JP4468919B2 - 突然変異型dnaポリメラーゼを使用する高温逆転写 - Google Patents
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Description
LXXXXXXXXXE(配列番号1)
配列中、位置2のXはSまたはA、位置3、4、6、7、8、9および10のXは任意のアミノ酸、また位置5のXはLまたはIである。
LSXELXIPYEE(配列番号2)
配列中、位置3のXはQまたはG、位置6のXはSまたはAである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は好熱性細菌テルムス(Thermus)属に由来するDNAポリメラーゼである。
LSQELAIPYEE(配列番号3)
このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は、テルムス(Thermus)種アクアティクス(aquaticus)、テルモフィルス(thermophilus)、ZO5およびカルドフィルス(caldophilus)に由来するDANポリメラーゼである。
もう1つの好ましい態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む:
LSXELSIPYEE(配列番号4)
配列中、位置3のXはQまたはGである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はテルムス(Thermus)種フラブス(flavus)、sps17およびフィリホルミス(filiformis)に由来するDNAポリメラーゼである。
LSVRLGXPVKE(配列番号5)
配列中、位置7のXはVまたはIである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は超好熱性細菌テルモトガ(Thermotoga)種マリティマ(maritima)とネオポリタナ(neopolitana)に由来するDANポリメラーゼである。
LSKRIGLSVSE(配列番号6)
このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はテルモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)に由来するDNAポリメラーゼである。
LAQNLNIXRKE(配列番号7)
配列中、位置8のXはSまたはTである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はバシラス(Bacillus)種カルドテナクス(caldotenax)およびステアロテルモフィルス(stearothermophilus)に由来するDNAポリメラーゼである。
実施例で示すように、決定的アミノ酸の(実施例で使用した天然型DNAポリメラーゼ中に存在する)E、A、GまたはP以外の任意のアミノ酸への突然変異はRT効率を向上させた。そこで本発明の方法では、天然型DNAポリメラーゼが配列番号1〜7よりなる群から選択される配列モチーフを含み、同モチーフの位置4のアミノ酸がE、A、GまたはP以外の任意のアミノ酸へと突然変異していることを特徴とする突然変異型DNAポリメラーゼを使用する。好ましくは、決定的アミノ酸はE、A、G、PまたはQ以外の任意のアミノ酸へと、もっと好ましくはE、A、G、P、QまたはD以外の任意のアミノ酸へと突然変異させる。
(a) RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対して十分に相補的であるプライマーと本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼとを含む反応混合物を提供すること;および
(b) 前記反応混合物を適当な条件の下で処理して、1本鎖cDNAを提供すること。
本発明のもう1つの態様は、本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを使用して単一酵素による連結型逆転写/増幅反応を行わせるステップを含むRNAの増幅方法に関連する。好ましくは、これらの方法は次のステップを含む:
(a) RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対して十分に相補的である第1プライマー、前記cDNAへとハイブリダイズし延長産物の合成を開始するためのターゲットRNAに対して十分に相同的である第2プライマー、および本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを適当なMg+2緩衝液中に含んでなる反応混合物を提供すること;
(b) 前記反応混合物を適当な条件の下で処理して、1本鎖cDNAを提供すること;および
(c) ステップ(b)の反応混合物を適当な条件の下で処理して、ステップ(b)のcDNAを増幅すること。
本発明の理解に資する意味で、以下に用語の定義をしておく。
「熱活性DNAポリメラーゼ」は本書では高温の反応至適条件をもつDNAポリメラーゼをいう。本発明に使用するこの熱活性酵素は60〜90℃の温度範囲でプライマーの伸長を最大限に触媒する。
