DE60122962T2

DE60122962T2 - Reverse Transkription bei hoher Temperatur durch die Verwendung von mutierten DNA Polymerasen

Info

Publication number: DE60122962T2
Application number: DE60122962T
Authority: DE
Inventors: Edward Soh San Francisco Smith; Carita Maria San Francisco Elfstrom; David Harrow Oakland Gelfand; Russell Gene Alameda Higuchi; Thomas William Alameda Myers; Nancy Jeneane Moraga Schoenbrunner; Alice Ming Lafayette Wang
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: CA2342277A1; JP4468919B2; TR200101093A2; US20020012970A1; BR0101493B1; JP2006304804A; JP2002253234A; MXPA01003759A; ATE339518T1; KR20010098620A; CN1273611C; HK1044569B; HK1044569A1; EP1152062A3; EP1152062B1; ES2270915T3; EP1152062A2; AU3516501A; CN1344802A; AU781191B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und insbesondere Verfahren zur reversen Transkription und Amplifikation von Ribonukleinsäure-(RNA)-Sequenzen.
BESCHREIBUNG DES DAZUGEHÖRIGEN FACHGEBIETES
Der Begriff "reverse Transkriptase" beschreibt eine Klasse von Polymerasen, die als RNA-abhängige DNA-Polymerasen charakterisiert sind. Sämtliche bekannten reversen Transkriptasen benötigen einen Primer zur Synthese eines DNA-Transkripts von einer RNA-Matrize. Historisch wurde die reverse Transkriptase in erster Linie zur Transkription von mRNA in cDNA verwendet, die dann zur weiteren Verarbeitung in einen Vektor kloniert werden kann.
Der Begriff "DNA-Polymerase" beschreibt eine Klasse von Polymerasen, die als DNA-abhängige DNA-Polymerasen charakterisiert sind. DNA-Polymerasen zeigen eine starke Abgrenzung gegen die Verwendung einer RNA-Matrize, wie es aus ihren Funktionen in vivo erwartet wird. Trotzdem zeigten verschiedene Laboratorien, daß einige DNA-Polymerasen zur In-vitro-reversen-Transkription von RNA fähig sind (Karkas, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 3834–3838; Gulati et al., 1974, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71: 1035–1039; und Wittig und Wittig 1978, Nuc. Acid Res. 5: 1165–1178). Gulati et al. fanden, daß E. coli Pol I zur Transkription von Qβ-Virus-RNA mit Oligo(dT)10 als Primer verwendet werden kann. Wittig und Wittig haben gezeigt, daß E. coli Pol I zur reversen Transkription von tRNA verwendet werden kann, die enzymatisch mit Oligo(dA) verlängert wurde. Wie jedoch Gulat et al. zeigten, legt die Menge an erforderlichem Enzym und die geringe Größe des cDNA-Produkts nahe, daß die reverse Transkriptase-Aktivität von E. coli Pol I wenig praktischen Nutzen hat.
T. aquaticus (Taq)-DNA-Polymerase, eine thermostabile DNA-Polymerase, synthetisiert Berichten zufolge cDNA mit Mg²⁺ als zweiwertiges Metallion ineffizient (Jones und Foulkes, 1989, Nuc. Acids Res. 176: 8387–8388). Tse und Forget, 1990, Gene 88: 293–296; und Shaffer et al., 1990, Anal. Biochem. 190: 292–296, haben Verfahren zum Amplifizieren von RNA mit Taq-DNA-Polymerase und Mg²⁺-Ion beschrieben. Die Verfahren sind jedoch ineffizient und unempfindlich.
Die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, d.h. RNA und DNA, ist in den US-Patenten 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188 beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren, die Polymerasekettenreaktion (PCR), erfolgt gewöhnlich mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase, wie Taq-DNA-Polymerase, die den verwendeten Temperaturen, die zum Denaturieren des amplifizierten Produkts in jedem Zyklus verwendet werden, standhalten kann. Die PCR ist mittlerweile im Stand der Technik gut bekannt und wurde ausgiebig in der Wissenschaftsliteratur beschrieben. Siehe beispielsweise PCR Applications, 1999 (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, 1995, (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego); PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego); und PCR Technology, 1989 (Erlich, Hrsg., Stockton Press, New York). Kommerzielle Lieferanten, wie PE Biosystems (Foster City, CA) vertreiben PCR-Reagentien und veröffentlichen PCR-Protokolle. Ein Rückblick der Amplifikationsverfahren ist in Abramson und Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47 bereitgestellt.
Da die reverse Transkription mit Taq-DNA-Polymerase in einem Magnesiumionenpuffer für die Praxis zu ineffizient war, wurde zu Beginn eine PCR-Amplifikation ausgehend von einer RNA-Matrize durchgeführt, indem zuerst die reverse Transkription der Ziel-RNA, beispielsweise mit einer nicht- thermostabilen viralen reversen Transkriptase, wie reverse Transkriptase aus Molony Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV RT) oder AMV-RT, und dann die Amplifikation der resultierenden cDNA mit einer thermostabilen DNA-Polymerase erfolgte.
Ein signifikanter Vorteil wurde erzielt mit der Entdeckung, daß eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet werden kann, um eine RNA-Matrize effizient revers zu transkribieren, indem die Reaktion in einem Manganpuffer (Mn²⁺) und nicht in einem Magnesium (Mg²⁺)-Puffer durchgeführt wird, wie es für die Primer-Extension mit einer DNA-Matrize bevorzugt ist. Effiziente Mn²⁺-aktivierte reverse Transkription mit einer thermostabilen DNA-Polymerase ist beschrieben in den US-Patenten Nr. 5,310,652; 5,322,770; 5,407,800, 6,641,864; 5,561,058 und 5,693,517. Da sowohl die Synthese von cDNA aus einer RNA-Matrize als auch die Synthese von DNA aus einer DNA-Matrize in einem Mn²⁺-Puffer durchgeführt werden können, ermöglicht die Verwendung eines Mn²⁺-Puffers Reaktionen mit einem einzelnen Enzym aus gekoppelter reverser Transkription und Amplifikation (siehe ebenfalls Myers und Sigua, 1995, in PCR Strategies, siehe oben, Kapitel 5).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur reversen Transkription und Amplifikation von RNA-Sequenzen, vorzugsweise mit einer einzelnen thermostabilen DNA-Polymerase in einer gekoppelten in einem einzigen Röhrchen durchgeführten Reaktion, wobei die Verfahren eine verbesserte reverse Transkriptions-("RT")-Effizienz relativ zu vorher beschriebenen reversen Transkriptions-Verfahren bei hoher Temperatur bereitstellen.
Die Erfindung stellt Verfahren zur reversen Transkription und Amplifikation von RNA-Sequenzen bereit, die eine einzelne thermostabile DNA-Polymerase in einem Magnesiumionen (Mg²⁺)-Puffer in einer gekoppelten Reaktion in einem einzigen Röhrchen verwendet. Die Verfahren, die mit einem Mg²⁺-Puffer durchgeführt werden, stellen eine gesteigerte Genauigkeit gegenüber vorher beschriebenen Verfahren bereit, die auf einer Mangan (Mn²⁺)-aktivierung einer thermostabilen DNA-Polymerase beruhen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden eine mutierte thermoaktive, vorzugsweise thermostabile, DNA-Polymerase, die eine Punktmutation an einer entscheidenden Aminosäureposition hat, von der vorher geschrieben wurde, daß sie die Fähigkeit der DNA-Polymerase zum Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTPs), die mit Farbstoffen der Fluorescein- oder Cyanin-Familie markiert sind, beeinflußt. Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß diese mutierten DNA-Polymerasen auch eine signifikant erhöhte Fähigkeit zur Durchführung der reversen Transkription aufweisen, insbesondere in einem Mg²⁺-Puffer.
Mutierte DNA-Polymerasen, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, sind in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0,902,035, der US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631, und der internationalen PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 98/40496 beschrieben. Diese DNA-Polymerase-Mutanten haben Beschreibungen zufolge eine gesteigerte Aktivität zum Einbau von Nukleotiden, einschließlich Desoxynukleotiden (dNTPs) und Basenanaloga, wie Didesoxynukleotiden (ddNTPs), die mit Farbstoffen der Fluorescein- und Cyaninfamilie markiert sind. Der Einfachheit halber werden diese DNA-Polymerase-Mutanten als DNA Polymerasen, "die Farbstoffe der Fluorescein-Familie einbauen" oder "FDI"-DNA-Polymerasen bezeichnet. Der primäre Nutzen, der für FDI-DNA-Polymerasen beschrieben wird, liegt in den DNA-Sequenzierungsreaktionen, die Farbstoff-Terminatoren nutzen (farbstoffmarkierte ddNTPs), welche mit Farbstoffen der Fluorescein- oder Cyanin-Familie markiert sind. Da eine Wildtyp-DNA-Polymerase gegen Nukleotid-Analoga unterscheidet, und noch stärker gegen so genannte markierte Nukleotid-Analoga, wurden Farbstoff-Terminator-Sequenzierungsreaktionen mit einem Überschuß an Farbstoff-Terminatoren gewöhnlich durchgeführt. Durch Senken der Unterscheidung gegen die markierten Farbstoffterminatoren, ermöglichen FDI-DNA-Polymerasen, daß Sequenzierungsreaktionen mit einer signifikant niedrigeren Konzentration an Farbstoff-Terminatoren durchgeführt werden können.
Die entscheidende Aminosäureposition, die in den DNA-Polymerasen mutiert ist, welche in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und die die gleiche entscheidende Aminosäure ist, die die Stabilität der DNA-Polymerase zum Einbau von Didesoxynukleotiden steigert, die mit Farbstoffen der Fluorescein- und Cyanin-Familie markiert sind, ist in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0,902,035 und in der US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631 durch ihre Position in einem konservierten Sequenzmotiv identifiziert, das in der nativen Form des Enzyms zugegen ist. Beispiele für dieses Sequenzmotiv in einer Reihe von DNA-Polymerasen sind dort in Tabelle 1 bereitgestellt. Das Sequenzmotiv und die entscheidende Aminosäure sind unten im Wesentlichen auf die gleiche Weise identifiziert.
Ganz allgemein beschrieben, umfaßt dieses entscheidende Motiv mit Hilfe der Standard-Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren in der nativen Form der DNA-Polymerase die Aminosäuresequenz

