DE60034396T2 - Reaktionsgemisch und Verfahren für RT-PCR mittels einer homopolymeren Nukleinsäure - Google Patents

Reaktionsgemisch und Verfahren für RT-PCR mittels einer homopolymeren Nukleinsäure Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Molekularbiologie. Die vorliegende Erfindung zielt ab auf neue Zusammensetzungen und Methoden, die für die Erzeugung von Nukleinsäuren von einer Ribonukleinsäure-Matrize und des Weiteren für eine Nukleinsäurereplikation nützlich sind. Spezifisch zielt die Erfindung auf die Erzeugung und Amplifikation von Nukleinsäuren durch die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR).
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Nachweis, die Analyse, die Transkription und die Amplifikation von Nukleinsäuren sind die wichtigsten Verfahren in der modernen Molekularbiologie. Die Anwendung solcher Verfahren zur RNA-Analyse ist besonders wichtig bei der Erforschung der Genexpression, der Diagnose infektiöser Agenzien oder genetischer Erkrankungen, der Erzeugung von cDNA und der Analyse von Retroviren, um nur einige Anwendungen zu nennen. Die reverse Transkription von RNA, gefolgt von einer Amplifikation durch die Polymerase-Ketten-Reaktion, gewöhnlich als RT-PCR oder RNA-PCR bezeichnet, wird zum Nachweis und zur Mengenbestimmung von RNA viel verwendet.
  • Das RT-PCR-Verfahren schließt zwei verschiedene molekulare Synthesen ein: (i) die Synthese von cDNA von einer RNA-Matrize; und (ii) die Replikation der neu synthetisierten cDNA durch PCR-Amplifikation. RT-PCR kann nach drei allgemeinen Protokollen durchgeführt werden: (1) ungekoppelte RT-PCR, auch als Zwei-Schritt-RT-PCR bezeichnet; (2) mit einem Enzym gekoppelte RT-PCR (gekoppelte RT-PCR wird auch als Ein-Schritt-RT-PCR oder kontinuierliche RT-PCR bezeichnet), bei der eine einzelne Polymerase sowohl für die Bildung der cDNA von einer RNA als auch für die nachfolgende DNA-Amplifikation verwendet wird; und (3) mit zwei (oder mehr) Enzymen gekoppelte RT-PCR, bei der mindestens zwei getrennte Polymerasen für die anfängliche cDNA-Synthese und die nachfolgende Replikation verwendet werden.
  • Bei der ungekoppelten RT-PCR wird die reverse Transkription als unabhängiger Schritt durchgeführt unter Verwendung von Puffer und Reaktionsbedingungen, die für die Aktivität der Reversen Transkriptase optimal sind. Nach der cDNA-Synthese wird ein Aliquot des RT-Reaktionsproduktes als Matrize für die PCR-Amplifikation mit einer hitzestabilen DNA-Polymerase, wie z.B. Taq-DNA-Polymerase, verwendet, unter Bedingungen, die zur PCR-Amplifikation optimal sind.
  • Bei der gekoppelten RT-PCR werden reverse Transkription und PCR-Amplifikation in einem einzigen Reaktionsgemisch kombiniert. Ein-Enzym-RT-PCR verwendet die Reverse-Transkriptase-Aktivität einiger DNA-Polymerasen, wie z.B. Taq-DNA-Polymerase und Tth-DNA-Polymerase, während Zwei-Enzym-RT-PCR charakteristischerweise eine retrovirale oder bakterielle Reverse Transkriptase verwendet (z.B. AMV-RT, MMLV-RT, HIV-RT, EIA-RT, RAV2-RT, Carboxydothermus hydrogenoformans-DNA-Polymerase oder eine Mutante, eine Variante oder ein Derivat davon) und eine hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. Taq, Tbr, Tth, Tih, Tfi, Tfl, Pfu, Pwo, Kod, VENT, DEEPVENT, Tma, Tne, Bst, Pho, Sac, Sso, ES4 und andere oder eine Mutante, eine Variante oder ein Derivat davon).
  • Gekoppelte RT-PCR bietet zahlreiche Vorteile gegenüber ungekoppelter RT-PCR. Gekoppelte RT-PCR erfordert weniger Handhabung der Reagenzien des Reaktionsgemisches und der Nukleinsäureprodukte als ungekoppelte RT-PCR (z.B. Öffnen des Reaktionsglases zum Zufügen von Bestandteilen oder Enzym zwischen den beiden Reaktionsschritten), und ist deshalb weniger arbeitsintensiv, indem sie die benötigte Zahl an Personenstunden verringert. Gekoppelte RT-PCR benötigt auch weniger Proben und verringert das Kontaminationsrisiko (Sellner und Turbett, 1998).
  • Mit einem einzigen Enzym gekoppelte RT-PCR ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt das einfachste RT-PCR-Verfahren. Jedoch ist dieses System wegen der Menge an DNA-Polymerase, die benötigt wird, teuer in der Durchführung. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass die mit einem Enzym gekoppelte RT-PCR-Methode weniger sensitiv ist als ungekoppelte RT-PCR (Cusi et al., 1994), und darauf beschränkt ist, Nukleinsäuren von weniger als einem Kilobasenpaar (> 1 kbp) Länge zu polymerisieren. RT-PCR-Systeme mit zwei Enzymen zeigen im Allgemeinen eine erhöhte Sensitivität im Vergleich zum System mit einem Enzym, sogar wenn sie in einem einzigen Reaktionsgemisch gekoppelt sind. Dieser Effekt wurde der höheren Effizienz der Reversen Transkriptase im Vergleich zur Reverse-Transkriptase-Aktivität der DNA-Polymerasen zugeschrieben (Sellner und Turbett, 1998).
  • Obwohl das mit zwei Enzymen gekoppelte RT-PCR-System sensitiver als das ungekoppelte Protokoll ist, stellte man fest, dass die Reverse Transkriptase während der Replikation der cDNA direkt die DNA-Polymerase stört und somit die Sensitivität und Effizienz dieser Technik vermindert (Sellner et al., 1992; Aatsinki et al., 1994; Mallet et al., 1995). Es wurden verschiedene Lösungen versucht, um die hemmende Aktivität der Reversen Transkiptase auf die DNA-Polymerase zu überwinden, einschließlich: Erhöhung der Menge an Matrizen-RNA, Erhöhung des Verhältnisses von DNA-Polymerase zu Reverser Transkiptase, Zugabe von Modifizierungs-Reagenzien, die den hemmenden Effekt der Reversen Transkriptase auf die DNA-Polymerase vermindern können (z. B. nichthomologe tRNA, T4-Gen-32-Protein, Schwefel oder Acetat enthaltende Moleküle) und Hitze-Inaktivierung der Reversen Transkriptase vor der Zugabe von DNA-Polymerase.
