesend war
(4B). Mit V93Q prädominierte das Produkt voller
Länge;
in den Fällen
von P115Δ und
Y7A wurde sowohl das Produkt voller Länge als auch das trunkierte
Produkt gesehen.
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Als
Nächstes
erfolgte unter Verwendung eines auf der Fluoreszenz-Anisotropie
basierenden Bindungsassays die Untersuchung der Fähigkeit
der Polymerasen, einsträngige
DNA, die Uracil enthielt, zu binden (S. L. Reid, D. Parry, H-H.
Liu, B. A. Connolly, Biochemistry 40, 2484 (2001)). Die Bestimmung
von KD mittels Fluoreszenz-Anisotropie verwendete
ein Oligodesoxynukleotid, enthaltend ein einzelnes Uracil und eine
Hexachlorofluorescein-Markierung an ihrem 5'-Terminal. Bei dem verwendeten Oligodesoxynukleotid
handelte es sich um: 5'-hex-GCCCGCGGGAUATCGGCCCTTA-3' (SEQ ID NO:16) (oder
eine Kontrolle, in der das Uracil durch Thymin ersetzt wurde). Die
Konzentration des Oligodesoxynukleotids betrug 5 nM in 1 ml von
10 mM Hepes-NaOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Aliquote des Enzyms
wurden zugefügt
und die Anisotropie gemessen; die Titration wurde fortgesetzt, bis
die Anisotropie nicht mehr weiter zunahm. Das Datenfitting zum Erhalt
von KD-Werten erfolgte wie von Reid et al.
(vorstehend) beschrieben. Die KD-Werte sind
in Tabelle 1 zusammengefasst. Das Wildtyp-Enzym band das Uracil-enthaltende
Oligodesoxynukleotid mit einem KD von 8,3 nM,
eine 17fache Präferenz
im Vergleich zu einem Kontrollstrang, dem es an dieser Base mangelt.
Drei der Mutanten, Y7A, V93Q und P115Δ banden an das Uracil-enthaltende
Oligodesoxynukleotid weniger gut als der Wildtyp (KD-Werte
von 25,7, 144,5 bzw. 84 nM, Tabelle 1). Diese Mutanten entsprechen
genau denen, die fähig sind,
eine Uracil-enthaltende Matrize durchzulesen, die Verkleinerung
der Uracil-Bindung entspricht überdies der
Durchlesefähigkeit.
In beiden Assays verhält
sich der Verlust der Uracil-Erkennung wie folgt: V93Q > P115Δ > Y7A. Diese drei Mutanten
zeigen auch eine reduzierte Präferenz
für Uracilenthaltende
DNA im Vergleich zur Kontrollsequenz; mit P115Δ und V93Q ist die Präferenz nahezu
aufgehoben. Die Mutanten Y7A, Y37A und P115F binden die Uracil-enthaltende
DNA mit im Wesentlichen der gleichen Affinität wie der Wildtyp (Tabelle
1). In einigen Fällen,
Y37A und Y37F, ist die Präferenz
für das
Uracil-enthaltende Oligodesoxynukleotid reduziert, dies ergibt sich
jedoch lediglich aus der engeren Bindung der Kontrolle. In Tabelle
1 ist auch die spezifische Aktivität der mutanten Pfu-Pols relativ
zum Wildtyp ersichtlich. Im Allgemeinen treten, selbst mit der Mutante
mit der geringsten Aktivität
(Y37), die 38 % der Wildtyp-Aktivität beibehält, nur kleine Abnahmen der
Aktivität
auf.
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Im
DNA-Polymerase-Aktivitätsassay
(Richardson, C. C. (1966) in Procedures in Nucleic Acids Research,
G. L. Cantoni, D. R. Davies, Hrsg. (Harper and Row, New York, 1966),
S. 263–27)
wurden 50 μl
Proben, enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4,
2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X100, 100 μg/ml BSA,
je 200 μM
dNTPs, 0,2 mg/ml aktivierte Kalbthymus-DNA (AP Biotech), 1 μCi 3000 Ci/mol
[α-32P]-dATP verwendet. Pfu-Pol (die Menge variierte
abhängig
von der Aktivität
des Enzyms) wurde zugefügt
und 10 Minuten bei 72 °C
inkubiert (die Reaktionen waren in Abhängigkeit zu dieser Zeit linear).
Nach dieser Periode wurde die in das mit Säure präzipitierbare Material inkorporierte
Radioaktivität
mittels Szintillationszählung
bestimmt. Eine Enzymeinheit wird als die Enzymmenge definiert, die
in 30 Minuten bei 72 °C
10 nmol dATP in mit Säure präzipitierbares
Material inkorporiert.
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Tabelle
1. Pfu-Pol-Varianten: spezifische Aktivität und Fähigkeit zur Bindung an Uracil
enthaltende DNA
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Die
spezifischen Aktivitäten
der Pfu-Pol-Varianten wurden unter Verwendung der Inkorporation
von [α-32P]-dATP in mit Säure präzipitierbarer Kalbthymus-DNA
wie beschrieben inkorporiert (siehe vorstehend): Die Werte sind ± 15 %
genau. Die Bindungskonstanten wurden anhand der Fluoreszenz-Anisotropie
unter Verwendung von hex-GCCCGCGGGAUATCGGCCCTTA (SEQ ID NO:16) (Uracil)
oder einem analogen Oligodesoxynukleotid, in dem das Uracil durch
Thymin (Kontrolle) ersetzt wurde, bestimmt (S. L. Reid, et al. (vorstehend)
und J. Wang et al. (vorstehend). Jeder Wert wurde dreimal bestimmt
und der Durchschnitt ± einer Standardabweichung
wird angegeben. Die Präferenz
für Uracil
ist das Verhältnis
KD(Uracil)/KD(Kontrolle).