LXXXXXXXXXE (SEQ ID NO: 1),

Bei einer spezifischeren Ausführungsform umfaßt das entscheidende Motiv in der nativen Form der DNA-Polymerase die Aminosäuresequenz

LSXELXIPYEE (SEQ ID NO: 2),

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das entscheidende Motiv in der nativen Form der DNA-Polymerase die Aminosäuresequenz:

LSQELAIPYEE (SEQ ID NO: 3).

Beispiele für DNA-Polymerasen, die dieses Motiv enthalten, sind die DNA-Polymerasen der Thermus-Art aquaticus, thermophilus, ZO5 und caldophilus.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das entscheidende Motiv in der nativen Form der DNA-Polymerase die Aminosäuresequenz

LSXELSIPYEE (SEQ ID NO: 4),

Bei einer weiteren spezifischeren Ausführungsform umfaßt das entscheidende Motiv in der nativen Form der DNA-Polymerase die Aminosäuresequenz:

LSVRLGXPVKE (SEQ ID NO: 5),

LSKRIGLSVSE (SEQ ID NO: 6).

Ein Beispiel für eine DNA-Polymerase, die dieses Motiv enthält, sind die DNA-Polymerasen von Thermosipho africanus.
Bei einer weiteren spezifischeren Ausführungsform umfaßt das entscheidende Motiv in der nativen Form der DNA-Polymerase die Aminosäuresequenz:

LAQNLNIXRKE (SEQ ID NO: 7),

In jedem der vorstehend identifizierten entscheidenden Motive ist die entscheidende Aminosäure an der Aminosäureposition 4.
Wie in den Beispielen gezeigt, verbesserte die Mutation der entscheidenden Aminosäure zu einer anderen Aminosäure als E (vorhanden in der nativen DNA-Polymerase, die in den Beispielen verwendet wird), A, G oder P die RT-Effizienz. Somit verwenden die erfindungsgemäßen Verfahren eine thermoaktive, vorzugsweise thermostabile, DNA-Polymerase-Mutante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die native Form der DNA-Polymerase ein Sequenzmotiv umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis 7, und die Aminosäure an der Position 4 des Motivs ist zu einer beliebigen anderen Aminosäure mutiert als E, A, G oder P. Die entscheidende Aminosäure ist vorzugsweise zu einer anderen Aminosäure als E, A, G, P oder Q mutiert, stärker bevorzugt zu einer anderen Aminosäure als E, A, G, P, Q oder D.
Die Erfindung betrifft Verfahren zur reversen Transkription und Amplifikation einer RNA in einer mit einem einzelnen Enzym in einem einzigen Röhrchen durchgeführten gekoppelten Reaktion aus reverser Transkription und Amplifikation, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen eines die RNA, einen Primer, Mg²⁺ und eine mutierte temperaturaktive DNA-Polymerase umfassenden Reaktionsansatzes zur reversen Transkription, wobei die mutierte DNA-Polymerase dadurch gekennzeichnet ist, daß
i) die DNA-Polymerase in ihrer nativen Form innerhalb der DNA-Polymerasedomäne eine Aminosäuresequenz umfaßt, bei der es sich um SEQ ID NO: 1 handelt,
ii) es sich bei der Aminosäure in Position 2 der Aminosäuresequenz um S oder A und bei der Aminosäure in Position 5 der Aminosäuresequenz um L oder I handelt und
iii) die Aminosäure in Position 4 der Aminosäuresequenz gegenüber der nativen Sequenz zu einer von E, A, G oder P verschiedenen Aminosäure mutiert ist, und
(b) Behandeln des Reaktionsansatzes bei einer Temperatur, die der mutierten DNA-Polymerase genügt, um die Synthese eines Verlängerungsprodukts des Primers zu starten, so daß ein zu der RNA komplementäres cDNA-Molekül bereitgestellt wird, wobei ein Primerpaar einen ersten Primer, der hinreichend komplementär zur RNA ist, um damit zu hybridisieren, und mit dem die Synthese eines zur RNA komplementären cDNA-Moleküls gestartet wird, sowie einen zweiten Primer, der hinreichend homolog zur RNA ist, um an die cDNA zu hybridisieren, und mit dem die Synthese eines Verlängerungsprodukts gestartet wird, umfaßt, und
(c) Amplifizieren der cDNA.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird anhand einiger nachstehend erläuterter Begriffe leichter verstanden.
Der Begriff "thermoaktive DNA-Polymerase", wie er hier verwendet wird, betrifft eine DNA-Polymerase, die ein erhöhtes Temperatur-Reaktionsoptimum hat. Das erfindungsgemäß verwendete thermoaktive Enzym katalysiert die Primer-Verlängerung optimal bei einer Temperatur zwischen 60 und 90°C.
Der Begriff "thermostabile DNA-Polymerase" betrifft eine DNA-Polymerase, die wärmestabil ist, d.h. nicht irreversibel denaturiert (inaktiviert) wird, wenn sie solange erhöhten Temperaturen ausgesetzt wird, daß die Denaturierung der doppelsträngigen Nukleinsäuren erfolgt. Die Heizbedingungen, die für eine Nukleinsäure-Denaturierung notwendig sind, sind im Stand der Technik bekannt. Wie hier verwendet, ist eine thermostabile Polymerase geeignet zur Verwendung in einer Termperaturzyklusreaktion, wie den Polymerase-Kettenreaktion ("PCR")-Amplifikations-Verfahren, die in 4,965,188 beschrieben sind.
Eine "reverse Transkriptionsreaktion bei hoher Temperatur", wie sie hier verwendet wird, betrifft eine reverse Transkriptionsreaktion, die bei einer Temperatur von mindestens 40°C, vorzugsweise 40 bis 80°C, und stärker bevorzugt 50 bis 70°C durchgeführt wird.
Der Begriff "Gen" betrifft eine DNA-Sequenz, die Kontroll- und codierende Sequenzen umfaßt, die zur Produktion eines gewinnbaren biologisch aktiven Polypeptids oder einer Vorstufe notwendig sind.
Der Begriff "nativ" betrifft ein Gen oder Genprodukt, das aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert wird. Dieser Begriff betrifft auch eine durch molekularbiologische Techniken erzeugte rekombinante Form des nativen Proteins, die eine identische Aminosäuresequenz wie die native Form hat.
Der Begriff "Mutante" betrifft ein Gen, dessen Nukleinsäuresequenz verändert wurde, oder ein Genprodukt, dessen Aminosäuresequenz verändert wurde, was zu einem Genprodukt führt, das im Vergleich mit dem nativen oder Wild-Typ-Gen oder -Genprodukt veränderte funktionelle Eigenschaften aufweist. Solche Veränderungen umfassen Punktmutationen, Deletionen und Insertionen.
Wie hier verwendet betrifft eine "Punktmutation" in einer Aminosäuresequenz entweder eine einzelne Aminosäuresubstitution oder einzelne Aminosäure-Deletion. Eine Punktmutation wird vorzugsweise durch eine geeignete Codonänderung in der codierenden DNA in eine Aminosäuresequenz eingebracht.
Einzelne Aminosäuren in einer Sequenz werden hier als AN veranschaulicht, wobei A die Aminosäure in der Sequenz und N die Position in der Sequenz ist. Mutationen des Substitutionstyps in einer Aminosäuresequenz werden hier als A₁NA₂ veranschaulicht, wobei A₁ die Aminosäure in der unmutierten Proteinsequenz ist, A₂ die Aminosäure in der mutierten Proteinsequenz ist und N die Position der Aminosäuresequenz ist. Entweder der Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Code werden zum Bezeichnen der Aminosäuren verwendet (siehe Lehninger, Biochemistry, 2. Auflage, Hrsg., 1975, Worth Publisher, Inc. New. York, NY, Seiten 73–75) Beispielsweise eine G64D-Mutation veranschaulicht eine Änderung von Glycin zu Asparaginsäure an der Aminosäure-Position 46. Die Aminosäure-Positionen werden auf der Basis der Vollängensequenz des Proteins numeriert, aus dem der Bereich, der die Mutation umfaßt, hergeleitet ist. Veranschaulichungen von Nukleotiden und Mutationen in DNA-Sequenzen sind analog.
Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Oligonukleotid" betreffen Primer, Sonden und Oligomer-Fragmente, die nachgewiesen werden sollen, und sollen generisch zu Polydesoxyribonukleotiden sein (die 2-Desoxy-D-ribose enthalten), zu Polyribonukleotiden (die D-Ribose enthalten) und jedem anderen Typ von Polynukleotid, der ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase, oder modifizierten Purin- oder Pyrimidinbase ist. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung hinsichtlich der Länge zwischen den Begriffen "Nukleinsäure" und "Oligonukleotid", und diese Begriffe werden untereinander austauschbar verwendet. Diese Begriffe betreffen nur die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfassen diese Begriffe doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA.
Oligonukleotide lassen sich nach einem beliebigen geeigneten Verfahren herstellen, wie beispielsweise durch Klonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen und direkte chemische Synthese durch ein Verfahren wie das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151; das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862; und das Festträger-Verfahren von US-Patent Nr. 4,458,066. Die automatische Synthese mittels Cyanoethylphosphoramidit-Chemie ist bevorzugt. Die Reagentien und Geräte sind beispielsweise von PE Biosystems (Applied Biosystems Foster City, CA) und Pharmacia (Piscataway, NJ) kommerziell erhältlich.
Der Begriff "Primer", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Oligonukleotid, unabhängig davon, ob es natürlich oder synthetisch ist, das als Initiationspunkt für die Synthese wirkt, wenn es unter Bedingungen untergebracht wird, in denen die Primerverlängerung gestartet wird. Ein Primer ist vorzugsweise ein einzelsträngiges Oligodesoxyribonukleotid. Die ungefähre Länge eines Primers hängt von der beabsichtigten Verwendung des Primers ab, reicht aber gewöhnlich von 15 bis 35 Nukleotiden. Kurze Primer-Moleküle erfordern gewöhnlich kühlere Temperaturen, damit hinreichend stabile Hybrid-Komplexe mit der Matrize gebildet werden. Ein Primer muß nicht die genaue Sequenz der Matrize widerspiegeln, muß aber hinreichend komplementär sein, daß er mit einer Matrize hybridisiert, damit die Primerverlängerung stattfindet.