  • Sellner et al. ... "Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity", Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 7, 1487-1490, beschreiben, dass der Nachweis viraler RNA durch die Polymerase-Ketten-Reaktion zuerst die reverse Transkription der viralen RNA erfordert, um die Anzahl an manuellen Bearbeitungen zu vermindern, die für die Verarbeitung einer großen Anzahl an Proben notwendig sind. Sellner et al. versuchten, ein System zu schaffen, bei dem alle Reagenzien, die sowohl für die reverse Transkription als auch für die Amplifikation notwendig sind, in ein Reagenzglas zugegeben werden können und ein einzelnes, nicht unterbrochenes, zyklisches Erhitzungs-Programm durchgeführt werden kann. Während des Versuchs, ein solches Ein-Reagenzglas-System mit Taq-Polymerase und Myoblastis-Virus von Vögeln zu errichten, stellten Sellner et al. eine beträchtliche Abnahme der Sensitivität für den Nachweis der viralen RNA fest. Sellner et al. ermittelten eine direkte Beeinträchtigung der Taq-Polymerase durch die Reverse Transkriptase.
  • Alle diese modifizierten RT-PCR-Methoden haben jedoch wesentliche Nachteile. Die Menge an Matrizen-RNA zu erhöhen ist in Fällen, in denen nur begrenzte Probenmengen zur Verfügung stehen, nicht möglich. Eine individuelle Optimierung des Verhältnisses von Reverser Transkriptase zu DNA-Polymerase ist nicht möglich für gebrauchsfertige Reagenz-Kits für die Ein-Schritt-RT-PCR. Der Netto-Effekt von gegenwärtig vorgeschlagenen Modifizierungs-Reagenzien, um die Hemmung der DNA-Polymerisation durch Reverse Transkriptase abzuschwächen, ist umstritten und wird bezweifelt: Positive Wirkungen durch diese Reagenzien hängen in hohem Maße von der Menge der RNA-Matrize ab, von der RNA-Zusammensetzung oder können bestimmte Reverse-Transkriptase-DNA-Polymerase-Kombinationen erfordern (siehe z.B. Chandler et al., 1998). Schließlich beseitigt Hitzeinaktivierung der Reversen Transkriptase vor der Zugabe von DNA-Polymerase die Vorteile der gekoppelten RT-PCR und bringt all die Nachteile des ungekoppelten Systems mit sich, die zuvor diskutiert wurden.
  • Wegen der Bedeutung der RT-PCR-Anwendungen ist ein gekoppeltes RT-PCR-System, in Form einer allgemeinen gebrauchsfertigen Zusammensetzung, die hohe Sensitivität aufweist, eine geringe Menge an Ausgangsprobe erfordert, die Menge an Manipulationen durch den Praktiker vermindert, die Kontaminationsrisiken verkleinert, die Kosten für die Reagenzien reduziert, nicht auf die Verwendung bestimmter Reaktionspuffer beschränkt ist, und die Menge an Nukleinsäure-Endprodukt maximiert, auf diesem Fachgebiet erforderlich.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zielt ab auf neuartige Zusammensetzungen und Methoden, die für die Erzeugung von Nukleinsäuren von einer Ribonukleinsäure-Matrize und des Weiteren für eine Nukleinsäurereplikation nützlich sind. Spezifisch zielt die Erfindung auf die Bildung und Amplifikation von Nukleinsäuren durch die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR), unter Verwendung von zwei oder mehr unterschiedlichen Polymerasen in Gegenwart einer homopolymeren Nukleinsäure, die aus homopolymerem poly(A), homopolymerem poly(U), homopolymerem poly(C), homopolymerem poly(G), homopolymerem poly(dA), homopolymerem poly(dI), homopolymerem poly(dC), homopolymerem poly(dG) oder einer Mischung aus zwei oder mehreren von diesen ausgewählt ist. Die Anwesenheit der homopolymeren Nukleinsäure dient dazu, die Hemmung der DNA-Polymerase zu negieren, die auftritt, wenn eine Zusammensetzung verwendet wird, die zwei oder mehr Polymerasen umfasst, von denen mindestens eine Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzt. Die Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um DNA-Moleküle zu bilden und zu replizieren, die zu einem Teil einer RNA-Matrize komplementär sind.
  • Die vorliegende Erfindung zielt im Allgemeinen auf alle Reaktionsgemische ab, die bei der Bildung und Replikation einer Nukleinsäure von einer RNA-Matrize verwendet werden können. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zielt auf eine Zusammensetzung, die eine homopolymere Nukleinsäure und einen oder mehrere der folgenden Reaktionsbestandteile umfasst: eine Reverse Transkriptase, eine DNA-Polymerase, einen oder mehrere Oligonukleotid-Primer, eine oder mehrere Nukleotid-Basen, ein geeignetes Puffer-Agens, eine Salzlösung, oder andere Zusatzstoffe, die bei der RT-PCR nützlich sind.
  • Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile im Vergleich zu bekannten Methoden zur Bildung von cDNA von einem RNA-Ziel, einschließlich, aber nicht beschränkt auf:
    • • die Möglichkeit gekoppelter RT-PCR, einschließlich Eine-Reaktion-Lösung und reduzierte Handhabung von Reagenzien und Produkten;
    • • die Möglichkeit der Verwendung einer kleinen Ausgangsprobe an RNA-Matrize;
    • • die Möglichkeit der Verwendung eines weiten Bereiches an unterschiedlichen Reversen Transkriptasen;
    • • die Möglichkeit der Verwendung eines weiten Bereiches an unterschiedlichen DNA-Polymerasen;
    • • die Möglichkeit der Verwendung eines weiten Bereiches an unterschiedlichen Reaktionsgemisch-Puffern und Salzlösungen, einschließlich Puffer, die zusätzliche spezialisierte Reaktionszusatzstoffe enthalten (z.B. Sulfat und Acetat enthaltende Verbindungen).
    • • die Verminderung von nachteiligen Effekten auf die Spezifität und die Produktausbeute (beobachtet mit tRNA- Zusätzen);
    • • das Arbeiten mit Reagenzien, die im Handel erhältlich, leicht zu synthetisieren und nicht teuer sind.
  • Somit erleichtert die Erfindung sowohl die schnelle und effiziente Bildung von Nukleinsäuremolekülen von einer Probe, die Ribonukleinsäuren (RNA) enthält, als auch den Nachweis und die Mengenbestimmung von RNA-Molekülen. Die Erfindung ist auch nützlich bei der schnellen Herstellung und Amplifikation von cDNAs, die für eine Vielzahl industrieller, medizinischer und forensischer Ziele verwendet werden können.
  • Die Homopolymere sind poly(A), poly(C), poly(G), poly(U), poly(dA), poly(dC), poly(dG), und poly(dI) oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren von diesen Homopolymeren. Das Homopolymer, das für RT-PCR verwendet wird, ist ein Oligonukleotid mit einer Länge von zwei oder mehr Basen, bevorzugt mit einer Länge zwischen 100 und 5000 Basen und mehr bevorzugt mit einer Länge zwischen 200 und 2000 Basen. Die Menge an Nukleinsäure-Homopolymer, das für RT-PCR verwendet wird, kann größer als 10 ng sein, bevorzugt zwischen 10 ng und 2000 ng, mehr bevorzugt zwischen 100 ng und 1000 ng und am meisten bevorzugt zwischen 200 ng und 600 ng. Vorzugsweise liegt die Endkonzentration des Nukleinsäure-Homopolymers in der RT-PCR zwischen 200 ng/ml und 40000 ng/ml, mehr bevorzugt zwischen 2000 ng/ml und 20000 ng/ml und am meisten bevorzugt zwischen 4000 ng/ml und 12000 ng/ml. Die vorliegende Erfindung schließt Zusammensetzungen ein, die Nukleinsäure-Homopolymer in höheren Konzentrationen enthalten als die oben angegebenen bevorzugten Endkonzentrationen, die aber die bevorzugten Endkonzentrationen durch Verdünnung erreichen sollen, z.B. durch Kombination mit weiteren Bestandteilen des endgültigen Reaktionsgemisches.