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Letztendlich
wurde die PCR durchgeführt,
+/– dUTP,
die Fähigkeit
von Pfu-Pol zum Ausführen
der PCR wurde durch Amplifizieren eines 2 Kilobasen-Fragments (zwischen
dem T7-Promotor und dem HindIII-Ort) von pET17-b(Pfu-Pol) bewertet
[S. J. Evans et al., Nucl. Acids. Res. 28, 1059 (2000)]. Bedingungen: 100 μl Volumen,
20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0,1 Triton
X100, 100 μg/ml
BSA, je 250 μM
dNTP (eine Reaktionsreihe enthielt dTTP, die andere dUTP), 2,5 Einheiten
DNA-Polymerase überschichtet
mit 40 μl
Mineralöl.
5 ng pET17-b(Pfu-Pol) wurden verwendet und die Konzentrationen der
Forward- und Reverse-Primer betrugen beide 0,3 μM. Jede Reaktion beinhaltete
30 Zyklen von 1 Minute bei 95 °C,
2 min bei 52 °C
und 4,5 min bei 72 °C.
Die PCR mit Taq-Pol war identisch mit Pfu-Pol, außer dass
10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 0,08 % NP-40, 1,5 mM MgCl2 verwendet wurden. Für die Analyse wurden mit Ethidiumbromid
gefärbte
Agarosegele verwendet.
-
Pfu-Pol
(Wildtyp und Mutanten) und Taq-Pol waren zur Duchführung der
PCR mit den vier normalen dNTPs fähig (4C).
Wenn dUTP anstelle von dTTP verwendet wurde, wurde die PCR mit Taq-Pol
nicht beeinflusst; das Wildtyp-Pfu-Pol ergab jedoch kein Produkt
(4D). Die drei Mutanten, Y7A, P115Δ und V93Q, die
eine verminderte Uracil-Erkennung in Durchlese- und Bindungsassays
aufwiesen, ergaben ein PCR-Produkt (4D).
Die Menge des produzierten PCR-Produkts betrug V93Q > P115Δ > Y7A, wobei wiederum
die für
den Verlust der Uracil-Erkennung gefundene Ordnung abgestimmt wurde.
dUTP (Konzentration 250 μM) ersetzte
in diesen Reaktionen dTTP vollständig.
Das Wildtyp-Enzym ist vollständig
inhibiert, wenn 0,02 μM dUTP
zum „Spiken" der PCR-Reaktionen,
enthaltend die vier normalen dNTPs, verwendet werden (H. H. Hogrefe,
et al. (vorstehend)); wobei deutlich gezeigt wird, dass diese drei
Mutanten hinsichtlich der Uracil-Erkennung sehr behindert sind.
Die Pfu-Pol-Mutanten, Y37A, Y37F und P115F, ergaben mit dUTP kein
PCR-Produkt.
-
In 5 sind
die Ergebnisse von der PCR mit der Polymerase von Thermus aquaticus
(Taq-Pol), dein Wildtyp und zwei Mutanten (V93Q und V93R) der Polymerase
von Pyrococcus furiosus (Pfu-Pol) ersichtlich. Die PCR-Amplifikation
wurde unter zwei distinkten Bedingungssets durchgeführt, d.
h. in Anwesenheit von TTP und in Anwesenheit von dUTP.
-
Alle
vier Polymerasen, Taq-Pol, der Wildtyp von Pfu-Pol und die beiden
Mutationen von Pfu-Pol (V93Q, V93R) waren wie erwartet dazu in der
Lage, die Amplifikation der DNA-Probe in Anwesenheit von TTP erfolgreich
zu vermitteln. Diese erfolgreiche Amplifikation wird durch eindeutig
sichtbare Banden von 1064-bp-Fragmenten in Lanes 1 bis 4 veranschaulicht.
Die Verwendung; von dUTP führte
zu der erwarteten Amplifikationsmenge, wenn sie zusammen mit Taq-Pol,
wie in Lane 5 veranschaulicht, verwendet wird. Darüber hinaus
zeigt Lane 6 keine amplifizierte DNA-Probe und bestätigte dadurch,
dass dUTP die Blockierung der von Pfu-Pol vermittelten Amplifikation
vermittelt. Am wichtigsten ist jedoch, dass Lanes 7 und 8 Banden
aufweisen, die 1064-bp-Fragmenten entsprechen und somit bestätigen, dass
beide Mutanten der Pfu-Polymerase zur Amplifikation fähig sind.
Dadurch kann belegt werden, dass im Gegensatz zur Wildtyp-Pfu-Pol
die V93Q- und V93R-Mutanten von Pfu-Pol, nicht von der dUTP-induzierten
Blockierung beeinflusst sind.
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Insgesamt
bestätigt 5 die
Nützlichkeit
der erfindungsgemäßen Mutanten
bei der PCR unter Verwendung von dUTP.