「遺伝子」は回収可能な生体活性ポリペプチドまたは前駆物質の産生に必要な調節およびコード配列を含むDNA配列をいう。
「天然型」は天然源から単離される遺伝子または遺伝子産物をいう。この用語はまた、分子生物学的手法によって産生される組み換え型の天然タンパク質であって、天然型と同じアミノ酸配列をもつものをいう。
アミノ酸配列の「点突然変異」は本書では単一アミノ酸の置換または単一アミノ酸の欠失のいずれかをいう。点突然変異は好ましくはコードDNA中の適当なコドン変更によりアミノ酸配列に導入される。
「逆転写反応混合物」という用語はターゲットRNAの逆転写に使用される種々の試薬を含んだ水溶液をいう。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、オリゴヌクレオチドプライマー、ターゲット核酸およびヌクレオシド三リン酸を含む。この混合物は文脈次第で完全または不完全逆転写反応混合物のいずれかである。
分子生物学と核酸化学の在来手法は技術の熟練の範囲内に収まるものであり、文献に詳しく記載されている。たとえば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984); Nuclei Acid Hybridization(B.D. Hames and S.J. Higgins. eds., 1984); Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier, NY); Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, NY); およびMethods in Enzymology(Academic Press, Inc.)シリーズを参照。これらの文献はすべて参照により本書に組み込まれる。本書で触れる特許、特許出願および刊行物は前述、後述を問わずすべて、参照により本書に組み込まれる。
本発明の方法に使用される突然変異型DNAポリメラーゼは、天然型DNAポリメラーゼが配列番号1〜7よりなる群から選択される配列モチーフを含み同モチーフの位置4のアミノ酸がE、A、GまたはP以外の任意のアミノ酸へと突然変異していることを特徴とする熱活性の、好ましくは耐熱性の突然変型DNAポリメラーゼである。好ましくは、この決定的アミノ酸はE、A、G、PまたはQ以外の任意のアミノ酸へと、さらに好ましくはE、A、G、P、QまたはD以外の任意のアミノ酸へと突然変異している。
本方法の実施に必要とされる他の態様、たとえばターゲットRNAの選択、試料の調製、プライマー設計、および(DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの活性化に使用される二価陽イオンを除く)試薬と反応条件の選択などは技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されている。同様に、逆転写を増幅反応と連結する場合でも、DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの活性化に使用される二価陽イオンに関連しない増幅の諸態様も技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されている。最後に、RNAの逆転写および増幅の用途も技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されている。当業者は本方法を、RNAの逆転写および随意に増幅が求められる任意の用途に応用することができよう。
突然変異型DNAポリメラーゼの例
「天然型」テルムス・テルモフィルス(Thermus thermophilus)(Tth) DNAポリメラーゼから決定的アミノ酸の可能な突然変異を網羅する一連の突然変異型DNAポリメラーゼ19種を構築した。欧州特許公開第0 902,035号と同時係属米国出願第09/146,631号に記載されているように、Tth DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は配列番号3として表される決定的配列モチーフを含む(このモチーフは、一般的モチーフ配列番号1のより狭い態様である配列番号2の特定の態様である)。決定的アミノ酸は位置683にある(E683)。
逆転写/増幅効率
実施例1で述べた20種のDNAポリメラーゼ(天然型1種、突然変異型19種)について、それぞれの逆転写/増幅反応触媒能を比較した。大体、各DNAポリメラーゼを使用して単一酵素による連結型逆転写/増幅反応を実施した。各反応に同じ初期ターゲットコピー数を使用し、反応中に増幅産物の合成をモニターした。各DNAポリメラーゼについて、反応効率の尺度となる任意(ただし一定)量の増幅産物の生成に要するサイクル数を決定した。初期逆転写ステップは一般に逆転写/増幅反応の決定的律速ステップであるため、総合的な反応効率の改善は初期逆転写ステップの改善をも示唆する。
ターゲットRNAは、ヒトのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子をコードする発現プラスミドを使用して合成した。GAPDH RNAのある領域を、5’→3’方向に示した次のプライマーを使用して増幅した。
P1(配列番号20) 5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA
P2(配列番号21) 5’-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA
初期ターゲット濃度は標準的な手段で測定した。本書で述べる比較反応では、絶対コピー数は相対コピー数ほど重要ではない。各反応で同じ初期コピー数を確保するために、同じ初期RNAストックの希釈液の等分量を使用した。
増幅
各RT-PCR増幅は総反応容量100 μlで行った。最終試薬濃度は次のとおりであった。
GAPDH RNA 106コピー
トリシン 50 mM、pH 8.15
KOAc 50 mM
Mg(OAc)2 2 mM
dATP、dGTP、dCTP 200 μM
dUTP 400 μM
各プライマー 200 nM
グリセロール 8 %
DMSO 1 %
臭化エチジウム 1 μg/ml
UNG* 2単位
* 製造元Roche Molecular Systems、発売元Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティー)
臭化エチジウムの代わりにSYBR(登録商標)Green Iを使用しても増幅産物の検出が可能になる。SYBR(登録商標)Green I使用の増幅は(10,000Xとして販売されている)SYBR(登録商標)Green IをDMSOで0.2Xに希釈して行うことができる。
熱サイクル時間および温度
反応前インキュベーション 50℃、2分間
逆転写 60℃、30秒間
95℃、1分間
55サイクル:変性 95℃、15秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、15秒間
最終伸長および保持 72℃
検出
増幅産物の累積を反応中の各サイクルで、反応蛍光強度の増加を測定することにより測定した。各増幅サイクル中に、色素の励起極大付近の波長光で各反応を励起させ、色素の発光を発光極大付近で測定した。
蛍光が任意蛍光レベル(AFL)を超えるまでに実施した増幅サイクルの数を実測蛍光値から計算した。AFLは基準蛍光レベル近くに、ただし実測蛍光強度のランダム変動範囲を超えるように選び、産物量が幾何級数的に増加する増幅初期段階で反応速度を測定するようにした。この幾何級数的増加段階では、特定の閾値に到達するのに要するサイクル数はもっぱら初期コピー数と反応効率に依存する。各反応は同じ初期ターゲットコピー数を使用して行われるので閾値に到達するまでのサイクル数が反応効率の尺度となる。もっと後段のサイクルでは、増幅産物の累積と試薬の消耗から最終的には反応プラトーに至る。
天然型Tth DNAポリメラーゼ(E683)と各突然変異型DNAポリメラーゼ(位置683のアミノ酸(aa)によって識別)を使用して得られたCT値を次表に示す。各CT値は2つの反応で得られた平均値である。比較を容易にするために、天然型と突然変異型のCT値の差((CT native)−(CT mutant))も示している。突然変異型DNAポリメラーゼの使用によって効率が高まれば結果的に、この閾値に到達するまでの所要サイクル数が少なくなる、すなわち低CT値となる。したがって、CT値の差がプラスであれば効率が高まったことになる。
逆転写効率
実施例1で述べた特定DNAポリメラーゼについて、逆転写反応触媒能を比較した。逆転写反応は各DNAポリメラーゼで、Mg+2かMn+2を使用して行った。次に、各反応から得られたcDNAを天然型酵素とMg+2を使用して同一条件下で増幅した。このプロトコールは、特に逆転写/増幅反応の逆転写部分に対する酵素の効果の測定を可能にする。
逆転写
各逆転写は総反応容量100 μlで行った。最終試薬濃度は次のとおりであった。
GAPDH RNA 106コピー
トリシン 50 mM、pH 8.15
KOAc 50 mM
Mg(OAc)2またはMn(OAc)2 2 mM
dATP、dGTP、dCTP、dUTP 200 μM
各プライマー 200 nM
グリセロール 8 %
DMSO 1 %
SYBR(登録商標)Green I 0.2 X
UNG* 1単位
* 製造元Roche Molecular Systems、発売元Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティー)
逆転写反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィールを使用して行った。
反応前保温インキュベーション
50℃、2分間
逆転写 60℃、30分間
保持 4℃
増幅
逆転写後、10 μlの反応産物を10 μl 2mM EGTAに加えて、金属陽イオンをキレートして後続増幅反応から金属陽イオンを効果的に除去するようにした。この混合物を、天然型酵素とMg+2を含むPCR増幅混合物に加えた。こうして、残存突然変異型DNAポリメラーゼを希釈し、どのような影響も無視しうる程度と見込まれるようにした。PCR増幅は総反応容量100 μlで行い、試薬の最終濃度は次のとおりとした。
トリシン 50 mM、pH 8.15
KOAc 50 mM
Mg(OAc)2 2 mM
dATP、dGTP、dCTP、dUTP 200 μM
各プライマー 200 nM
グリセロール 8 %
DMSO 1 %
SYBR(登録商標)Green I 0.2 X