  • Die Reverse Transkiptase kann jede Polymerase sein, die Reverse-Transkiptase-Aktivität aufweist. Vorzugsweise ist die Reverse Transkiptase AMV-RT, MMLV-RT, HIV-RT, EIAV-RT, RAV2-RT, C. hydrogenoformans-DNA-Polymerase, SuperScript I, SuperScript II, oder Mutanten, Varianten und Derivate von diesen, die Reverse-Transkiptase-Aktivität besitzen.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich Mutanten, Varianten und Derivate auf alle Permutationen einer chemischen Spezies, die vorhanden sein oder hergestellt werden können, die noch die bestimmte chemische Aktivität dieser chemischen Spezies beibehalten: Beispiele umfassen Verbindungen, sind aber nicht auf diese beschränkt, die nachweisbar markiert werden oder anderweitig modifiziert werden können, wodurch die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Verbindung verändert werden.
  • Die DNA-Polymerase kann jede Polymerase sein, die fähig ist, ein DNA-Molekül zu replizieren. Vorzugsweise ist die DNA-Polymerase eine hitzestabile Polymerase, die bei der PCR nützlich ist. Mehr bevorzugt ist die DNA-Polymerase Taq, Tbr, Tth, Tih, Tfi, Tfl, Pfu, Pwo, Kod, VENT, DEEPVENT, Tma, Tne, Bst, Pho, Sac, Sso, Poc, Pab, ES4 oder Mutanten, Varianten und Derivate von diesen, die DNA-Polymerase-Aktivität besitzen.
  • Oligonukleotidprimer können jedes Oligonukleotid mit einer Länge von zwei oder mehr Nukleotiden sein. Primer können Zufallsprimer, Homopolymere oder Primer sein, die für eine Ziel-RNA-Matrize spezifisch sind (z.B. ein sequenzspezifischer Primer).
  • Zusätzliche, die Zusammensetzung betreffende Ausführungsformen umfassen eine homopolymere Nukleinsäure und andere Bestandteile des Reaktionsgemisches, wie z.B. ein oder mehrere Nukleotide oder Derivate von diesen. Vorzugsweise ist das Nukleotid ein Deoxynukleotidtriphosphat: dNTP (z.B. dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, α-ThiodNTPs, Biotin-dUTP, Fluoreszein-dUTP, Digoxigenin-dUTP).
  • Pufferagenzien, Salzlösungen und andere Zusatzstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen jene Lösungen, die bei der RT-PCR von Nutzen sind. Bevorzugte Pufferagenzien schließen z.B. TRIS, TRICINE, BIS-TRICINE, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES, CAPS ein. Bevorzugte Salzlösungen schließen z.B. Kaliumchlorid, Kaliumacetat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Manganacetat, Mangansulfat, Natriumchlorid, Natriumacetat, Lithiumchlorid und Lithiumacetat ein. Bevorzugte Zusatzstoffe schließen z.B. DMSO, Glycerol, Formamid, Betain, Tetramethylammoniumchlorid, PEG, Tween 20, NP 40, Ectoin, Polyole, E. coli-SSB-Protein, Phage-T4-Gen-32-Protein, BSA ein.
  • Weitere Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf Methoden zur Bildung von Nukleinsäuren von einer Ribonukleinsäure-Matrize und weitere Nukleinsäure-Replikation. Die Methode umfasst: (a) das Zufügen einer RNA-Matrize zu einem Reaktionsgemisch, das eine Reverse Transkiptase, eine Nukleinsäure-Polymerase oder Derivate davon und eine homopolymere Nukleinsäure umfasst, und (b) das Inkubieren des Reaktionsgemisches unter Bedingungen, die ausreichend sind, um das Polymerisieren eines Nukleinsäure-Moleküls zu ermöglichen, das zumindest zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Methode die Replikation des DNA-Moleküls, das zumindest zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist, ein. Mehr bevorzugt ist die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) als die Methode der DNA-Replikation. Am meisten bevorzugt umfasst die Methode die gekoppelte Reverse-Transkiptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR).
  • Das Nukleinsäure-Homopolymer in einer solchen Methode ist poly(A), poly(C), poly(G), poly(U), poly(dA), poly(dC), poly(dG), oder poly(dI), oder eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Homopolymere. Das Homopolymer ist bevorzugt ein Oligonukleotid mit einer Länge von zwei oder mehr Basen, bevorzugt mit einer Länge zwischen 100 und 5000 Basen, und mehr bevorzugt mit einer Länge zwischen 200 und 2000 Basen.
  • Vorzugsweise liegt die Endkonzentration des Nukleinsäure-Homopolymers in der Methode der Erfindung zwischen 200 ng/ml und 40000 ng/ml, mehr bevorzugt zwischen 2000 ng/ml und 20000 ng/ml und am meisten bevorzugt zwischen 4000 ng/ml und 12000 ng/ml.
  • In spezifischeren Ausführungsformen findet RT-PCR zwischen etwa 23°C und etwa 100°C statt. Vorzugsweise findet reverse Transkription zwischen etwa 35°C und 75°C statt, gefolgt von PCR, die zwischen etwa 60°C und etwa 95°C stattfindet. Unter den am meisten bevorzugten Bedingungen tritt reverse Transkription zwischen etwa 37°C und etwa 60°C auf, Denaturierung tritt bei etwa 94°C auf, Annealing tritt bei etwa 60°C und Polymerisation bei etwa 72°C auf.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Photographie eines Ethidiumbromid(EtdBr)-gefärbten, 1%igen Agarosegels, die die Verminderung der Reverse-Transkripase-Hemmung der PCR durch homopolymeres poly(A) darstellt. Spur 1 ist eine Nukleinsäure-Leiter, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurde. Spuren 2 und 3 sind Kontrollen, die kein homopoloymeres poly(A) besitzen. Spuren 4 und 5 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 100 ng poly(A). Spuren 6 und 7 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 200 ng poly(A). Spuren 8 und 9 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 400 ng poly(A).
  • 2 ist eine Photographie einer Ethidiumbromid(EtdBr)-gefärbten, 1%igen Agarosegels, die die Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der PCR durch 2a homopolymeres poly(U) und 2b homopolymeres poly(C) darstellt. Spur 1 ist eine Nukleinsäure-Leiter, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurde. Spuren 2 und 3 sind Kontrollen, die keine homopolymere Nukleinsäure besitzen. Spuren 4 und 5 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 100 ng (2a) poly(U) oder (2b) poly(C). Spuren 6 und 7 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 200 ng (2a) poly(U) oder (2b) poly(C). Spuren 8 und 9 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 400 ng (2a) poly(U) oder (2b) poly(C).
  • 3 ist eine Photographie eines Ethidiumbromid(EtdBr)-gefärbten, 1%igen Agarosegels, die die Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der PCR durch homopolymeres poly(dA) darstellt. Spur 1 ist eine Nukleinsäure-Leiter, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurde. Spuren 2 bis 4 sind Kontrollen, die kein homopolymeres poly(dA) besitzen. Spuren 5 bis 7 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 200 ng poly(dA). Spuren 8 bis 10 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von 400 ng poly(A).
