RU2215037C1 - Способ ферментативного синтеза днк - Google Patents
Способ ферментативного синтеза днк Download PDFInfo
- Publication number
- RU2215037C1 RU2215037C1 RU2002109576/13A RU2002109576A RU2215037C1 RU 2215037 C1 RU2215037 C1 RU 2215037C1 RU 2002109576/13 A RU2002109576/13 A RU 2002109576/13A RU 2002109576 A RU2002109576 A RU 2002109576A RU 2215037 C1 RU2215037 C1 RU 2215037C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- synthesis
- reaction
- magnesium
- pcr
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для синтеза, выявления и идентификации ДНК в биологических образцах. Предложен способ ферментативного синтеза ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, который осуществляется в присутствии насыщенного раствора малорастворимой соли магния - оксалата магния. Использование оксалата магния позволяет создать оптимальную для синтеза ДНК концентрацию ионов магния только при температурах выше 50-55oС, что подавляет инициацию синтеза неспецифических последовательностей ДНК. Данный способ обеспечивает высокую специфичность, доступен и прост в реализации. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для синтеза и детекции ДНК.
Известен способ получения ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он заключается в последовательном повторении стадий: 1) плавления двуцепочечной ДНК-матрицы, 2) комплементарного взаимодействия (гибридизации или отжига) с ДНК олигонуклеотидных праймеров и 3) удлинения праймеров с помощью ДНК-полимеразы. При проведении ПЦР праймеры гибридизуются с концевыми участками целевого фрагмента ДНК и направлены таким образом, что синтез цепей осуществляется полимеразой вдоль участка, ограниченного праймерами. В результате каждого цикла происходит удвоение целевого фрагмента ДНК. Накопление целевого фрагмента ДНК в процессе ПЦР происходит экспоненциально, так как отжиг праймеров осуществляется и на вновь синтезированых цепях.
(Патент США 4683202, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1987).
Недостатком этого способа получения ДНК является недостаточно высокая специфичность синтеза целевой последовательности ДНК. Под специфичностью понимается отношение количества целевой последовательности ДНК, синтезированной в процессе реакции, к общему количеству синтезированной ДНК.
Высокая специфичность синтеза целевой последовательности ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) обеспечивается проведением реакции при температурах свыше 50oС. Инициация (начало) синтеза неспецифических последовательностей ДНК, как правило, происходит при более низкой температуре. Известно, что способы повышения специфичности ПЦР заключаются в инициации синтеза ДНК при температуре свыше 50oС. Обычно для этого используют введение отдельных компонентов реакционной смеси, необходимых для осуществления реакции (обычно это ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты или соль магния), в уже нагретую смесь или используют препараты обратимо инактивированных ДНК-полимераз, для активации которых требуется высокая (свыше 50oС) температура.
Известен способ получения ДНК путем проведения ПЦР с использованием парафиновых шариков, внутрь которых помещают ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты или соль магния. Введение в реакционную смесь реагентов, находящихся в парафиновом шарике, и инициация реакции происходит только после плавления парафина при температуре свыше 50oС, что повышает специфичность реакции (Патент США 5411876, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1995).
Недостатками этого способа проведения ПЦР являются:
1) сложность производства подобных парафиновых шариков, что почти вдвое увеличивает стоимость проведения ПЦР с их использованием;
2) использование данного способа ограничивает возможность произвольного изменения объема реакционной смеси, так как количество реагентов в парафиновом шарике соответствует определенному объему реакционной смеси.
1) сложность производства подобных парафиновых шариков, что почти вдвое увеличивает стоимость проведения ПЦР с их использованием;
2) использование данного способа ограничивает возможность произвольного изменения объема реакционной смеси, так как количество реагентов в парафиновом шарике соответствует определенному объему реакционной смеси.
Известен способ получения ДНК путем проведения ПЦР с использованием препарата термостабильной ДНК-полимеразы, чья ферментативная активность обратимо инактивирована с помощью моноклональных антител к используемой ДНК-полимеразе. В этом случае активация ферментативной активности ДНК-полимеразы и инициация реакции ферментативного синтеза ДНК происходит только после прогревания реакционной смеси при температуре свыше 70oС в течение нескольких (от 2 до 20) минут, что значительно увеличивает специфичность реакции.
(Патент США 5338671, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1994).
Недостатками этого способа проведения ПЦР являются:
1) при использовании моноклональных антител для обратимой инактивации ДНК-полимеразы существует опасность загрязнения препарата эукариотической ДНК,
2) высокая стоимость производства моноклональных антител.
1) при использовании моноклональных антител для обратимой инактивации ДНК-полимеразы существует опасность загрязнения препарата эукариотической ДНК,
2) высокая стоимость производства моноклональных антител.
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения ДНК путем проведения ПЦР в присутствии хлорида магния с использованием препарата термостабильной ДНК-полимеразы, чья ферментативная активность обратимо инактивирована с помощью химической модификации (изменения) белка. В этом случае инициация реакции ферментативного синтеза ДНК происходит только после прогревания реакционной смеси при температуре свыше 70oС в течение нескольких (от 2 до 20) минут, что значительно увеличивает специфичность реакции.
