NO323552B1 - Termostabilt enzym, fremgangsmate for fremstilling av enzymet og fremgangsmate for amplifikasjon av en mal-nukleinsyre, samt amplifikasjonsreaksjonsblanding og testsett. - Google Patents

Abstract

Det beskrives et termostabilt enzym som er reversibelt inaktivert ved kjemisk modifikasjon, og som kjennetegnes ved at inkubering av det kjemisk modifiserte termostabile enzym i en vandig buffer ved alkalisk pH, ved lavere temperatur enn ca. 25°C, ikke resulterer i vesentlig enzymaktivitetsøkning i mindre enn ca. 20 minutter, og hvor en inkubering av det modifiserte enzym i en vandig buffer,. innstillet på pH 8-9 ved 25°C, ved høyere temperatur enn ca.50°C, resulterer i minst en to gangers økning i enzymaktivitet i løpet av mindre enn ca. 20 minutter.Det kjemisk modifiserte termostabile enzym kan benyttes til amplifikasjon av nukleinsyrer, idet aktiviteten av det inaktiverte enzym gjenopprettes gjennom en inkubering av reaksjonsblandingen ved høyere temperatur før, eller som del av, amplifikasjonsreaksjonen.

Description

Denne oppfinnelse vedrører generelt feltet nukleinsyrekjemi. Nærmere bestemt vedrører den termostabilt enzym, fremgangsmåte for fremstilling av enzymet og fremgangsmåte for amplifikasjon av en mål-nukleinsyre, samt amplifikasjonsreaksjonsblanding og testsett.

PCR-prosessen (polymerase chain reaction) for amplifisering av nukleinsyresekvenser er velkjent og er beskrevet i US-patent 4.683.202; 4.683.195 og 4.965.188. Termostabile enzymer for utførelse av PCR er for eksempel beskrevet i WO 91/09950. DNA polymeraser mutert i deres aminosyresekvens som fører til delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av aminosyreresidier for å modifisere DNA polymerase kvaliteten og/eller aktiviteten er beskrevet i Cariello et a!., 1991 Nucleic Actds Research 19(15):4193-4198: EP patentsøknad, EP 0655,506; og WO 91/02090. Derimot er ingen reversibelt inaktiverte former av de termostabile DNA polymerasene beskrevet i tidligere kjent teknikk. Kommersielle forhandlere som Perkin Eimer, Norwalk og CT, fører PCR-reagenser og publiserer PCR-bruksanvisninger.

I hver PCR-amplifikasjonsrunde denatureres en dobbeltkjédet målsekvens, hvoretter primere hybridiseres tii hver kjede av den denaturerte målsekvens og primerne forlenges gjennom virkningen av en DNA-polymerase. Spesifisiteten av ampiifikasjonen avhenger av spesifisiteten av primerhybridiseringen. Primere velges slik at de er komplementære med, eller tilnærmet komplementære med, sekvenser som forekommer i 3'-enden av de respektive mål-kjeders nukletnsyresekvens.Under de forhøyede temperaturene som benyttes ved en typisk PCR, hybridiserer primerne kun til den tiltenkte målsekvens. Amplifikasjonsreaksjonsblandinger settes i alminnelighet sammen ved romtemperatur, godt under den temperatur som trengs for å sikre spesifisitet av primerhybridiseringen. Under slike mindre stringente betingelser kan primerne binde seg uspesifikt til andre, kun partielt, komplementære nukleinsyresekvenser (eller endog til andre primere) og initiere syntese av uønskede ekstensjonsprodukter som kan amplifiseres sammen med målsekvensen. Amplifisering av de uspesifikke primerekstensjonsproduktene kan konkurrere med ampiifikasjonen av de ønskede målsekvensene og i vesentlig grad nedsette effektiviteten av ampiifikasjonen av den ønskede sekvens. Problemer forårsaket av uspesifikk amplifikasjon er ytterligere omtalt av Chou et a!., 1992, Nucleic Acids Research 20(7):1717-1723.

Uspesifikk amplifikasjon kan reduseres ved å redusere dannelsen av ekstensjonsprodukter fra primere bundet til utilsiktede sekvenser før starten av reaksjonen. I henhold til en metode, en såkalt "varm-start" protokoll, holdes ett eller flere avgjørende reagenser tilbake fra reaksjonsblandingen inntil temperaturen er hevet tilstrekkelig til å gi den nødvendige hybridiseringsspesifisitet. På denne måten kan reaksjonsblandingen ikke bidra til primerekstensjon i den tiden hvor reaksjonsbetingelsene ikke sikrer spesifikk primerhybridisering.

Varm-statr-metoder kan utføres manuelt ved å åpne reagensrøret etter den innledende inkubering ved høy temperatur og tilsette de manglende reagenser. Manuelle varm-start-metoder er imidlertid arbeidskrevende og øker risikoen for forurensing av reaksjonsblandingen. Varm-start-metoder som benytter et varmelabitt materiale, som f .eks. voks, for å separere eller isolere reaksjonskomponenter er beskrevet i US-patent 5.411.876 og av Chou et al., 1992, supra. Ved hjelp av disse metoder smelter den høye temperatur under den forutgående inkubering, det varmelabile materialet, hvorved reagensene får mulighet til å blandes.

En annen metode for å redusere dannelsen av ekstensjonsprodukter fra primere bundet til utilsiktede sekvenser før starten av reaksjonen, er basert på inhibering av DNA-polymerasen ved å benytte en forbindelse som ikke-kovalent binder seg til DNA-polymerasen på varmereversibei måte. US-patent 5.338.671 beskriver bruken av antistoffer som er spesifikke for en termostabil DNA-polymerase for å inhibere DNA-polymeraseaktiviteten. Antistoffene må inkuberes med DNA-polymerasen i en buffer ved romtemperatur før reaksjonsblandingen slås sammen for å muliggjøre dannelsen av antistoff-DNA-polymerasekomplekset. Antistoff-inhibering av DNA-polymeraseaktivitet inaktiveres som en for-reaksjon under inkubering ved høy temperatur. En ulempe ved denne metode er at produksjonen av antistoffer som er spesifikke for DNA-polymerasen, er kostbar og tidkrevende, spesielt i større mengder. Tilsetningen av antistoffer til en reaksjonsblanding kan dessuten fordre en endring av amplifikasjonsreaksjonen.

Dannelsen av ekstensjonsproduktene kan også inhiberes gjennom tilsetning av en forbindelse som ikke-kovalent binder seg til primerne på varmereversibei måte, hvorved primerne hindres i hybridisering til enhver sekvens, tilsiktet eller ikke. For eksempel vil enkeltkjedet bindende protein tilsatt til en reaksjonsblanding binde primerne slik at primerhybirdisering forhindres og primerekstensjonen inhiberes. Forbedringer i utbyttet av PCR-produkter ved bruk av gen 32-protein er beskrevet av Schwartz et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18{4):10.

Uspesifikk amplifikasjon kan reduseres ved å bryte ned ekstensjons-produkter dannet fra primere bundet til utilsiktede sekvenser før reaksjonsstart, f.eks. ved bruk av de metoder som er beskrevet i US-patent 5.418.149 og i WO 92/01814. Nedbrytningen av nysyntetiserte ekstensjonsprodukter oppnås ved å inkorporere dUTP og UNG i reaksjonsblandingen og inkubere den ved 45-60°C før amplifikasjonsreaksjonen foretas. En ulempe ved denne metode er at nedbrytningen av ekstensjonsprodukt konkurrerer med dannelsen av ekstensjonsprodukt og at fjerningen av uspesifikke primerekstensjonsprodukter sannsynligvis vil være mindre fullstendig.

Konvensjonelle teknikker innen molekylær biologi, proteinkjemi og nukleinsyrekjemi innenfor dette fagområdet, er fullstendig forklart i litteraturen. Se for eksempel Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Sambrook et al., 1989); Oligonucteotide Synthesis (M.J. Gait, red. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgens, red. 1984); Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press); og serien Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og reagenser for amplifisering av nukleinsyrer ved å benytte en primer-basert amplifikasjonsreaksjon som spesifisert i patentkravene. Disse fremgangsmåtene og reagensene gir en enkel og økonomisk løsning på problemet med uspesifikk amplifikasjon. Fremgangsmåtene gjør bruk av et reversibelt inaktivert termostabilt enzym som kan reaktiveres ved inkubering i amplifikasjonsblandingen ved forhøyet temperatur. Uspesifikk amplifikasjon reduseres betydelig fordi reaksjonsblandingen ikke understøtter primerekstensjon før temperaturen i reaksjonsblandingen er hevet til en temperatur som sikrer primerhybridiseringsspesifisitet.

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører termostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet eller ligaseaktivitet, hvor enzymaktiviteten er reversibelt inaktivert ved kjemisk modifikasjon, kjennetegnet ved at nevnte reversibelt inaktivert termostabilt enzym er fremstilt ved å omsette en termostabil enzymblanding med et modifiseringsreagens, hvor omsetningen foretas ved alkalisk pH ved en temperatur som er lavere enn ca. 25°C, og hvor nevnte reagens er et dikarboksylsyreanhydrid med den generell formel: hvor Ri og R2 er hydrogen eller organiske radikaler, som kan være sammenkoblet, eller med den generelle formel:

hvor Ri og R2 er organiske radikaler, som fortrinnsvis er sammenkoblet, og hvor hydrogenet har cis-stilling, og hvor nevnte omsetning resulterer i tilnærmet fullstendig inaktivering av enzymaktiviteten.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge krav 1, kjennetegnet ved at inkubering av det kjemisk modifiserte termostabile enzym i en vandig buffer ved alkalisk pH, ved lavere temperatur enn ca. 25°C, resulterende i praktisk talt ingen enzymaktivitetsøkning i mindre enn ca. 20 minutter, og hvor en inkubering av det nevnte kjemisk modifiserte enzym i en vandig buffer, innstilt på omtrent pH 8-9 ved 25°C, ved høyere temperatur enn ca. 50°C, resulterer i minst en to gangers økning i enzymaktivitet i løpet av mindre enn ca. 20 minutter. I deres virksomme tilstand katalyserer de reversibelt inaktiverte termostabile enzymene ifølge oppfinnelsen, primerekstensjon, eller er de nødvendige for at primerekstensjon skal finne sted. Foretrukne enzymer innbefatter termostabile DNA-polymeraser og ligaser.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av et kjemisk modifisert termostabilt enzym, hvor umodifisert enzym har DNA-polymeraseaktivitet eller ligaseaktivitet og hvor enzymaktiviteten er reversibel inaktivert ved nevnte kjemiske modifikasjon, hvor prosessen omfatter omsetning av en termostabil enzymblanding med et modifiseringsreagens, hvor nevnte omsetning foretas ved alkalisk pH ved en temperatur som er lavere enn ca. 25°C, og hvor nevnte reagens er et dikarboksylsyreanhydrid med den generelle formel: hvor Ri og R2 er hydrogen eller organiske radikaler, som kan være sammenkoblet, eller med den generelle formel:

hvor Ri og R2 er organiske radikaler, som fortrinnsvis er sammenkoblet, og hvor hydrogenet har cis-stilling, og hvor nevnte omsetning resulterer i tilnærmet fullstendig inaktivering av enzymaktivitet. Det organiske radikal til nevnte modifiseringsreagens kan være direkte knyttet til ringen med en karbon-karbon-binding eller gjennom en karbon-heteroatom-binding, som f.eks. en karbon-oksygen-, karbon-nitrogen- eller karbon-svovel-binding. De organiske radikalene kan også være bundet til hverandre for å danne en ringstruktur, som for eksempel i 3,4,5,6-tetrahydroftalsyreanhydrid.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre kjemisk modifisert inaktivert termostabilt enzym, kjennetegnet ved at det er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten i krav 8.