  • 4 ist eine Photographie eines Ethidiumbromid(EtdBr)-gefärbten, 1%igen Agarosegels, die die reduzierenden Effekte von homopolymerem poly(A) auf die PCR-Hemmung unter Einbeziehung verschiedener Reverser Transkriptasen darstellt. Spur 1 ist eine Nukleinsäure-Leiter, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurde. Spuren 2 bis 4, 9 bis 11 und 16 bis 18 sind Kontrollen, die kein homopolymeres poly(A) besitzen. Spuren 5 bis 7 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von AMV-RT. Spuren 12 bis 14 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von MMLV-RT. Spuren 19 bis 21 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von MMLV-RT RNAse H-. (Spuren 8 und 15 sind unbenutzt als Abstandshalter.)
  • 5 ist eine Photographie eines Ethidiumbromid(EtdBr)-gefärbten, 1%igen Agarosegels, die die reduzierenden Effekte von homopolymerem poly(A) auf unterschiedliche DNA-Polymerasen und unter verschiedenen Puffer- und Salzbedingungen darstellt. 5a stellt die RT-PCR-Nukleinsäureprodukte dar unter Verwendung von AmpliTaq-DNA-Polymerase in Abwesenheit (Spuren 2 bis 4) von homopolymerem poly(A) und in Anwesenheit (Spuren 5 bis 7) von homopolymerem poly(A). Spur 1 ist eine Nukleinsäure-Leiter, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurde. 5b stellt die RT-PCR-Nukleinsäureprodukte dar unter Verwendung von PFU-DNA-Polymerase in Abwesenheit (Spuren 2 bis 4) von homopolymerem poly(A) und in Anwesenheit (Spuren 5 bis 7) von homopolymerem poly(A). Spuren 1 und 8 sind Nukleinsäure-Leitern, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurden.
  • 6 ist eine Photograhie eines Ethidiumbromid(EtdBr)-gefärbten, 1%igen Agarosegels, die die Verminderung der Reverese-Transkriptase-Hemmung der PCR durch eine homopolymere Nukleinsäure darstellt im Vergleich zu der von tRNA und rRNA. Spur 1 ist eine Nukleinsäure-Leiter, die als Gel-Referenzmarker verwendet wurde. Spuren 3 bis 5 sind Kontrollen, die keinen Nukleinsäure-Zusatz zum Standard-RT-PCR-Reaktionsgemisch besitzen. Spuren 7 bis 9 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von homopolymerem poly(A). Spuren 11 bis 13 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von tRNA. Spuren 15 bis 17 zeigen die Nukleinsäureprodukte einer RT-PCR-Reaktion in Anwesenheit von rRNA. (Spuren 2, 6, 10 und 14 sind unbenutzt als Abstandshalter.)
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zielt auf Zusammensetzungen und Methoden zur Verwendung bei der Bildung von Nukleinsäuren von einer RNA-Matrize und besonders für die Herstellung und Analyse von Nukleinsäuren durch die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR). Die Erfindung liefert Zusammensetzungen, die eine homopolymere Nukleinsäure in Kombination mit einem oder mehr Bestandteilen, die bei der Bildung von Nukleinsäuren von einer RNA-Matrize von Nutzen sind, einschließen. Solche Bestandteile können eine Reverse Transkriptase, eine DNA-Polymerase, einen oder mehrere Oligonukleotidprimer, irgendeine oder mehrere Nukleotidbasen, ein geeignetes Pufferagens, ein Salz, oder andere Zusätze, die bei der RT oder RT-PCR nützlich sind, einschließen. Methoden der Erfindung verwenden homopolymere Nukleinsäure in Kombination mit anderen Reagenzien, um Nukleinsäure von einer RNA-Matrize zu erzeugen, und vorzugsweise auch, um die neu synthetisierte Nukleinsäure zu replizieren. Die Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung, die nützlich sind, um Nukleinsäuremoleküle zu bilden, replizieren, analysieren, mengenmäßig zu bestimmen und anderweitig zu manipulieren, sind außerordentlich nützlich in gekoppelten oder ungekoppelten RT-PCR-Verfahren.
  • RT-PCR ist eine molekulare Manipulation, die verwendet wird, um eine Nukleinsäure, die sich von einer RNA-Matrize ableitet, zu bilden und zu replizieren. RT-PCR wird hier beschrieben als ein exemplarisches Protokoll, das fähig ist, die Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung ohne Beschränkung zu verwenden. Es ist für einen Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung in anderen Verfahren von Nutzen ist, die eine Kombination aus Reverser Transriptase- und DNA-Polymerase-Akivität einschließen. RT-PCR schließt zwei getrennte molekulare Synthesen ein: (i) die cDNA-Synthese von einer RNA-Matrize; und (ii) die Replikation der neu synthetisierten cDNA durch PCR-Amplifikation.
  • Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)
  • Bei der RT-PCR wird das Reaktionsgemisch zuerst inkubiert (in einem geeigneten Pufferagens) bei einer Temperatur, die ausreicht, um Synthese eines DNA-Moleküls zu erlauben, das zu mindestens einem Teil einer RNA-Matrize komplementär ist. Bestandteile eines Reverse-Transkiptase-Reaktionsgemisches schließen charakteristischerweise eine RNA-Matrize ein, von der die komplementäre DNA (cDNA) transkribiert wird; eine Nukleinsäure-Polymerase, die Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist; und die geeigneten Nukleotidbildenden Blocks, die für die Nukleinsäure-Synthese benötigt werden. Für die Zwecke dieser Erfindung ist cDNA definiert als jedes beliebige DNA-Molekül, dessen Nukleinsäuresequenz zu einem RNA-Molekül komplementär ist. Eine RNA-Matrize ist definiert als jedes beliebige RNA-Molekül, das verwendet wird, um eine Nukleinsäuresequenz zur Verfügung zu stellen, von der ein cDNA-Molekül synthetisiert werden kann. Die Synthese von cDNA von einer RNA-Matrize wird typischerweise erreicht durch Verwendung einer Nukleinsäure-Polymerase, die Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist. Für die Ziele dieser Erfindung bezieht sich Reverse-Transkriptase-Aktivität auf die Fähigkeit eines Enzyms, ein cDNA-Molekül von einer RNA-Matrize zu polymerisieren und Reverse Transkriptase bezieht sich allgemein auf jedes beliebige Enzym, das Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzt. Reverse Transkription tritt typischerweise in einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 75°C auf, bevorzugt von etwa 35°C bis etwa 70°C.
