DE69601488T2

DE69601488T2 - Umkehrbares Inaktivierung von thermostabiles Enzym unter Verwendung einem Dicarbonsäureanhydrid und Verwendung im Amplifizierungsverfahren

Info

Publication number: DE69601488T2
Application number: DE69601488T
Authority: DE
Inventors: David Edward Birch; Walter Joseph Laird; Michael Anthony Zoccoli
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1996-08-17
Publication date: 1999-09-30
Anticipated expiration: 2016-08-18
Also published as: RU2174556C2; AU689047B2; PL185711B1; HU221750B1; US5677152A; IL119088A; CZ289237B6; CN1151437A; ES2101668T1; ATE176499T1; NO963541L; DK0771870T3; IL119088A0; ES2101668T3; HUP9602289A2; MX9603608A; PL315803A1; CZ249596A3; CA2184105A1; EP0771870A1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein den Bereich der Nucleinsäurechemie. Insbesondere betrifft sie Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen und Verfahren zur Reduktion einer nicht-spezifischen Amplifikation.
Das Polymerasekettenreaktion(PCR)-Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und in den US-Patenten mit den Nrn. 4,683,202, 4,683,195 und 4,965,188 offenbart. Händler, wie Perkin Elmer, Norwalk, CT, vertreiben PCR-Reagenzien und veröffentlichen PCR-Protokolle.
In jedem Zyklus einer PCR-Amplifikation wird eine doppelsträngige Zielsequenz denaturiert, Primer werden an jeden Strang des denaturierten Ziels aneliert und die Primer durch die Wirkung einer DNA-Polymerase verlängert. Die Spezifität der Amplifikation hängt von der Spezifität der Primerhybridisierung ab. Die Primer werden so gewählt, daß sie zu Sequenzen am 3'-Ende jedes Strangs der Zielnucleinsäuresequenz komplementär oder im wesentlichen komplementär sind. Bei den in einer Standard-PCR verwendeten erhöhten Temperaturen hybridisieren die Primer nur an die interessierende Zielsequenz. Die Amplifikationsreaktionsgemische werden jedoch üblicherweise bei Raumtemperatur vereinigt, weit unterhalb der zur Sicherstellung der Hybridisierungsspezifität des Primers erforderlichen Temperatur. Unter diesen weniger stringenten Bedingungen können die Primer nicht-spezifisch an andere nur partiell komplementäre Nucleinsäuresequenzen (oder sogar an andere Primer) binden und die Synthese von zusammen mit der Zielsequenz amplifizierbaren unerwünschten Extensionsprodukten initiieren. Die Amplifikation der nicht-spezifischen Primerextensionsprodukte kann mit der Amplifikation der interessierenden Zielsequenzen in Konkurrenz treten und die Effizienz der Amplifikation der gewünschten Sequenz signifikant verringern. Die von der nicht-spezifischen Amplifikation bewirkten Probleme werden genauer in Chou et al., Nucleic Acids Research 20(7) (1992), 1717- 1723, diskutiert.
Die nicht-spezifische Amplifikation kann durch Reduktion der Bildung von Extensionsprodukten von an Nicht-Zielsequenzen vor Reaktionsbeginn gebundenen Primern verringert werden. In einem Verfahren mit der Bezeichnung "hot-start"- Protokoll werden ein oder mehrere kritische Reagenzien nicht in das Reaktionsgemisch gegeben, bis die Temperatur für die erforderliche Hybridisierungsspezifität ausreichend hoch ist. So kann das Reaktionsgemisch die Primerextension während der Zeit, in der die Reaktionsbedingungen keine spezifische Primerhybridisierung sicherstellen, nicht unterstützen.
"Hot-start"-Verfahren können manuell durch Öffnen des Reaktionsröhrchens nach dem anfänglichen Hochtemperatur-Inkubationsschritt und Zugabe der fehlenden Reagenzien durchgeführt werden. Manuelle "hot-start"-Verfahren sind jedoch arbeitsintensiv und erhöhen das Risiko einer Verunreinigung des Reaktionsgemisches. "Hot- start"-Verfahren, die ein hitzelabiles Material, wie Wachs, zur Abtrennung oder Absonderung von Reaktionsbestandteilen verwenden, werden im US-Patent mit der Nr. 5,411, 876, und von Chou et al., 1992, a. a. O., offenbart. In diesen Verfahren schmilzt eine Hochtemperatur-Vorreaktionsinkubation das hitzelabile Material, wodurch sich die Reagenzien vermischen können.
Ein weiteres Verfahren zur Reduktion der Bildung von Extensionsprodukten von an Nicht-Zielsequenzen vor Beginn der Reaktion bindenden Primern beruht auf der Inhibition der DNA-Polymerase unter Verwendung einer Verbindung, die nicht-kovalent an die DNA-Polymerase in einer hitze-reversiblen Weise bindet. US-Patent Nr. 5,338,671 offenbart die Verwendung von für eine thermostabile DNA-Polymerase spezifischen Antikörpern zur Hemmung der Aktivität der DNA-Polymerase. Die Antikörper müssen mit der DNA-Polymerase in einem Puffer bei Raumtemperatur vor der Vereinigung des Reaktionsgemisches inkubiert werden, damit sich der Antikörper- DNA-Polymerase-Komplex bilden kann. Die Inhibition der DNA-Polymeraseaktivität durch Antikörper wird durch eine Hochtemperatur-Vorreaktionsinkubation inaktiviert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß die Produktion von für die DNA-Polymerase spezifischen Antikörpern, besonders in großen Mengen, teuer und zeitaufwendig ist. Ferner kann die Zugabe von Antikörpern zu einem Reaktionsgemisch eine Veränderung der Amplifikationsreaktion erfordern.
Die Bildung von Extensionsprodukten kann ebenfalls durch Zugabe einer Verbindung gehemmt werden, die nicht-kovalent an die Primer in einer hitze-reversiblen Weise bindet, wodurch eine Hybridisierung der Primer an jede Sequenz, jedes Ziel etc. verhindert wird. Beispielsweise bindet ein einem Reaktionsgemisch zugesetztes einzelsträngiges Bindungsprotein an die Primer, wodurch eine Primerhybridisierung verhindert und die Primerextension gehemmt ist. Eine Erhöhung der Ausbeute von PCR- Produkten unter Verwendung des Gen 32-Proteins wird von Schwarz et al., Nucleic Acids Research 18(4) (1990), 10, beschrieben.
Die nicht-spezifische Amplifikation kann durch einen Abbau von Extensionsprodukten, die von an Nicht-Zielsequenzen vor Reaktionsbeginn bindenden Primern gebildet werden, beispielsweise unter Verwendung der im US-Patent Nr. 5,418,149 und in der WO 92/01814 offenbarten Verfahren, reduziert werden. Der Abbau von neu synthetisierten Extensionsprodukten wird durch Einschluß von dUTP und UNG in das Reaktionsgemisch und Inkubation des Reaktionsgemisches bei 45 bis 60ºC vor der Durchführung der Amplifikationsreaktion erreicht. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß der Abbau der Extensionsprodukte mit der Bildung des Extensionsprodukts konkurriert und die Elimination des nicht-spezifischen Primerextensionsprodukts wahrscheinlich weniger vollständig ist.
Übliche Verfahren der Molekularbiologie, Proteinchemie und Nucleinsäurechemie, die im Stand der Technik bekannt sind, werden in der Literatur vollständig erklärt. Vgl. beispielsweise Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames und S.J. Higgins, Hrsg., 1984); Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press); und eine Reihe, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.). Alle hier, sowohl vorstehend als auch nachstehend, erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
WO 89/02916 offenbart ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipaseenzymen auf einem makroporösen Acrylharz und Verwendungen für diese immobilisierten Lipaseenzyme. Es wurde festgestellt, daß die immobilisierten Lipasen eine erhöhte Thermostabilität im Vergleich zu den nativen Lipasen aufweisen. Diese Lipasen sind keine thermostabilen Enzyme. WO 89/02916 offenbart nicht, daß die an der Immobilisierung dieser Lipasen beteiligte chemische Modifikation reversibel ist und daß diese Lipaseenzyme die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Enzyme aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zur Amplifikation einer Nucleinsäure unter Verwendung einer auf einem Primer beruhenden Amplifikationsreaktion, wie in den angefügten Ansprüchen beschrieben, bereit. Diese Verfahren und Reagenzien liefern eine einfache und ökonomische Lösung des Problems der nicht-spezifischen Amplifikation. Die Verfahren verwenden ein reversibel inaktiviertes thermostabiles Enzym, das durch Inkubation im Amplifikationsreaktionsgemisch bei einer erhöhten Temperatur reaktiviert werden kann. Die nicht-spezifische Amplifikation wird stark reduziert, da das Reaktionsgemisch die Primerextension nicht unterstützt, bis die Temperatur des Reaktionsgemisches auf eine die Primerhybridisierungsspezifität sicherstellende Temperatur erhöht wurde.
Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft reversibel inaktivierte thermostabile Enzyme, die durch eine Reaktion zwischen einem eine Primerextensionsreaktion katalysierenden thermostabilen Enzym und einem Modifikator produziert werden. Die Reaktion führt zu einer signifikanten, vorzugsweise im wesentlichen vollständigen, Reduktion der Enzymaktivität. Die Inkubation des modifizierten Enzyms in einem wäßrigen Puffer bei einem alkalischen pH bei einer Temperatur von weniger als etwa 25ºC führt im wesentlichen nicht zu einer Erhöhung der Enzymaktivität in weniger als etwa 20 Minuten. Die Inkubation des modifizierten Enzyms in einem wäßrigen Puffer, der auf einen pH-Wert von 8 bis 9 bei 25ºC eingestellt war, führte bei einer Temperatur von mehr als etwa 50ºC zu einer mindestens zweifachen Erhöhung der Primerextensionsaktivität in weniger als etwa 20 Minuten. Die erfindungsgemäßen reversibel inaktivierten ihermostabilen Enzyme katalysieren in ihrem aktiven Stadium entweder die Primerextension oder sind für das Auftreten der Primerextension erforderlich. Bevorzugte Enzyme schließen thermostabile DNA-Polymerasen und Ligasen ein.
Bevorzugte Modifikatoren sind Dicarbonsäureanhydride der allgemeinen Formel
worin R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome oder organische Radikale sind, die miteinander verbunden sein können, oder der allgemeinen Formel
worin R&sub1; und R&sub2; organische Radikale sind, die miteinander verbunden sein können, und die Wasserstoffatome in cis-Stellung sind. Das organische Radikal kann durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder eine Kohlenstoff-Heteroatom- Bindung, wie Kohlenstoff-Sauerstoff-, Kohlenstoff-Stickstoff- oder Kohlenstoff- Schwefel-Bindung, direkt an den Ring gebunden sein. Die organischen Radikale können auch miteinander verbunden sein, um eine Ringstruktur, wie beispielsweise im 3,4,5,6- Tetrahydrophthalsäureanhydrid, zu bilden.
Bevorzugte Reagenzien schließen Maleinsäureanhydrid; substituierte Maleinsäureanhydride, wie Citraconsäureanhydrid, cis-Aconitsäureanhydrid und 2,3- Dimethylmaleinsäureanhydrid; exo-cis-3,6-endoxo-Δ4-Tetrahydrophthalsäureanhydrid und 3,4,5,6-Tetrahydrophthalsäureanhydrid ein. Insbesondere werden Citracon säureanhydrid und cis-Aconitsäureanhydrid zur Herstellung von reversibel inaktivierten DNA-Polymerasen zur Verwendung in PCR-Amplifikationen bevorzugt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft Verfahren zur Durchführung einer Nucleinsäureamplifikationsreaktion unter Verwendung eines erfindungsgemäßen reversibel inaktivierten thermostabilen Enzyms. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Amplifikation einer in einer Probe enthaltenen Zielnucleinsäure bereit, das die nachstehenden Schritte umfaßt.
(a) Kontaktieren der Probe mit einer Amplifikationsreaktionsmischung, die einen zur Zielnucleinsäure komplementären Primer und ein modifiziertes thermostabiles Enzym enthält, wobei das modifizierte thermostabile Enzym durch eine Reaktion eines Gemisches eines thermostabilen Enzyms, das eine Primerextensionsreaktion katalysiert, und eines Modifikators produziert wird, wobei die Reaktion bei einem alkalischen pH- Wert bei einer Temperatur, die weniger als etwa 25ºC ist, durchgeführt wird, die Reaktion zu einer chemischen Modifikation des Enzyms führt, die eine im wesentlichen vollständige Inaktivierung der Enzymaktivität bewirkt, und die Inkubation des modifizierten Enzyms in einem wäßrigen Puffer, der auf einen pH-Wert von 8 bis 9 bei 25ºC eingestellt wird, bei einer Temperatur von mehr als etwa 50ºC mindestens eine zweifache Erhöhung der Enzymaktivität in weniger als etwa 20 Minuten bewirkt; und
(b) Inkubation des erhaltenen Gemisches von Schritt (a) bei einer Temperatur, die größer als etwa 50ºC ist, über einen Zeitraum, der zur Reaktivierung des Enzyms ausreicht und die Bildung von Primerextensionsprodukten ermöglicht.
Als ein bevorzugtes Verfahren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer in einer Probe enthaltenen Zielnucleinsäure bereit, umfassend:
(a) Kontaktieren der Probe mit einem Amplifikationsreaktionsgemisch, das einen zur Zielnucleinsäure komplementären Primer und ein modifiziertes thermostabiles Enzym enthält, wobei das modifizierte thermostabile Enzym durch eine Reaktion eines Gemisches eines thermostabilen Enzyms und eines Dicarbonsäureanhydrids der allgemeinen Formel