Foretrukne reagenser innbefatter maleinsyreanhydrid; substituerte maleinsyreanhydrider, så som citrakonsyreanhydrid, cis-akonitsyreanhydrid og 2,3-dimetylmaleinsyreanhydrid; exo-cis-3,6-endokso-A<4->tetrahydroftalsyreanhydridsamt 3,4,5,6-tetrahydroftalsyreanhydrid. Særlig foretrekkes citrakonsyreanhydrid og cis-akonitsyreanhydrid for fremstillingen av reversibelt inaktiverte DNA-polymeraser for bruk ved PCR-amplifikasjoner. I.henhold til et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å foreta en nukleinsyreamplifikasjonsreaksjon ved å benytte et reversibelt inaktivert termostabilt enzym ifølge foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for amplifikasjon av en mål-nukleinsyre som inngår i en prøve, og som omfatter trinnene: (a) kontakting av prøven med en amplifikasjonsreaksjonsblanding inneholdende en primer som er komplementær til den tilsiktede nukleinsyre og et kjemisk modifisert termostabilt enzym, ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller 9; og (b) inkubering av den resulterende blanding fra trinn (a) ved en temperatur som er høyere enn ca. 50°C i tilstrekkelig tid til å reaktivere det kjemisk modifiserte termostabile enzym og muliggjøre dannelse av primerekstensjonsprodukter.

Foretrukne utførelsesformer av fremgangsmåtene gjør bruk av reversibelt modifiserte enzymer som er modifisert ved å benytte de foretrukne modifiserings-reagensene. Inkuberingstrinn (b) kan foretas før starten av amplifikasjonsreaksjonen. Inkuberingen som resulterer i reaktivering av enzymet, kan utgjøre et integrert trinn i amplifikasjons-prosessen. For eksempel kan det denaturereringstrinn som foretas i hver PCR-runde samtidig bevirke reaktivering av en modifisert DNA-polymerase.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er amplifikasjonsreaksjonen en PCR (polymerase chain reaction), og det benyttes en reversibelt inaktivert termostabil DNA-polymerase. Før amplifikasjonsreaksjonen foretas, inkuberes reaksjonsblandingen ved en temperatur som er høyere enn hybridiseringstemperaturen for amplifikasjonsreaksjonen. DNA-polymerasen er således inaktivert inntil temperaturen er over den temperatur som sørger for spesifisitet av amplifikasjonsreaksjonen, og derved reduseres uspesifikk amplifikasjon.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører amplifikasjonsblanding for en PCR-reaksjon (polymerase-kjedereaksjon), som omfatter et primerpar; og et kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller 9.

I henhold til en foretrukket utførelsesform inneholder amplifikasjonsreaksjonsblandingen oligonukleotidprimere for utførelse av en PCR.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører testsett for å foreta en PCR-polymerasekjedereaksjon som omfatter et kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller 9. Figur 1 viser strukturen av citrakonsyreanhydrid, cis-akonitsyreanhydrid og 2,3-dimetylmaleinsyreanhydrid samt reaksjonen mellom citrakonsyreanhydrid og lysin. Figur 2 viser resultatene av amplifikasjoner foretatt ved å benytte citrakonylert Taq DNA-polymerase som beskrevet i Eksempel 4. Figur 3 viser resultatene av amplifikasjoner foretatt ved å benytte citrakonylert DNA-polymerase som beskrevet i Eksempel 6. Figur 4 viser resultatene av variasjon av inkubasjonstiden for den forutgående reaksjon ved amplifikasjoner foretatt ved bruk av citrakonylerte og cis-akonitylerte DNA-polymeraser som beskrevet i Eksempel 9. Figur 5 viser resultatene av variasjon antallet av amplifikasjonsrunder ved amplifikasjoner foretatt under bruk av citrakonylerte og cis-akonitylerte DNA-polymeraser som beskrevet i Eksempel 10.

For å lette forståelsen av oppfinnelsen er flere betegnelser definert nedenfor.

Betegnelsene "nukleinsyre" og "oligonukleotid" refererer seg til primere, prober og oligofragmenter som skal påvises, og er å forstå som generiske for polydeoksyribonukleotider (inneholdende 2-deoksy-D-ribose), for polyribonukleotider (inneholdende D-ribose) og for en hvilken som helst annen type av polynukleotid som er et N-glykosid av en purin- eller pyrimidinbase eller modifisert purin- eller pyrimidinbase. Det ikke lagt noen distinksjon i lengde mellom betegnelsene "nukleinsyre" og "oligonukleotid" og disse betegnelsene vil bli benyttet om hverandre. Disse betegnelsene refererer kun til molekylets primærstruktur. Betegnelsene inkluderer således dobbelt- og enkeltkjedet DNA, så vel som dobbelt- og enkettkjedet RNA. Oligonukleotider kan fremstilles ved en hvilken som helst egnet metode. En oversikt over syntesemetoder finnes i Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187.

Betegnelsen "hybridisering" refererer seg til dannelsen av en dupleks-struktur av to enkeltkjedede nukleinsyrer som følge av komplementær baseparing. Hybridisering kan forekomme mellom helt komplementære nukleinsyrekjeder eller mellom "tilnærmet komplementære" nukleinsyrekjeder som inneholder mindre områder av mistilpasning. Betingelser hvorunder kun fullstendig komplementære nukleinsyrekjeder vil hybridisere er omtalt som "stringente hybridiseringsbetingelser" eller "sekvensspesifikke hybridiseringsbetingelser". Stabile duplekser av tilnærmet komplementære sekvenser kan oppnås under mindre stringente hybridiseringsbetingelser. Fagmannen på området nukleinsyreteknologi vil kunne fastslå dupleks-stabilitet empirisk ved å ta hensyn til en rekke variabler, som for eksempel lengden og baseparkonsentrasjonen av oligonukleotidene, ionestyrke og hyppigheten av mistilpassede basepar, ved å følge kjente anvisninger (se f.eks. Sambrook et al., 1989, supra).

Generelt velges stringente hybridiseringsbetingelser ca. 5°C lavere enn Tm (thermal melting point) for angjeldende sekvens ved en definert ionestyrke og pH. Tm er den temperatur (under definert ionestyrke og pH) ved hvilken 50% av baseparene er dissosiert. Renonsering på stringensen av hybridiserings-betingelsene vil medføre at sekvens-mistilpasning må tolereres. Graden av tolerert mistilpasning kan kontrolleres ved passende justering av hybridiserings-betingelsene.

Betegnelsen "primer" refererer seg til et oligonukleotid, enten det er naturlig eller syntetisk, som er i stand til å virke som et initieringspunkt for DNA-syntese under betingelser hvor syntese av et primerekstensjonsprodukt som er komplementært til en nukleinsyrekjede, induseres, dvs. i nærvær av fire forskjellige nukleosid-trifosfater og et polymeriseringsmiddel (dvs. DNA-polymerase eller revers transkriptase) i en passende buffer og ved en passende temperatur. Oligonukleotid-analoger, som f.eks. "peptidnukleinsyrer" kan virke som primere og inngår i den betydning av begrepet "primer" som her er benyttet. En primer er fortrinnsvis et enkeltkjedet oligodeoksyribonukleotid. Den passende primerlengde avhenger av den tiltenkte anvendelse av primeren, men utgjør typisk fra 6 til 50 nukleotider. Korte primermolekyler fordrer i alminnelighet lavere temperaturer for å danne tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med templaten. En primer behøver ikke gjenspeile den eksakte sekvens av nukleinsyretemplaten, men må være tilstrekkelig komplementær til å hybridisere med templaten.

Betegnelsen "primerekstensjon" refererer her både til syntesen av DNA som resultat av polymerisering av individuelle nukleosid-trifosfater ved å benytte en primer som initieringspunkt, og til tilkoblingen av ytterligere oligonukleotider til primeren for å forlenge primeren. I denne sammenheng er betegnelsen "primerekstensjon" ment å innbefatte ligeringen av to oligonukleotider for å danne et lengre produkt som så kan tjene som et mål i senere amplifikasjonsrunder. I denne sammenheng er betegnelsen "primer" ment å innbefatte de oligonukleotider som benyttes i ligeringsmedierte amplifikasjonsprosesser og som forlenges gjennom ligeringen av et andre oligonukleotid som hybridiserertil en tilstøtende posisjon.

Primere kan inkorporere ytterligere trekk som muliggjør deteksjon eller immobilisering av primeren, men som ikke endrer primerens grunnleggemde egenskap, nemlig å virke som et initieringspunkt for DNA-syntese. For eksempel kan primere inneholde en ytterligere nukleinsyresekvens i 5'-enden som ikke hybridiserer til den tilsiktede nukleinsyren, men som forenkler kloningen av det amplifiserte produkt. Det primerområde som er tilstrekkelig komplementært til templaten til å hybridisere omtales her som hybridiseringsregionen.

Uttrykket "målregion" og "tilsiktet nukleinsyre" refererer seg til et område eller subsekvens av en nukleinsyre som skal amplifiseres. Primerhybridiseringssetet kan betegnes målregionen for primerhybridisering.

I denne sammenheng er en oltgonukleotidprimer "spesifikk" for en målsekvens dersom det antall av mistilpasninger som forekommer mellom oligonukleotidet og målsekvensen er mindre enn det antall mistilpasninger som forekommer mellom oligonukleotidet og ikke tilsiktede sekvenser som kan forekomme i prøven. Det kan velges hybridiseringsbetingelser hvorunder stabile duplekser dannes bare dersom antallet av forekommende mistilpasninger ikke er fler enn det antall av mistilpasninger som forekommer mellom oligonukleotidet og målsekvensen. Under slike betingelser kan oligonukleotidet danne en stabil dupleks kun med en målsekvens. Anvendelsen av målspesifikke primere og passende stringente amplifiseringsbetingelser muliggjør således den spesifikke amplifikasjon av de målsekvenser som inneholder bindingssetene for målprimeren. Anvendelsen av sekvensspestfikke amplifikasjonsbetingelser muliggjør den spesifikke amplifikasjon av de målsekvenser som inneholder de nøyaktig komplementære primerbindings-setene.