(Патент США 5677152, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1997).
Недостатками этого способа проведения ПЦР являются:
1) высокая стоимость производства обратимо инактивированной ДНК-полимеразы, что примерно в полтора раза увеличивает стоимость проведения реакции,
2) при проведении химической модификации белка не менее 20% ДНК-полимеразы инактивируется необратимо.
1) высокая стоимость производства обратимо инактивированной ДНК-полимеразы, что примерно в полтора раза увеличивает стоимость проведения реакции,
2) при проведении химической модификации белка не менее 20% ДНК-полимеразы инактивируется необратимо.
Изобретение решает задачу упрощения и удешевления процесса.
Поставленная задача достигается за счет того, что в известном способе ферментативного синтеза ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы в присутствии соли магния, реакцию проводят в насыщенном растворе малорастворимой соли магния - оксалата магния.
Оксалат магния является малорастворимой солью, чья растворимость в воде возрастает с увеличением температуры от 5,7•10-4 моль/л при 18oС до 5,4•10-3 моль/л при 100oС. Оксалат магния добавляют в реакционную смесь в количестве, достаточном для образования насыщенного раствора. В этом случае концентрация ионов магния, необходимых для ферментативного синтеза ДНК, определяется растворимостью оксалата магния и возрастает с увеличением температуры реакционной среды. Использование оксалата магния позволяет создать оптимальную для синтеза ДНК концентрацию ионов магния только при температурах свыше 50-55oС, что снижает уровень синтеза ДНК при более низких температурах и подавляет инициацию синтеза неспецифических последовательностей ДНК.
Для изменения растворимости оксалата магния и оптимизации концентрации ионов магния в реакционную среду вводят хорошо растворимую соль щавелевой кислоты - оксалат аммония. При проведении ПЦР с Taq ДНК-полимеразой и с оксалатом магния оптимальная концентрация оксалата аммония в реакционной среде (определенная по результатам ПЦР) составляет от 10 до 12 мМ.
Предлагаемый способ позволяет сохранить высокую специфичность полимеразной цепной реакции (ПЦР), прост в реализации за счет использования более доступных и недорогих реагентов (не требуется использование химически модифицированной ДНК-полимеразы). Он может быть использован для увеличения специфичности не только ПЦР, но и других реакций праймер-зависимого ферментативного синтеза ДНК, например реакций удлинения олигонуклеотидного праймера или секвенирования ДНК по методу Сенгера.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1.
ПЦР осуществляют следующим образом:
Готовят реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую: 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0 at 25oC); 50 мМ КСl; 0,1% Triton X-100; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) в концентрации 0,2 мМ каждого; 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы; олигонуклеотидные праймеры Р1 и Р2 в количестве 20 пикомоль каждого; 1 наног геномной ДНК человека; 10 мМ оксалата аммония. Оксалат магния получают смешением 5 микрол 100 мМ раствора хлорида магния и 5 микрол 100 мМ раствора оксалата аммония и добавляют в реакционную смесь.
Готовят реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую: 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0 at 25oC); 50 мМ КСl; 0,1% Triton X-100; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) в концентрации 0,2 мМ каждого; 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы; олигонуклеотидные праймеры Р1 и Р2 в количестве 20 пикомоль каждого; 1 наног геномной ДНК человека; 10 мМ оксалата аммония. Оксалат магния получают смешением 5 микрол 100 мМ раствора хлорида магния и 5 микрол 100 мМ раствора оксалата аммония и добавляют в реакционную смесь.
Синтез фрагмента геномной ДНК человека (ген МНС I HLA-C allele HLA-4) размером 1230 п.о. осуществляют с использованием олигонуклеотидных праймеров Р1 (5'-GCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAG) и Р2 (5'-CATCATAGCGGTGACCACAGCTCCAA). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: 94oС - 30 сек; 58oС - 30 сек; 72oС - 100 сек, в течение 35 циклов.
После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции расчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Данные о специфичности ПЦР представлены в таблице.
Пример 2.
ПЦР осуществляют следующим образом:
Готовят реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую: 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0 at 25oС); 50 мМ КСl; 0,1% Triton Х-100; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) в концентрации 0,2 мМ каждого; 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы; олигонуклеотидные праймеры Р3 и Р4 в количестве 20 пикомоль каждого; 0,1 наног кДНК человека; 10 мМ оксалата аммония. Оксалат магния получают смешением 5 микрол 100 мМ раствора хлорида магния и 5 микрол 100 мМ раствора оксалата аммония и добавляют в реакционную смесь.
Готовят реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую: 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0 at 25oС); 50 мМ КСl; 0,1% Triton Х-100; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) в концентрации 0,2 мМ каждого; 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы; олигонуклеотидные праймеры Р3 и Р4 в количестве 20 пикомоль каждого; 0,1 наног кДНК человека; 10 мМ оксалата аммония. Оксалат магния получают смешением 5 микрол 100 мМ раствора хлорида магния и 5 микрол 100 мМ раствора оксалата аммония и добавляют в реакционную смесь.