worin R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome oder organische Radikale sind, die miteinander verbunden sein können, oder der allgemeinen Formel
worin R&sub1; und R&sub2; organische Radikale sind, die miteinander verbunden sein können, und die Wasserstoffatome in cis-Stellung sind, produziert wird, wobei die Reaktion eine im wesentlichen vollständige Inaktivierung der Enzymaktivität bewirkt; und
(b) Inkubation des erhaltenen Gemisches von Schritt (a) bei einer Temperatur, die größer als etwa 50ºC ist, über einen Zeitraum, der zur Reaktivierung des Enzyms ausreicht und die Bildung von Primerextensionsprodukten erlaubt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Verfahren verwenden unter Verwendung der bevorzugten Modifikatoren reversibel modifizierte Enzyme. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird der Inkubationsschritt, Schritt (b), vor Beginn der Amplifikationsreaktion durchgeführt. In weiteren Ausführungsformen ist die Inkubation, die eine Reaktivierung des Enzyms bewirkt, ein integraler Schritt im Amplifikationsverfahren. Beispielsweise kann der Denaturierungsschritt, der in jedem PCR- Zyklus durchgeführt wird, gleichzeitig zur Reaktivierung einer modifizierten DNA- Polymerase dienen.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR), und eine reversibel inaktivierte thermostabile DNA-Polymerase wird verwendet. Das Reaktionsgemisch wird vor der Durchführung der Amplifikationsreaktion bei einer über der Anelierungstemperatur der Amplifikationsreaktion liegenden Temperatur inkubiert. Daher ist die DNA-Polymerase inaktiviert, bis die Temperatur oberhalb der die Spezifität der Amplifikationsreaktion sicherstellenden Temperatur ist, wodurch die nicht-spezifische Amplifikation reduziert wird.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft Amplifikationsreaktionsgemische, die ein erfindungsgemäßes reversibel inaktiviertes thermostabiles Enzym zusammen mit Reagenzien zur Durchführung der Amplifikationsreaktion enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Amplifikationsreaktionsgemisch Oligonucleotidprimer zur Durchführung einer PCR.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft Kits, die ein erfindungsgemäßes reversibel inaktiviertes thermostabiles Enzym umfassen und ein oder mehrere Amplifikationsreagenzien.
Fig. 1 zeigt die Strukturen des Citraconsäureanhydrids, cis-Aconitsäureanhydrids und 2,3-Dimethylmaleinsäureanhydrids und die Reaktion zwischen dem Citraconsäureanhydrid und Lysin.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen, die unter Verwendung der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt wurden.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen, die unter Verwendung von citraconylierten DNA-Polymerasen, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt wurden.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Variation der Präreaktionsinkubationszeit in Amplifikationen, die unter Verwendung von citraconylierten und cis-aconitylierten DNA-Polymerasen, wie in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt wurden.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Variation der Zahl von Amplifikationszyklen in Amplifikationen, die unter Verwendung von citraconylierten und cis-aconitylierten DNA-Polymerasen, wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt wurden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend mehrere Begriffe definiert.
Die Begriffe "Nucleinsäure" und "Oligonucleotid" betreffen Primer, Sonden und Oligomerfragmente, die nachgewiesen werden sollen, und gelten allgemein für Polydesoxyribonucleotide (enthaltend 2-Desoxy-D-ribose), für Polyribonucleotide (enthaltend D-Ribose) und für jede andere Art von Polynucleotid, das ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder einer modifizierten Purin- oder Pyrimidinbase ist. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung in der Länge zwischen den Begriffen "Nucleinsäure" und "Oligonucleotid", und diese Begriffe werden austauschbar verwendet. Diese Begriffe meinen nur die Primärstruktur des Moleküls. Daher schließen diese Begriffe doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA ein. Das Oligonucleotid kann durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden. Eine Zusammenfassung der Syntheseverfahren gibt Goodchild, Bioconjugate Chemistry 1(3) (1990), 165-187.
Der Begriff "Hybridisierung" meint die Erzeugung einer Doppelstrangstruktur aus zwei einzelsträngigen Nucleinsäuren durch eine komplementäre Basenpaarung. Eine Hybridisierung kann zwischen vollständig komplementären Nucleinsäuresträngen oder zwischen "im wesentlichen komplementären" Nucleinsäuresträngen, die kleine Bereiche einer Fehlpaarung enthalten, erfolgen. Bedingungen, bei denen nur vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren, werden als "stringente Hybridisierungsbedingungen" oder "Sequenz-spezifische Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Stabile Doppelstränge von im wesentlichen komplementären Sequenzen können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen erreicht werden. Ein Fachmann der Nucleinsäuretechnologie kann die Doppelstrangstabilität unter Berücksichtigung einer Reihe von Variabeln, einschließlich beispielsweise der Länge und Basenpaarkonzentration der Oligonucleotide, der Ionenstärke und dem Auftreten von fehlgepaarten Basenpaaren, gemäß der Anleitung auf dem Fachgebiet (vgl. z. B. Sambrook et al., (1989), a. a. O.) empirisch ermitteln.
Üblicherweise werden stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt, die etwa 5ºC niedriger als die Temperatur des Schmelzpunkts (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Der Tm- Wert ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Basenpaare dissoziiert sind. Durch eine Reduktion der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen können Sequenzfehlpaarungen tolerierbar sein; der Grad von tolerierten Fehlpaarungen kann durch geeignetes Einstellen der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
Der Begriff "Primer" meint ein natürliches oder synthetisches Oligonucleotid, das als Initiationspunkt der DNA-Synthese unter Bedingungen wirken kann, bei denen eine Synthese eines zu einem Nucleinsäurestrang komplementären Primerextensionsprodukts induziert wird, d. h. in Gegenwart der vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate und eines Polymerisationsmittels (d. h. DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Oligonucleotidanaloge, wie "Peptidnucleinsäuren", können als Primer wirken und sind in die Bedeutung des Begriffs "Primer", wie hier verwendet, eingeschlossen. Ein Primer ist vorzugsweise ein einzelsträngiges Oligodesoxyribonucleotid. Die geeignete Länge eines Primers hängt von der beabsichtigten Verwendung des Primers ab, liegt jedoch üblicherweise im Bereich von 6 bis 50 Nucleotiden. Kurze Primermoleküle erfordern üblicherweise kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize zu bilden. Ein Primer braucht nicht die genaue Sequenz der Matrizennucleinsäure wiederzugeben, muß jedoch ausreichend komplementär sein, um mit der Matrize zu hybridisieren.
Der Begriff "Primerextension", wie hier verwendet, meint sowohl die Synthese von DNA, die durch Polymerisation von einzelnen Nucleosidtriphosphaten unter Verwendung eines Primers als Initiationspunkt erhalten wird, als auch das Anfügen von zusätzlichen Oligonucleotiden an den Primer zur Extension des Primers. Wie hier verwendet, soll der Begriff "Primerextension" die Ligierung von zwei Oligonucleotiden umfassen, zur Bildung eines längeren Produkts, das anschließend als Ziel in zukünftigen Amplifikationszyklen dienen kann. Wie hier verwendet, soll der Begriff "Primer" die in Ligierungs-vermittelten Amplifikationsverfahren verwendeten Oligonucleotide umfassen, die durch Ligierung eines an einer benachbarten Position hybridisierenden zweiten Oligonucleotids verlängert werden.
Die Primer können weitere Merkmale einschließen, die den Nachweis oder die Immobilisierung des Primers ermöglichen, jedoch nicht die grundlegende Eigenschaft des Primers, nämlich die der Wirkung als Initiationspunkt der DNA- Synthese, verändern. Beispielsweise können Primer eine weitere Nucleinsäuresequenz am 5'-Ende enthalten, die nicht an die Zielnucleinsäure hybridisiert, jedoch eine Clonierung des amplifizierten Produkts erleichtert. Der Bereich des Primers, der zu der Matrize, an die er hybridisieren soll, ausreichend komplementär ist, wird hier als hybridisierender Bereich bezeichnet.
Die Begriffe "Zielbereich" und "Zielnucleinsäure" bezeichnen einen Bereich oder eine Untersequenz einer zu amplifizierenden Nucleinsäure. Die Primerhybridisierungsstelle kann als Zielbereich für die Primerhybridisierung bezeichnet werden.
Wie hier verwendet, ist ein Oligonucleotidprimer für eine Zielsequenz "spezifisch", wenn die Zahl an zwischen dem Oligonucleotid und der Zielsequenz vorhandenen Fehlpaarungen geringer als die Zahl an Fehlpaarungen ist, die zwischen dem Oligonucleotid und den in der Probe vorhandenen Nicht-Zielsequenzen vorhanden sind. Es können Hybridisierungsbedingungen gewählt werden, bei denen stabile Doppelstränge nur gebildet werden, wenn die Zahl von vorhandenen Fehlpaarungen nicht größer als die Zahl von zwischen dem Oligonucleotid und der Zielsequenz vorhandenen Fehlpaarungen ist. Unter diesen Bedingungen kann das Oligonucleotid einen stabilen Doppelstrang nur mit einer Zielsequenz bilden. Daher ermöglicht die Verwendung von zielspezifischen Primern unter geeignet stringenten Amplifikationsbedingungen die spezifische Amplifikation dieser Zielsequenzen, die die Zielprimerbindungsstellen enthalten. Die Verwendung von Sequenz-spezifischen Amplifikationsbedingungen ermöglicht die spezifische Amplifikation dieser die genau komplementären Primer- Bindungsstellen enthaltenden Zielsequenzen.
Der Begriff "nicht-spezifische Amplifikation" meint die Amplifikation von anderen Nucleinsäuresequenzen als die Zielsequenz, die von Primern bewirkt wird, die an andere Sequenzen als die Zielsequenz hybridisieren und anschließend als Substrat zur Primerextension dienen. Die Hybridisierung eines Primers an eine Nicht-Zielsequenz wird als "nicht-spezifische Hybridisierung" bezeichnet und kann während der niedrig temperierten, reduziert stringenten Vorreaktionsbedingungen vorkommen.
Der Begriff "thermostabiles Enzym" meint ein Enzym, das gegen Hitze relativ stabil ist. Die thermostabilen Enzyme überstehen die zur Entfernung der Modifikatoren verwendete Hochtemperaturinkubation, üblicherweise bei mehr als 50ºC, ohne einen irreversiblen Verlust an Aktivität. Modifizierte thermostabile Enzyme, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, schließen thermostabile DNA-Polymerasen und thermostabile Ligasen ein.
Der Begriff "thermostabile DNA-Polymerase" meint ein Enzym, das gegen Hitze relativ stabil ist und die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten unter Bildung von zu einem der Nucleinsäurestränge der Zielsequenz komplementären Primerextensionsprodukten katalysiert. Das Enzym initiiert die Synthese am 3'-Ende des Primers und schreitet in Richtung des 5'-Endes der Matrize bis zum Ende der Synthese fort. Die gereinigten thermostabilen DNA-Polymerasen werden im US-Patent Nr. 4,889,818; US-Patent Nr. 5,352,600; US-Patent Nr. 5,079,352; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; US-Patent Nr. 5,491,086; WO 92/09689; und US-Patent Nr. 5,210,036 offenbart.
Ein Enzym, das von einem Organismus "abstammt", meint hier ein von dem Organismus gereinigtes Enzym oder eine rekombinante Version eines von dem Organismus gereinigten Enzyms und schließt Enzyme ein, in denen die Aminosäuresequenz unter Verwendung von Verfahren der Molekularbiologie modifiziert wurde.
Der Begriff "reversibel inaktiviert", wie hier verwendet, meint ein Enzym, das durch Umsetzung mit einer Verbindung inaktiviert wurde, die zu einer kovalenten Modifikation (auch als chemische Modifikation bezeichnet) des Enzyms führt, in dem die modifizierende Verbindung unter geeigneten Bedingungen entfernt werden kann. Die Reaktion, die zu einer Entfernung der modifizierenden Verbindung führt, muß nicht die Umkehrung der Modifikationsreaktion sein. Sofern es eine Reaktion gibt, die zu einer Entfernung der modifizierenden Verbindung und Wiederherstellung der Enzymfunktion führt, wird das Enzym als reversibel inaktiviert angesehen.