Betegnelsen "uspesifikk amplifikasjon" refererer seg til ampiifikasjonen av andre nukleinsyresekvenser enn målsekvensen, og som er et resultat av primere som hybridiseres til andre sekvenser enn målsekvensen og derved tjener som et substrat for primerekstensjon. Hybridiseringen av en primer til en utilsiktet målsekvens omtales som "uspesifikk hybridisering" og kan inntre under de lavere temperaturbetingelser og den reduserte stringens under pre-reaksjonen.

Betegnelsen "termostabilt enzym" refererer seg til et enzym som er relativt stabilt overfor varme. De termostabile enzymene kan tåle den inkubering ved høy temperatur som benyttes for å fjerne modifiseringsgruppene, i alminnelighet høyere enn 50°C, uten å lide et irreversibelt aktivitetstap. Modifiserte termostabile enzymer som er anvendelige for fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter termostabile DNA-polymeraser og termostabile ligaser.

Betegnelsen "termostabil DNA-polymerase" refererer seg til et enzym som er relativt stabilt overfor varme og katalyserer polymeriseringen av nuklesid-trifosfater for å danne primerekstensjonsprodukter som er komplementære til én av målsekvensens nukleinsyrekjeder. Enzymet initierer syntese i 3'-enden av primeren og fortsetter mot 5'-enden av templaten inntil syntesen avsluttes. Renset termostabil DNA-polymerase er beskrevet i US-patent 4.889.818; US-patent 5.352.600; US-patent 5.079.352; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; US-patent 5.491.086; WO 92/09689; og US-patent 5.210.036.

Et enzym "avledet" fra en organisme refererer seg her til et enzym som er renset fra organismen eller en rekombinant versjon av et enzym som er renset fra organismen, og inkluderer enzymer hvor aminosyresekvensen er modifisert gjennom molekylærbiologisk teknikk.

Betegnelsen "reversibelt inaktivert" refererer seg her til et enzym som er inaktivert gjennom reaksjon med en forbindelse som resulterer i kovatent modifisering av enzymet (også omtalt som kjemisk modifisering), hvor modifiseringsforbindelsen lar seg fjerne under passende betingelser. Reaksjonen som fører til fjerning av modifiseringsforbindelsen behøver ikke være den reverserte modifikasjonsreaksjon. Så lenge det finnes en reaksjon som resulterer i fjerning av modifiseringsforbindelsen og gjenopprettelse av enzymfunksjonen, ansees enzymet som reversibelt inaktivert.

Betegnelsen "reaksjonsblanding" refererer seg til en løsning inneholdende de nødvendige reagenser for å foreta en gitt reaksjon. En "amplifiseringsreaksjons-blanding" som refererer seg til en løsning som inneholder nødvendige reagenser for å foreta en amplifiseringsreaksjon, inneholder vanligvis oligonukleotidprimere og en DNA-polymerase eller -ligase i en passende buffer. En "PCR-reaksjonsblanding" inneholder vanligvis oligonukleotidprimere, en termostabil DNA-polymerase, dNTP'er og et divalent metallkation i en passende buffer. En reaksjonsblanding omtales som komplett dersom den inneholder alle nødvendige reagenser for å muliggjøre reaksjonen, og ukomplett dersom den kun inneholder noen av de nødvendige reagensene. Det vil for fagmannen være klart at reaksjonskomponenter rutinemessig oppbevares som separate løsninger som hver inneholder en del av samtlige komponenter. Dette gjøres for lettvinthets skyld med henblikk på lagrings-stabilitet og for å muliggjøre uavhengig tilpasning av komponentkonsentrasjonene til anvendelsesformålet, idet reaksjonskomponentene kombineres før reaksjonen for å frembringe en komplett reaksjonsblanding.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse innebærer at det utføres en amplifiseringsreaksjon ved å benytte et varmeaktivert termostabilt enzym, hvor det aktive enzym fordres for primerekstensjon. Før den inkubering ved høy temperatur som aktiverer enzymet, understøtter ikke amplifiseringsreaksjons-blandingen primerekstensjon og det dannes ingen ekstensjonsprodukter, hverken uspesifikke eller andre. Etter inkuberingen ved høy temperatur som reaktiverer enzymet, holdes amplifiseringsreaksjonsblandingen ved temperaturer som er tilstrekkelig høye til at de sikrer reaksjonsspesifisitet. Primerekstensjonsprodukter dannes således kun under betingelser som sikrer amplifikasjonspesifisitet.

Ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse katalyserer det varmeaktiverte enzym, i dets aktive tilstand, primerekstensjonsreaksjonen. For anvendelse ved en typisk amplifiseringsreaksjon, f.eks. en PCR, har det varmeaktiverte termostabile enzym, i sin aktive tilstand, DNA-polymeraseaktivitet. For anvendelse i Iigase-medierte amplifiseringssystemer har det varmeaktiverte termostabile enzym i sin aktive tilstand, DNA-ligaseaktivitet.

I et ligasemediert amplifiseringssystem dannes et "ekstensjonsprodukt" ved ligering av et første oligonukleotid (som her kommer inn under begrepet "primer") til et andre oligonukleotid som hybridiseres i tilknytning til 3'-enden av det første oligonukleotid. Det andre oligonukleotid kan hybridiseres i umiddelbar nabostilling til primeren, hvorunder det kun fordres ligering, eller kan hybridiseres én eller flere baser fra primeren, hvorunder det fordres polymeraseaktivitet for å forlenge primeren før ligeringen. I begge tilfeller er sammenkoblingen av to oligonukleotider som hybridiseres til tilstøtende regioner i mål-DNA, ment å inngå i betegnelsen "primerekstensjon".

De reversibelt inaktiverte termostabile enzymene ifølge oppfinnelsen, fremstilles gjennom en reaksjon mellom enzymet og et modifiseringsreagens, som resulterer i en reversibel kjemisk modifikasjon av enzymet, som resulterer i at all eller nesten all, enzymaktivitet tapes. Modifikasjonen består i den kovalente tilknytning av modifiseringsgruppen til proteinet. Modifiseringsforbindelsen velges slik at modifiseringen reverseres ved inkubering ved forhøyet temperatur i amplifiseringsreaksjonsbufferen. Egnede enzymer og modifiseringsgrupper er beskrevet nedenfor.

Reversibelt inaktiverte enzymer som i deres aktive tilstand har DNA-polymeraseaktivitet, fremstilles fra termostabile DNA-polymeraser. Termostabile

DNA-polymeraser som er anvendelige for amplifiseringsreaksjonene er velkjente på området og kan avledes fra en rekke kilder, så som termofile eubakterier eller archaebakterier fra arter av slekten Thermus, Thermotoga, Thermococcus, Pyrodictium, Pyrococcus og Thermosipho. Representative arter som termostabile DNA-polymeraser anvendelige for PCR-amplifikasjoner er avledet fra, inkluderer Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Pyrodictium occultum, Pyrodictium abyssi og Thermosipho africanus. Termostabile DNA-polymeraser er beskrevet i US-patent 4.889.818; US-patent 5.352.600; US-patent 5.079.352; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; US-patent 5.491.086; WO 92/09689; og US-patent 5.210.036. Termostabile DNA-polymeraser er kommersielt tilgjengelige fra Perkin Eimer, Norwalk, CT.

Reversibelt inaktiverte termostabile enzymer som er egnet for bruk i andre amplifikasjonsprosesser, som f .eks. ligasemedierte amplifikasjoner, fremstilles fra de termostabile enzymer som er beskrevet i de nedenfor siterte referanser og som beskriver ulike amplifikasjonsmetoder.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til bruken av de eksemplifiserte enzymene. For eksempel kan en hvilken som helst termostabil DNA-polymerase beskrevet i litteraturen for bruk i amplifikasjons-reaksjoner, modifiseres slik som her beskrevet, for å fremstille et reversibelt inaktivert enzym egnet for anvendelse ifølge foreliggende fremgangsmåter. Generelt kan et hvilket som helst enzym som katalyserer primerekstensjon, eller som er nødvendig for at det skal inntre primerekstensjon, og som er tilstrekkelig termostabilt tit å tåle reaktiveringsinkubering ved høy temperatur uten å bli irreversibelt inaktivert, og kan modifiseres som her beskrevet for å frembringe et reversibelt inaktivert enzym, benyttes i de foreliggende metoder. Basert på de her gitte retningslinjer vil fagmannen være i stand til å optimalisere betingelsene for modifikasjonsreaksjonen og amplifikasjonsreaksjonen for det angjeldende enzym.

I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen foretas reversibel inaktivering av et termostabilt enzym ved reversibelt å blokkere lysinrestene gjennom kjemisk modifikasjon av e-aminogruppen i lysinrestene. Modifikasjon av lysinrestene i proteinets aktive område resulterer i inaktivering av proteinet. I tillegg kan modifisering av tysiner utenfor det aktive område bidra til inaktiveringen av proteinet gjennom sterisk interaksjon eller konformasjonsendringer. Det er i litteraturen beskrevet en rekke forbindelser som reagerer med aminogrupper på reversibel måte. For eksempel er aminogrupper blitt reversibelt modifisert ved trifluor-acetylering (se Goldberger & Anfinsen, 1962, Biochemistry 1:410), amidinering (se Hunter & Ludwig, 1962, J. Amer. Chem. Soc. 84:3491), mateylering (se Butler et al., 1967, Biochem. J. 103:78), acetoacetylering (se Marzotto et al., 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun. 26:517; og Marzotto et al., 1968; Biochim. Biophys. Acta 154:450), tetrafluorsuccinylering (se Braunitzer et al., 1968, Hoppe-Seyler^s Z. Physiol. Chem. 349:265) og citrakonylering (se Dixon & Perham, 1968, Biochem. J. 109:312-314; og Habeeb & Atassi, 1970, Biochemistry 9(25):4939-4944).

Foretrukne reagenser for den kjemiske modifisering av e-aminogruppen av lysinrester er dikarboksylsyreanhydrider med den generelle formel: hvor Ri og R2 er hydrogen eller organiske radikaler, som kan være sammenkoblet, eller har den generelle formel:

hvor Ri og R2 er organiske radikaler, som kan være sammenkoblet, og hydrogenet har cis-stilling. Det organiske radikal kan være direkte knyttet til ringen gjennom en karbon-karbon-binding eller gjennom en karbon-heteroatom-binding, så som en karbon-oksygen-, karbon-nitrogen- eller karbon-svovel-binding. De organiske radikalene kan også være forbundet med hverandre for å danne en ringstruktur, som for eksempel i 3,4,5,6-tetrahydroftalsyreanhydrid.