増幅反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィールを使用して行った。
95℃、1分間
55サイクル:変性 95℃、15秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、15秒間
最終伸長および保持 72℃
逆転写用に天然型Tth DNAポリメラーゼ(E683)と各突然変異型DNAポリメラーゼ(位置683のアミノ酸で識別)を、また増幅用に一律に天然型Tth DNAポリメラーゼを、それぞれ使用して得られたCT値を次表に示す。比較を容易にするために、CT値の差すなわち(CT native)−(CT mutant)も示す。突然変異型DNAポリメラーゼの使用によって効率が高まれば結果的に、この閾値に到達するまでの所要サイクル数が少なくなる、すなわち低CT値となる。したがって、CT値の差がプラスなら効率が高まったことになる。
忠実性
特定突然変異型DNAポリメラーゼと天然型酵素の忠実性をいくつかの方法で比較した。Mg+2緩衝液で実施した連結型逆転写/増幅反応の忠実性を、Mn+2緩衝液中で実施した場合の忠実性と比較した。さらに、DNA増幅に使用した場合のDNAポリメラーゼの忠実性も比較した。
Mg+2活性化反応とMn+2活性化反応の増幅産物に関する実測Tm値は次表のとおりである。各測定値は複製反応の平均である。温度の単位はすべて℃である。
増幅産物のTm値
DNAポリメラーゼ Tm、Mg +2 Tm、Mn +2
天然型 80 78
E683K 80 76
E683N 80 76
Mg+2を使用すると、天然型と突然変異型のDNAポリメラーゼに忠実性の差はまったく観測されなかった。20種のDNAポリメラーゼすべてを使用して実施した同様の反応から、Mg+2活性化反応ではどの突然変異型DNAポリメラーゼの忠実性も天然型DNAポリメラーゼの忠実性と同じであることが確認された。
以上の結果は、前掲実施例の結果と総合すれば、本発明の方法の優位性を証明する。先行技術の高温逆転写および増幅方法は十分な反応効率を実現するためにMn+2を使用して実施されたが、忠実性の低下に見舞われた。本発明はいくつかの選択肢を提供する。RNAの高温逆転写および増幅にMn+2を使用するときは、突然変異型酵素の使用により天然型酵素使用の場合よりも高い効率が実現するし、より低Mn+2濃度での反応の実施が可能になり、もって忠実性に対するMn+2濃度の有害な影響を最小限に抑えることができる。Mg+2を使用するときは、突然変異型酵素の使用により高温、高忠実性のRNA逆転写および増幅が実用効率で実現される。
Claims (5)
- RNAを単一酵素逆転写/増幅反応を使用して逆転写/増幅するための、次のステップを含む方法:
(a) 前記RNA、プライマー、Mg+2、および突然変異型熱活性DNAポリメラーゼを含む逆転写反応混合物であって、前記の突然変異型DNAポリメラーゼが
i) その天然型において前記DNAポリメラーゼがDNAポリメラーゼドメイン内に配列番号5、配列番号6または配列番号7であるアミノ酸配列を含むこと、
ii) 前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が前記天然型配列に比してアミノ酸C、F、H、I、K、L、M、S、T、V、WまたはYへと突然変異していること、
を特徴とする逆転写反応混合物を用意すること;
(b) 前記反応混合物を、前記突然変異型DNAポリメラーゼが前記プライマーの伸長産物の合成を開始させるに足る温度で処理して、前記RNAに対して相補的であるcDNA分子を提供すること;および
(c) 前記cDNAを増幅すること。 - RNAを単一酵素逆転写/増幅反応を使用して逆転写/増幅するための、次のステップを含む方法:
(a) 前記RNA、プライマー、Mn+2、および突然変異型熱活性DNAポリメラーゼを含む逆転写反応混合物であって、前記の突然変異型DNAポリメラーゼが
i) その天然型において前記DNAポリメラーゼがDNAポリメラーゼドメイン内に配列番号5、配列番号6または配列番号7であるアミノ酸配列を含むこと、
ii) 前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が前記天然型配列に比してアミノ酸C、F、H、I、K、L、M、S、T、V、WまたはYへと突然変異していること、
を特徴とする逆転写反応混合物を用意すること;
(b) 前記反応混合物を、前記突然変異型DNAポリメラーゼが前記プライマーの伸長産物の合成を開始させるに足る温度で処理して、前記RNAに対して相補的であるcDNA分子を提供すること;および
(c) 前記cDNAを増幅すること。 - 前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸がF、K、LまたはYである請求項1または2記載の方法。
- ステップ(c)の増幅がポリメラーゼ連鎖反応法を使用して行われる請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 突然変異型DNAポリメラーゼが耐熱性である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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