Der Begriff "Reaktionsgemisch" meint eine Lösung, die zur Durchführung einer bestimmten Reaktion erforderliche Reagenzien enthält. Ein "Amplifikationsreaktionsgemisch", das eine Lösung meint, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion erforderliche Reagenzien enthält, umfaßt üblicherweise Oligonucleotidprimer und eine DNA-Polymerase oder Ligase in einem geeigneten Puffer. Ein "PCR-Reaktionsgemisch" enthält üblicherweise Oligonucleotidprimer, eine thermostabile DNA-Polymerase, dNTPs und ein divalentes Metallkation in einem geeigneten Puffer. Ein Reaktionsgemisch wird als vollständig bezeichnet, wenn es alle Reagenzien enthält, die zur Durchführung der Reaktion erforderlich sind, und als unvollständig, wenn es nur einen unvollständigen Satz der erforderlichen Reagenzien enthält. Dem Fachmann ist bekannt, daß die Reaktionsbestandteile üblicherweise als getrennte Lösungen, wobei jede einen Teilsatz der gesamten Bestandteile enthält, aus Gründen der Bequemlichkeit, Aufbewahrungsstabilität und der Möglichkeit einer unabhängigen Einstellung der Konzentrationen der Bestandteile je nach der Anwendung aufbewahrt werden, und ihm ist ferner bekannt, daß Reaktionsbestandteile vor der Reaktion zur Erzeugung eines vollständigen Reaktionsgemisches kombiniert werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Durchführung einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines hitzeaktivierten thermostabilen Enzyms, in der das aktive Enzym zur Primerextension erforderlich ist. Vor der das Enzym aktivierenden Hochtemperaturinkubation unterstützt das Amplifikationsreaktionsgemisch nicht die Primerextension, und keine Extensionsprodukte, weder nicht-spezifische noch andere, werden gebildet. Nach der das Enzym reaktivierenden Hochtemperaturinkubation wird die Amplifikationsreaktion bei erhöhten Temperaturen, die eine Reaktionsspezifität sicherstellen, gehalten. Daher werden Primerextensionsprodukte nur unter eine Amplifikationsspezifität sicherstellenden Bedingungen gebildet.
In den erfindungsgemäßen Verfahren katalysiert das hitzeinaktivierte Enzym in seinem aktiven Zustand die Primerextensionsreaktion. Zur Verwendung in einer üblichen Amplifikationsreaktion, z. B. einer PCR, besitzt das hitze-aktivierte thermostabile Enzym in seinem aktiven Zustand eine DNA-Polymeraseaktivität. Zur Verwendung in Ligase-vermittelten Amplifikationssystemen besitzt das hitze-aktivierte thermostabile Enzym in seinem aktiven Zustand eine DNA-Ligase-Aktivität.
In einem Ligase-vermittelten Amplifikationssystem wird ein "Extensionsprodukt" durch Ligierung eines ersten Oligonucleotids (hier durch den Begriff "Primer" eingeschlossen) an ein zweites Oligonucleotid, das benachbart zum 3'-Ende des ersten Oligonucleotids hybridisiert, gebildet. Das zweite Oligonucleotid kann in unmittelbarer Nachbarschaft zum Primer hybridisieren, dann ist nur noch eine Ligierung erforderlich, oder kann eine oder mehrere Basen entfernt vom Primer hybridisieren, dann ist die Polymeraseaktivität zur Extension des Primers vor der Ligierung erforderlich. In jedem Fall soll das Zusammenfügen der beiden Oligonucleotide, die an benachbarte Bereiche der Ziel-DNA hybridisieren, hier im Begriff "Primerextension" eingeschlossen sein.
Die erfindungsgemäßen reversibel inaktivierten thermostabilen Enzyme werden durch eine Reaktion zwischen dem Enzym und einem Modifizierungsmittel produziert, was zu einer reversiblen chemischen Modifikation des Enzyms mit einem Verlust der gesamten oder fast der gesamten Enzymaktivität führt. Die Modifikation besteht aus einer kovalenten Bindung der Modifizierungsgruppe an das Protein. Die Modifizierungsverbindung wird so gewählt, daß die Modifikation durch Inkubation bei einer erhöhten Temperatur im Amplifikationsreaktionspuffer rückgängig gemacht wird. Geeignete Enzyme und Modifizierungsgruppen werden nachstehend beschrieben.
Reversibel inaktivierte Enzyme, die in aktivem Zustand eine DNA- Polymeraseaktivität aufweisen, werden aus thermostabilen DNA-Polymerasen hergestellt. In Amplifikationsreaktionen verwendbare thermostabile DNA-Polymerasen sind im Stand der Technik gut bekannt und können von einer Reihe von Quellen, wie thermophilen Eubakterien oder Archaebakterien von Arten der Gattungen Thermus, Thermotoga, Thermococcus, Pyrodictium, Pyrococcus und Thermosipho, stammen. Repräsentative Arten, von denen in PCR-Amplifikationen verwendbare thermostabile DNA-Polymerasen abstammen, schließen Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Pyrodictium occultum, Pyrodictium abyssi und Thermosipho africanus ein. Thermostabile DNA-Polymerasen sind im US-Patent Nr. 4,889,818; US- Patent Nr. 5,352,600; US-Patent Nr. 5,079,352; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; US-Patent Nr. 5,491,086; WO 92/09689; und US-Patent Nr. 5,210,036 offenbart. Thermostabile DNA-Polymerasen sind von Perkin Elmer, Norwalk, CT, verfügbar.
Reversibel inaktivierte thermostabile Enzyme, die zur Verwendung in anderen Amplifikationsverfahren, wie Ligase-vermittelte Amplifikationen, geeignet sind, werden aus den thermostabilen Enzymen, die in den nachstehend zitierten, die verschiedenen Amplifikationsverfahren beschreibenden Literaturhinweisen dargestellt werden, hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind nicht auf die Verwendung der beispielhaft aufgeführten Enzyme beschränkt. Beispielsweise kann jede in der Literatur zur Verwendung in Amplifikationsreaktionen beschriebene thermostabile DNA-Polymerase zur Produktion eines zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten reversibel inaktivierten Enzyms, wie hier beschrieben, modifiziert werden. Allgemein kann jedes Enzym, das die Primerextension katalysiert oder für das Auftreten der Primerextension erforderlich ist und zum Überstehen einer Hochtemperatur-Reaktivierungsinkubation ohne irreversible Inaktivierung ausreichend thermostabil ist und zur Herstellung eines reversibel inaktivierten Enzyms, wie hier beschrieben, modifiziert werden kann, in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Ein Fachmann kann die Modifikationsreaktion und die Amplifikationsreaktionsbedingungen für jedes bestimmte Enzym auf der Basis der hier beschriebenen Anleitung optimieren.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird die reversible Inaktivierung eines thermostabilen Enzyms durch reversible Blockierung der Lysinreste durch chemische Modifikation der &epsi;-Aminogruppe der Lysinreste durchgeführt. Die Modifikation der Lysinreste im aktiven Bereich des Proteins führt zur Inaktivierung des Proteins. Ferner kann die Modifikation von Lysinresten außerhalb des aktiven Bereichs zur Inaktivierung des Proteins durch sterische Wechselwirkung oder Konfor mationsveränderungen beitragen. Eine Reihe von Verbindungen, die mit Aminogruppen in einer reversiblen Weise reagieren, wurde in der Literatur beschrieben. Beispielsweise wurden Aminogruppen durch Trifluoracetylierung (vgl. Goldherger und Anfinsen, Biochemistry 1 (1962), 410), Amidinierung (vgl. Hunter und Ludwig, J. Amer. Chem. Soc. 84 (1962), 3491), Maleylierung (vgl. Butler et al. Biochem. J. 103 (1967), 78), Acetoacetylierung (vgl. Marzotto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 26 (1967), 517; und Marzotto et al., Biochim. Biophys. Acta 154 (1968), 450), Tetrafluorsuccinylierung (vgl. Braunitzer et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 349 (1968), 265) und Citraconylierung (vgl. Dixon und Perham, Biochem. J. 109 (1968), 312-314, und Habeeb und Atassi, Biochemistry 9(25) (1970), 4939-4944) reversibel modifiziert.
Bevorzugte Reagenzien zur chemischen Modifikation der &epsi;-Aminogruppe der Lysinreste sind Dicarbonsäureanhydride der allgemeinen Formel
worin R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome oder organische Radikale sind, die miteinander verbunden sein können, oder der allgemeinen Formel
worin R&sub1; und R&sub2; organische Radikale sein können, die miteinander verbunden sein können, und die Wasserstoffatome in cis-Stellung sind. Das organische Radikal kann direkt an den Ring durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder eine Kohlenstoff- Heteroatom-Bindung, wie eine Kohlenstoff-Sauerstoff-, Kohlenstoff-Stickstoff- oder Kohlenstoff-Schwefel-Bindung, gebunden werden. Die organischen Radikale können auch miteinander verbunden sein, um eine Ringstruktur, wie beispielsweise im 3,4,5,6- Tetrahydrophthalsäureanhydrid, zu bilden.
Die Dicarbonsäureanhydride reagieren mit den Aminogruppen der Proteine, um die entsprechenden acylierten Produkte zu erhalten, wie für das Citraconsäureanhydrid in Fig. 1 dargestellt. Es wird angenommen, daß die Reversibilität der vorstehend beschriebenen Dicarbonsäureanhydride durch die Gegenwart entweder der cis-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung oder der cis-Wasserstoffatome erhöht wird, was die terminale Carboxylgruppe der acylierten Reste in einer räumlichen Orientierung hält, die eine Wechselwirkung mit der Amidgruppe und eine anschließende Deacylierung ermöglicht. Vgl. Palacian et al., Mol. Cell. Biochem. 97 (1990), 101- 111, wegen Beschreibungen von plausiblen Mechanismen sowohl für die Acylierungs- als auch Deacylierungsreaktionen. Weitere Substituenten können in ähnlicher Weise die Rotation um die 2,3-Bindung der Acyleinheit im acylierten Produkt begrenzen, und es wird erwartet, daß diese Verbindungen für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.
Beispiele für bevorzugte Reagenzien schließen Maleinsäureanhydrid ein; substituierte Maleinsäureanhydride, wie Citraconsäureanhydrid, cis-Aconitsäureanhydrid und 2,3-Dimethylmaleinsäureanhydrid; exo-cis-3,6-endoxo-Δ4-Tetrahydrophffialsäureanhydrid; und 3,4,5,6-Tetrahydrophthalsäureanhydrid. Die Reagenzien sind im Handel beispielsweise von der Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) oder Spektrum Chemical Mfg. Corp. (Gardena, CA) erhältlich. Modifikationen von thermostabilen DNA-Polymerasen unter Verwendung der substituierten Maleinsäureanhydridreagenzien Citraconsäureanhydrid und cis- Aconitsäureanhydrid werden in den Beispielen beschrieben.
Die relativen Stabilitäten der Aminogruppen, die unter Verwendung der vorstehenden Reagenzien acyliert wurden, verringerten sich in der nachstehenden Reihenfolge: Maleinsäureanhydrid; exo-cis-3,6-endoxo-Δ4-Tetrahydrophthalsäureanhydrid; Citraconsäureanhydrid; 3,4,5,6-Tetrahydrophthalsäureanhydrid; cis- Aconitsäureanhydrid; und 2,3-Dimethylmaleinsäureanhydrid (vgl. Palacian et al., a. a. O.). Optimale Aktivierungsinkubationsbedingungen für mit einem bestimmten Reagens modifizierte Enzyme werden empirisch, wie in den Beispielen beschrieben, bestimmt.
US-Patent Nr. 5,262,525 offenbart Verfahren zur chemischen Modifikation von Proteinen, in denen durch die Diels-Alder-Reaktion von Maleinsäureanhydrid und einem Dien hergestellte Dicarbonsäureanhydridverbindungen verwendet werden. Im '525-Patent offenbarte Verbindungen, die die hier beschriebene Stabilität aufweisen, können für die vorliegende Erfindung geeignet sein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind nicht auf die beispielhaft beschriebenen Modifizierungsverbindungen oder auf die Modifikation des Proteins durch chemische Modifikation von Lysinresten beschränkt. Alle in der Literatur beschriebenen Verbindungen, die durch Reaktion mit Proteinen den reversiblen Verlust der gesamten, oder fast der gesamten, Enzymaktivität bewirken, wobei die Modifikation durch Inkubation bei einer erhöhten Temperatur im Amplifikationsreaktionspuffer reversibel ist, sind zur Herstellung eines reversibel inaktivierten Enzyms geeignet. Wenn Proteine reversibel modifizierende neue Verbindungen verfügbar werden, werden diese ebenfalls zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein. Daher schließen Verbindungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen modifizierten thermostabilen Enzyme Verbindungen ein, die die nachstehenden Eigenschaften aufweisen:
(1) Reaktion mit einem thermostabilen Enzym, das die Primerextension katalysiert, bewirkt eine signifikante Inaktivierung des Enzyms;
(2) Inkubation des erhaltenen modifizierten Enzyms in einem wäßrigen Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 9 bei einer Temperatur bei oder unter etwa Raumtemperatur (25ºC) bewirkt keine signifikante Erhöhung der Enzymaktivität in weniger als etwa 20 Minuten; und
(3) Inkubation des erhaltenen modifizierten thermostabilen Enzyms in einem Amplifikationsreaktionspuffer, der auf einen pH-Wert von etwa 8 bis 9 bei Raumtemperatur eingestellt ist, bewirkt bei einer erhöhten Temperatur von mehr als etwa 50ºC eine mindestens zweifache Erhöhung der Enzymaktivität in weniger als etwa 20 Minuten.
Die Eignung einer bestimmten Modifizierungsverbindung kann nach der hier gelieferten Anleitung empirisch routinemäßig ermittelt werden. Experimentelle Verfahren zur Messung der vorstehend beschriebenen Eigenschaften, des Grads der Verringerung der Enzymaktivität durch Modifikation des Proteins und des Grads der Wiederherstellung der Enzymaktivität nach einer Inkubation bei erhöhten Temperaturen in einem Amplifikationsreaktionsgemisch werden in den Beispielen beschrieben.