  • Nach Reverser Transkription einer RNA-Matrize, um ein cDNA-Molekül herzustellen, wird die cDNA unter Bedingungen inkubiert (in einem geeigneten Pufferagens), die für die Replikation des cDNA-Moleküls ausreichend sind. Das Reaktionsgemisch kann das gleiche sein wie das des vorhergehenden Transkriptions-Reaktionsgemisches, wie verwendet bei gekoppelter (auch kontinuierlicher oder Ein-Schritt genannt) RT-PCR, oder das Reaktionsgemisch kann ein Aliquot des vorhergehenden Reverse-Transkiptase-Reaktionsgemisches enthalten und kann weiter modifiziert werden für die Nukleinsäurereplikation, wie bei ungekoppelter (oder Zwei-Schritt) RT-PCR. Bestandteile eines Replikationsreaktionsgemisches schließen typischerweise eine Nukleinsäure-Matrize ein (in diesem Fall die cDNA); eine Nukleinsäure-Polymerase; und die geeigneten Nukleotidbildenden Blocks, die für die Nukleinsäure-Synthese benötigt werden. Nukleinsäure-Replikation bezieht sich auf die Polymerisierung einer Nukleinsäure, deren Sequenz durch eine andere Nukleinsäure bestimmt wird, und zu der sie komplementär ist. DNA-Replikation, wie hier verwendet, ist gleichbedeutend mit DNA-Amplifikation. Vorzugsweise tritt DNA-Amplifikation wiederholt auf, wodurch beide Stränge der Nukleinsäure-Sequenz repliziert werden, das bedeutet DNA, die zur RNA-Matrize komplementär ist und DNA, deren Nukleinsäuresequenz zur RNA-Matrize im Wesentlichen identisch ist. Repetitive oder zyklische DNA-Replikation kann vorteilhaft durchgeführt werden unter Verwendung einer hitzestabilen Polymerase in einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).
  • PCR ist eine auf dem Fachgebiet gut bekannte Technik. PCR wird verwendet, um Nukleinsäuren zu amplifizieren, indem ein Reaktionsgemisch Zyklen von: (i) Nukleinsäure-Denaturierung, (ii) Oligonukleotidprimer-Annealing und (iii) Nukleinsäure-Polymerisierung unterworfen wird. Bevorzugte Reaktionsbedingungen für Amplifikation umfassen Erhitzungszyklen, d.h. wechselweises Verändern der Temperatur des Reaktionsgemisches, um jeden der Schritte des PCR-Zyklus zu erleichtern. PCR wird typischerweise ausgedehnt über mehrere Zyklen von Denaturierung, Annealing und Replikation, vermehrt (fakultativ oder vorzugsweise) mit einem verlängerten Denaturierungsschritt am Anfang und einem verlängerten Ausdehnungs(Polymerisierungs)schritt am Ende. Zyklisches Erwärmen tritt typischerweise innerhalb eines Temperaturbereiches von etwa 23°C bis etwa 100°C und bevorzugt zwischen etwa 37°C und etwa 95°C auf. Nukleinsäuredenaturierung tritt typischerweise zwischen etwa 90°C und etwa 100°C auf, bevorzugt bei etwa 94°C. Annealing tritt typischerweise zwischen etwa 37°C und etwa 75°C auf, bevorzugt bei etwa 60°C. Polymerisierung tritt typischerweise zwischen etwa 55°C und etwa 80°C auf, bevorzugt bei etwa 72°C. Die Anzahl der Erhitzungszyklen variiert erheblich in Abhängigkeit von der Präferenz des Praktikers und davon, welche Menge an DNA-Produkt gewünscht wird. Vorzugsweise erstreckt sich die Zahl der PCR-Zyklen von etwa 5 bis etwa 99, mehr bevorzugt ist eine Zahl von über 20 Zyklen, am meisten bevorzugt eine Zahl von etwa 40 Zyklen.
  • Matrizen-RNA
  • Die Matrizen-RNA kann jegliche Ribonukleinsäure von Interesse sein, die dem Praktiker bekannt oder unbekannt ist. Matrizen-RNA kann künstlich synthetisiert oder aus natürlichen Quellen isoliert sein. Vorzugsweise ist die RNA mRNA. Mehr bevorzugt ist die RNA biologisch aktiv oder kodiert ein biologisch aktives Polypeptid.
  • Homopolymere Nukleinsäuren
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass homopolymere Nukleinsäuren als ein hemmungsreduzierenden Agens dienen, das fähig ist, die Hemmung der Nukleinsäure-Replikation durch Revere Transkriptase zu unterdrücken oder anderweitig zu vermindern (reduzieren), wie bei der RT-PCR beobachtet. Eine homopolymere Nukleinsäure ist jegliches Oligonukleotid mit einer Länge von 2 oder mehr Basen, das aus einer einzigen Nukleotidart zusammengesetzt ist. Homopolymere Nukleinsäuren können Ribonukleinsäuren oder Deoxyribonukleinsäuren sein. Die homopolymeren Ribonukleinsäuen sind poly(A), poly(C), poly(G) oder poly(U). Die homopolymeren Deoxyribonukleinsäuren sind poly(dA), poly(dC), poly(dG), oder poly(dI). Das Homopolymer, das für RT-PCR verwendet wird, ist ein Oligonukleotid mit einer Länge von zwei oder mehr Basen, bevorzugt mit einer Länge zwischen 100 und 5000 Basen, und mehr bevorzugt mit einer Länge zwischen 200 und 2000 Basen. Die Menge an Nukleinsäure-Homopolymer, das für RT-PCR verwendet wird, kann mehr als 10 ng betragen, bevorzugt zwischen 10 ng und 2000 ng, mehr bevorzugt zwischen 100 ng und 1000 ng und am meisten bevorzugt zwischen 200 ng und 600 ng. Vorzugsweise liegt die Endkonzentration des Nukleinsäure-Homopolymers bei der RT-PCR zwischen 200 ng/ml und 40000 ng/ml, mehr bevorzugt zwischen 2000 ng/ml und 20000 ng/ml, und am meisten bevorzugt zwischen 4000 ng/ml und 12000 ng/ml.
  • Reverse Transkriptasen
  • Reverse Transkriptasen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können jede beliebige Polymerase sein, die Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist. Bevorzugte Enzyme schließen jene ein, die reduzierte RNase-H-Aktivität besitzen. Einige Reverse Transkriptasen sind auf dem Fachgebiet bekannt und kommerziell erhältlich (z.B. von Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN; Life Technologies, Inc., Rockville, MD; New England Biolabs, Inc., Beverley, MA; Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ; Qiagen, Inc., Valencia, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Bevorzugte Reverse Transkriptasen schließen ein: Reverse Transkriptase aus dem Vogel-Myeloblastose-Virus (AMV-RT), Reverse Transkriptase aus dem Moloney Murine Leukämie-Virus (MMLV-RT), Reverse Transkriptase aus dem humanen Immunvirus (HIV-RT), EIAV-RT, RAV2-RT, C. hydrogenoformans-DNA-Polymerase, rTth-DNA-Polymerase, SuperScript I, SuperScript II und Mutanten, Varianten und Derivate von diesen. Es ist klar, dass eine Vielzahl von Reversen Transkriptasen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, einschließlich Reverse Transkriptasen, die oben nicht spezifisch beschrieben wurden, ohne von dem Umfang oder bevorzugten Ausführungsformen davon abzuweichen.