Dikarboksylsyreanhydrider reagerer med aminogruppene i proteiner for å gi de tilsvarende acylerte produktene slik som vist for citrakonsyreanhydrid i Figur 1. Reversibiliteten av dikarboksylsyreanhydridene ovenfor antas å forbedres gjennom nærvær enten av cis-karbon-karbon-dobbeltbindingen eller av cis-hydrogen-atomene, som holder den terminale karboksylgruppe i de acylerte rester i en romlig orientering som er egent for interaksjon med amidgruppen, og påfølgende deacylering. Se Palacian et al., 1990, Mol. Cell. Biochem. 97:101-111 angående beskrivelser av plausible mekanismer for både acylerings- og deacylerings-reaksjonene. Andre substituenter kan på lignende måte begrense dreiningen om 2,3-bindingen av acyldelen i det acylerte produkt, og slike forbindelser forventes å være virksomme for fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempler på foretrukne reagenser er bl.a. maieinsyreanhydrid; substituerte maleinsyreanhydrider, som f .eks. citrakonsyreanhydrid, cis-akonitsyreanhydrid og 2,3-dimetylmaleinsyreanhydrid; exo-cis-3,6-endokso-A4-tetrahydroftalsyreanhydrid og 3,4,5,6-tetrahydroftalsyreanhydrid. Reagensene er kommersielt tilgjengelige, for eksempel fra Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wl), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) eller Spectrum Chemical Mfg. Corp. (Gardena, CA). Modifikasjoner av termostabile DNA-polymeraser under bruk av de substituerte maieinsyreanhydrid-reagensene citrakonsyreanhydrid og cis-akonitsyreanhydrid, er beskrevet i eksemplene.

Den relative stabilitet av aminogruppene acylert ved bruk av ovennevnte reagenser, avtar i følgende rekkefølge: maieinsyreanhydrid; exo-cis-3,6-endokso-A<4->tetrahydroftalsyreanhydrid; citrakonsyreanhydrid; 3,4,5,6-tetrahydroftalsyre-anhydrid; cis-akonitsyreanhydrid og 2,3-dimetylmaleinsyreanhydrid (se Palacian et al. supra). Optimale betingelser for aktiveringsinkubering av enzymer modifisert med et bestemt reagens, bestemmes empirisk som beskrevet i eksemplene.

US-patent 5.262.525 beskriver fremgangsmåter for kjemisk modifikasjon av proteiner hvor det gjøres bruk av forbindelser som er dikarboksylsyreanhydrider fremstillet ved Diels-Alder-reaksjon av maieinsyreanhydrid og et dien. Forbindelser beskrevet i dette patentet som har den her angitte stabilitet, kan være egnet for foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke begenset til de eksemplifiserte modifiseringsforbindelser eller til modifiseringen av proteinet ved kjemisk modifikasjon av lysinrester. En hvilken som helst av de forbindelsene som er beskrevet i litteraturen og som reagerer med proteinene under forårsakelse av reversibelt tap av hele, eller nesten hele, enzymaktiviteten, hvor modifiseringen er reversibel ved inkubering ved høyere temperatur i amplifikasjonsreaksjonsbufferen, er egnet for fremstilling av et reversibelt inaktivert enzym. Etter hvert som nye forbindelser som reversibelt modifiserer proteiner blir tilgjengelige, vil disse også være egnet for bruk i henhold til foreliggende fremgangsmåter. Forbindelser for fremstilling av de modifiserte termostabile enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer forbindelser som tilfredsstiller følgende krav: (1) reaksjon med et termostabilt enzym som katalyserer primerekstensjon, resulterer i en vesentlig inaktivering av enzymet; (2) inkubering av det resulterende modifiserte enzym i en vandig buffer på ca. pH 8-9 ved en temperatur ved, eller lavere, enn ca. romtemperatur (25°C) resulterer i ingen nevneverdig økning i enzymaktivitet i mindre enn ca. 20 minutter; og (3) inkubering av det resulterende modifiserte termostabile enzym i en amplifiseringsreaksjonsbuffer, innstillet på ca. pH 8-9 ved romtemperatur, ved en høyere temperatur enn ca. 50°C, resulterer i minst en to gangers økning i enzymaktivitet i mindre enn ca. 20 minutter.

I hvilken grad en bestemt modifiseringsforbindelse er egnet, kan bestemmes empirisk ved å følge den rutine som her er angitt. Eksperimentelle prosedyrer for måling av ovennevnte egenskaper, graden av svekkelse av enzymaktivitet som resultat av modifisering av proteinet, og graden av gjenvinning av enzymaktivitet etter inkubering ved høyere temperaturer i en ampltfiseringsreaksjonsblanding, er beskrevet i eksemplene.

Fremstilling av de reversibelt inaktiverte termostabile enzymene

Den kjemiske modifikasjon av lysinrester i proteiner er basert på den evne som e-aminogruppen i denne rest har til å reagere som en nukleofil. Den uprotonerte aminogruppe som favoriseres av alkalisk pH, er den reaktive form. Modifikasjonsreaksjonen utføres ved pH 8,0 til 9,0 i en vandig buffer ved en temperatur ved, eller lavere, enn romtemperatur (25°C). Reaksjonen er i det vesentlige fullført etter en inkubering i 12-24 timer. Passende reaksjonsbetingelser erkjent på området og er ytterligere beskrevet i eksemplene.

Dikarboksylsyreanhydrider reagerer lett med vann til de tilsvarende syrer. En stor andel av reagenset hydrolyseres derfor under modifiseringen av protein-aminogruppene. Hydrolysegraden øker med pH. Den hydrolyseøkning som skjer ved høyere pH enn ca. 4, kan resultere i suboptimal acylering av proteinet.

Generelt benyttes det i acyleringsreaksjonen et molart overskudd av modifiseringsreagenset i forhold til proteinet. Det optimale molforhold mellom modifiseringsreagens og enzym avhenger av det anvendte reagens og bestemmes empirisk. Som et eksempel inaktiveres Taq DNA-polymerase tilnærmet fullstendig (<5% av opprinnelig aktivitet) ved en omsetning med et 20-gangers eller høyere molart overskudd av citrakonsyreanhydrid. Det minimale molforhold av modifiseringsreagens som resulterer i tilnærmet fullstendig inaktivering av enzymet, kan bestemmes ved å utføre inaktiveringsreaksjoner med en fortynningsrekke av modifiseringsreagens slik som beskrevet i eksemplene.

I fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er det ikke nødvendig at enzymet inaktiveres fullstendig, men bare at enzymet inaktiveres i vesentlig grad. Et enzym er i denne sammenheng vesentlig inaktivert dersom aktiviteten av enzymet etter reaksjon med modifiseringsreagenser, er mindre enn ca. 50% av den opprinnelige aktivitet. En reduksjon av uspesifikk amplifikasjon kan oppnås ved å benytte et betydelig inaktivert enzym. Det kan empirisk velges et molforhold mellom modifiseringsreagens og enzym i reaksjonsblandingen som vil resultere i praktisk talt fullstendig inaktivering eller betydelig inaktivering av enzymet, ved å følge de retningslinjer som her er gitt. Passende molare forhold er angitt i eksemplene. Passende reaksjonsbetingelser for inaktiveringen av enzymer som ikke er eksemplifisert, kan bestemmes gjennom rutinemessig eksperimentering ved å følge de retningslinjer som her er gitt.

En vesentlig side ved de varmeinaktiverte enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse, er deres lagringsstabilitet. De her beskrevne forbindelsene er generelt stabile over lengre tidsrom og eliminerer derved behovet for fremstilling umiddelbart før hver bruk. For eksempel ble citrakonylert Taq DNA-polymerase funnet å være fortsatt inaktivert i minst fire uker når den ble oppbevart ved 25°C. Anbefalte lagringsbetingelser varierer med hvilket modifiseringsreagens som benyttes, men generelt bør et preparat av inaktivert enzym oppbevares ved, eller lavere, enn romtemperatur (25°C), fortrinnsvis i kjøleskap. Særlig bør mer ustabile modifiserte enzymer, som f.eks. de som er modifisert med 2,3-dimetylmaleinsyreanhydrid oppbevares t kjøleskap.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse involverer bruk av en reaksjonsblanding som inneholder et reversibelt inaktivert termostabilt enzym, hvor reaksjonsblandingen utsettes for en inkubering ved høy temperatur før, eller som en integrert del av, amplifiseringsreaksjonen. Inkuberingen ved høy temperatur resulterer i deacylering av aminogruppene og gjenopprettelse av enzymaktivitet.

Deacyleringen av de modifiserte aminogruppene skyldes både temperaturøkningen og en samtidig senkning av pH. Amplifiseringsreaksjoner utføres i alminnelighet i en Tris-HCI-buffer innstillet på pH 8,0 til 9,0 ved romtemperatur. Ved romtemperatur favoriserer de alkaliske bufferbetingelsene den acylerte form av aminogruppen. Selv om pH i reaksjonsbufferen er innstillet på en pH på 8,0 til 9,0 ved romtemperatur, avtar pH av en Tris-HCI-reaksjonsbuffer med økende temperatur. Reaksjonsbufferens pH avtar således ved de høyere temperaturer som amplifiseringen foretas ved, og særlig, som den aktiverende inkubering utføres ved. Senkningen av reaksjonsbufferens pH favoriserer deacylering av aminogruppene.

Den pH endring som skjer som resultat av reaksjonsbetingelsene ved høy temperatur, avhenger av den anvendte buffer. Temperaturavhengigheten av pH for forskjellige buffere benyttet i biologiske reaksjoner, er beskrevet av Good et al., 1966, Biochemistry, 5(2):467-477. For Tris-buffere er endringen i pKa, dvs. pH for midtpunktet i bufferområdet, relatert til temperaturen på følgende måte: ApKa/°C=-0,031. For eksempel skjer det i en Tris-HCI-buffer som er satt sammen ved 25°C, et fall i pKa på 2,17 når den heves til 95°C for den aktiverende inkubering.

Selv om amplifikasjonsreaksjoner gjeme foretas i Tris-HCI-buffer, kan amplifikasjonsreaksjoner også foretas i buffere som oppviser en mindre eller større pH-endring med temperaturen. Avhengig av hvilken buffer som benyttes, kan et mer eller mindre stabilt modifisert enzym være ønskelig. For eksempel muliggjør bruk av et modifiseringsreagens som resulterer i et mindre stabilt modifisert enzym, gjenopprettelse av tilstrekkelig enzymaktivitet under små endringer av buffer-pH. En empirisk sammenligning av den relative stabilitet av enzymer som er modifisert ed ulike reagenser, som omtalt ovenfor, bidrar til valg av et modifisert enzym egnet for bruk i bestemte buffere.

I fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås aktivering av det modifiserte enzym gjennom en inkubering som utføres ved en temperatur som er lik eller høyere enn den primerhybridiseringstemperatur som benyttes for å sikre ampiifiseringsspesifisitet i am pl if ise rings reaksjonen. Den inkuberingstid som fordres for å gjenopprette enzymaktivitet avhenger av temperaturen og av reaksjonsblandingens pH, samt av stabiliteten av de acylerte aminogrupper i enzymet, som igjen avhenger av modifiseringsreagenset benyttet ved fremstillingen av det modifiserte enzym. Et stort utvalg inkuberingsbetingelser kan benyttes, hvorunder de optimale betingelsene bestemmes empirisk for hver reaksjon. I alminnelighet foretas en inkubering i amplifikasjonsreaksjonsbufferen ved høyere temperatur enn ca. 50°C i et tidsrom på mellom ca. 10 sekunder og ca. 20 minutter. Optimalisering av inkuberingsbetingelser for ikke eksemplifisert reaktivering av enzymer eller for ikke eksemplifiserte reaksjonsblandinger, kan bestemmes ved rutinemessig eksperimentering ved å følge de her gitte retningslinjer.

I henhold til en foretrukket utførelsesform foretas en PCR-amplifikasjon ved å benytte en reversibelt inaktivert termostabil DNA-polymerase. Hybridiseringstemperaturen benyttet ved en PCR-amplifikasjon er i alminnelighet ca. 55-75°C, og pre-reaksjonsinkuberingen foretas ved en temperatur som er lik eller høyere enn hybridiseringstemperaturen, fortrinnsvis en temperatur høyere enn ca. 90°C. Amplifikasjonsreaksjonsblandingen inkuberes fortrinnsvis ved ca. 90-100°C i opptil 12 minutter for å reaktivere DNA-polymerase før temperaturcykliseringen. Egnede pre-reaksjonsinkuberingsbetingelser for typiske PCR-amplifikasjoner er beskrevet i eksemplene sammen med den effekt som variasjon av pre-reaksjons-inkuberingsbetingelsene har på amplifikasjonene.

Det første trinn i en typisk PCR-amplifikasjon består i varmedenaturering av den dobbeltkjedede mål-nukleinsyre. De eksakte betingelsene som fordres for denaturering av prøvens nukleinsyre avhenger av lengden og sammensetningen av denne nukleinsyre. En inkubering ved 90-100°C i ca. 10 sekunder opptil 4 minutter, bevirker i alminnelighet full denaturering av prøvens nukleinsyre. Det initiale denatureringstrinn kan tjene som pre-reaksjonsinkubering for å reaktivere DNA-polymerasen. Avhengig av lengde og temperatur av det initiale denatureringstrinn og av hvilket modifiseringsreagens som benyttes for å inaktivere DNA-polymerasen, kan imidlertid gjenopprettelsen av DNA-polymeraseaktiviteten være ufullstendig. Om maksimal gjenvinning av enzymaktiviteten ønskes, må pre-reaksjonsinkuberingen forlenges eller alternativt, antallet av amplifiseirngsrunder økes.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen velges det modifiserte enzym og de innledende denatureringsbetingelser slik at bare en del av den gjenopprettelige enzymaktivitet gjenopprettes under det initiale inkuberingstrinn. Påfølgende PCR-runder som hver involverer et denatureringstrinn ved høy temperatur, resulterer i ytterligere gjenopprettelse av enzymaktiviteten. Aktiveringen av enzymaktivitet forsinkes således over den initiale amplifikasjonsrunde. Denne "frigjøring over tid" av DNA-polymeraseaktivitet har vist seg å ytterligere nedsette uspesifikk amplifikasjon. Det er kjent at et overskudd av DNA-polymerase bidrar til uspesifikk amplifikasjon. I den foreliggende metode er den tilstedeværende mengde av DNA-polymeraseaktivitet lav under de initiale trinn av amplifiseringen når antallet av målsekvenser er lavt, og dette reduserer den mengde av uspesifikke ekstensjonsprodukter som dannes. Maksimal DNA-polymeraseaktivitet forekommer under de senere trinn av ampiifikasjonen når antallet av målsekvenser er høyt, og dette muliggjør høye amplifikasjonsutbytter. Om nødvendig kan antallet av amptifikasjonsrunder økes for å kompensere for den lavere grad av DNA-polymeraseaktivitet som er tilstede i de innledende runder. Effekten på ampiifikasjonen ved å variere antallet amplifikasjonsrunder er vist i eksemplene.

En fordel ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er at fremgangsmåtene ikke fordrer noen håndtering av reaksjonsblandingen etter den innledende behandling av reaksjonsblandingen. Fremgangsmåtene er således ideelle for bruk i automatiske amplifiseringssystemer og i in situ amplifikasjonsmetoder, hvor tilsetningen av reagenser etter det innledende denatureringstrinn eller bruken av voks-barrierer er uhensiktsmessig eller ikke lar seg praktisere.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig egnet for reduksjonen av uspesifikk amplifikasjon ved PCR. Oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til noe bestemt amplrfikasjonssystem. De reversibelt inaktiverte enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan benyttes i et hvilket som helst primer-basert amplifikasjonssystem som benytter termostabile enzymer og som for å oppnå amplifikasjonsspesifisitet, er avhengig av reaksjonstemperaturen. Foreliggende fremgangsmåter kan anvendes for isoterme amplifikasjonssystemer som benytter termostabile enzymer. For å gjenopprette enzymaktivitet fordres bare en forbigående inkubering ved en forhøyet temperatur. Etter at reaksjonsblandingen har vært inkubert ved en høy temperatur for å gjenvinne ensymaktiviteten, foretas reaksjonen ved en passende reaksjonstemperatur.

Andre amplifikasjonsmetoder i tillegg til PCR (US-patent 4.683.195; 4.683.202 og 4.965.188) inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende: Ligase Chain Reaction

(LCR, Wu & Waltace, 1989, Genomics 4:560-569 og Barany, 1991, Proe. Nati. Acad, Sei. USA 88:189-193); Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16); Gap-LCR (PCT Patentpublikasjon WO 90/01069); Repair Chain Reaction (Europeisk patentpublikasjon 439.182 A2), 3SR (Kwoh et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:1173-1177; Guatelii et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:1874-1878; PCT Patentpublikasjon WO 92/08800) og NASBA (US-patent 5.130.238). Denne oppfinnelse er ikke begrenset til noe bestemt amplifiseringssystem. Etter hvert som det utvikles systemer kan disse ha fordel av å benytte oppfinnelsen. En nylig oversikt over amplifikasjonssystemer ble publisert av Abramson & Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47.

Egnede metoder for prøvepreparering for hver amplifikasjonsreaksjon er beskrevet (se for eksempel Sambrook et al., supra, og de referanser som beskriver de ovennevnte amplifikasjonsmetoder). Enkle og hurtige metoder for prøve-preparering for PCR-amplifikasjon av målsekvenser, er beskrevet i Higuchi, 1989, i PCR Technology (Erlich, red. Stockton Press, New York) og i PCR Protocols, kapittel 18-20 (Innis et al., red. Academic Press, 1990). Fagmannen på området vil også være i stand til velge og empirisk optimalisere en egnet fremgangsmåte.

Metoder for påvisning av amplifiserte produkter er vidt beskrevet i litteraturen. Standardmetoder inkluderer analyse ved gelelektroforese eller ved hybridisering med oligonukleotidprober. Påvisningen av hybrider dannet mellom prober og amplifiserte nukleinsyrer kan foretas i en rekke former, inklusivt dot-blot bestemmelsen og den reverse dot-blot bestemmelse. (Se Saiki et al., 1986, Nature 324:163-166; Saiki et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 86:6230; PCT Patentpublikasjon WO 89/11548; US-patent 5.008.182 og 5.176.775; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (red. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA):337-347. Reverse dot-blot-metoder hvor det benyttes mikrobrønnplater er beskrevet i samtidig verserende USSN 141.355 (tilsvarende EP-A-420260); US-patent 5.232.829; Loeffelholz et al., 1992, J. Ctin. Microbiol. 30(11):2847-2851; Mulder et al., 1994; J. Ctin. Microbiol. 32{2):292-300; og Jackson et al, 1991, AIDS 5:1463-1467.

En annen egnet bestemmelsesmetode omtalt som en 5'-nuklease-bestemmelse, er beskrevet i US-patent 5.210.015 og av Holland et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:7276-7280. Ved 5'-nukleasebestemmelsen nedbrytes merkede prober samtidig med primerekstensjon ved 5'- til 3'-eksonukleaseaktiviten av DNA-polymerasen, f.eks. Taq DNA-polymerase. Påvisning av nedbrytnings-produkter fra proben indikerer både at hybridisering mellom probe og mål-DNA har inntrådt og at amplifikasjonsreaksjonen har inntrådt. US-patent 5.491.063 (som tilsvarer EP-A-699.768) og EP-A-713.921, beskriver forbedrede metoder for påvisning av den probenedbrytning som inntrer samtidig med ampiifikasjonen.

En alternativ metode for å påvise nukleinsyreamplifikasjonen ved å følge økningen i den totale mengde dobbeltkjedet DNA i reaksjonsblandingen, er - beskrevet av Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11:1026-1030; og europeisk patentpublikasjon 487.218 og 512.334. Påvisningen av dobbeltkjedet mål-DNA bygger på den tiltagende fluorescens som etidiumbromid (EtBr) og andre DNA-bindende innmerkinger oppviser når de bindes til dobbelkjedet DNA. Økningen av dobbeltkjedet DNA som resulterer fra syntesen av målsekvenser, fører til en påvisbar fluorescensøkning. Et problem med denne metode er at syntesen av utilsiktet sekvens, dvs. uspesifikk amplifikasjon, resulterer i en fluorescensøkning som forstyrrer målingen av den fluorescensøkning som skyldes syntesen av målsekvenser. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor særlig anvendelig siden den reduserer uspesifikk amplifikasjon og derved minimaliserer den fluorescensøkning som er resultat av ampiifikasjonen av utilsiktede sekvenser.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også reagenssett, for eksempel flerbeholder-enheter som omfatter komponenter som kan anvendes for praktisering av foreliggende metode. Et egnet sett inneholder et reversibelt inaktivert termostabilt enzym og ett eller flere reagenser for å foreta en amplifikasjonsreaksjon, så som oligonukleotid-primere, substrat-nukleosid-trifosfater, kofaktorer og en passende buffer.