Herstellung der reversibel inaktivierten thermostabilen Enzyme

Die chemische Modifikation von Lysinresten in Proteinen beruht auf der Fähigkeit der &epsi;-Aminogruppe dieses Restes zur Reaktion als Nucleophib Die nicht-protonierte Aminogruppe ist die reaktive Form, die bei einem alkalischen pH-Wert begünstigt ist. Die Modifikationsreaktion wird bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0 in einem wäßrigen Puffer bei einer Temperatur bei oder unter Raumtemperatur (25ºC) durchgeführt. Die Reaktion ist nach einer Inkubation über 12 bis 24 Stunden im wesentlichen abgeschlossen. Geeignete Reaktionsbedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden in den Beispielen genauer beschrieben.
Dicarbonsäureanhydride reagieren leicht mit Wasser unter Bildung der entsprechenden Säuren. Daher wird ein großer Teil des Reagenzes während der Modifikation der Aminogruppen des Proteins hydrolysiert. Die Hydrolysegeschwindigkeit erhöht sich mit dem pH-Wert. Die erhöhte Hydrolyse bei einem pH-Wert von mehr als etwa 9 kann zu einer suboptimalen Acylierung des Proteins führen.
Üblicherweise wird ein molarer Überschuß des Modifizierungsreagenzes relativ zum Protein in der Acylierungsreaktion verwendet. Das optimale molare Verhältnis von Modifizierungsreagens zu Enzym hängt vom verwendeten Reagens ab und wird empirisch ermittelt. Beispielsweise wird die Taq-DNA-Polymerase durch eine Reaktion mit einem 20fachen oder größeren molaren Überschuß von Citraconsäureanhydrid im wesentlichen vollständig inaktiviert (< 5% der ursprünglichen Aktivität). Das minimale molare Verhältnis an Modifikator, das zu einer im wesentlichen vollständigen Inaktivierung des Enzyms führt, kann durch Inaktivierungsreaktionen mit einer Verdünnungsreihe von Modifizierungsreagens, wie in den Beispielen beschrieben, ermittelt werden.
In den erfindungsgemäßen Verfahren ist nicht die vollständige, sondern nur eine signifikante Inaktivierung des Enzyms erforderlich. Wie hier verwendet, wird ein Enzym signifikant inaktiviert, wenn die Aktivität des Enzyms nach der Reaktion mit dem Modifikator weniger als etwa 50% der ursprünglichen Aktivität ist. Eine Reduktion der nicht-spezifischen Amplifikation kann unter Verwendung eines signifikant inaktivierten Enzyms erhalten werden. Ein molares Verhältnis von Modifikator zu Enzym in der Reaktion kann empirisch gewählt werden, was zu einer im wesentlichen vollständigen Inaktivierung oder signifikanten Inaktivierung des Enzyms nach der hier gegebenen Anleitung führt. Geeignete molare Verhältnisse werden in den Beispielen angegeben. Geeignete Reaktionsbedingungen zur Inaktivierung von Enzymen, die nicht als Beispiel beschrieben wurden, können durch Standardexperimente nach der hier gegebenen Anleitung ermittelt werden.
Ein wichtiger Gesichtspunkt der erfindungsgemäßen hitze-inaktivierten Enzyme ist ihre Haltbarkeit. Allgemein sind die hier beschriebenen Verbindungen über längere Zeiträume stabil, was die Notwendigkeit zur Herstellung unmittelbar vor jeder Verwendung beseitigt. Beispielsweise wurde festgestellt, daß die citraconylierte Taq- DNA-Polymerase bei einer Aufbewahrung bei 25ºC über mindestens vier Wochen inaktiviert bleibt. Die empfohlenen Aufbewahrungsbedingungen variieren je nach dem verwendeten Modifikator, üblicherweise sollte ein Präparat von inaktiviertem Enzym bei oder unter Raumtemperatur (25ºC), vorzugsweise gekühlt, aufbewahrt werden. Insbesondere müssen instabilere modifizierte Enzyme, wie die mit 2,3-Dimethylmaleinsäureanhydrid modifizierten, gekühlt aufbewahrt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen die Verwendung eines ein reversibel inaktiviertes thermostabiles Enzym enthaltenden Reaktionsgemisches und die Inkubation des Reaktionsgemisches bei hoher Temperatur vor oder als integraler Bestandteil der Amplifikationsreaktion ein. Die Hochtemperaturinkubation führt zu einer Deacylierung der Aminogruppen und Wiederherstellung der Enzymaktivität.
Die Deacylierung der modifizierten Aminogruppen wird sowohl von der Erhöhung der Temperatur als auch einer gleichzeitigen Abnahme des pH-Werts bewirkt. Die Amplifikationsreaktionen werden üblicherweise in einem auf einen pH-Wert von 8,0 bis 9,0 eingestellten Tris-HCl-Puffer bei Raumtemperatur durchgeführt. Bei Raumtemperatur begünstigen alkalische Reaktionspufferbedingungen die acylierte Form der Aminogruppe. Obwohl der pH-Wert des Reaktionspuffers auf einen pH von 8,0 bis 9,0 bei Raumtemperatur eingestellt ist, verringert sich der pH-Wert eines Tris-HCl- Reaktionspuffers mit steigender Temperatur. Daher wird der pH-Wert des Reaktionspuffers bei den erhöhten Temperaturen, bei denen die Amplifikation und besonders die Aktivierungsinkubation durchgeführt wird, verringert. Die Verringerung des pH-Werts des Reaktionspuffers begünstigt die Deacylierung der Aminogruppen.
Die aufgrund der Hochtemperaturreaktionsbedingungen erfolgende Veränderung des pH-Werts hängt vom verwendeten Puffer ab. Die Temperaturabhängigkeit des pHs von verschiedenen in biologischen Reaktionen verwendeten Puffern wird von Good et al., Biochemistry 5(2) (1966), 467-477, beschrieben. Für Tris-Puffer hängt die Veränderung des pKa, d. h. des pH-Werts in der Mitte des Pufferbereichs, mit der Temperatur auf folgende Weise zusammen: ΔpKa/ºC = -0,031. Beispielsweise sinkt in einem bei 25ºC zusammengestellten Tris-HCl-Puffer der pKa um 2,17, wenn seine Temperatur auf 95ºC für die aktivierende Inkubation erhöht wird.
Obwohl Amplifikationsreaktionen üblicherweise in einem Tris-HCl-Puffer durchgeführt werden, können Amplifikationsreaktionen in Puffern, die eine kleinere oder größere Veränderung des pH-Werts mit der Temperatur zeigen, durchgeführt werden. Je nach dem verwendeten Puffer kann ein mehr oder weniger stabiles modifiziertes Enzym wünschenswert sein. Beispielsweise kann bei Verwendung eines zu einem weniger stabilen modifizierten Enzym führenden Modifizierungsreagenzes eine ausreichende Enzymaktivität durch einen geringfügig veränderten pH-Wert des Puffers wiederhergestellt werden. Ein empirischer Vergleich der relativen Stabilitäten von Enzymen, die mit verschiedenen Reagenzien, wie vorstehend bereitgestellt, modifiziert werden, bestimmt die Wahl eines modifizierten, zur Verwendung in bestimmten Puffern geeigneten Enzyms.
In den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Aktivierung des modifizierten Enzyms durch eine Inkubation bei einer Temperatur erreicht, die gleich oder höher als die Primerhybridisierungs(Anelierung)-Temperatur ist, die in der Amplifikationsreaktion zur Sicherstellung der Amplifikationsspezifität verwendet wird. Die Länge der zur Wiederherstellung der Enzymaktivität erforderlichen Inkubation hängt von der Temperatur und dem pH-Wert des Reaktionsgemisches und von der Stabilität der acylierten Aminogruppen des Enzyms ab, die vom zur Herstellung des modifizierten Enzyms verwendeten Modifizierungsreagens abhängt. Ein weiter Bereich der Inkubationsbedingungen ist verwendbar; optimale Bedingungen werden empirisch für jede Reaktion ermittelt. Allgemein wird eine Inkubation im Amplifikationsreaktionspuffer etwa 10 Sekunden bis etwa 20 Minuten bei einer Temperatur von mehr als etwa 50ºC durchgeführt. Eine Optimierung der Inkubationsbedingungen zur Reaktivierung von nicht beschriebenen Enzymen oder nicht beschriebenen Reaktionsgemischen kann durch Routineexperimente nach der hier gegebenen Anleitung ermittelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine PCR-Amplifikation unter Verwendung einer reversibel inaktivierten thermostabilen DNA-Polymerase durchgeführt. Die in einer PCR-Amplifikation verwendete Anelierungstemperatur ist üblicherweise etwa 55 bis 75ºC, und die Präreaktionsinkubation wird bei einer Temperatur, die gleich oder höher als die Anelierungstemperatur ist, vorzugsweise eine Temperatur von mehr als etwa 90ºC, durchgeführt. Das Amplifikationsreaktionsgemisch wird vorzugsweise bei etwa 90 bis 100ºC bis zu etwa 12 Minuten inkubiert, um die DNA- Polymerase vor dem Temperaturzyklus zu reaktivieren. Geeignete Präreaktionsinkubationsbedingungen für übliche PCR-Amplifikationen werden in den Beispielen zusammen mit der Wirkung von veränderten Präreaktionsinkubationsbedingungen auf die Amplifikation beschrieben.