  • DNA-Polymerasen
  • DNA-Polymerasen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können jede beliebige Polymerase sein, die fähig ist, ein DNA-Molekül zu replizieren. Bevorzugte DNA-Polymerasen sind hitzestabile Polymerasen, die in der PCR besonders nützlich sind. Hitzestabile Polymerasen werden aus einer Vielfalt von hitzestabilen Bakterien isoliert, wie z.B. Thermus aquaticus (Taq), Thermus brockianus (Tbr), Thermus flavus (Tfl), Thermus ruber (Tru), Thermus thermophilus (Tth), Thermococcus litoralis (Tli) und anderen Arten der Thermococcus-Gattung, Thermoplasma acidophilum (Tac), Thermotoga neapolitana (Tne), Thermotoga maritima (Tma), und anderen Arten der Thermotoga-Gattung, Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei (Pwo) und anderen Arten der Pyrococcus-Gattung, Bacillus sterothermophilus (Bst), Sulfolobus acidocaldarius (Sac), Sulfolobus solfataricus (Sso), Pyrodictium occultum (Poc), Pyrodictium abyssi (Pab) und Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) und Mutanten, Varianten oder Derivaten von diesen.
  • Mehrere DNA-Polymerasen sind auf dem Fachgebiet bekannt und kommerziell erhältlich (z.B. von Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN; Life Technologies, Inc., Rockville, MD; New England Biolabs, Inc., Beverley, MA; Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ; Qiagen, Inc., Valencia, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Vorzugsweise ist die hitzestabile DNA-Polymerase ausgewählt aus der Gruppe von Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENTTM, DEEPVENTTM und aktiven Mutanten, Varianten und Derivaten von diesen. Es ist klar, dass eine Vielzahl von DNA-Polymerasen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, einschließlich DNA-Polymerasen, die oben nicht spezifisch beschrieben wurden, ohne vom Umfang oder bevorzugten Ausführungsformen davon abzuweichen.
  • Oligonukleotid-Primer
  • Olidonukleotidprimer, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können jegliches Oligonukleotid mit einer Länge von 2 oder mehr Nukleotiden sein. Vorzugsweise sind PCR-Primer etwa 15 bis 30 Basen lang und sind nicht palindromisch (selbst-komplementär) oder komplementär zu anderen Primer, die im Reaktionsgemisch verwendet werden können. Primer können Zufallsprimer sein, Homopolymere, oder Primer, die für eine Ziel-RNA-Matrize spezifisch sind (z.B. ein sequenzspezifischer Primer), sind aber nicht beschränkt auf diese. Oligonukleotidprimer sind Oligonukleotide, die verwendet werden, um mit einem Bereich einer Ziel-Nukleinsäure zu hybridisieren, um die Polymerisierung einer komplementären Nukleinsäure zu erleichtern. Bei bevorzugten RT-PCR-Techniken dienen Primer dazu, Reverse Trankription eines ersten Nukleinsäure-Moleküls zu erleichtern, das zu einem Teil einer RNA-Matrize komplementär ist (z.B. ein cDNA-Molekül) und ebenso um die Replikation der Nukleinsäure zu erleichtern (z.B. PCR-Amplifikation von DNA). Jeglicher Primer kann durch einen Praktiker mit Fachwissen synthetisiert werden oder kann von einem beliebigen aus einer Anzahl kommerzieller Händler (z. B. von Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN; New England Biolabs, Inc., Beverley, MA; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ) erworben werden. Es ist klar, dass eine breite Menge an Primer in der vorliegenden Erfindung nützlich sein kann, einschließlich jener, die hier nicht spezifisch beschrieben sind, ohne vom Umfang und bevorzugten Ausführungsformen davon abzuweichen.
  • Nukleotidbasen
  • Nukleotidbasen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können jegliches Nukleotid sein, das bei der Polymerisierung einer Nukleinsäure nützlich ist. Nukleotide können natürlich vorkommen, unüblich sein, modifiziert sein, eine Derivat sein oder künstlich sein. Nukleotide können unmarkiert oder nachweisbar markiert sein durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden (z.B. durch Verwendung von Radioisotopen, Vitaminen, fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Teilen, Dioxigenin). Vorzugsweise sind die Nukleotide Deoxynukleosidtriphosphate, dNTPs (z.B. dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, α-Thio-dNTPs, Biotin-dUTP, Fluoreszein-dUTP, Digoxigenin-dUTP, 7-Deaza-dGTP). dNTPs sind auch gut bekannt auf dem Fachgebiet und sind von Händlern kommerziell zu beziehen (z.B. von Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN; New England Biolabs, Inc., Beverley, MA; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ).
  • Pufferagenzien und Salzlösungen
  • Pufferagenzien und Salze, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, liefern geeignete stabile pH- und Innenbedingungen für die Nukleinsäuresynthese, z.B. für die Reverse-Transkriptase- und DNA-Polymerase-Aktivität. Eine weite Menge an Puffer und Salzlösungen und modifizierten Puffer sind auf dem Fachgebiet bekannt, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, einschließlich Agenzien, die hier nicht spezifisch beschrieben sind. Bevorzugte Pufferagenzien schließen TRIS, TRICINE, BIS-TRICINE, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES, CAPS ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bevorzugte Salzlösungen schließen Kaliumacetat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Manganacetat, Mangansulfat. Natriumchlorid, Natriumacetat, Lithiumchlorid und Lithiumacetat ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Andere Zusätze, die bei RT-PCR nützlich sind
  • Andere Zusätze, die fähig sind, Reverse Transkription, Replikation und/oder eine Kombination aus beiden Reaktionen zu erleichtern (z.B. Agenzien zur Erleichterung von RT-PCR), andere als jene, die zum ersten Mal durch diese Erfindung beschrieben werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Gemäß den Zusammensetzungen und Methoden dieser Erfindung können ein oder mehrere dieser Zusätze in die gegenwärtigen Zusammensetzungen eingefügt werden, um die Bildung und Replikation von Nukleinsäuren von einer Ribonukleinsäure-Matrize zu optimieren. Zusätze können organische oder anorganische Verbindungen sein. Hemmungsvermindernde Agenzien, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Polypeptide ein, wie z.B. humanes Serumalbumin, Rinder-Serumalbumin (BSA), Ovalbumin, Albumax, Casein, Gelatine, Kollagen, Globulin, Lysozym, Transferrin, Myoglobin, Hämoglobin, α-Lactalbumin, Fumarase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH), Amyloglucosidase, Carboanhydrase, β-Lactoglobulin, Aprotinin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, Trypsinogen, Phosphorylase b, Myosin, Aktin, β-Galaktosidase, Katalase, tryptische Soja-Aufschlüsse, Tryptose, Lektine, E.-coli-Einzelstrangbindendes Protein (SSB), Phage-T4-Gen32-Protein und ähnliche oder Fragmente oder Derivate davon, sind aber nicht auf diese beschränkt. Beispiele von Zusätzen, die keine Polypeptide sind, schließen tRNA, rRNA, schwefelenthaltende Verbindungen, acetatenthaltende Verbindungen, Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerol, Formamid, Betain, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC), Polyethylenglycol (PEG), Tween 20, NP 40, Ectoin und Polyole ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bevorzugte Zusätze schließen DMSO, Glycerol, Formamid, Betain, TMAC, PEG, Tween 20, NP 40, Ectoin, Polyole, E.-coli-(SSB)-Protein, Phage-T4-Gene32-Protein, BSA ein.