De nedenfor beskrevne eksempler på foreliggende oppfinnelse er angitt for illustrasjonsformål.

Eksempel 1

Polymeraseaktivitetsbestemmelse

Alle målinger av DNA-polymeraseaktivitet beskrevet nedenfor i eksemplene, ble foretatt ved å benytte følgende DNA-polymeraseaktivitetsbestemmelse. Bestemmelsen er i det vesentlige som beskrevet av Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:6427-6437 og i AmpliTaq® DNA-porymeraseproduktinnskuddet (Perkin Eimer, Norwalk, CT.

En enzymaktivitetsenhet er definert som den mengde som vil inkorporere

10 nmol dNTP i syre-uløselig materiale per 30 minutter ved en 10 minutters inkubering ved 74°C. På grunn av de modifiserte enzymers labilitet ble aktivitetene målt ved 50°C og normalisert til en standard Taq DNA-polymeraseløsning som også var bestemt ved 74°C. Reaksjoner ble foretatt i 50 uL volum inneholdende følgende reagenser: 25 mM TAPS (Tris-(hydroksymetyl)-metylamino-propansulfonsyre-natriumsalt), pH 9,3 (ved romtemperatur); 50 mM KCI; 2 mM MgCI2;

1 mM p-merkaptoetanol,

200 uM hver av dATP, dGTP og dTTP;

100 uM [a-<32>P]-dCTP (0,05-0,1 Ci/nmol);

aktivert DNA fra laksesperma.

Eksempel 2

Citrakonylering av Taq DNA-polymerase

Dette eksempel beskriver modifiseringen av Taq DNA-polymerase ved å benytte citrakonsyreanhydrid. Målinger av aktiviteten av den citrakonylerte Taq DNA-polymerase som indikerer det molforhold mellom modifiseringsreagens og enzym som fordres i inaktiveringsreaksjonen for å oppnå fullstendig inaktivering av DNA-polymeraseaktiviteten, er beskrevet nedenfor i Eksempel 3.

Taq DNA-polymerase (AmpliTaq®, Perkin Eimer, Norwalk, CT) ble benyttet i en initial konsentrasjon på 1,3 mg/mL. I de innledende forsøk ble Taq DNA-polymerasen først dialysert mot et 1000-gangers volumoverskudd av 0,1 M natriumborat ved pH 8,63. Dette trinn viste seg å ikke være avgjørende, og i senere forsøk ble Taq DNA-polymerase benyttet i en Tris-buffer (50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 65 mM KCI, pH 7,5) direkte uten dialyse mot natriumborat.

Citrakonsyreanhydrid (11,06M) er kommersielt tilgjengelig (Aldrich, Milwaukee, Wl). En startløsning av citrakonsyreanhyrid ble fremstillet ved å fortynne 11,06M citrakonsyreanhydrid 100 ganger i DMF (N.N-dimetylfonmamid).

For ett sett av modifikasjonsreaksjoner ble en fortynningsrekke av løsningen av citrakonsyreanhydrid opprettet ved gjentatte dobbelte fortynninger i DMF. For hver

løsning i rekken, ble 4 uL fortynnet citrakonsyreanhydridløsning tilsatt til 400 u.L

Taq DNA-polymeraseløsning (med natriumborat-dialyse), hvilket resulterte i løsninger som inneholdt molare forhold mellom citrakonsyreanhydrid og Taq DNA-polymerase på ca. 80/1,40/1,20/1 og 10/1. Løsningene ble inkubert over natten ved 4°C for å inaktivere Taq DNA-polymerasen. I denne sammenheng omtales et enzym som er modifisert i en reaksjon med et N-gangers molart overskudd av modifiseringsreagens, som et NX-enzym. De resulterende citrakonylerte Taq DNA-polymerasene omtales således her som 80X, 40X, 20X og 10X Taq DNA-polymeraser.

Ytterligere modifikasjonsreaksjoner ble foretatt ved å benytte ca. 80X, 160X og 240X molforhold mellom citrakonsyreanhydrid og Taq DNA-polymerase (uten natriumborat-dialyse). Forholdene 160X og 240X ble frembragt ved passende justering av 11,06M citrakonsyreanhydridet i DMF (N,N-dimetylformamid). For et endelig 160X-forhold ble for eksempel 11.06M citrakonsyreanhydrid fortynnet 1/50 i DMF og 4 uL av den resulterende citrakonsyreanhydrid-utgangstøsning tilsatt til 400 uL Taq DNA-polymeraseløsning. De resulterende citrakonylerte Taq DNA-polymerasene omtales her som 240X, 160X og 80X Taq DNA-polymeraser.

Eksempel 3

Inaktivering og gjenopprettelse av DNA-polymeraseaktivitet

ved varmebehandling under bruk av citrakonsyreanhydrid

Dette eksempel beskriver aktivitetsmålinger av de citrakonylerte Taq DNA-polymeraser fra Eksempel 2, både før og etter reaktivering av citrakonylert Taq DNA-polymerase ved varmeinkubering. Effekten av pH på graden av gjenopprettet aktivitet etter varmereaktivering av de citrakonylerte Taq DNA-polymerasene ble målt.

Prøver av citrakonylert Taq DNA-polymerase ble fortynnet 1/200 i en buffer bestående av 10 mM Tris-HCI, 100 mM KCI, 2 mM MgCI2,0,5% Tween20, 0,5% NP-40,16% glycerol. Bufferen hadde pH 8,25 ved romtemperatur. Fortynnede prøver av citrakonylert Taq DNA-polymerase ble enten inkubert ved 90°C i 20 minutter eller holdt ved romtemperatur som kontroll. Etter behandlingen ble prøven fortynnet 1/5 i enzymfortynningsbuffer (25 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1 mM p-merkaptoetanol, 0,5% Tween™ 20, 0,5% NP-40,0,1% gelatin) og aktiviteten bestemt som beskrevet i Eksempel 1. DNA-polymeraseaktiviteter etter behandling er vist nedenfor. Molforholdet refererer seg til det molforhold mellom citrakonsyreanhydrid og Taq DNA-polymerase som ble benyttet i modifikasjonsreaksjonen. Hver enkelt aktivitetsverdi utgjør gjennomsnittet av to aktivitetsverdier målt i parallellprøver.

Fullstendig inaktivering av Taq DNA-polymerase ble oppnådd ved å benytte mer enn 20 gangers molart overskudd av citrakonsyreanhydrid. Etter inkubering av den fullstendig inaktiverte Taq DNA-polymerase ved 90°C i 20 minutter, ble minst 16% av aktiviteten gjenvunnet.

Selv om mer av enzymaktiviteten ble gjenvunnet ved å benytte 40X citrakonylert Taq DNA-polymerase enn ved å benytte 80X citrakonylert Taq DNA-polymerase, kan det være mer praktisk å benytte den 80X (eller høyere) citrakonylerte Taq DNA-polymerase i et kommersielt sett for å oppnå større toleranse ved fremstillingen.

Lignende forsøk ble foretatt ved å benytte en buffer justert til pH 7,75 ved romtemperatur. Resultatene er vist nedenfor.

Graden av gjenvunnet DNA-polymeraseaktivitet var høyere ved lavere pH.

Aktivitetene av 80X og 160X Taq DNA-polymerasene (uten natriumborat-dialyse) ble målt før og etter reaktivering ved varmeinkubering, i det vesentlige som beskrevet ovenfor. pH av bufferen benyttet for inkuberingene var 8,0 ved romtemperatur. Resultatene er vist nedenfor. Hver aktivitetsverdi utgjør gjennomsnittet av to aktivitetsverdier målt i parallellprøver.

Effekten av pH på reaktivering fremgår dessuten ved å sammenligne aktivitetsgjenvinningen under bruk av 80X Taq DNA-polymeraser fra de tre reaktiveringene ved ulik pH. Dataene ovenfor tyder på at enzymaktivitet gjenvinnes selv når det benyttes et høyt molart overskudd av modifiseringsreagens i modifiseringsreaksjonen.

Eksempel 4

PCR-amplifikasjon ved å benytte citrakonylerte Taq DNA-polymeraser Dette eksempel beskriver anvendelsen av den termostabile citrakonylerte Taq DNA-polymerase beskrevet i Eksempel 2, i PCR-amplifikasjoner.

PCR-metodikk

Amplifikasjoner ble foretatt ved å benytte 1/20,1/40 og 1/80 fortynninger av den 240X modifiserte Taq DNA-polymerase som er beskrevet i Eksempel 2. Fortynninger ble foretatt med en buffer bestående av 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 (ved romtemperatur), 100 mM KCI, 0,1 mM EDTA (etylendiamintetraeddiksyre), 1 mM DTT (ditiotreitol), 50% glycerol, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P40 (AmptiTaq® lagringsbuffer, Perkin Eimer, Norwalk, CT). Til sammenligning ble også amplifikasjoner foretatt ved å benytte 1/10,1/20,1/40 og 1/80 fortynninger av umodifisert Taq DNA-polymerase.

En klonet genomisk HTLV-l-sekvens ble amplifisert ved å benytte primerne SK432 og SK111. Primersekvensene er angitt i US-patent 5.418.149. PCR ble foretatt i et 100 u.L reaksjonsvolum under følgende reaksjonsbetingelser.

Reaksjonsblanding:

30 kopier av HTLV-I-DNA templat

10 mM Tris, pH 8,3

50 mM KCI

0,5 u.M av hver primer

200 uM dATP, dCTP og dGTP

400 u.M dUTP

0,5 uL citrakonylert Taq DNA-polymeraseløsning

2,5 mM MgCfe

1 ng hpDNA

1 enhet UNG (Perkin Eimer, Norwalk, CT)

Varmesirkuleringsprofil:

De amplifiserte produktene ble analysert ved elektroforese på 4% agarosegel ved å benytte en 1X TBE (0,089MTris, 0.089M borsyre, 0.0025M dinatrium-EDTA) vandringsbuffer. Elektroforesen ble foretatt ved 100 volt i ca. 2 timer. Etidiumbromid (0,5 ug/mL) ble tilsatt etter elektroforese for å farve eventuelt forekommende DNA. Gelen ble avfarvet i 1X TBE og de etidiumbromid-farvede bånd av DNA ble synliggjort ved å benytte UV-bestråling.