Ein "Primerpaar", wie es hier verwendet wird, betrifft einen ersten und zweiten Primer, der zur Funktion in einer Amplifikationsreaktion, wie einer Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation einer gewünschten Zielsequenz ausgewählt wird. Zur Verwendung in einer gekoppelten Reaktion aus reverser Transkription und Amplifikation zur Amplifikation einer Ziel-RNA umfaßt ein Primerpaar einen ersten und zweiten Primer, wobei der erste Primer hinreichend komplementär ist zur Ziel-RNA, damit er mit dieser hybridisiert, und die Synthese eines cDNA-Moleküls aktiviert, die komplementär zur Ziel-RNA ist, und der zweite Primer hinreichend homolog ist zur Ziel-RNA, damit er an die cDNA hybridisiert und die Synthese eines Extensionsproduktes aktiviert. Das Design eines Primerpaars zur Amplifikation der Nukleinsäuresequenzen ist im Fachgebiet bekannt.
Ein Primer kann bei Bedarf markiert werden durch Einbringen einer Markierung, die sich durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Maßnahmen nachweisen läßt. Geeignete Markierungen umfassen beispielsweise ³²P, Fluoreszenz-Farbstoffe, elektronendichte Reagentien (wie sie im allgemeinen in ELISA-Tests verwendet werden), Biotin oder Haptene und Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind.
Der Begriff "cDNA", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Kopien-DNA-Molekül, das mit einem Ribonukleinsäurestrang (RNA) als Matrize synthetisiert wird. Die RNA kann mRNA, tRNA, rRNA oder eine andere Form von RNA sein, wie Viren-RNA. Die cDNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder sie kann an ein komplementäres RNA-Molekül über Wasserstoffbrückenbindungen wie in einem RNA/cDNA-Hybrid gebunden sein.
Der Begriff "Reaktionsansatz zur reversen Transkription", betrifft eine wäßrige Lösung, die die verschiedenen Reagentien umfaßt, die zur reversen Transkription einer Ziel-RNA verwendet werden. Diese umfassen Enzyme, wäßrige Puffer, Salze, Oligonukleotid-Primer, Ziel-Nukleinsäure, und Nukleosidtriphosphate. Je nach dem Zusammenhang kann der Ansatz entweder ein vollständiger oder unvollständiger Reaktionsansatz zur reversen Transkription sein.
Der Begriff "Reaktionsansatz zur Amplifikation" betrifft eine wäßrige Lösung, die verschiedene Reagentien umfaßt, die zur Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäure verwendet werden. Diese umfassen Enzyme, wäßrige Puffer, Salze, Amplifikations-Primer, Ziel-Nukleinsäure und Nukleosid-Triphosphate. Je nach dem Zusammenhang kann das Gemisch entweder ein vollständiger oder unvollständiger Reaktionsansatz zur Amplifikation sein. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Reaktionsansatz zur Amplifikation ist ein PCR-Ansatz. Wie hier verwendet, umfaßt ein Reaktionsansatz zur Amplifikation das Reaktionsgemisch, das zur Amplifikation einer RNA verwendet wird, wie in der gekoppelten Reaktion aus reverser Transkription und Amplifikation.
Der Begriff "Puffer", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Lösung, die ein Puffermittel oder ein Gemisch aus Puffermitteln und gegebenenfalls ein zweiwertiges Kation und ein einwertiges Kation enthält.
Herkömmliche Techniken der Molekularbiologie und Nukleinsäurechemie, die innerhalb des Fachkönnens liegen, werden vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molekular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames und S.J. Higgins Hrsg., 1984); Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, NY); Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), und eine Serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Die DNA-Polymerase-Mutanten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, enthalten eine Punktmutation an einer entscheidenden Aminosäureposition, die in der europäischen Patent-Veröffentlichung Nr. 0,902,035, US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631 und internationalen PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 98/40496 identifiziert sind. Die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0,902,035 und die US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631 identifizieren die entscheidende Aminosäure in Bezug auf deren Position innerhalb eines konservierten entscheidenden Sequenzmotivs in der nativen DNA-Polymerase-Sequenz. Die internationale PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 98/40496 identifiziert die entscheidende Aminosäure in der Taq-DNA-Polymerase durch Positionsnummer (E681) und in anderen DNA-Polymerasen durch Aminosäure-Homologie zur Taq-DNA-Polymerase. Beide Verfahren identifizieren die gleiche entscheidende Aminosäureposition. Zur Erläuterung der Beschreibung wird die entscheidende Aminosäure hier in Bezug auf ihre Position in dem konservierten entscheidenden Sequenzmotiv beschrieben.
Die Tabelle 1, im wesentlichen reproduziert aus Tabelle 1 der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0,902,035 und der US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631, liefert die entscheidenden Motive, die man in einer Anzahl veranschaulichender DNA-Polymerasen findet (wobei die entscheidende Aminosäure hervorgehoben ist) zusammen mit Positionen der entscheidenden Aminosäure in der vollständigen Enzymsequenz. Mehrere Positionszahlen sind dann angegeben, wenn leicht unterschiedliche Aminosäuresequenzen für die DNA-Polymerasen aus den gleichen Spezies in der Literatur beschrieben wurden.
TABELLE 1
Eine Reihe von Spezies, die eine thermoaktive DNA-Polymerase mit dem entscheidenden Motiv besitzen, sind in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0,902,035, der US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631 und in der Internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/40496 beschrieben. Bevorzugte DNA-Polymerasen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind hergeleitet von einer Thermus-Art.
Die DNA-Polymerase-Mutante, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist eine thermoaktive, vorzugsweise thermostabile, DNA-Polymerase-Mutante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die native Form der DNA-Polymerase ein Sequenzmotiv umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis 7, und die Aminosäure an der Position 4 zu einer anderen Aminosäure mutiert ist als E, A, G oder P. Die entscheidende Aminosäure ist vorzugsweise zu einer anderen Aminosäure als E, A, G, P oder Q mutiert, stärker bevorzugt zu einer anderen Aminosäure als E, A, G, P, Q oder D.
Die DNA-Polymerase-Mutante kann hergeleitet werden von einer beliebigen Spezies, die eine thermoaktive DNA-Polymerase mit dem entscheidenden Motiv in der Polymerasedomäne aufweist. Das entscheidende Motiv identifiziert einen bestimmten funktionellen Bereich in der Polymerasedomäne des Enzyms, und identifiziert eine Aminosäure in dem Motiv, das für die Funktion entscheidend ist. Die Beispiele beschreiben die Wirkungen auf Mg²⁺-aktivierte reverse Transkriptionseffizienz von jeder möglichen Mutation, an dieser Stelle in einer weithin verwendeten thermostabilen DNA-Polymerase, Thermus thermophilus DNA-Polymerase. Direkt, wenn Aminosäureaustausche an dieser Stelle die Effizienz des Einbaus von Didesoxynukleotiden (ddNTPs) beeinflussen, die in im wesentlichen sämtlichen DNA-Polymerasen mit dem konservierten entscheidenden Motiv mit Farbstoffen der Fluorescein- oder Cyanin-Familie markiert sind, erwartet man, daß die Aminosäureänderungen an dieser Stelle die Mg²⁺-aktivierte reverse Transkriptionseffizienz im wesentlichen von allen DNA-Polymerasen mit dem konservierten entscheidenden Motiv ändern.
Die strukturelle Verwandtheit der DNA-Polymerasen und die Anwesenheit der konservierten funktionellen Domänen ist gut bekannt (siehe beispielsweise Ito und Braithwaite, 1991, Nucl Acids Res. 19(15): 4045–4-47; Blanco et al. 1991, Gene 100: 27–38; Gutman und Minton, 1993, Nucl. Acids Res. 21 (18): 4406–4407; und Delarue et al., 1990, Protein Engineering 3(6): 461–467).
Mutationen einer entscheidenden Aminosäure innerhalb einer konservierten funktionellen Domäne im allgemeinen haben erwartungsgemäß analoge Wirkungen beim Einbau in andere DNA-Polymerasen (siehe beispielsweise Xu et al., 1997, J. Mol. Biol. 268: 284–302; US-Patent Nr. 5,466,591; 5,795,762; 5,939,292 und 5,614,365).
Zusätzliche thermoaktive oder thermostabile DNA-Polymerasen, die das entscheidende Motiv enthalten, und die Position der entscheidenden Aminosäure darin, kann routinemäßig durch direkte Untersuchung der Aminosäuresequenz identifiziert werden. Zudem können das entscheidende Motiv und die Aminosäure identifiziert werden durch Sequenzhomologie mit einer anderen DNA-Polymerase, von der bekannt ist, daß sie das entscheidende Motiv enthält, wie die DNA-Polymerasen von der in der Tabelle I aufgeführten Thermus-Art. Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz-Alignment-Programme sind leicht verfügbar. Weithin verwendete Sequenzalignment-Programme, einschließlich "GAP", "BESTFIT" und "PILEUP" sind erhältlich von der Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin). Im allgemeinen erleichtert die Durchführung eines Sequenzalignments mit den Default-Parametern die Identifikation der entscheidenden Aminosäure in einer DNA-Polymerasesequenz, die homolog zu der entscheidenden Aminosäure in einer der in Tabelle 1 aufgeführten DNA-Polymerasen ist.