Der erste Schritt einer üblichen PCR-Amplifikation besteht aus einer Hitzedenaturierung der doppelsträngigen Zielnucleinsäure. Die genauen zur Denaturierung der Probennucleinsäure erforderlichen Bedingungen hängen von der Länge und Zusammensetzung der Probennucleinsäure ab. Üblicherweise bewirkt eine Inkubation bei 90 bis 100ºC etwa 10 Sekunden bis zu etwa 4 Minuten die vollständige Denaturierung der Probennucleinsäure. Der anfängliche Denaturierungsschritt kann als Präreaktionsinkubation zur Reaktivierung der DNA-Polymerase dienen. Je nach der Länge und Temperatur des anfänglichen Denaturierungsschritts und des zur Inaktivierung der DNA-Polymerase verwendeten Modifikators kann die Wiederherstellung der DNA-Polymeraseaktivität jedoch unvollständig sein. Wenn eine maximale Wiederherstellung der Enzymaktivität gewünscht wird, kann die Präreaktionsinkubation ausgedehnt oder alternativ die Zahl der Amplifikationszyklen erhöht werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden das modifizierte Enzym und die anfänglichen Denaturierungsbedingungen so gewählt, daß nur ein Bruchteil der wiederherstellbaren Enzymaktivität während des anfänglichen Inkubationsschritts wiederhergestellt wird. Anschließende, jeweils einen Hochtemperaturdenaturierungsschritt einschließende PCR-Zyklen bewirken eine zunehmende Wiederherstellung der Enzymaktivität. So zieht sich die Aktivierung der Enzymaktivität über den anfänglichen Zyklus der Amplifikation hinaus hin. Diese "zeitlich verzögerte Freisetzung" der DNA-Polymeraseaktivität wurde zur weiteren Verringerung der nicht- spezifischen Amplifikation eingehalten. Es ist bekannt, daß ein Überschuß an DNA- Polymerase zu. einer nicht-spezifischen Amplifikation beiträgt. In den erfindungsgemäßen Verfahren ist die vorhandene Menge von DNA-Polymeraseaktivität während der anfänglichen Stadien der Amplifikation bei einer kleinen Zahl von Zielsequenzen gering, wodurch die Menge von gebildeten nicht-spezifischen Extensionsprodukten reduziert wird. Die maximale DNA-Polymeraseaktivität ist während der letzten Stadien der Amplifikation bei einer hohen Zahl von Zielsequenzen vorhanden, was hohe Amplifikationsausbeuten ermöglicht. Falls erforderlich, kann die Zahl von Amplifikationszyklen erhöht werden, um die in den anfänglichen Zyklen vorhandene geringere Menge von DNA-Polymeraseaktivität zu kompensieren. Die Wirkung der Variierung der Zahl der Amplifikationszyklen auf die Amplifikation ist in den Beispielen beschrieben.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Verfahren keine Manipulation des Reaktionsgemisches nach der anfänglichen Herstellung des Reaktionsgemisches erfordern. Daher sind die Verfahren ideal zur Verwendung in automatisierten Amplifikationssystemen und in in-situ-Amplifikationsverfahren, in denen die Zugabe von Reagenzien nach dem anfänglichen Denaturierungsschritt oder der Verwendung von Wachsbarrieren unbequem oder unpraktisch ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zur Reduktion der nicht-spezifischen Amplifikation in einer PCR besonders geeignet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf irgendein bestimmtes Amplifikationssystem beschränkt. Die erfindungsgemäßen reversibel inaktivierten Enzyme können in jedem auf Primern beruhenden Amplifikationssystem, in dem thermostabile Enzyme verwendet werden und das sich auf die Reaktionstemperatur zum Erhalt der Amplifikationsspezifität verläßt, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf thermostabile Enzyme verwendende isothermale Amplifikationssysteme angewendet werden. Nur eine vorübergehende Inkubation bei einer erhöhten Temperatur ist zur Wiederherstellung der Enzymaktivität erforderlich. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Hochtemperaturinkubation zur Wiederherstellung der Enzymaktivität unterzogen wurde, wird die Reaktion bei einer geeigneten Reaktionstemperatur durchgeführt.
Weitere Amplifikationsverfahren neben der PCR (US-Patent Nr. 4,683,195; 4,683,202; und 4,965,188) schließen, jedoch ohne Beschränkung darauf, die nachstehend beschriebenen ein: Ligasekettenreaktion (Ligase Chain Reaction (LCR, Wu und Wallace, Genomics 4 (1989), 560-569, und Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 189-193)); Polymerase-Ligasekettenreaktion (Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany, PCR Methods and Applic. 1 (1991), 5-16)); Gap-LCR (PCT- Patentveröffentlichung Nr. WO 90/01069); Repair Chain Reaction (Europäische Patentveröffentlichung Nr. 439,182 A2), 3SR (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173-1177; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1874-1878; PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/08800, und NASBA (US-Patent Nr. 5,130,238). Diese Erfindung ist nicht auf irgendein bestimmtes Amplifikationssystem begrenzt. Wenn andere Systeme entwickelt werden, können diese Systeme von der Durchführung dieser Erfindung profitieren. Eine kürzlicher Überblick über Amplifikationssysteme wurde in Abramson und Myers, Current Opinion in Biotechnology 4 (1993), 41-47, veröffentlicht.
Für jede Amplifikationsreaktion geeignete Probenherstellungsverfahren sind auf dem Fachgebiet beschrieben worden (vgl. beispielsweise Sambrook et al., a. a. O., und die vorstehend angegebenen Hinweise, die das Amplifikationsverfahren beschreiben). Einfache und schnelle Verfahren zur Herstellung von Proben für die PCR- Amplifikation von Zielsequenzen werden von Higuchi, 1989, in PCR Technology (Erlich, Hrsg., Stockton Press, New York) und in PCR Protocols, Kapitel 18-20 (Innis et al., Hrsg., Academic Press, 1990) beschrieben. Ein Fachmann kann ein geeignetes Protokoll auswählen und empirisch optimieren.
Verfahren zum Nachweis von amplifizierten Produkten wurden ausführlich in der Literatur beschrieben. Standardverfahren schließen eine Analyse durch Gelelektrophorese oder Hybridisierung mit Oligonucleotidsonden ein. Der Nachweis von Hybriden, die sich zwischen Sonden und amplifizierter Nucleinsäure bilden, können in einer Reihe von Formaten, einschließlich dem Dot-Blot-Testformat und dem reversen Dot-Blot-Testformat, durchgeführt werden. (Vgl. Saiki et al., Nature 324 (1986), 163- 166; Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6230; PCT-Patentanmeldung Nr. WO 89/11548; US-Patent mit den Nrn. 5,008,182 und 5,176,775; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Hrsg. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA): 337-347. Reverse Dot-Blot-Verfahren unter Verwendung von Mikrotiterplatten werden in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 141,355 (entspricht der EP-A-0 420 260); US-Patent Nr. 5,232,829; Loeffelholz et al., J. Clin. Microbiol. 30(11) (1992), 2847-2851; Mulder et al., J. Clin. Microbiol. 32(2) (1994), 292-300; und Jackson et al., AIDS 5 (1991), 1463-1467, beschrieben.
Ein weiteres geeignetes Testverfahren mit der Bezeichnung 5'-Nucleasetest wird im US-Patent Nr. 5,210,015 und von Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 7276-7280, beschrieben. Im 5'-Nucleasetest werden markierte Sonden zusammen mit der Primerextension durch die 5' zu 3'-Exonucleaseaktivität der DNA- Polymerase, z. B. Taq-DNA-Polymerase, abgebaut. Der Nachweis des Sondenabbauprodukts zeigt sowohl an, daß eine Hybridisierung zwischen Sonde und Ziel-DNA als auch die Amplifikationsreaktion erfolgte. US-Patent Nr. 5,491,063 (entspricht der EP-A-0 699 768) und EP-A-0 713 921 offenbaren verbesserte Verfahren zum Nachweis des Abbaus der Sonde, der zusammen mit der Amplifikation erfolgt.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Amplifikation einer Nucleinsäure durch Überwachung der Erhöhung der Gesamtmenge von doppelsträngiger DNA im Reaktionsgemisch wird in Higuchi et al., Bio/Technology 10 (1992), 413-417; Higuchi et al., Bio/Technology 11 (1993), 1026-1030; und den europäischen Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 487,218 und 512,334 offenbart. Der Nachweis von doppelsträngiger Ziel-DNA beruht auf der erhöhten Fluoreszenz, die Ethidiumbromid (EtBr) und andere DNA-Bindungsmarker nach einer Bindung an doppelsträngige DNA zeigen. Die Erhöhung von doppelsträngiger DNA durch Synthese von Zielsequenzen bewirkt eine nachweisbare Erhöhung der Fluoreszenz. Ein Problem in diesem Verfahren ist, daß die Synthese der Nicht-Zielsequenz, d. h. die nicht-spezifische Amplifikation, eine Erhöhung der Fluoreszenz bewirkt, die den Nachweis der Synthese von Zielsequenzen durch Messung der Erhöhung der Fluoreszenz stört. So sind die erfindungsgemäßen Verfahren durch Reduktion der nicht-spezifischen Amplifikation besonders nützlich, da sie die Erhöhung der Fluoreszenz durch Amplifikation von Nicht- Zielsequenzen minimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, Multibehältereinheiten, die nützliche Bestandteile zur Durchführung der vorliegenden Erfindung umfassen. Ein nützlicher Kit enthält ein reversibel inaktiviertes thermostabiles Enzym und ein oder mehrere Reagenzien zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion, wie Oligonucleotidprimer, Substratnucleosidtriphosphate, Cofaktoren und einen geeigneten Puffer.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele der vorliegenden Erfindung sollen die Erfindung lediglich erläutern und nicht ihren Schutzbereich einschränken. Zahlreiche erfindungsgemäße Ausführungsformen im Schutzbereich der Ansprüche, die den Beispielen folgen, sind dem Fachmann nach der Lektüre des vorstehenden Textes und den nachstehenden Beispielen bewußt.