Resultater

Resultatene er presentert i Figur 2. Det bånd som tilsvarer den amplifiserte målsekvens er angitt. Andre bånd på gelen enn det som tilsvarer den amplifiserte målsekvens svarer til produkter dannet gjennom den uspesifikke amplifikasjon av utilsiktede sekvenser. Amplifiseringseffekten under bruk av den citrakonylerte Taq DNA-polymerase (merket Taq, HS) sees ved å sammenligne det bånd-dannende mønster og intensiteten innenfor hver av banene. Siden amplifiseringen av uspesifikke produkter konkurrerer med amplifiseringen av målsekvensen, indikerer en økning i amplifikasjon av målsekvensen graden av reduksjon av uspesifikk amplifikasjon. En endring i den relative mengde produkter innen hver bane gir således den beste indikasjon på effekten av pre-reaksjonsbehandlinger på uspesifikk amplifikasjon.

Amplifikasjoner ved å benytte umodifisert Taq DNA-polymerase resulterte hovedsakelig i uspesifikke amplifikasjonsprodukter. Bruken av citrakonylert Taq DNA-polymerase resulterte i en vesentlig økning av intensiteten av det bånd som tilsvarer den amplifiserte målsekvens, og en vesentlig svekking av intensiteten av de bånd som tilsvarer uspesifikke amplifikasjonsprodukter. Dataene tyder på at PCR-amplifikasjon ved å benytte en reversibelt inaktivert DNA-polymerase i vesentlig grad reduserer uspesifikk amplifikasjon og i vesentlig grad øker mengden av ønsket amplifisert målsekvens.

Eksempel 5

Andre citrakonylerte termostabile DNA-polymeraser

Dette eksempel beskriver citrakonyleringen av flere andre termostabile DNA-polymeraser i tillegg til den ovenfor beskrevne Taq DNA-polymerase. De følgende termostabile DNA-polymeraser ble modifisert: (1) En termostabil DNA-polymerase fra Thermus thermophilus (rTth, Perkin

Eimer, Norwalk, CT> som beskrevet i WO 91/09950.

(2) En termostabil DNA-polymerasemutant fra Thermatoga maritima

(UlTma™, Perkin Eimer, Norwalk, CT) som beskrevet i WO 92/03556.

(3) En mutant form av termostabil DNA-polymerase fra Thermus aquaticus

som mangler 3* til 5' eksonuklease, aktivert som beskrevet i WO 92/06200. Dette enzym omtales her som Taq CS eller AmpliTaq® CS.

Av hver av ovennevnte tre DNA-polymeraser ble det først laget en løsning med en konsentrasjon på ca. 200 enheter/uL. Til sammenligning er 1,3 mg/mL Taq DNA-polymerase, som benyttet i de foregående eksempler, tilnærmet lik 260 enheter/uL. Hver av DNA-polymerasene ble modifisert i det vesentlige som beskrevet ovenfor i Eksempel 2.10 ul citrakonsyreanhydrid ble fortynnet i 500 jiL DMF. Deretter ble 10 uL fortynnet citrakonsyreanhydrid kombinert med 1000 u.L av hver av enzymløsningene. De resulterende løsninger ble inkubert ved 4°C over natten.

Eksempel 6

PCR-amplifikasjon ved å benytte citrakonylerte DNA-polymeraser Dette eksempel beskriver anvendelsen av de citrakonylerte termostabile Taq DNA-polymerasene beskrevet i Eksempel 2 og 5, ved PCR-amplifikasjoner.

PCR-metodikk

Amplifikasjoner ble foretatt ved å benytte fortynninger av modifiserte DNA-polymeraser. Fortynninger ble foretatt med en buffer bestående av 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 (ved romtemperatur), 100 mM KCI, 0,1 mM EDTA (etylendiamintetraeddiksyre), 1 mM DTT (ditiotreitol), 50% glycerol, 0,5% Tween™ 20,0,5% Nonidet P40 (AmpliTaq® lagringsbuffer, Perkin Eimer, Norwalk, CT).

En genomisk HIV-1-sekvens ble amplifisert ved å benytte primerne SK145 og SK431 (Perkin Eimer, Norwalk, CT). Primerne SK145 og SK 431 er beskrevet i US-patent 5.481.149 og i følgende vitenskapelige publikasjoner: SK 145 er beskrevet i Kwok et al., 1990, Nucleic Acids res. 18:999-1005; SK431 er beskrevet i Jackson et al., 1991, AIDS, 5:1463-1467. PCR ble foretatt i et 100 uL reaksjonsvolum under følgende reaksjonsbetingelser.

Reaksjonsblanding:

100 kopier av HIV-1 DNA templat

10 mM Tris, pH 8,3

50 mM KCI

0,5 u.M av hver primer

200 uM dATP, dCTP og dGTP

400 uM dUTP

0,5 M-L DNA-polymeraseløsning

2,5 mM MgCI2

1 |ig hpDNA

1 enhet UNG (Perkin Eimer, Norwalk, CT)

Varmesirkuleringsprofil:

Inkuberingstrinnet for pre-reaksjonen tjener også som det innledende denatureringstrinn. Et innledende denatureringstrinn benyttes rutinemessig i en typisk amplifikasjonsreaksjon for å sikre fullstendig denaturering av det dobbeltkjedede mål. Hver PCR-runde begynner med et denatureringstrinn ved 94°C i 1 minutt. Umiddelbart deretter følger den innledende pre-reaksjonsinkubering som foretas ved 95°C i 12 minutter, hvoretter reaksjonsblandingen inkuberes ved 94°C i 1 minutt under denatureringstrinnet i den første runden.

De amplifiserte produktene ble analysert ved elektroforese på agarosegel (100 ml_ 3% NuSieve® og 0,5% SeaChem®) ved å benytte en 1X TBE (0,089MTris, 0.089M borsyre, 0.0025M dinatrium-EDTA) vandringsbuffer. Elektroforesen ble foretatt ved 100 volt i ca. 1 time. Etidiumbromid (0,5 (ig/mL) ble tilsatt etter elektroforese for å farve eventuelt forekommende DNA. Gelen ble avfarvet i TBE, og de etidiumbromid-farvede bånd av DNA ble synliggjort ved å benytte UV-bestråling.

Amplifikasjoner ved bruk av citrakonylerte DNA-polymeraser

Fortynninger (1/10,1/20,1/40 og 1/80) av de citrakonylerte DNA-polymerasene beskrevet i Eksempel 5 og den 240X citrakonylerte Taq DNA-polymerase beskrevet i Eksempel 2, ble benyttet for amplifikasjoner av HIV-1 nukleinsyre, og de amplifiserte produktene ble analysert ved agarosegelelektroforese. Til sammenligning ble amplifikasjoner foretatt ved å benytte fortynninger av umodifisert Taq DNA-polymerase.

Resultatene er angitt i Figur 3. Det bånd som tilsvarer den amplifiserte målsekvens er antydet. Bånd som forekommer på gelen utenom det bånd som tilsvarer den amplifiserte målsekvens, tilsvarer de produktene som er frembragt gjennom den uspesifikke amplifikasjon av utilsiktede sekvenser. Effekten av amplifikasjon ved bruk av en citrakonylert DNA-polymerase kan sees ved å sammenligne det bånd-dannende mønster og intensiteten innen de enkelte baner. Siden ampiifikasjonen av uspesifikke produkter konkurrerer med ampiifikasjonen av målsekvensen indikerer dessuten en øket amplifikasjon av målsekvensen graden av reduksjonen av uspesifikk amplifikasjon. En endring i den relative mengde av produkter innen hver bane indikerer følgelig best effekten av en pre-reaksjonsbehandling på uspesifikk amplifikasjon.

Amplifikasjoner under bruk av umodifisert Taq DNA-polymerase resulterte hovedsakelig i uspesifikt amplifikasjonsprodukt for enzymfortynningsnivåer. Bruken av citrakonylert Taq DNA-polymerase resulterte i et intenst bånd som tilsvarte den amplifiserte målsekvens for alle fortynningene utenom 1/80-fortynningen og en betydelig svekkelse av intensiteten av det bånd som tilsvarte de uspesifikke amplifikasjonsproduktene. Dataene tyder på at PCR-amplifikasjon ved bruk av en reversibelt inaktivert DNA-polymerase, klart reduserer uspesifikk amplifikasjon og klart øker av mengden av ønsket amplifisert målsekvens.

Anvendelsen av citrakonylert UlTma-, Taq CS- og rTth-DNA-polymeraser førte også til en større produksjon av spesifikt amplifikasjonsprodukt enn den som sees ved amplifikasjoner under bruk av umodifisert Taq DNA-polymerase, samtidig som det ble oppnådd en reduksjon i mengden av uspesifikke amplifikasjons-produkter. Resultatene demonstrerer at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er generelt anvendelig for termostabile DNA-polymeraser.

Det skal bemerkes at selv om resultatene viser foreliggende oppfinnelses anvendelighet, er de oppnådde resultater ved bruk av citrakonylert Taq-, UlTma-, Taq CS- og rTth DNA-polymeraser ikke direkte sammenlignbare fordi modifikasjonsbetingelsene ikke var optimalisert på en sammenlignbar måte for hver DNA-polymerase. Selv om hver utgangsløsning av DNA-polymerase inneholdt samme enheter/mL, ble molariteten av løsningen ikke bestemt, og det molare overskudd av citrakonsyreanhydrid for hver modifikasjonsreaksjon derfor ikke bestemt. For fagmannen vil det være klart at optimale modifikasjonsbetingelser kan bestemmes empirisk ved å benytte de her beskrevne retningslinjer.

Eksempel 7

Cis-akonitylert DNA-polymerase

Dette eksempel beskriver modifiseringen av Taq DNA-polymerase ved bruk av cis-akonitsyreanhydrid.

Modifisering ved bruk av cis-akonitsyreanhydrid ble foretatt i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 2, hvor forskjellen hovedsakelig skyldtes at cis-akonitsyreanhydrid selges som et pulver og ikke som en væske. Taq DNA-polymerase (AmpliTaq®, Perkin, Eimer, Norwalk, CT) i en Tris-buffer (50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 68 mM HCI, pH 7,5) ble benyttet i en utgangskonsentrasjon på 1,3 mg/mL. En utgangsløsning av cis-akonitsyreanhydrid (Aldrich, Milwaukee, Wl) ble frembragt ved å løse 20 mg cis-akonitsyreanhydrid i 1 ml_ 100% EtOH.

En løsning av 10 eller av 20 ul cis-akonitsyreanhydrid ble tilsatt til 1000 uL Taq DNA-polymeraseløsning, hvilket resulterte i løsninger som inneholdt molare forhold mellom cis-akonitsyreanhydrid og Taq DNA-polymerase på ca. 90/1 og 180/1. Løsningene ble inkubert over natten ved 4°C for å inaktivere Taq DNA-polymerasen.

Sammenligninger av amplifikasjoner ved bruk av den cis-akonitylerte

Taq DNA-polymerase og amplifikasjoner ved bruk av citrakonylert Taq DNA-polymeraser er beskrevet nedenfor.