  • Reagenzienkits für gekoppelte RT-PCR
  • Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit für gekoppelte RT-PCR, das eine Reverse Transkriptase, eine DNA-Polymerase und eine homopolymere Nukleinsäure umfasst. In einem solchen Reagenzienkit können die Reverse Transkriptase, die DNA-Polymerase und die homopolymere Nukleinsäure in einem Behälter vereinigt sein. Alternativ können die Reverse Transkriptase und die DNA-Polymerase in einem Behälter vereinigt sein und die homopolymere Nukleinsäure kann sich in einem zweiten Behälter befinden. Alternativ können die Reverse Transkriptase und die homopolymere Nukleinsäure in einem Behälter vereinigt sein und die DNA-Polymerase kann sich in einem zweiten Behälter befinden. Alternativ können die DNA-Polymerase und die homopolymere Nukleinsäure in einem Behälter vereinigt sein und die Reverse Transkriptase kann sich in einem zweiten Behälter befinden. Alternativ können sich alle drei Bestandteile in getrennten Behältern befinden. Solch ein Reagenzienkit kann weiterhin ein Gemisch aus zwei oder mehreren von dATP, dCTP, dGTP und dTTP umfassen, und/oder einen oder mehrere Zusätze, die bei RT-PCR nützlich sind, und/oder einen Puffer. Alle oben erwähnten Bestandteile können sich in getrennten Behältern befinden, oder zwei oder mehrere von ihnen können in einem Behälter vereinigt sein. Vorzugsweise sind die beiden Enzyme in einem Behälter vereinigt, entweder zusammen mit der homopolymeren Nukleinsäure oder die homopolymere Nukleinsäure befindet sich in einem getrennten Behälter, und eine Pufferlösung, ein dNTP-Gemisch, und ein oder mehrere nützliche Zusätze, falls vorhanden, stehen in dem Kit in getrennten Behältern zur Verfügung.
  • Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zusammensetzung oder eines Reagenzienkits, wie oben beschrieben, für gekoppelte RT-PCR.
  • Besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:
    Eine Zusammensetzung, die für die Bildung von Nukleinsäuren von einer Ribonukleinsäure-Matrize geeignet ist, umfassend eine homopolymere Nukleinsäure, zwei oder mehrere unterschiedliche Polymerasen, von denen mindestens eine Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzt, einen oder mehrere Oligonukleotidprimer und ein oder mehrere beliebige Nukleotide oder Derivate davon, wobei die homopolymere Nukleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus homopolymerem poly(A), homopolymerem poly(U), homopolymerem poly(C), homopolymerem poly(G), homopolymerem poly(dA), homopolymerem poly(dI), homopolymerem poly(dC), homopolymerem poly(dG) besteht oder einem Gemisch aus zwei oder mehreren von diesen.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die Zusammensetzung mindestens 10 ng Homopolymer enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die Zusammensetzung zwischen 10 und 2000 ng Homopolymer enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die Zusammensetzung zwischen 100 und 1000 ng Homopolymer enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die Zusammensetzung zwischen 200 und 600 ng Homopolymer enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich eine Reverse Transkriptase enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die Reverse Transkriptase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus AMV-RT, M-MLV-RT, HIV-RT, EIAV-RT, RAV2-RT, C.-hydrogenoformans-DNA-Polymerase, SuperScript I, SuperScript II und Mutanten, Varianten und Derivaten von diesen besteht.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich eine DNA-Polymerase enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die DNA-Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENTTM, DEEPVENTTM und Mutanten, Varianten und Derivaten von diesen besteht.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich einen oder mehrere Oligonukleotidprimer enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der der Primer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Zufallsprimern, Homopolymeren, oder Primern, die für eine Ziel-RNA-Matrize spezifisch sind, besteht.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich ein Pufferagens enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der das Pufferagens aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TRIS, TRICINE, BIS-TRICINE, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES und CAPS besteht.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich eine Salzlösung enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der die Salzlösung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kaliumchlorid, Kaliumacetat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Manganacetat, Mangansulfat, Natriumchlorid, Natriumacetat, Lithiumchlorid und Lithiumacetat besteht.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich einen Zusatz enthält, der für RT-PCR nützlich ist.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der der Zusatz, der für RT-PCR nützlich ist, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DMSO, Glycerol, Formamid, Betain, Tetramethylammoniumchlorid, PEG, Tween 20, NP 40, Ectoin, Polyolen, E.-coli-SSB-Protein, Phage-T4-Gen32-Protein, BSA besteht.
  • Die Zusammensetzung wie oben, die zusätzlich ein oder mehrere Nukleotide enthält.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der das Nukleotid ein Deoxyphosphonukleotid oder Derivat davon ist.
  • Die Zusammensetzung wie oben, bei der das Deoxyphosphonukleotid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, α-Thio-dNTPs, Biotin-dUTP, Fluoreszein-dUTP und Digoxigenin-dUTP besteht.
  • Eine Methode zur Bildung einer Nukleinsäure von einer RNA-Matrize, umfassend die Schritte:
    • a) Zugabe der RNA-Matrize zu einem Reaktionsgemisch, wobei das Reaktionsgemisch mindestens eine Reverse Transkriptase und mindestens eine Nukleinsäure-Polymerase oder Derivate davon und eine homopolymere Nukleinsäure enthält, die aus homopolymerem poly(A), homopolymerem poly(U), homopolymerem poly(C), homopolymerem poly(G), homopolymerem poly(dA), homopolymerem poly(dI), homopolymerem poly(dC), homopolymerem poly(dG) oder einem Gemisch aus zwei oder mehreren von diesen ausgewählt ist; und
    • b) Inkubieren des Reaktionsgemisches unter Bedingungen, die ausreichen, um Polymerisierung eines Nukleinsäuremoleküls zu erlauben, das zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist.
  • Eine Methode zur Bildung einer Nukleinsäure von einer RNA-Matrize, umfassend die Schritte:
    • a) Zugabe der RNA-Matrize zu einem Reaktionsgemisch, wobei das Reaktionsgemisch mindestens eine Reverse Transkriptase, mindestens eine Nukleinsäure-Polymerase, ein oder mehrere Ribonukleotidtriphosphate oder Derivate davon und eine homopolymere Nukleinsäure enthält, die aus homopolymerem poly(A), homopolymerem poly(U), homopolymerem poly(C), homopolymerem poly(G), homopolymerem poly(dA), homopolymerem poly(dI), homopolymerem poly(dC), homopolymerem poly(dG) oder einem Gemisch aus zwei oder mehreren von diesen augewählt ist; und
    • b) Inkubieren des Reaktionsgemisches unter Bedingungen, die ausreichen, um Polymerisierung eines Nukleinsäuremoleküls zu erlauben, das zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist.
  • Die Methode wie oben, bei der die Nukleinsäure DNA ist, die Polymerase DNA-Polymerase ist, und das Ribonukleinsäuretriphosphat-Derivat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, α-Thio-dNTPs, Biotin-dUTP, Fluoreszein-dUTP und Digoxigenin-dUTP besteht.
  • Die Methode wie oben, bei der die DNA-Polymerase eine hitzestabile Polymerase ist.
  • Die Methode wie oben, bei der die DNA-Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENTTM, DEEPVENTTM und Mutanten, Varianten und Derivaten von diesen besteht.
  • Die Methode wie oben, bei der die Reverse Transkriptase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus AMV-RT, M-MLV-RT, HIV-RT, EIAV-RT, RAV2-RT, C.-hydrogenoformans-DNA-Polymerase, SuperScript I, SuperScript II und Mutanten, Varianten und Derivaten von diesen besteht.