Da neue DNA-Polymerase-Sequenzen erhalten werden, können Sequenzen entdeckt werden, die eine Variante des entscheidenden Motivs enthalten, das nicht genau durch SEQ ID NO: 1 beschrieben wird, aber durch Sequenzhomologie mit den bekannten Enzymen identifizierbar ist. Als hypothetisches Beispiel wird ein Enzym mit einem Motiv in der DNA-Polymerase-Domäne, die eine Variante von SEQ ID NO: 3 ist, die sich nur dahingehend unterscheidet, daß die Aminosäure an der Position 5 nicht L oder I ist, anhand der hohen Homologie (10 von 11 Aminosäuren in diesem Beispiel) zum entscheidenden Motiv der Enzyme verschiedener Thermus-Arten erkannt, daß es das entscheidende Motiv hat. Ein solches Enzym wird für erfindungsgemäße Zwecke als äquivalent angesehen.
Die entscheidende Aminosäure wird anhand des nativen Enzyms identifiziert. Dies soll jedoch nicht die Aminosäuresequenz des mutierten Enzyms an irgend einer anderen Stelle auf die des nativen Enzyms einschränken. Mutierte DNA-Polymerasen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können zusätzliche Mutationen enthalten, deren Anwesenheit für bestimmte Anwendungen vorteilhaft ist. Mutationen, die die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität oder 3'→5'-Exonuklease-Aktivität und ihre Anwendungen eliminieren, sind bekannt. Eine zusätzliche Substitutionsmutation in der Position 3 der entscheidenden Motive, die als SEQ ID NO: 1 bis 7 identifiziert sind (beispielsweise eine Q682K, E683K-Mutante der Tth-DNA-Polymerase) kann zusätzliche Vorteile verleihen, insbesondere in Mn²⁺-aktivierten Reaktionen, wie das Ermöglichen einer weiteren Reduktion der Mn²⁺-Konzentration oder eine weitere Verbreiterung des Bereichs der üblichen Salzkonzentrationen.
DNA-Polymerase-Mutanten zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise aus rekombinanten Expressionsvektoren exprimiert, in denen die codierende Sequenz derart modifiziert wurde, daß die bestimmte Proteinsequenzmutante von Interesse exprimiert wird. Verfahren zum Einbringen von Punktmutationen in eine codierende Sequenz in einem Expressionsplasmid sind im Fachgebiet bekannt und in dem Patent und in der Wissenschaftsliteratur beschrieben. Genaue Protokolle sind beispielsweise bereitgestellt in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, 2. Auflage, Kapitel 15.51, "Oligucleotide-mediated mutagenesis" und Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (laufende Ausgabe). Die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0,902,035, die US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631, und die internationale PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 98/40496 lehrt die Konstruktion geeigneter Expressionsvektoren und die Expression und die Reinigung der resultierenden DNA-Polymerase-Mutante. Nach den Richtlinien, die in den zitierten Literaturstellen bereitgestellt werden, und nur mit Hilfe bekannter Techniken, kann der Fachmann eine beliebige Zahl von Expressionsvektoren herstellen, die eine Genmutante enthalten, die sich zur Expression von DNA-Polymerase-Mutanten in einer Vielzahl von Wirtssystemen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Hochtemperatur-Verfahren zur reversen Transkription ist es nur wesentlich, daß die DNA-Polymerase thermoaktiv ist. Weil die Herstellung der cDNA aus einer RNA-Matrize keine wiederholten Denaturierungszyklen bei erhöhten Temperaturen beinhaltet, ist es nicht essentiell, daß die Enzyme, die sich in dem Verfahren eignen, thermostabil und thermoaktiv sind. Bei den Verfahren mit einzelnem Enzym aus kombinierter reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation (RT/PCR), die in den Beispielen beschrieben sind, ist die Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase bevorzugt, weil die DNA-Polymerase RT-Bedingungen und PCR-Bedingungen unterliegt, die mehrere Denaturierungszyklen umfassen.
Für die reverse Transkription erfolgt die Reaktion in einem Gemisch, das die RNA-Matrize, einen Primer, und eine thermoaktive oder thermostabile DNA-Polymerase-Mutante enthält. Der Reaktionsansatz enthält gewöhnlich alle vier Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) und einen Puffer, der ein zweiwertiges Kation und ein einwertiges Kation enthält. DNA-Polymerasen benötigen ein zweiwertiges Kation für die katalytische Aktivität. Für Extensionsreaktionen mit einer DNA-Matrize, ist das bevorzugte zweiwertige Kation Mg²⁺, obgleich andere Kationen, wie Mn²⁺ oder Co²⁺ DNA-Polymerasen aktivieren können.
Im Gegensatz zu Verlängerungsreaktionen, die eine thermoaktive oder thermostabile DNA-Polymerase und eine DNA-Matrize verwenden, erfordern Verlängerungsreaktionen, die eine RNA-Matrize verwenden, d.h. reverse Transkription, im wesentlichen die Verwendung von Mn²⁺, damit eine geeignete Effizienz erzielt wird. Die Verwendung von MnCl₂ oder Mn(OAc)₂ zur RNA-Amplifikation mit der Tth-DNA-Polymerase liefert einen Anstieg der Empfindlichkeit von mindestens 10⁶-fach verglichen mit der Verwendung von MgCl₂ und Standard-PCR-Bedingungen.
Die Verwendung von Mn²⁺ steigert die Effizienz der reversen Transkription, senkt aber auch die Genauigkeit, was zu einer erhöhten Anzahl falsch eingebauter Nukleotide führt. Die Verwendung von Mn²⁺ senkt auch die Genauigkeit der DNA-Amplifikationen. Somit leiden in einem Röhrchen durchgeführte RNA-Amplifikationsreaktionen mit einem einzelnen Enzym, unter Verwendung von Mn²⁺ an der verringerten Genauigkeit von RNA- und DNA-Phasen der Reaktion. Somit wird die Reaktion in zwei Stufen durchgeführt, wenn genauere RNA-Amplifikationen gewünscht sind. Dies wird erzielt durch effizientes Entfernen der Mn²⁺-Ionen aus dem reversen Transkriptionsansatz mit einem Chelatbildner, wie EDTA oder vorzugsweise EGTA, und dann Zugabe des geeigneten Mg²⁺-haltigen DNA-Amplifikationsansatzes zur Beendigung der Reaktion.
Die Verwendung der DNA-Polymerase-Mutanten in den hier offenbarten Verfahren stellt Vorteile für die reversen Transkriptionsreaktionen bereit, unabhängig vom verwendeten zweiwertigen Kation. Bei Mn²⁺-Reaktionen stellt die Verwendung der DNA-Polymerase-Mutante eine reverse Transkription bei hoher Temperatur und Amplifikation von RNA mit höherer Effizienz bereit, als mit dem nativen Enzym erzielt wird. Zudem ermöglicht die Verwendung der DNA-Polymerase-Mutante die Durchführung der Reaktion bei einer niedrigeren Mn²⁺-Reaktion, wodurch die schädliche Wirkung der Mn²⁺-Konzentration auf die Genauigkeit minimiert wird.
Besonders überraschend ist, daß die DNA-Polymerase-Mutanten die Durchführung der reversen Transkription mit Mg²⁺ mit erheblich erhöhter Effizienz ermöglichen. Die Verwendung von Mg²⁺, dem bevorzugten zweiwertigen Kation des Enzyms, stellt eine signifikant höhere Genauigkeit bereit. Somit stellt bei Mg²⁺-Reaktionen die Verwendung der DNA-Polymerase-Mutante eine hochgenaue reverse Transkription und Amplifikation von RNA mit verwendbarer Effizienz bereit.
Das zweiwertige Kation wird in der Form eines Salzes, wie MgCl₂, Mg(OAc)₂, MgSO₄, MnCl₂, Mn(OAc)₂ oder MnSO₄ bereitgestellt. Für Reaktionen, die Mn²⁺ verwenden, sind geeignete Kationenbereiche in einem Tris-HCl-Puffer in einem Bereich von 0,5 bis 7 mM MnCl₂, vorzugsweise zwischen 0,5 und 2 mM und in einem Bicin/KOAc-Puffer oder Tricin/KOAc-Puffer im Bereich von 0,5 bis 20 mM Mn(OAc)₂, vorzugsweise zwischen 0,5 und 5 mM. Im allgemeinen für Reaktionen, die Mg²⁺ verwenden, sind geeignete zweiwertige Kationenkonzentrationen in einem Tris-HCl-Puffer in einem Bereich von 0,5 bis 10 mM MgCl₂ und in einem Bicin/KOAc oder Tricin/KOAc-Puffer in einem Bereich von 0,5 bis 20 mM für Mg(OAc)₂, vorzugsweise zwischen 0,5 und 5 mM. Diese Konzentrationen stellen geeignete Ausgangsbedingungen zur Durchführung der Routine-Reaktionsoptimierung bereit. Die optimale zweiwertige Ionenkonzentration in einer bestimmten Reaktion hängt nicht nur vom jeweiligen verwendeten Enzym ab, sondern auch von anderen Reaktionskomponenten, wie beispielsweise dNTP-Konzentration und Primer-Sequenz und -Konzentration. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Reaktionsbedingungen im allgemeinen und die Konzentration an zweiwertigem Kation im besonderen für eine bestimmte Reaktion mittels routinemäßiger Experimentalverfahren empirisch optimiert werden können.