Eksempel 8

Inaktivering og varmegjenopprettelse av DNA-polymeraseaktivitet

ved bruk av cis-akonitsyreanhydrid

Aktivitetene av de 90X og 180X cis-akonitylerte Taq DNA-polymerasene fremstillet i Eksempel 7, ble målt i det vesentlige som beskrevet ovenfor i Eksempel 3, før og etter reaktivering ved varmeinkubering. Bufferens pH under inkuberingene var 8,0. Resultatene er vist nedenfor. Hver aktivitetsverdi er gjennomsnittet av to aktivitetsmålinger av parallelle prøver.

En sammenligning av disse resultatene med de fra Eksempel 3 tyder på at cis-akonitylering lettere reverseres enn citrakonylering. Det fordres et høyere molart overskudd av cis-akonitsyreanhydrid for fullstendig å inaktivere DNA-polymerasen, og større grad av aktivitet gjenopprettes etter en inkubering ved høy temperatur. Årsaken tii aktivitetsmålingen på mer enn 100% etter modifisering med et 90 gangers molart overskudd av cis-akonitsyreanhydrid og påfølgende varme-reaktivering er ukjent, men kan være forårsaket av unøyaktighet i aktivitets-bestemmelsen eller gjenspeile en faktisk modifiksjon av DNA-polymerasen.

Eksempel 9

Effekt av pre-reaksjonsinkuberingstid

Dette eksempel beskriver effekten av pre-reaksjonsinkuberingstiden på mengden av oppnådd produkt.

Amplifikasjonene ble foretatt ved å benytte de citrakonylerte og cis-akonitylerte Taq DNA-polymeraser fremstillet som beskrevet ovenfor. For hvert sett av amplifikasjonsbetingelser ble det benyttet Taq DNA-polymeraser modifisert ved å benytte et 80-gangers og et 160-gangers molart overskudd av citrakonsyreanhydrid og et 90-gangers og 180-gangers molart overskudd av cis-akonitsyreanhydrid. Amplifikasjonene ble foretatt ved å benytte HIV-1 modellsystemet beskrevet ovenfor i Eksempel 6, bortsett fra at den innledende pre-reaksjonsinkubering ble variert. For hvert enzympreparat ble amplifikasjonene foretatt ved å benytte pre-reaksjons-inkuberinger i 12,6, 3 og 0 minutter.

Som nevnt ovenfor tjener pre-reaksjonsinkuberingstrinnet også som det innledende denatureringstrinn. Hver PCR-runde begynner med et denatureringstrinn. Umiddelbart etter den innledende pre-reaksjonsinkubering ved 95°C i 12, 6, 3 eller 0 minutter, ble hver reaksjonsblanding inkubert ved 94°C i 1 minutt under denatureringstrinnet i den første runde. Selv når det ikke ble benyttet noen pre-reaksjonsinkubering, ble enzymaktiviteten således gjenopprettet under denatureringstrinnet i de innledende runder.

Amplifikasjonsproduktene ble analysert ved agarosegelelektroforese. Disse resultatene er vist i Figur 4. Det bånd som tilsvarer den amplifiserte målsekvens er antydet. Andre bånd som fremkommer på gelen enn det bånd som tilsvarer den amplifiserte målsekvens, tilsvarer de produkter som dannes av den uspesifikke amplifikasjon av utilsiktede sekvenser.

Resultatene viser at alle pre-reaksjonsinkuberingstider under bruk av cis-akonitylert DNA-polymerase, resulterte i et sterkt bånd som tilsvarte det amplifiserte produkt. Amplifikasjoner foretatt uten en pre-reaksjonsinkubering resulterte i nesten like meget produkt som de amplifikasjoner hvor det ble benyttet forlengede pre-reaksjonsinkube ringer.

I motsetning til dette viste resultatene ved bruk av citrakonylert DNA-polymerase at det trengtes en pre-reaksjonsinkubering på minst 3 minutter for å oppnå den maksimale mengde av amplifisert produkt. Amplifikasjoner foretatt uten en pre-reaksjonsinkubering resulterte i betydelig mindre amplifisert produkt. Resultatene tyder på at gjenopprettelse av aktiviteten av cis-akonitylerte DNA-polymeraser skjer hurtigere enn for citrakonylerte DNA-polymeraser.

Eksempel 10

Effekten av antall cykliseringer

Dette eksempel beskriver effekten av å øke antallet amplifiseringsrunder som kompensasjon for en kort pre-reaksjonsinkuberingstid.

Amplifikasjoner ble foretatt ved å benytte Taq DNA-polymerasene modifisert ved bruk av et 80-gangers og et 160-gangers molart overskudd av citrakonsyreanhydrid og et 90-gangers og 180-gangers molart overskudd av cis-akonitsyreanhydrid. Amplifikasjonene ble foretatt i det vesentlige som beskrevet ovenfor, under bruk av HIV-1 modellsystemet beskrevet i Eksempel 6, bortsett fra at den innledende pre-reaksjonsinkubering og antall runder ble variert. For hver enzymfremstilling ble amplifikasjoner foretatt ved å benytte følgende betingelser:

Amplifikasjonsproduktene ble analysert ved agarosegelelektroforese. Resultatene er vist i Figur 5. Av resultatene fremgår det at en økning av antall amplifikasjonsrunder kan kompensere for det tap av amplifikasjonseffektivitet som skriver seg fra ufullstendig reaktivering av DNA-polymeraseaktivitet når ingen pre-reaksjonsinkubering benyttes.

For hver DNA-polymerase resulterte økning av antallet amplifikasjons-runder i en økning av amplifisert produkt. Effekten var minst når cis-akonitylert Taq DNA-polymerase ble benyttet, noe som i Eksempel 9 viste seg å fordre liten, om i det hele tatt noen, pre-reaksjonsinkubering.

Claims (12)

1. Termostabilt enzym med DNA-polymeraseaktivitet eller ligaseaktivitet, hvor enzymaktiviteten er reversibelt inaktivert ved kjemisk modifikasjon, karakterisert ved at nevnte reversibelt inaktivert termostabilt enzym er fremstilt ved å omsette en termostabil enzymblanding med et modifiseringsreagens, hvor omsetningen foretas ved alkalisk pH ved en temperatur som er lavere enn ca. 25°C, og hvor nevnte reagens er et dikarboksylsyreanhydrid med den generell formel: hvor Ri og R2 er hydrogen eller organiske radikaler, som kan være sammenkoblet, eller med den generelle formel: hvor Ri og R2 er organiske radikaler, som fortrinnsvis er sammenkoblet, og hvor hydrogenet har cis-stilling, og hvor nevnte omsetning resulterer i tilnærmet fullstendig inaktivering av enzymaktiviteten.

2. Kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge krav 1, karakterisert v e d at inkubering av det kjemisk modifiserte termostabile enzym i en vandig buffer ved alkalisk pH, ved lavere temperatur enn ca. 25°C, resulterende i praktisk talt ingen enzymaktivitetsøkning i mindre enn ca. 20 minutter, og hvor en inkubering av det nevnte kjemisk modifiserte enzym i en vandig buffer, innstilt på omtrent pH 8-9 ved 25°C, ved høyere temperatur enn ca. 50°C, resulterer i minst en to gangers økning i enzymaktivitet i løpet av mindre enn ca. 20 minutter.

3. Kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge krav 1 eller 2, hvor den reversible inaktiverte enzymaktivitet er termostabil DNA-polymeraseaktivitet, og hvor nevnte enzym er reversibel inaktivert form av den termostabile DNA-polymerase oppnådd fra en art valgt fra gruppen av slekter Thermus aquaticus, Thermus thermophilus etler Thermotoga maritima.

4. Kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, som er fremstilt med et modifiseringsreagens valgt fra gruppen bestående av maieinsyreanhydrid; exo-cis-3,6-endokso-A<4->tetrahydro-ftalsyreanhydrid; citrakonsyreanhydrid; 3,4,5,6-tetrahydroftalsyreanhydrid; cis-akonitsyreanhydrid; og 2,3-dimetylmaleinsyreanhydrid.

5. Kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, som er fremstilt ved en reaksjon hvor nevnte modifiseringsreagens er i mer enn 20-gangers molart overskudd i forhold til nevnte termostabile enzym.

6. Kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, som er fremstilt ved en reaksjon mellom en blanding av et termostabilt enzym og et modifiseringsreagens, hvor nevnte termostabile enzym er en termostabil DNA-polymerase oppnådd fra Thermus aquaticus og hvor nevnte modifiseringsreagens er citrakonsyreanhydrid.

7. Kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, som er fremstilt ved en reaksjon mellom en blanding av et termostabilt enzym og et modifiseringsreagens, hvor nevnte termostabile enzym er en termostabil DNA-polymerase oppnådd fra Thermus thermophilus og hvor nevnte modifiseringsreagens er cis-akonitsyreanhydrid.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et kjemisk modifisert termostabilt enzym, hvor umodifisert enzym har DNA-polymeraseaktivitet eller ligaseaktivitet og hvor enzymaktiviteten er reversibel inaktivert ved nevnte kjemiske modifikasjon, hvor prosessen omfatter omsetning av en termostabil enzymblanding med et modifiseringsreagens, hvor nevnte omsetning foretas ved alkalisk pH ved en temperatur som er lavere enn ca. 25°C, og hvor nevnte reagens er et dikarboksylsyreanhydrid med den generelle formel: hvor Ri og R2 er hydrogen eller organiske radikaler, som kan være sammenkoblet, eller med den generelle formel: hvor Ri og R2 er organiske radikaler, som fortrinnsvis er sammenkoblet, og hvor hydrogenet har cis-stilling, og hvor nevnte omsetning resulterer i tilnærmet fullstendig inaktivering av enzymaktivitet.

9. Kjemisk modifisert inaktivert termostabilt enzym, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten i krav 8.

10. Fremgangsmåte for amplifikasjon av en mål-nukleinsyre som inngår i en prøve, og som omfatter trinnene: (a) kontakting av prøven med en amplifikasjonsreaksjonsblanding inneholdende en primer som er komplementær til den tilsiktede nukleinsyre og et kjemisk modifisert termostabilt enzym, ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller 9; og (b) inkubering av den resulterende blanding fra trinn (a) ved en temperatur som er høyere enn ca. 50°C i tilstrekkelig tid til å reaktivere det kjemisk modifiserte termostabile enzym og muliggjøre dannelse av primerekstensjonsprodukter.

11. Amplifikasjonsreaksjonsblanding for en PCR-reaksjon (polymerase-kjedereaksjon), som omfatter et primerpar; og et kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller 9.

12. Testsett for å foreta en PCR-polymerasekjedereaksjon som omfatter et kjemisk modifisert termostabilt enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller 9.