Beispiel 1

Polymerase-Aktivitätstest

Alle Messungen der nachstehend in den Beispielen beschriebenen DNA- Polymeraseaktivität wurden unter Verwendung des nachstehenden DNA-Polymeraseaktivitätstests durchgeführt. Der Test ist im wesentlichen wie von Lawyer et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 6427-6437, und in der AmpliTaq®DNA-Polymeraseproduktbeilage (Perkin Elmer, Norwalk, CT), die beide hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind, beschrieben.
Eine Einheit an Enzymaktivität wird als die Menge definiert, die in einer 10- minütigen Inkubation bei 74ºC 10 nmol dNTPs pro 30 Minuten in säureunlösliches Material einbaut. Aufgrund der Labilität der modifizierten Enzyme wurden die Aktivitäten bei 50ºC gemessen und in Bezug auf eine ebenfalls bei 74ºC getesteten Standard-Taq-DNA-Polymerase-Lösung normalisiert. Die Reaktionen wurden in einem 50 ul-Volumen durchgeführt, das die nachstehenden Reagenzien enthielt:
25 mM TAPS (Tris(hydroxymethyl)methylaminopropansulfonsäure, Natriumsalz), pH 9,3 (bei Raumtemperatur);
50 mM KCl;
2 mM MgCl&sub2;;
1 mM β-Mercaptoethanol;
200 uM jeweils von dATP, dGTP und dTTP;
100 uM [ -³²P]-dCTP (0,05 bis 0,1 Ci/nmol);
Aktivierte Lachssperma-DNA.

Beispiel 2

Citraconylierung der Tag-DNA-Polymerase

Dieses Beispiel beschreibt die Modifikation der Taq-DNA-Polymerase unter Verwendung von Citraconsäureanhydrid. Messungen der Aktivität der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase, die das zum Erhalt einer vollständigen Inaktivierung der DNA- Polymeraseaktivität erforderliche molare Verhältnis von Modifikator zu Enzym in der Inaktivierungsreaktion zeigen, werden nachstehend in Beispiel 3 beschrieben.
Die Taq-DNA-Polymerase (AmpliTat, Perkin Elmer, Norwalk CT) wurde bei einer anfänglichen Konzentration von 1,3 mg/ml verwendet. In den anfänglichen Experimenten wurde die Taq-DNA-Polymerase zunächst gegen einen 1000fachen Überschuß an Volumen von 0,1 M Natriumborat bei einem pH von 8,63 dialysiert. Es wurde festgestellt, daß dieser Schritt nicht kritisch ist und in späteren Experimenten wurde die Taq-DNA-Polymerase in einem Tris-Puffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 65 mM KCl, pH 7,5) direkt ohne Dialyse gegen Natriumborat verwendet.
Citraconsäureanhydrid (11,06 M) ist im Handel erhältlich (Aldrich, Milwaukee, WI). Eine Ausgangslösung von Citraconsäureanhydrid wurde durch 100fache Verdünnung von 11,06 M Citraconsäureanhydrid in DMF (N,N-Dimethylformamid) erzeugt.
Für einen Satz von Modifikationsreaktionsgemischen wurde eine Verdünnungsreihe der Citraconsäureanhydridlösung durch wiederholte 2fache Verdünnungen in DMF erzeugt. In Bezug auf jede Lösung in der Reihe wurden 4 ul verdünnte Citraconsäureanhydridlösung zu 400 ul Taq-DNA-Polymerase-Lösung (mit einer Natriumborat-Dialyse) zugesetzt, was zu Lösungen führte, die molare Verhältnisse von Citraconsäureanhydrid zu Taq-DNA-Polymerase von etwa 80/1, 40/1, 20/1 und 10/1 enthielten. Die Lösungen wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert, um die Taq-DNA- Polymerase zu inaktivieren. Wie hier verwendet, wird ein Enzym, das in einer Reaktion mit einem N-fachen molaren Überschuß von Modifikator modifiziert wurde, als NX- Enzym bezeichnet. Daher werden die erhaltenen citraconylierten Taq-DNA-Polymerasen hier als 80X, 40X, 20X und 10X Taq-DNA-Polymerasen bezeichnet.
Weitere Modifikationsreaktionen wurden unter Verwendung von etwa 80X, 160X und 240X molaren Verhältnissen von Citraconsäureanhydrid zu Taq-DNA- Polymerase (ohne Natriumboratdialyse) durchgeführt. Die 160X- und 240X-Verhältnisse wurden durch eine geeignete Einstellung der Ausgangslösung des 11,06 M Citraconsäureanhydrids in DMF (N,N-Dimethylformamid) erzeugt. Beispielsweise wurden für ein finales 160X-Verhältnis 11,06 M Citraconsäureanhydrid 1/50 in DMF verdünnt und 4 ul der erhaltenen Citraconsäureanhydrid-Ausgangslösung wurden zu 400 ul Taq-DNA-Polymerase-Lösung zugesetzt. Die erhaltenen citraconylierten Taq-DNA- Polymerasen werden hier als 240X, 160X und 80X Taq-DNA-Polymerasen bezeichnet.

Beispiel 3

Inaktivierung und Hitzewiederherstellung der DNA-Polymeraseaktivität bei Verwendung von Citraconsäureanhydrid

Dieses Beispiel beschreibt Aktivitätsmessungen der citraconylierten Taq- DNA-Polymerasen von Beispiel 2 sowohl vor als auch nach der Reaktivierung der citra conylierten Taq-DNA-Polymerase durch Hitzeinkubation. Die Wirkung des pH-Werts auf die Menge an wiederhergestellter Aktivität nach der Hitzereaktivierung der citraconylierten Taq-DNA-Polymerasen wurde gemessen.
Proben der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase wurden 1/200 in einem Puffer verdünnt, der aus 10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 2 mM MgCl&sub2;, 0,5% Tween 20, 0,5% NP-40 und 16% Glycerin bestand. Der pH-Wert des Puffers war 8,25 bei Raumtemperatur. Verdünnte Proben der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase wurden 20 Minuten bei 90ºC inkubiert oder bei Raumtemperatur als eine Kontrolle gehalten. Nach der Behandlung wurden die Proben 1/5 in einem Enzymverdünnungspuffer (25 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM β-Mercaptoethanol, 0,5% TweenTM 20, 0,5% NP- 40 und 0,1% Gelatine) verdünnt und die Aktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die DNA-Polymeraseaktivitäten nach einer Behandlung sind nachstehend dargestellt. Das molare Verhältnis bezieht sich auf das in der Modifizierungsreaktion verwendete molare Verhältnis von Citraconsäureanhydrid zu Taq-DNA-Polymerase. Jede der Aktivitäten ist der Durchschnitt von zwei Aktivitäten, die bei Probenduplikaten gemessen wurden.
Die vollständige Inaktivierung der Taq-DNA-Polymerase wurde unter Verwendung eines mehr als 20fachen molaren Überschusses von Citraconsäureanhydrid erhalten. Nach der Inkubation der vollständig inaktivierten Taq-DNA-Polymerase für 20 Minuten bei 90ºC wurde ein Minimum von 16% Aktivität wiederhergestellt.
Obwohl mehr Enzymaktivität unter Verwendung der 40X citraconylierten Taq-DNA-Polymerasen als unter Verwendung der 80X citraconylierten Taq-DNA- Polymerase gewonnen wurde, kann es praktischer sein, die 80X (oder mehr) citraconylierte Taq-DNA-Polymerase in einem im Handel erhältlichen Kit zu verwenden, um größere Herstellungstoleranzen zu ermöglichen.
Ähnliche Experimente wurden unter Verwendung eines auf pH 7,75 eingestellten Puffers bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend beschrieben.
Die gewonnene Menge an DNA-Polymeraseaktivität war bei niedrigerem pH größer.
Die Aktivitäten der 80X und 160X Taq-DNA-Polymerasen (ohne Natriumboratdialyse) wurden vor und nach der Reaktivierung durch Hitzeinkubation im wesentlichen wie vorstehend beschrieben gemessen. Der für die Inkubationen verwendete pH-Wert des Puffers betrug 8,0 bei Raumtemperatur. Die Ergebnisse sind nachstehend beschrieben. Jede der Aktivitäten ist der Durchschnitt von zwei Aktivitäten, die von Probenduplikaten gemessen wurden.
Die Wirkung des pH-Werts auf die Reaktivierung kann ferner beobachtet werden, indem bei Verwendung der 80X Taq-DNA-Polymerasen die wiederhergestellte Aktivität von den drei Reaktivierungen bei einem unterschiedlichen pH-Wert verglichen wird. Die vorstehenden Daten zeigen, daß eine Enzymaktivität selbst dann wiederhergestellt wird, wenn ein hoher molarer Überschuß von Modifikator in der Modifizierungsreaktion verwendet wird.

Beispiel 4

PCR-Amplifikation unter Verwendung der citraconylierten Taa-DNA-Polymerasen

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen citraconylierten thermostabilen Taq-DNA-Polymerase in PCR-Amplifikationen.

PCR-Protokoll

Die Amplifikationen wurden unter Verwendung von 1/20-, 1/40- und 1/80- Verdünnungen der modifizierten 240X Taq-DNA-Polymerase, die in Beispiel 2 beschrieben wird, durchgeführt. Die Verdünnungen wurden in einem Puffer hergestellt, der aus 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei Raumtemperatur), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 1 mM DTT (Dithiothreit), 50% Glycerin, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P40 (AmpliTaq®-Vorratspuffer, Perkin Elmer, Norwalk, CT) bestand. Zum Vergleich wurden Amplifikationen auch unter Verwendung von 1/10-, 1/20-, 1/40- und 1/80-Verdünnungen der nicht-modifizierten Taq-DNA-Polymerase durchgeführt.
Eine clonierte HTLV-I-Genomsequenz wurde unter Verwendung der Primer SK432 und SK111 amplifiziert. Die Primersequenzen werden im US-Patent Nr. 5,418,149 bereitgestellt, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die PCR wurde in einem 100 ul-Reaktionsvolumen unter den nachstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen durchgeführt.