Синтез фрагмента кДНК гена рибосомального белка L2 митохондрии человека (RPML2) размером 139 п.о. осуществляют с использованием олигонуклеотидных праймеров Р3 (5'-CCAAATTCTTGACGCCCTCGCTAG) и Р4 (5'-CTGAATGTCTCT GGCTTGAAACC). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: 94oС - 30 сек; 58oС - 30 сек; 72oС -100 сек, в течение 35 циклов.
После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции рассчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Даные о специфичности ПЦР представлены в таблице.
Пример 3 (контрольный по пат. США 5677152)
ПЦР осуществляют, как указано в примере 1, но вместо оксалата аммония и оксалата магния реакционная смесь содержит хлорид магния в концентрации 1,75 мМ и вместо обычной Taq-полимеразы используют обратимо инактивированную Taq-полимеразу.
ПЦР осуществляют, как указано в примере 1, но вместо оксалата аммония и оксалата магния реакционная смесь содержит хлорид магния в концентрации 1,75 мМ и вместо обычной Taq-полимеразы используют обратимо инактивированную Taq-полимеразу.
После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции рассчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Даные о специфичности ПЦР представлены в таблице.
Пример 4 (контрольный по пат. США 5677152)
ПЦР осуществляют, как указано в примере 2, но вместо оксалата аммония и оксалата магния реакционная смесь содержит хлорид магния в концентрации 1,75 мМ и вместо обычной Taq-полимеразы используют обратимо инактивированную Taq-полимеразу.
ПЦР осуществляют, как указано в примере 2, но вместо оксалата аммония и оксалата магния реакционная смесь содержит хлорид магния в концентрации 1,75 мМ и вместо обычной Taq-полимеразы используют обратимо инактивированную Taq-полимеразу.
После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции расчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Данные о специфичности ПЦР представлены в таблице.
Claims (1)
- Способ ферментативного синтеза ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы в присутствии соли магния, отличающийся тем, что реакцию проводят в насыщенном растворе малорастворимой соли магния - оксалата магния.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002109576/13A RU2215037C1 (ru) | 2002-04-15 | 2002-04-15 | Способ ферментативного синтеза днк |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002109576/13A RU2215037C1 (ru) | 2002-04-15 | 2002-04-15 | Способ ферментативного синтеза днк |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2215037C1 true RU2215037C1 (ru) | 2003-10-27 |
RU2002109576A RU2002109576A (ru) | 2004-02-10 |
Family
ID=31989025
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002109576/13A RU2215037C1 (ru) | 2002-04-15 | 2002-04-15 | Способ ферментативного синтеза днк |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2215037C1 (ru) |
-
2002
- 2002-04-15 RU RU2002109576/13A patent/RU2215037C1/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2002109576A (ru) | 2004-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8822158B2 (en) | Miniaturized, high-throughput nucleic acid analysis | |
US9347092B2 (en) | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis | |
ES2254505T3 (es) | Metodo para la amplificacion y caracterizacion opcional de acidos nucleicos. | |
EP1712618B1 (en) | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same | |
US6361940B1 (en) | Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity | |
EP0907752B1 (en) | Method for determination of nucleic acid sequences and diagnostic applications thereof | |
EP2606148B1 (en) | Helicase dependent isothermal amplification using nicking enzymes | |
JP4393700B2 (ja) | Dna増幅法および配列決定方法 | |
EP2058396A1 (en) | Nucleic acid amplification method | |
Jäger et al. | Polymerase chain reaction | |
JPH04501205A (ja) | サーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus)のDNAポリメラーゼを用いたDNA配列決定法 | |
EP0481065A1 (en) | PROCESS OF HYBRIDIZATION AND AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID. | |
JP2005512572A (ja) | Pcrにおける非特異的増幅を減少する方法 | |
CN105209639B (zh) | 在固相载体扩增核酸的方法 | |
US20030186312A1 (en) | Method for synthesizing DNA | |
US20040191830A1 (en) | Method and apparatus for amplification of nucleic acid sequences using immobilized DNA polymerase | |
JP2004537987A (ja) | ソルビトールを使用するマイクロサテライトの増幅において不連続を減少させるための方法 | |
JP5357893B2 (ja) | 迅速超長鎖pcrのための単一酵素系 | |
CN101671672B (zh) | 用于改进的核酸扩增的聚阴离子 | |
RU2215037C1 (ru) | Способ ферментативного синтеза днк | |
JP7191115B2 (ja) | エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡(EM-SEq)による核酸の増幅のための方法 | |
WO2021166989A1 (ja) | アダプター配列が付加されたdna分子を製造する方法、およびその利用 | |
RU2716589C1 (ru) | Способ определения полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам | |
EP1004676A1 (en) | Methods for dna amplification and kits therefor | |
US20070092899A1 (en) | Multiple displacement amplification with blocker DNA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120416 |