Man konnte zwar vorher die RNA-Matrizen-gerichtete DNA-Synthese aktivieren, jedoch wurden gemischte zweiwertige Kationenpuffer (beispielsweise Mn²⁺ und Mg²⁺) aufgrund einer reduzierten Empfindlichkeit und Effizienz nicht bevorzugt. Es wird erwartet, daß sich gemischte zweiwertige Kationenpuffer in den hier offenbarten Verfahren eignen, und bei einigen Anwendungen bevorzugt sein können. Die Verwendung gemischter Kationen kann beispielsweise einen Ausgleich zwischen einer effizienteren, aber weniger genauen Mn²⁺-aktivierten Reaktion und einer genaueren Mg²⁺-aktivierten Reaktion ermöglichen.
Reverse Transkriptionsverfahren bei hoher Temperatur und kombinierte reverse Transkriptions- bzw. Amplifikationsverfahren, die eine thermostabile DNA-Polymerase in einem Mn²⁺-Puffer nutzen, sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 5,310,652; 5,322,770; 5,407,800; 5,561,058; und 5,693,517. Die erfindungsgemäßen Verfahren veranschaulichen eine Modifikation der vorher beschriebenen Verfahren, wobei die Modifikation die Verwendung von DNA-Polymerase-Mutanten wie vorstehend beschrieben beinhaltet, und die Reaktion in einem Puffer erfolgt, der Mg²⁺ als zweiwertiges Kation verwendet, um die DNA-Polymerase zu aktivieren.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß die Verwendung der DNA-Polymerase-Mutanten schnellere RT-Extensionsraten liefert, und folglich wird weniger Zeit für die RT-Reaktion benötigt. Zur Maximierung der Menge an cDNA, die in einer reversen Transkriptionsreaktion erzeugt wird, erfolgt die Reaktion vorzugsweise für etwa 30 min. Je nach der Anwendung, insbesondere in Mangan-Reaktionen, können RT-Zeiten von nur 1 min oder weniger annehmbare Ergebnisse hervorbringen.
Andere Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren sind, daß die Verwendung der DNA-Polymerase-Mutante eine verbesserte RT-Effizienz bei niedrigeren Enzym-Konzentrationen bereitstellen kann, und darüber hinaus einen breiteren Bereich an geeigneten Salzkonzentrationen bereitstellen. Man erwartet, daß die optimalen Reaktionsbedingungen beispielsweise von dem jeweils verwendeten Enzym abhängen und empirisch auf routinemäßige Weise bestimmt werden können.
Andere Aspekte, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich sind, wie die Auswahl einer Ziel-RNA, Proben-Präparation, Primer-Design und Auswahl andere Reagentien und Reaktionsbedingungen als DNA-Polymerase und zweiwertigem Kation, das zur Aktivierung der DNA-Polymerase verwendet wird, sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben in den vorstehend genannten Patenten. Wird entsprechend die reverse Transkription mit einer Amplifikationsreaktion gekoppelt, sind sämtliche Aspekte der Amplifikation, die nicht die DNA-Polymerase und das zweiwertige Kation betreffen, die zur Aktivierung der DNA-Polymerase verwendet werden, im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in den vorstehend genannten Patenten beschrieben. Schließlich sind die Anwendungen der reversen Transkription und Amplifikation von RNA im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in den vorstehend genannten Patenten beschrieben. Der Fachmann kann die erfindungsgemäßen Verfahren bei jeder Anwendung anwenden, bei der die reverse Transkription und gegebenenfalls die Amplifikation von RNA gewünscht ist.
Die folgenden Beispiele werden lediglich veranschaulichend gegeben und sollen die Erfindung keinesfalls einschränken.
BEISPIEL 1
BEISPIELE FÜR DNA-POLYMERASE-MUTANTEN
Eine Reihe von 19 DNA-Polymerase-Mutanten wurde hier aus "nativer" Thermus thermophilus (Tth)-DNA-Polymerase konstruiert, die sämtliche möglichen Mutationen in der entscheidenden Aminosäure veranschaulicht. Wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0,902,035 und der US-Parallelanmeldung Nr. 09/146,631 beschrieben, enthält die Tth-DNA-Polymerase-Aminosäuresequenz das entscheidende Sequenzmotiv, das unter SEQ ID NO: 3 (die eine besondere Ausführungsform von SEQ ID NO: 2 ist, die eine schmalere Ausführungsform des allgemeinen Motivs von SEQ ID NO: 1 ist) veranschaulicht ist. Die entscheidende Aminosäure befindet sich an der Position 683 (E683).
Die Sequenz der Tth-DNA-Polymerase und der Plasmide, die das Gen für die Tth-DNA-Polymerase enthalten, sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise US-Patente Nr. 5,618,711 und 5,789,224). Das in dem vorliegenden Beispiel jeweils verwendete Plasmid codiert eine Tth-DNA-Polymerase, die auch eine G46E-Punkt-Mutation enthält, die die 5'→3'-Exonukleaseaktivität des Enzyms eliminiert, wie in US-Patent Nr. 5,466,591 beschrieben. Zudem enthält das Plasmid stille Nukleotid-Substitutionen, die eine ClaI-Erkennungs- und Spaltstelle einbringen, welche die Codons 678, 679 und das erste Nukleotid von 680 umfassen, ohne daß die codierte Aminosäuresequenz verändert wird. Die Anwesenheit der zusätzlichen Mutation in der 5'→3'-Exonuklease-Domäne hat wahrscheinlich keinen nennenswerten Effekt auf die Fähigkeit der DNA-Polymerase zur reversen Transkription von RNA in einem Mg²⁺-Puffer; Tth-DNA-Polymerase mit der G46E-Mutation wird hier als die native DNA-Polymerase angesehen.
Punktmutationen in den exprimierten Proteinen wurden eingebracht durch Mutieren der codierenden DNA-Sequenz mittels Standard-Techniken. Im wesentlichen wurde ein kurzes Fragment der codierenden Sequenz, die das Codon 683 umfaßt, durch ein synthetisches Fragment ersetzt, das die gewünschte Sequenz enthält. Das kurze Fragment mit ~65 Nukleotiden Länge wurde durch Spalten des Plasmids mit den Restriktionsenzymen ClaI und HindIII ausgeschnitten. Ein synthetisches doppelsträngiges DNA-Insert wurde synthetisiert, welches die gleiche Aminosäuresequenz codiert, wie das ausgeschnittene Fragment, aber die gewünschte Mutation in Codon 683 enthält. Das synthetische Fragment wurde dann in das gespaltene Plasmid ligiert, so daß ein Plasmid erhalten wurde, das ein mutiertes Codon enthält, welches eine Vollängen-Tth-DNA-Polymerase mit der gewünschten Punktmutation codiert.
BEISPIEL 2
EFFIZIENZ VON REVERSER TRANSKRIPTION BZW. AMPLIFIKATION
Die 20 DNA-Polymerasen, die in Beispiel 1 beschrieben sind (1 native und 19 Mutanten) wurden auf ihre Fähigkeit zur Katalyse von reversen Transkriptions- bzw. Amplifikationereaktionen verglichen. Im Überblick wurden gekoppelte reverse Transkriptionsreaktionen mit einem einzelnen Enzym mit jeder der DNA-Polymerasen durchgeführt. Die gleiche anfängliche Ziel-Kopienzahl wurde für jede Reaktion verwendet, und die Synthese des Amplifikationsproduktes wurde während der Reaktion überwacht. Die Anzahl an Zyklen, die zur Erzeugung einer willkürlichen aber festen Menge an amplifiziertem Produkt erforderlich war, welches ein Maß für die Reaktionseffizienz bietet, wurde für jede DNA-Polymerase bestimmt. Weil der anfängliche reverse Transkriptionsschritt gewöhnlich der entscheidende einschränkende Schritt bei einer reversen Transkriptions- bzw. Amplifikationsreaktion ist, legt eine Verbesserung der Gesamt-Reaktionseffizienz auch eine Verbesserung des anfänglichen reversen Transkriptionsschritt nahe.
Der Anstieg der amplifizierten Nukleinsäure während der Reaktion wurde mit den Verfahren überwacht, die beschrieben sind in Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10: 413–417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026–1030; Higuchi und Watson, in PCR Applications, siehe oben, Kapitel 16; US-Patent Nr. 5,994,056; und europäische Patentveröffentlichungen Nr. 487,218 und 512,334. Diese Verfahren, die hier als kinetische PCR bezeichnet werden, beruhen auf der gesteigerten Fluoreszenz, die Ethidiumbromid (EtBr) und andere DNA-bindende Farbstoffe aufweisen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind, damit man die Änderung der Menge an doppelsträngiger DNA in einer Reaktion erfaßt. Der Anstieg der doppelsträngigen DNA, die von der Synthese der Zielsequenzen herrührt, führt zu einem Anstieg der Menge an Farbstoff, die an doppelsträngiger DNA gebunden ist, und einem gleichzeitigen nachweisbaren Anstieg der Fluoreszenz.
Die Amplifikationen erfolgten mit Ethidiumbromid in der Reaktion. Alternativ können die Amplifikationen mit dem SYBR^® Green I (Molecular Probes, Eugene, OR) in der Reaktion durchgeführt werden. Beide Farbstoffe steigern ihre Fluoreszenz bei Interkalation in oder Bindung an die doppelsträngige DNA. Die Reaktionen werden in einem kombinierten Thermocycler- und Fluoreszenz-Nachweissystem durchgeführt, das die Überwachung der Fluoreszenz des Reaktionsansatzes während der Amplifikation ermöglicht. Es ist klar, daß neben den nachstehend beschriebenen Geräten jedes geeignete Gerät verwendet werden kann.
RNA-ZIEL UND AMPLIFIKATIONSPRIMER
Eine Ziel-RNA wurde mit einem Expressionsplasmid synthetisiert, das das menschliche Gen für Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) codiert. Ein Bereich der GAPDH-RNA wurde mit den folgenden Primern amplifiziert, die in der 5'-3'-Orientierung gezeigt sind:

P1 (SEQ ID NO: 20) 5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA
P2 (SEQ ID NO: 21) 5'-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA

Die anfängliche Zielkonzentration wurde durch Standard-Maßnahmen gemessen. Für die hier beschriebenen Vergleichsreaktionen ist die absolute Kopienzahl weniger wichtig als die relative Kopienzahl. Zur Gewährleistung der gleichen anfänglichen Kopienzahl in jeder Reaktion wurden Aliquots von Verdünnungen des gleichen anfänglichen RNA-Ausgangsmaterials verwendet.
Der Fachmann erkennt, daß die Selektion des Ziels eine Frage der Zweckmäßigkeit ist. Andere RNA-Ziele und entsprechende Amplifikationsprimer können im wesentlichen in dem gleichen Protokoll verwendet werden. Die Routine-Optimierung der Reaktionsbedingungen wird erwartet.
AMPLIFIKATION
Jede RT-PCR-Amplifikation wurde in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Die Gesamtreagenskonzentrationen waren wie folgt:
10 Einheiten DNA-Polymerase
10⁶ Kopien GAPDH-RNA
50 mM Tricin, pH-Wert 8,15
50 mM KOAc
2 mM Mg(OAc)₂
200 μM dATP, dGTP, dCTP
400 μM dUTP
200 nM jedes Primers
8% Glycerin
1% DMSO
1 μg/ml Ethidiumbromid
2 Einheiten UNG
Alternativ kann SYBR^® Green I anstelle von Ethidiumbromid verwendet werden, damit die Erfassung des amplifizierten Produkts möglich wird. Amplifikationen mittels SYBR^® Green I werden mit 0,2 × SYBR^® Green I (verkauft als 10000 X), verdünnt in DMSO, durchgeführt.
Reaktionen mittels Ethidiumbromid werden vorzugsweise mittels ABI PRISM^® 7700 Sequenznachweissystem (Applied Biosystem, Foster City, CA) durchgeführt, das die Auswahl geeigneter Detektionswellenlängen ermöglicht. Die Reaktionen mittels SYBR^® Green I werden vorzugsweise mit einem GeneAmp^® 5700 Sequenznachweissystem (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter den gleichen Thermozyklusbedingungen durchgeführt. Das GeneAmp^® 5700 Sequenznachweissystem ist ausgelegt zur Verwendung mit SYBR^® Green I, und die Anregungs- und Nachweiswellenlängen werden für diesen Farbstoff voreingestellt.
Die nachstehend beschriebenen Tests erfolgten mit einem kundenspezifischen Gerät, im wesentlichen bestehend aus einem GeneAMP^® PCR-System 9600 Thermocycler (PE Biosystems, Foster City, CA), modifiziert durch die Zugabe von einem Fluoreszenznachweissystem, das demjenigen ähnelt, das in dem GeneAmp^® 5700 Sequenznachweissystem verwendet wird, aber zur Verwendung mit Ethidiumbromid ausgelegt ist. Die mit dem kundenspezifischen Gerät erhaltenen Ergebnisse sind erwartungsgemäß vergleichbar mit den Ergebnissen, die mit einem der bevorzugten Geräte erhalten werden.
Die Amplifikationsreaktionen erfolgten mit dem nachstehend gezeigten spezifischen Temperatur-Zyklusprofil.
THERMOZYKLUS-ZEITEN UND TEMPERATUREN
NACHWEIS
Die Anreicherung von amplifiziertem Produkt wurde bei jedem Zyklus während der Reaktion durch Messen des Anstiegs der Reaktionsfluoreszenz gemessen, Während jedes Amplifikationszyklus wurde jede Reaktion mit Licht bei einer Wellenlänge nahe dem Anregungsmaximum des Farbstoffs angeregt, und die Emission des Farbstoffs wurde nahe seines Emissionsmaximums gemessen.
Die Fluoreszenzmessungen wurden durch Teilen durch eine anfängliche Fluoreszenzmessung normalisiert, die erhalten wurde während eines frühen Zyklus in der Reaktion, während die Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen relativ konstant zu sein scheinen. Die Zykluszahl, die für die anfängliche Fluoreszenzmessung gewählt wurde, war die gleiche wie für alle verglichenen Reaktionen, so daß sämtliche Messungen Anstiege in Bezug auf den gleichen Reaktionszyklus veranschaulichen.
Die Anzahl der Amplifikationszyklen, die durchgeführt wurden, bis die Fluoreszenz einen willkürlichen Fluoreszenzwert (AFL) überstieg, wurde aus den beobachteten Fluoreszenzwerten berechnet. Der AFL wurde nahe des Grundlinien-Fluoreszenzwertes gewählt, aber oberhalb des Bereichs statistischer Schwankungen der gemessenen Fluoreszenz, so daß die Reaktionskinetiken während der frühen Phase der Amplifikation gemessen wurden, wenn die Menge des Produkts geometrisch ansteigt. Während dieser geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation hängt die Anzahl der Zyklen zum Erreichen eines bestimmten Schwellenwerts allein von der Anfangskopienzahl und der Reaktionseffizienz ab. Da jede Reaktion mit der gleichen anfänglichen Kopienzahl durchgeführt wird, liefert die Anzahl der Zyklen zum Erreichen der Schwelle ein Maß für die Reaktionseffizienz. In späteren Zyklen führt die Anreicherung des amplifizierten Produkts und das Aufbrauchen der Reagentien schließlich zu einem Reaktionsplateau.
Für alle Reaktionen wurde ein AFL von 1,12 gewählt. Da die PCR-Amplifikation aus bestimmten Zyklen besteht und die Fluoreszenzmessungen einmal pro Zyklus durchgeführt werden, steigt die gemessene Fluoreszenz in einem einzigen Zyklus gewöhnlich von unter AFL bis über AFL. Zur Verbesserung der Genauigkeit der Messungen wurde eine "exakte" Zahl von Zyklen zum Erreichen der AFL-Schwelle, die hier als C_T-Wert bezeichnet wird, durch Interpolation der Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen berechnet.
ERGEBNISSE
Die C_T-Werte, die mit der nativen Tth-DNA-Polymerase (E683) und jeder der DNA-Polymerase-Mutanten erhalten wurden (und die durch die Aminosäure an der Position 683 identifiziert sind), sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Jeder C_T-Wert veranschaulicht den aus zwei Reaktionen erhaltenen Mittelwert. Zur Erleichterung des Vergleichs wird auch die Differenz der CT-Werte (C_T nativ) – (C_T Mutante) bereitgestellt. Ein Anstieg der Effizienz mit der DNA-Polymerase-Mutante führt zum Erreichen des Schwellenwerts in wenigeren Zyklen, d.h. zu einem niedrigeren C_T-Wert. Somit spiegelt eine positive Differenz der C_T-Werte einen Anstieg der Effizienz wider.
REAKTIONSEFFIZIENZEN
Die Ergebnisse zeigen, daß die Mutationen der Aminosäure an der Position 683 bei jeder Aminosäure, außer Ala, Gly oder Pro zu einer DNA-Polymerase mit gesteigerter Effizienz führten. Von denen ergaben alle außer den Asp- und Gln-Mutanten mindestens eine Vier-Zyklen-Verbesserung des C_T-Wertes.
BEISPIEL 3
EFFIZIENZ DER REVERSEN TRANSKRIPTION
Ausgewählte DNA-Polymerasen, beschrieben in Beispiel 1, wurden auf ihre Fähigkeit zur Katalyse der reversen Transkriptionseffizienz verglichen. Die reversen Transkriptionsreaktionen erfolgten mit jeder der DNA-Polymerasen entweder mit Mg²⁺ oder Mn²⁺. Die resultierende cDNA aus jeder der Reaktionen wurde dann unter identischen Bedingungen mit dem nativen Enzym und Mg²⁺ amplifiziert. Dieses Protokoll ermöglicht die Messung der Wirkung des Enzyms speziell im Anteil der reversen Transkription einer Reaktion aus reverser Transkription und Amplifikation.
Neben dem nativen Enzym wurden die Reaktionen mit DNA-Polymerasen mit Mutationen zu F, K, L, R und Y an der Aminosäureposition 683 durchgeführt. Jede dieser Mutationen stellte Beispiel 2 zufolge signifikante Anstiege in der Effizient in einer kombinierten Reaktion aus reverser Transkription und Amplifikation bereit.
REVERSE TRANSKRIPTION
Jede reverse Transkription erfolgte in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 100 μl. Die Endreagenskonzentrationen waren wie folgt:
5 Einheiten DNA-Polymerase
10⁶ Kopien GAPDH-RNA
50 mM Tricin, pH-Wert 8,15
50 mM KOAC
2 mM Mg(OAc)₂ oder Mn(OAc)₂
200 μM dATP, dGTP, dCTP, dUTP
200 nM jedes Primers
8% Glycerin
1% DMSO
0,2 × SYBR^® Green I
1 Einheit UNG
Die reversen Transkriptionsreaktionen wurden mit dem nachstehend gezeigten spezifischen Temperaturzyklusprofil durchgeführt. ZEITEN UND TEMPERATUREN DER REVERSEN TRANSKRIPTION