Reaktionsgemisch:

30 Kopien der HTLV-I-DNA-Matrize
10 mM Tris, pH 8,3
50 mM KCl
0,5 uM jedes Primers
200 uM dATP, dCTP und dGTP
400 uM dUTP
0,5 ul citraconylierte Taq-DNA-Polymerase-Lösung
2,5 mM MgCl&sub2;
1 ng hpDNA
1 Einheit UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)

Schema des Temperaturzyklus:

Präreaktionsinkubation: (90ºC über 10 Minuten)
2 Zyklen
Denaturierung 98ºC über 1 Minute
Anelierung/Extension 60ºC über 2 Minuten
38 Zyklen
Denaturierung 94ºC über 1 Minute
Anelierung/Extension 60ºC über 1 Minute
Endinkubation: 60ºC über 7 Minuten
Die amplifizierten Produkte wurden durch 4% Agarosegelelektrophorese unter Verwendung eines 1X TBE (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure und 0,0025 M Dinatrium-EDTA) Laufpuffers analysiert. Die Elektrophorese wurde bei 100 Volt für etwa 2 Stunden durchgeführt. Ethidiumbromid (0,5 ug/ml) wurde nach der Elektrophorese zur Färbung jeder vorhandenen DNA zugesetzt. Das Gel wurde in 1X TBE entfärbt und die Ethidiumbromid-gefärbten Banden von DNA wurden unter Verwendung von UV-Strahlung sichtbar gemacht.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die Bande, die der amplifizierten Zielsequenz entspricht, ist angezeigt. Die auf dem Gel erscheinenden Banden, die sich von der der amplifizierten Zielsequenz entsprechenden Bande unterscheiden, entsprechen den Produkten, die durch die nicht-spezifische Amplifikation von Nicht- Zielsequenzen erzeugt werden. Die Wirkung der Amplifikation unter Verwendung der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase (markierte Taq, HS) kann durch einen Vergleich des Bandenmusters und der Intensität innerhalb jeder der Bahnen beobachtet werden. Da die Amplifikation von nicht-spezifischen Produkten mit der Amplifikation der Zielsequenz konkurriert, zeigt eine Erhöhung der Amplifikation der Zielsequenz ferner die Menge der Reduktion der nicht-spezifischen Amplifikation. Daher zeigt die Änderung der relativen Menge von Produkten innerhalb jeder Bahn am besten die Wirkung von Präreaktionsbehandlungen auf die nicht-spezifische Amplifikation.
Amplifikationen unter Verwendung der nicht-modifizierten Taq-DNA- Polymerase führte zu einem überwiegend nicht-spezifischen Amplifikationsprodukt. Die Verwendung der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase bewirkte eine signifikante Erhöhung der Intensität der der amplifizierten Zielsequenz entsprechenden Bande und eine signifikante Abnahme der Intensität der den nicht-spezifischen Amplifikationsprodukten entsprechenden Banden. Die Daten zeigen, daß die PCR-Amplifikation unter Verwendung einer reversibel inaktivierten DNA-Polymerase die nicht-spezifische Amplifikation signifikant reduziert und die Menge an gewünschter amplifizierter Zielsequenz signifikant erhöht.

Beispiel 5

Weitere citraconylierte thermostabile DNA-Polymerasen

Dieses Beispiel beschreibt die Citraconylierung von mehreren anderen thermostabilen DNA-Polymerasen zusätzlich zur vorstehend beschriebenen Taq-DNA- Polymerase. Die folgenden thermostabilen DNA-Polymerasen wurden modifiziert:
1) Eine thermostabile DNA-Polymerase von Thermus thermophilus (rTth, Perkin Elmer, Norwalk, CT), wie in der WO 91/09950 offenbart, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
2) Eine mutierte thermostabile DNA-Polymerase von Thermatoga maritima (UITmaTM, Perkin Elmer, Norwalk, CT), wie in der WO 92/03556 offenbart, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
3) Eine mutierte Form der thermostabilen DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, der die 3'- nach 5'-Exonuclease-Aktivität fehlt, wie in der WO 92/06200 offenbart, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Dieses Enzym wird hier als Taq CS oder AmpliTaq®CS bezeichnet.
Für jede der vorstehend beschriebenen drei DNA-Polymerasen wurde eine anfängliche Lösung bei einer ungefähren Konzentration von 200 Einheiten/ul hergestellt. Zum Vergleich sind 1,3 mg/ml Taq-DNA-Polymerase, wie in den vorstehenden Beispielen verwendet, zu 260 Einheiten/ul etwa äquivalent. Jede der DNA-Polymerasen wurde im wesentlichen wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben modifiziert. 10 ul Citraconsäureanhydrid wurden in 500 ul DMF verdünnt. Anschließend wurden 10 ul verdünntes Citraconsäureanhydrid mit 1 000 ul jeder der Enzymlösungen kombiniert. Die erhaltenen Lösungen wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert.

Beispiel 6

PCR-Amplifikation unter Verwendung von citraconylierten DNA-Polymerasen

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung der in den Beispielen 2 und 5 beschriebenen citraconylierten thermostabilen DNA-Polymerasen in den PCR-Amplifikationen.

PCR-Protokoll

Die Amplifikationen wurden unter Verwendung von Verdünnungen von modifizierten DNA-Polymerasen durchgeführt. Verdünnungen erfolgten in einem Puffer, der aus 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei Raumtemperatur), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 1 mM DTT (Dithiothreit), 50% Glycerin, 0,5% TweenTM 20, 0,5% Nonidet P40 (AmpliTaq®-Vorratspuffer, Perkin Elmer, Norwalk, CT) bestand.
Eine HIV-1-Genomsequenz wurde unter Verwendung der Primer SK145 und SK431 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) amplifiziert. Die Primer SK145 und SK431 werden im US-Patent Nr. 5,481,149 und in den nachstehenden wissenschaftlichen Veröffentlichungen offenbart: SK145 wird in Kwok et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 999-1005, und SK 431 in Jackson et al., AIDS 5 (1991), 1463-1467, beschrieben. Die PCR wurde in 100 ul-Reaktionsvolumen unter den nachstehenden Reaktionsbedingungen durchgeführt.

Reaktionsgemisch:

100 Kopien der HIV-1-DNA-Matrize
10 mM Tris, pH 8,3
50 mM KCl
0,5 uM jedes Primers
200 uM dATP, dCTP und dGTP
400 uM dUTP
0,5 ul DNA-Polymerase-Lösung
2,5 mM MgCl&sub2;
1 ug hpDNA
1 Einheit UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)

Schema des Thermalzyklus:

Präreaktionsinkubation: (95ºC über 12 Minuten)
38 Zyklen
Denaturierung 94ºC über 1 Minute
Anelierung/Extension 60ºC über 1 Minute
Endinkubation: 60ºC über 7 Minuten
Der Präreaktionsinkubationsschritt dient auch als anfänglicher Denaturierungsschritt. Ein anfänglicher Denaturierungsschritt wird routinemäßig in einer üblichen Amplifikationsreaktion zur Sicherstellung der vollständigen Denaturierung des doppelsträngigen Ziels verwendet. Jeder Zyklus der PCR beginnt mit einem Denaturierungsschritt von 94ºC über 1 Minute. Daher wird unmittelbar nach der anfänglichen Präreaktionsinkubation, die 12 Minuten bei 95ºC durchgeführt wird, das Reaktionsgemisch 1 Minute bei 94ºC während des Denaturierungsschritts des ersten Zyklus inkubiert.
Die amplifizierten Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese (100 ml 3% NuSieve® und 0,5% SeaChem®) unter Verwendung eines 1X TBE (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure und 0,0025 M Dinatrium-EDTA) Laufpuffers analysiert. Die Elektrophorese wurde bei 100 Volt über etwa 1 Stunde durchgeführt. Ethidiumbromid (0, 5 ug/ml) wurde nach der Elektrophorese zur Färbung jeder vorhandenen DNA zugesetzt. Das Gel wurde in TBE entfärbt und die Ethidiumbromid-gefärbten Banden von DNA wurden unter Verwendung von UV-Strahlung sichtbargemacht.

Amplifikationen unter Verwendung von citraconylierten DNA-Polymerasen

Verdünnungen (1/10, 1/20, 1/40 und 1/80) der in Beispiel 5 beschriebenen citraconylierten DNA-Polymerasen und die citraconylierte 240X Taq-DNA-Polymerase, die in Beispiel 2 beschrieben ist, wurden in den Amplifikationen der HIV-1- Nucleinsäure verwendet und die amplifizierten Produkte durch Agarose- Gelelektrophorese analysiert. Zum Vergleich wurden Amplifikationen unter Verwendung von Verdünnungen der nicht-modifizierten Taq-DNA-Polymerase durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Die Bande, die der amplifizierten Zielsequenz entspricht, ist angegeben. Die auf dem Gel erscheinenden Banden, die sich von der der amplifizierten Zielsequenz entsprechenden Bande unterscheiden, entsprechen den Produkten, die durch die nicht-spezifische Amplifikation von Nicht- Zielsequenzen erzeugt werden. Die Wirkung der Amplifikation unter Verwendung einer citraconylierten DNA-Polymerase kann durch einen Vergleich des Bandenmusters und der Intensität innerhalb jeder der Bahnen beobachtet werden. Da die Amplifikation von nicht-spezifischen Produkten mit der Amplifikation der Zielsequenz konkurriert, zeigt eine Erhöhung der Amplifikation der Zielsequenz ferner die Menge der Reduktion der nicht-spezifischen Amplifikation. Daher zeigt die Änderung der relativen Menge von Produkten innerhalb jeder Bahn am besten die Wirkung von Präreaktionsbehandlungen auf die nicht-spezifische Amplifikation.
Die Amplifikationen unter Verwendung der nicht-modifizierten Taq-DNA- Polymerasen führten zu einem überwiegend nicht-spezifischen Amplifikationsprodukt für verschiedene Verdünnungen des Enzyms. Die Verwendung der citraconylierten Taq- DNA-Polymerase führte zu einer intensiven Bande, die der amplifizierten Zielsequenz in allen außer der 1/80-Verdünnung entsprach, und eine signifikante Abnahme der Intensität der Bande, die nicht-spezifischen Amplifikationsprodukten entsprach. Die Daten zeigen, daß die PCR-Amplifikation unter Verwendung einer reversibel inaktivierten DNA-Polymerase die nicht-spezifische Amplifikation signifikant reduziert und die Menge an gewünschter amplifizierter Zielsequenz signifikant erhöht.
Die Verwendung der citraconylierten UITma-, Taq CS- und rTth-DNA- Polymerasen führte ebenfalls zu einer größeren Produktion des spezifischen Amplifikationsprodukts als in Amplifikationen beobachtet wurde, die die nichtmodifizierte Taq-DNA-Polymerase verwenden, wobei gleichzeitig die Menge von nichtspezifischem Amplifikationsprodukt reduziert wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verfahren für thermostabile DNA-Polymerasen allgemein verwendet werden können.
Es muß beachtet werden, daß, obwohl die Ergebnisse die Funktionalität der vorliegenden Erfindung zeigen, die Ergebnisse, die unter Verwendung der citraconylierten Taq-, UITma-, Taq CS- und rTth-DNA-Polymerasen erhalten werden, nicht direkt vergleichbar sind, da die Modifikationsbedingungen nicht vergleichbar für jede DNA-Polymerase optimiert wurden. Insbesondere wurde, obwohl jede anfängliche Lösung der DNA-Polymerase die gleichen Einheiten/ml enthielt, die Molarität der Lösungen nicht bestimmt und daher der molare Überschuß des Citraconsäureanhydrids in jeder Modifizierungsreaktion nicht ermittelt. Ein Fachmann erkennt, daß die optimalen Modifizierungsbedingungen empirisch unter Verwendung der hier beschriebenen Protokolle ermittelt werden können.

Beispiel 7

Cis-aconitylierte DNA-Polymerase

Dieses Beispiel beschreibt die Modifikation der Taq-DNA-Polymerase unter Verwendung von cis-Aconitsäureanhydrid.
Die Modifikation unter Verwendung von cis-Aconitsäureanhydrid wurde im wesentlichen, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, mit dem hauptsächlichen Unterschied, daß cis-Aconitsäureanhydrid als Pulver und nicht als Flüssigkeit verkauft wird. Die Taq-DNA-Polymerase (AmpliTaq®, Perkin Elmer, Norwalk, CT) in einem Tris-Puffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 68 mM HCl, pH 7,5) wurde bei einer Ausgangskonzentration von 1,3 mg/ml verwendet. Eine Ausgangslösung von cis- Aconitsäureanhydrid (Aldrich, Milwaukee, WI) wurde durch Lösung von 20 mg cis- Aconitsäureanhydrid in 1 ml 100% EtOH erzeugt.
Entweder 10 oder 20 ul cis-Aconitsäureanhydridlösung wurden zu 1000 ul Taq-DNA-Polymeraselösung zugesetzt, was zu Lösungen führte, die molare Verhältnisse von cis-Aconitsäureanhydrid zu Taq-DNA-Polymerase von etwa 90/ 1 und 180/1 enthielten. Die Lösungen wurden über Nacht bei 4ºC zur Inaktivierung der Taq- DNA-Polymerase inkubiert.
Der Vergleich der Amplifikationen unter Verwendung der cis-aconitylierten Taq-DNA-Polymerase und der Amplifikationen unter Verwendung der citraconylierten Taq-DNA-Polymerase ist nachstehend beschrieben.

Beispiel 8

Inaktivierung und Hitzewiederherstellung der DNA-Polymeraseaktivität bei Verwendung von cis-Aconitsäureanhydrid

Die Aktivitäten der cis-aconitylierten 90X und 180X Taq-DNA-Polymerasen, die in Beispiel 7 hergestellt wurden, wurden vor und nach der Reaktivierung durch Hitzeinkubation im wesentlichen wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Der Puffer-pH-Wert während der Inkubationen war 8,0. Die Ergebnisse sind nachstehend dargestellt. Jede der Aktivitäten ist der Durchschnitt von zwei Aktivitäten, die von Probenduplikaten gemessen wurden.
Ein Vergleich der Ergebnisse mit denen von Beispiel 3 zeigt, daß die cis- Aconitylierung leichter als die Citraconylierung rückgängiggemacht wird. Ein höherer molarer Überschuß von cis-Aconitsäureanhydrid ist zur vollständigen Inaktivierung der DNA-Polymerase erforderlich und mehr Aktivität wird nach einer Hochtemperaturinkubation wiederhergestellt. Der Grund für die Aktivitätsmessung von mehr als 100% nach der Modifikation mit einem 90fachen molaren Überschuß von cis- Aconitsäureanhydrid mit einer anschließenden Hitzereaktivierung ist unbekannt, kann jedoch durch Ungenauigkeit im Aktivitätstest verursacht sein oder eine tatsächliche Modifikation der DNA-Polymerase wiedergeben.

Beispiel 9

Wirkung der Präreaktionsinkubationszeit

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung der Präreaktionsinkubationszeit auf die Menge an erhaltenem Produkt.
Amplifikationen wurden unter Verwendung der wie vorstehend beschrieben hergestellten citraconylierten und cis-aconitylierten Taq-DNA-Polymerasen durchgeführt. Für jeden Satz von Amplifikationsbedingungen wurden Taq-DNA-Polymerasen verwendet, die unter Verwendung eines 80fachen und 160fachen molaren Überschusses von Citraconsäureanhydrid und eines 90fachen und 180fachen molaren Überschusses von cis-Aconitsäureanhydrid verwendet wurden. Amplifikationen wurden unter Verwendung des im vorstehenden Beispiel 6 beschriebenen HIV-1-Modellsystems durchgeführt, außer daß die anfängliche Präreaktionsinkubation variiert wurde. Für jedes Enzympräparat wurden Amplifikationen unter Verwendung von Präreaktionsinkubationen von 12, 6, 3 und 0 Minuten durchgeführt.
Wie vorstehend beschrieben, dient der Präreaktionsinkubationsschritt auch als anfänglicher Denaturierungsschritt. Jeder Zyklus einer PCR beginnt mit einem Denaturierungsschritt. Unmittelbar nach der anfänglichen Präreaktionsinkubation, die 12, 6, 3 oder 0 Minuten bei 95ºC durchgeführt wird, wird das Reaktionsgemisch 1 Minute bei 94ºC während des Denaturierungsschritts des ersten Zyklus inkubiert. Daher wird, selbst wenn keine Präreaktionsinkubation verwendet wurde, die Enzymaktivität während des Denaturierungsschritts der anfänglichen Zyklen wiederhergestellt.
Die Amplifikationsprodukte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Die der amplifizierten Zielsequenz entsprechende Bande wird angezeigt. Die auf dem Gel erscheinenden Banden, die sich von der der amplifizierten Zielsequenz entsprechenden Bande unterscheiden, entsprechen den Produkten, die durch nicht-spezifische Amplifikation von Nicht-Zielsequenzen erzeugt werden.
Die Ergebnisse zeigen, daß unter Verwendung der cis-aconitylierten DNA- Polymerase alle Präreaktionsinkubationszeiten zu einer starken Bande führten, die dem amplifizierten Produkt entsprach. Die ohne Präreaktionsinkubation durchgeführten Amplifikationen führten zu beinahe so viel Produkt wie die Amplifikationen unter Verwendung von verlängerten Präreaktionsinkubationen.
Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse, daß unter Verwendung der citraconylierten DNA-Polymerase eine Präreaktionsinkubation von mindestens 3 Minuten erforderlich war, um die maximale Menge von amplifiziertem Produkt zu erhalten. Die Amplifikationen, die ohne eine Präreaktionsinkubation durchgeführt wurden, führten zu einem signifikant geringer amplifizierten Produkt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität der cis-aconitylierten DNA-Polymerasen schneller als die der citraconylierten DNA-Polymerasen wiederhergestellt wird.

Beispiel 10

Wirkung der Zahl der Zyklen

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung der Erhöhung der Zahl der Amplifikationszyklen als Kompensation für einen kurzen Präreaktionsinkubationszeitraum.
Amplifikationen wurden unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerasen, die unter Verwendung eines 80fachen und 160fachen molaren Überschusses von Citraconsäureanhydrid und eines 90fachen und 180fachen molaren Überschusses von cis-Aconitsäureanhydrid modifiziert wurden, durchgeführt. Die Amplifikationen wurden im wesentlichen, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen HIV-1-Modellsystems durchgeführt, außer daß die anfängliche Präreaktionsinkubation und die Zahl der Zyklen variiert wurden. Für jedes Enzympräparat wurden Amplifikationen unter Verwendung der nachstehenden Bedingungen durchgeführt:

Präreaktionsinkubation Amplifikationszyklen

12 Minuten, 80ºC 60
0 60
0 48
0 43
0 39
Die Amplifikationsprodukte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Erhöhung der Zahl der Amplifikationszyklen den Verlust der Amplifikationseffizienz kompensiert, der von der unvollständigen Reaktivierung der Aktivität der DNA- Polymerase bewirkt wird, wenn keine Präreaktionsinkubation verwendet wird.
Bei jeder DNA-Polymerase führte eine Erhöhung der Zahl der Amplifikationszyklen zu einer Erhöhung der Menge des amplifizierten Produkts. Die Wirkung war am geringsten bei der Verwendung der cis-aconitylierten Taq-DNA- Polymerase, von der in Beispiel 9 gezeigt wurde, daß sie, falls überhaupt, eine geringe Präreaktionsinkubation benötigt.

Claims

1. Ein thermostabiles Enzym mit DNA Polymeraseaktivität oder Ligaseaktivität, worin die Enzymaktivität durch chemische Modifikation reversibel inaktiviert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das reversibel inaktivierte thermostabile Enzym mittels einer Reaktion einer Mischung eines thermostabilen Enzyms mit einem Modifizierungsreagenz hergestellt wurde, wobei diese Reaktion bei einem alkalischen pH und bei einer Temperatur die kleiner ist als etwa 25ºC durchgeführt wurde, wobei das Reagenz ein Dicarboxylsäureanhydtid der allgemeinen Formel:

ist, worin R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome oder organische Radikale sind, die miteinander verbunden sind, oder der allgemeinen Formel:

ist, worin R&sub1; und R&sub2; organische Radikale sind, die vorzugsweise miteinander verbunden sind und die Wasserstoffatome in cis Stellung sind und worin die Reaktion in einer im wesentlichen vollständigen Inaktivierung der Enzymaktivität resultiert.

2. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym gemäss Anspruch 1, worin eine Inkubation des chemisch modifizierten thermostabilen Enzyms in einem wässerigen Puffer bei einem alkalischen pH und bei einer Temperatur, die kleiner ist als etwa 25ºC, zu keinem signifikanten Anstieg in der Enzymaktivität in weniger als etwa 20 Minuten führt, und worin eine Inkubation des chemisch modifizierten Enzyms in einem wässerigen Puffer, der auf etwa pH 8-9 bei 25ºC eingestellt ist, bei einer Temperatur die grösser als 25 etwa 50ºC ist, zu einem mindestens zweifachen Anstieg der Enzymaktivität in weniger als etwa 20 Minuten führt.

3. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym gemäss Anspruch 1 oder 2, worin die reversibel inaktivierte Enzymaktivität eine thermostabile DNA Polymeraseaktivität ist und worin das Enzym die reversibel inaktivierte Form einer thermostabilen DNA Polymerase ist, die von einer Spezies, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Gattungen bestehend aus Thermus aquaticus, Thermus thermophilus und Thermotoga maritima herstammt.

4. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, das mit einem Modifizierungsreagenz hergestellt wurde, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Maleinsäureanhydrid, exo-cis-3,6-endoxo- Δ4-Tetrahydrophthalsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid, 3,4,5,6- Tetrahydrophthalsäureanhydrid, cis-Aconitsäureanhydrid, und 2,3- Dimethylmaleinsäureanhydrid.

5. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, das mittels einer Reaktion hergestellt wurde, worin das Modifizierungsreagenz in einem mehr als 20-fachen molaren Überschuss gegenüber dem thermostabilen Enzym eingesetzt ist.

6. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, das mittels einer Reaktion einer Mischung eines thermostabilen Enzyms mit einem Modifizierungsreagenz hergestellt wurde, wobei das thermostabile Enzym eine thermostabile DNA Polymerase ist, die von Thermus aquaticus herstammt und worin das Modifizierungsreagenz Citraconsäureanhydrid ist.

7. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, das mittels einer Reaktion einer Mischung eines thermostabilen Enzyms mit einem Modifizierungsreagenz hergestellt wurde, wobei das thermostabile Enzym eine thermostabile DNA Polymerase ist, die von Thermus thermophilus herstammt und worin das Modifizierungsreagenz cis-Aconitsäureanhydrid ist.

8. Ein Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten thermostabilen Enzyms, wobei das unmodifizierte Enzym DNA Polymeraseaktivität oder Ligaseaktivität besitzt, und wobei das Enzym durch die chemische Modifikation reversibel inaktiviert ist, wobei das Verfahren die Reaktion einer Mischung eines thermostabilen Enzyms mit einem Modifizierungsreagenz umfasst, wobei die Reaktion bei einem alkalischen pH, bei einer Temperatur die kleiner ist als etwa 25ºC durchgeführt wird, wobei das Reagenz ein Dicarboxylsäureanhydrid der allgemeinen Formel:

9. Das chemisch modifizierte thermostabile Enzym hergestellt gemäß einem Verfahren wie es in Anspruch 8 beansprucht ist.

10. Eine Methode zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure die in einer Probe vorhanden ist, die folgende Schritte umfasst:

(a) Kontaktieren der Probe mit einer Amplifikationsreaktionsmischung enthaltend einen Primer, der komplementär ist zu der Zielsequenz und ein chemisch modifiziertes thermostabiles Enzym wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 beansprucht ist, und

(b) Inkubation der aus Schritt (a) resultierenden Mischung bei einer Temperatur, die grösser ist als etwa 50ºC während einer Zeit, die ausreicht das chemisch modifizierte thermostabile Enzym zu reaktivieren und so die Bildung von Primerverlängerungsprodukten erlaubt.

11. Eine Polymerase-Kettenreaktionsamplifikationsreaktionsmischung bestehend aus einem Primerpaar und einem chemisch modifizierten thermostabilen Enzym wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 beansprucht ist.

12. Ein Kit zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion enthaltend ein chemisch modifiziertes thermostabiles Enzym wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 beansprucht ist.