Vorreaktionsinkubation: 50°C für 2 min

Reverse Transkription 60°C für 30 min

Halten: 4°C
AMPLIFIKATION
Nach der reversen Transkription wurden 10 μl Reaktionsprodukte in 10 μl 2 mM EGTA zum Chelatisieren des Metallkations gegeben, wodurch es effizient aus der folgenden Amplifikationsreaktion entfernt wurde. Das Gemisch wurde zu einem PCR-Amplifikationsansatz gegeben, der das native Enzym und Mg²⁺ enthielt. Somit wurde die restliche DNA-Polymerase-Mutante derart verdünnt, daß jegliche Effekte erwartungsgemäß vernachlässigbar waren. Die PCR-Amplifikationen erfolgten in 100 μl Reaktionen mit den folgenden Endreagenskonzentrationen:

5 Einheiten native DNA-Polymerase
50 mM Tricin, pH-Wert 8,15
50 mM KOAc
2 mM Mg(OAc)₂
200 μM dATP, dGTP, dCTP, dUTP
200 nM jedes Primers
8% Glycerin
1% DMSO
0,2 × SYBR^® Green I

Die Amplifiaktionsreaktionen erfolgten mit dem nachstehend gezeigten spezifischen Temperaturzyklusprofil.
ZEITEN UND TEMPERATUREN DER AMPLIFIKATIONS-THERMOZYKLEN
ERGEBNISSE
Die für die reverse Transkription mit der nativen Tth-DNA-Polymerase (E683) und jeder der DNA-Polymerase-Mutanten (identifiziert durch die Aminosäure an der Position 683), und der nativen Tth-DNA-Polymerase für alle Amplifikationen erhaltenen C_T-Werte sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Jeder C_T-Wert veranschaulicht den Mittelwert, der aus zwei Reaktionen erhalten wurde. Zur Erleichterung des Vergleichs wird auch die Differenz der C_T-Werte, (C_T nativ) – (C_T Mutante) bereitgestellt. Ein Anstieg der Effizienz mit der DNA-Polymerase-Mutante führt zu einem Erreichen des Schwellenwerts in weniger Zyklen, d.h. einem niedrigeren C_T-Wert. Somit spiegelt eine positive Differenz der C_T-Werte einen Anstieg der Effizienz wider.
REAKTIONSEFFIZIENZEN MG²⁺-AKTIVIERTE RT
REAKTIONSEFFIZIENZEN MN²⁺-AKTIVIERTE RT
Jede dieser DNA-Polymerase-Mutanten stellte eine signifikant erhöhte Effizienz bei reversen Transkriptions-/Amplifikationsreaktionen bereit. Da der DNA-Amplifikationsanteil jeder Reaktion identisch mit dem nativen Enzym erfolgte, zeigen diese Ergebnisse, daß jede dieser DNA-Polymerase-Mutanten eine gesteigerte Effizienz des reverse-Transkription-Anteils der Reaktionen bereitstellt. Die DNA-Polymerase-Mutante lieferte signifikant verbesserte Effizienz mit jedem Kation.
Die Verbesserung war besonders betont mittels Mg²⁺ und zeigte, daß die Verwendung der DNA-Polymerase- Mutante Mg²⁺-aktiverte Reaktionen praktisch macht. Übereinstimmend mit vorherigen Berichten erfordert die RNA-Amplifikation mit dem nativen Enzym im wesentlichen die Verwendung von Mn²⁺ zur Erzielung einer verwendbaren Reaktionseffizienz, wie es durch eine Verzögerung von fast 10 Zyklen in dem C_T mittels Mg²⁺ beobachtet wurde (33,8–24,6). Mit der E683Y-Mutante war die Effizienz der Mg²⁺-aktivierten Reaktion beispielsweise gleich derjenigen, die mit dem nativen Enzym und Mn²⁺ erzielt wurde.
BEISPIEL 4
GENAUIGKEIT
Die Genauigkeiten ausgewählter DNA-Polymerase-Mutanten und des nativen Enzyms wurden auf verschiedene Weise verglichen. Die Genauigkeiten in gekoppelten Reaktionen aus reverser Transkription und Amplifikation, die in einem Mg²⁺-Puffer durchgeführt wurden, wurden mit Genauigkeiten verglichen, die in einem Mn²⁺-Puffer durchgeführt wurden. Zudem wurden die Genauigkeiten von Enzymen bei Verwendung in DNA-Amplifikationen verglichen.
Die Genauigkeiten der DNA-Polymerasen können durch Messen des Schmelztemperatur (Tm)-Profils der amplifizierten Produkte, die mit den Enzymen erzeugt wurden, verglichen werden. Die Genauigkeit einer DNA-Polymerase wird in der Anzahl der Fehleinbauten widergespiegelt, die während der Strangsynthese vorkommen. Eine Amplifikation mit einem weniger genauen Enzym führt zu einer größeren Heterogenität in der resultierenden Population der amplifizierten Sequenzen. Zur Messung der Heterogenität werden die amplifizierten Produkte denaturiert, erneut hybridisiert, und der Tm der resultierenden Doppelstränge wird gemessen. Da die Stränge in den Doppelsträngen aus einer heterogenen Population von Sequenzen statistisch kombiniert werden, enthalten die Doppelstränge gewöhnlich eine Anzahl von Fehlpaarungen. Je größer die Sequenzheterogenität in der Population der amplifizierten Produkte ist, desto größer ist die mittlere Zahl der Fehlpaarungen in den Doppelsträngen. Diese Fehlpaarungen destabilisieren die Doppelstränge und führen zu einem niedrigeren gemessenen Tm.
Eine Schmelzkurve für die amplifizierten Produkte einer Kinetik-PCR-Reaktion erfolgt herkömmlicherweise mit dem Cycler/Fluoreszenz-Nachweisgerät, das bei der Amplifikation verwendet wird. Nach der Amplifikation wird das Verhältnis zwischen Fluoreszenz und Temperatur über einen Temperaturenbereich gemessen, der die Denaturierungstemperatur des Produktes umfaßt. Der Übergang zwischen doppelsträngigen und einzelsträngigen Molekülen spiegelt sich in einem Wechsel der Farbstoff-Fluoreszenz wider. Somit kann eine Schmelzkurve geeignet bestimmt werden. Alternativ können Messungen mit den Standard-Verfahren durchgeführt werden, die gewöhnlich die Überwachung der Änderung der optischen Dichte beinhalten, ein Maß der Menge an doppelsträngiger DNA in der Reaktion mit einer Temperaturänderung.
Die Genauigkeit der nativen DNA-Polymerase wurde mit den Genauigkeiten von zwei der DNA-Polymerase-Mutanten, die die E683K bzw. E683N-Mutationen enthalten, verglichen. Gekoppelte Reaktionen aus reverser Transkription und Amplifikation wurden doppelt in Mn²⁺- und Mg²⁺-Puffern durchgeführt, die im wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben sind, jedoch mit den folgenden Änderungen. Für die Mn²⁺-Reaktionen wurde 2 mM Mn(OAc)₂ in der Reaktion verwendet. Sämtliche Reaktionen erfolgten mit 25 U DNA-Polymerase.
Zur Messung des Hybridisierungsstabilitätsprofils (Schmelzkurve) der amplifizierten doppelsträngigen Zielsequenzen wurde die Fluoreszenz des Nach-Amplifikations-Reaktionsansatzes über einen Temperaturenbereich überwacht, der mindestens 60 bis 80°C überdeckte. Die Fluoreszenzmessungen ergaben erwartungsgemäß eine sigmoidale Schmelzkurve. Ein Tm wurde definiert als Temperatur des Wendepunktes in der sigmoidalen Schmelzkurve, der der Temperatur entspricht, bei der die Hälfte des Ziels in der einzelsträngigen Form ist.
ERGEBNISSE
Die Tm-Werte, die für die Amplifikationsprodukte der Mg²⁺-aktivierten Reaktionen und der Mn²⁺-aktivierten Reaktionen gemessen wurden, sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Jede aufgeführte Messung ist der Mittelwert von wiederholten Reaktionen. Sämtliche Temperaturen sind in °C.
TM-WERTE DES AMPLIFIKATIONSPRODUKTES
Mit Hilfe eines Mg²⁺-Puffers wurde kein Unterschied in der Genauigkeit zwischen nativen und mutierten DNA-Polymerasen beobachtet. Ähnliche Reaktionen, die mit allen 20 DNA-Polymerasen (Daten nicht gezeigt) erfolgten, bestätigten, daß die Genauigkeit sämtlicher DNA-Polymerase-Mutationen identisch ist zur Genauigkeit der nativen DNA-Polymerase in Mg²⁺-aktivierten Reaktionen.
Ein Vergleich der Ergebnisse, die mit einem Mn²⁺-Puffer erhalten wurden, mit denen, die mit einem Mg²⁺-Puffer erhalten wurden, ergab, daß die Genauigkeit sämtlicher DNA-Polymerasen reduziert war, wie es sich aus den erhaltenen niedrigeren Tm-Werten ersehen läßt. Interessanterweise wiesen die beiden DNA-Polymerase-Mutanten zumindest unter diesen Reaktionsbedingungen bei der Verwendung eines Mn²⁺-Puffers sogar eine niedrigere Genauigkeit auf als das native Enzym.
Die Genauigkeit wird durch die Mn²⁺-Konzentration beeinflußt. Zum Vergleich der Wirkung der Mn²⁺-Konzentration auf die Genauigkeit der mutierten und nativen Enzyme, wurden zusätzliche Experimente mit Hilfe der E683K-Mutation mit einem Bereich von Mn²⁺-Konzentrationen von 0,5 bis 5 mM durchgeführt. Die Ergebnisse (Daten nicht gezeigt) zeigten, daß die niedrigste Mn²⁺-Konzentration erwartungsgemäß die genauesten Reaktionen mit allen Enzymen ergab. Die Genauigkeit der Enzymmutante war durch eine erhöhte Mn²⁺-Konzentration stärker beeinflußt als die Genauigkeit des nativen Enzyms. Überraschend waren bei diesen Experimenten die Enzymmutanten mit der niedrigsten Mn²⁺-Konzentration am effizientesten. Somit ermöglicht die Verwendung der Enzymmutante die Durchführung der Reaktion bei einer niedrigeren Mn²⁺-Konzentration, wodurch die schädliche Wirkung der Mn²⁺-Konzentration auf die Genauigkeit minimiert wird.
Sowohl Mn²⁺-aktivierte als auch Mg²⁺-aktivierte Reaktionen wurden im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch mit DNA-Matrizen, die die Beobachtung der Wirkung der Genauigkeit nur in dem DNA-Abschnitt der Reaktion erleichtern. In sämtlichen Fällen war der Tm-Wert des Produkts der DNA-Amplifikation nicht unterscheidbar von dem Tm-Wert des Produktes der RNA-Amplifikation.
Die Ergebnisse, zusammengenommen mit den Ergebnissen der vorherigen Beispiele, zeigen Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren. Die vorher beschriebenen reversen Transkriptionsverfahren bei hoher Temperatur und Amplifikationsverfahren wurden mittels Mn²⁺ durchgeführt, so daß eine angemessene Reaktionseffizienz erzielt wurde, litten aber an einer Reduktion der Genauigkeit. Die vorliegende Offenbarung stellt mehrere Möglichkeiten bereit. Mit Mn²⁺ bietet die Verwendung der Enzymmutante eine reverse Transkription bei hoher Temperatur und Amplifikation von RNA mit höherer Effizienz, als sich mit dem nativen Enzym erzielen läßt und ermöglicht die Durchführung der Reaktion bei einer niedrigeren Mn²⁺-Konzentration, wodurch die schädliche Wirkung der Mn²⁺-Konzentration auf die Genauigkeit minimiert wird. Mit Mg²⁺ liefert die Verwendung der Enzymmutante eine genaue reverse Transkription bei hoher Temperatur und Amplifikation von RNA mit einer geeigneten Effizienz.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur reversen Transkription und Amplifikation einer RNA in einer mit einem einzelnen Enzym in einem einzigen Röhrchen durchgeführten gekoppelten Reaktion aus reverser Transkription und Amplifikation, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen eines die RNA, einen Primer, Mg²⁺ und eine mutierte temperaturaktive DNA-Polymerase umfassenden Reaktionsansatzes zur reversen Transkription, wobei die mutierte DNA-Polymerase dadurch gekennzeichnet ist, daß i) die DNA-Polymerase in ihrer nativen Form innerhalb der DNA-Polymerasedomäne eine Aminosäuresequenz umfaßt, bei der es sich um SEQ ID NO: 1 handelt, ii) es sich bei der Aminosäure in Position 2 der Aminosäuresequenz um S oder A und bei der Aminosäure in Position 5 der Aminosäuresequenz um L oder I handelt und iii) die Aminosäure in Position 4 der Aminosäuresequenz gegenüber der nativen Sequenz zu einer von E, A, G oder P verschiedenen Aminosäure mutiert ist, und (b) Behandeln des Reaktionsansatzes bei einer Temperatur, die der mutierten DNA-Polymerase genügt, um die Synthese eines Verlängerungsprodukts des Primers zu starten, so daß ein zu der RNA komplementäres cDNA-Molekül bereitgestellt wird, wobei ein Primerpaar einen ersten Primer, der hinreichend komplementär zur RNA ist, um damit zu hybridisieren, und mit dem die Synthese eines zur RNA komplementären cDNA-Moleküls gestartet wird, sowie einen zweiten Primer, der hinreichend homolog zur RNA ist, um an die cDNA zu hybridisieren, und mit dem die Synthese eines Verlängerungsprodukts gestartet wird, umfaßt, und (c) Amplifizieren der cDNA.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase in ihrer nativen Form eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase in ihrer nativen Form eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die DNA-Polymerase in ihrer nativen Form eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mutierte DNA-Polymerase temperaturstabil ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 und 4, wobei es sich bei der DNA-Polymerase um eine mutierte Form einer DNA-Polymerase aus einer Thermus-Spezies handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei der DNA-Polymerase um eine mutierte Form der DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus oder der DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Temperatur des Reaktionsansatzes in Schritt (b) zwischen 40°C und 80°C liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Aminosäure in Position 4 der Aminosäuresequenz gegenüber der nativen Sequenz zu einer von E, A, G, P, Q oder D verschiedenen Aminosäure mutiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Reaktionsansatz zur reversen Transkription ferner einen Puffer aus einem Gemisch zweiwertiger Kationen, umfassend Mg²⁺ und Mn²⁺, umfaßt.