  • Die Methode wie oben, bei der das Reaktionsgemisch zusätzlich einen Nukleinsäure-Primer enthält.
  • Die Methode wie oben, bei der der Primer zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist.
  • Die Methode wie oben, bei der das DNA-Molekül, das zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist, durch ein Verfahren der DNA-Replikation amplifiziert wird.
  • Die Methode wie oben, bei der das Verfahren der DNA-Replikation eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) umfasst.
  • Die Methode wie oben, bei der die kombinierten Reaktionen der DNA-Bildung und -Amplifikation in einem gekoppelten Reaktionsgemisch stattfinden.
  • Die Methode wie oben, bei der die Reaktion zwischen etwa 23°C und etwa 100°C vonstatten geht.
  • Die Methode wie oben, bei der Reverse Transkription zwischen etwa 37°C und etwa 70°C stattfindet und die PCR-Amplifikation zwischen etwa 60°C und etwa 95°C stattfindet.
  • Die Methode wie oben, bei der die PCR-Amplifikation mindestens 25 Zyklen von Denaturierung, Annealing und Polymerisierung umfasst.
  • Die Methode wie oben, bei der die Reverse Transkription zwischen etwa 37°C und etwa 60°C stattfindet, Denaturierung bei etwa 94°C stattfindet, Annealing bei etwa 60°C stattfindet und Polymerisierung bei etwa 72°C stattfindet.
  • Es wird für einen Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres (sofort) offensichtlich sein, dass andere geeignete Modifikationen und Anpassungen der Zusammensetzungen und Methoden der hier beschriebenen Erfindung offensichtlich sind und durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung oder den dargestellten Ausführungsformen davon abzuweichen. Nachdem nun die vorliegende Erfindung im Einzelnen beschrieben wurde, wird dieselbe klarer verstanden werden durch Bezug auf die folgenden Beispiele, die hier nur zum Zwecke der Veranschaulichung mit eingeschlossen sind und für die Erfindung nicht einschränkend sein sollen.
  • Beispiel 1: Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch Reverse Transkriptase
  • Um den hemmenden Effekt von Reversen Transkriptasen auf die Nukleinsäure-Replikation zu untersuchen, wurden 103 und 102 Kopien eines Plasmids, das ein 500 bp langes Fragment des RanBP2-Gens enthielt, als Matrize für PCR-Amplifikation verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch umfasste 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 1,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 200 μM von jedem dNTP, 0,16 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 1 bzw. 2), 2,5 Units HotStarTaqTM-DNA-Polymerase (QIAGEN), 10 Units rekombinante RNasIn (PromegaTM) und ansteigende Mengen Omniscript-RT (QIAGEN) von 0 bis 5 Units. Um eine gekoppelte RT-PCR zu simulieren, wurde der PCR ein Inkubationsschritt von 30 Minuten Länge bei 37°C („Pseudo-RT") vorausgeschickt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 45 Zyklen (30 sec, 94°C; 1 min, 60°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). PCR wurde in einem Biometra Uno II Thermocycler durchgeführt.
  • Die Proben (in dreifacher Ausfertigung) wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert, und die Produktausbeute wurde densitometrisch bestimmt. Die Produktausbeute in den Proben ohne Reverse Transkriptase wurde auf 100% festgesetzt. Tabelle 1: Hemmender Effekt von Omniscript-RT auf PCR
    Omniscript-RT (Units)
    Matrize 0 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0
    (Zahl der 103 100% 84% 47% 25% 14% 2%
    Kopien) 102 100% 90% 32% 20% 8% 1%
  • Die Ergebnisse zeigen klar, dass die Anwesenheit selbst geringer Mengen an Reverser Transkriptase die Effizienz der DNA-Replikation dramatisch reduzierte, wenn nur eine begrenzte Menge an Matrizen-DNA vorhanden war. Vergleichbare Experimente, die genomische DNA als Matrize verwendeten, bestätigten die hemmende Wirkung von Omniscript-RT auf PCR, besonders wenn geringe Mengen an Matrizen-DNA verwendet wurden.
  • Beispiel 2: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch homopolymeres poly(A)
  • Um die Entdeckung zu beweisen, dass der hemmende Effekt von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation durch die Vewendung von homopolymerem poly(A) vermindert wird, wurden ansteigende Mengen von poly(A) (kommerziell erworben von Pharmacia) zu Proben zugegeben, die unterschiedliche Mengen an Gesamt-RNA von HeLa-Zellen enthielten. Ein Fragment der β-Actin-mRNA aus der HeLa-Gesamt-RNA mit einer Länge von 626 bp wurde als die RNA-Matrize für die RT-PCR ausgewählt.
  • Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Zwei Reaktionsgemische enthielten 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 400 μM von jedem dNTP, 0,4 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 3 bzw. 4), 5 Units HotStar-Taq-DNA-Polymerase (QIAGEN), 0,5 Units Omniscript-RT und 1 bzw. 10 ng HeLa-Gesamt-RNA. Reaktionen wurden in Gegenwart von 0 ng, 100 ng, 200 ng und 400 ng poly(A)-Homopolymer durchgeführt. Reverse Transkription wurde 30 Minuten lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 60°C, 1 min, 72°C) und aus einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem Eppendorf-Gradienten-Cycler durchgeführt.
  • Die Proben (in doppelter Ausfertigung) wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Eine deutliche Verbesserung in Bezug auf Effizienz und Spezifität durch die Zugabe von poly(A) wurde sowohl für die 1 ng als auch für die 10 ng der Gesamt-HeLa-RNA-Proben beobachtet. Die Ausbeute der RT-PCR nahm deutlich mit steigenden Mengen an poly(A) zu. 1 zeigt die Wirkung von poly(A) bei der Verwendung von 1 ng HeLa-Gesamt-RNA als Matrize. Der gleiche Effekt wurde beobachtet, wenn 10 ng der Gesamt-HeLa-RNA als Matrize verwendet wurden (Daten nicht gezeigt).
  • Die Resultate zeigen, dass die Zugabe von poly(A)-Homopolymer den hemmenden Effekt von Omniscript-RT (QIAGEN) auf HotStar-Taq-DNA-Polymerase (QIAGEN) vermindert, wodurch sie zu höherer Sensitivität und Spezifität in der Ein-Schritt-RT-PCR beiträgt.
  • Beispiel 3: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch andere homopolymere Ribonukleinsäuren
  • Die in Beispiel 2 beschriebenen Experimente wurden repliziert unter Verwendung von poly(U) und poly(C) an Stelle von poly(A), um zu zeigen, dass die Verminderung des hemmenden Effektes von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation, die auf die Anwesenheit einer homopolymeren Ribonukleinsäure zurückzuführen ist, eine allgemeine charakteristische Gemeinsamkeit homopolymerer Ribonukleinsäuren ist.
  • Es wurde das gleiche 626 bp lange Fragment der β-Actin-mRNA als die Matrizen-RNA ausgewählt. Die Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch unfasste 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 400 um von jedem dNTP, 0,4 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 3 bzw. 4), 5 Units HotStar-Taq-DNA-Polymerase (QIAGEN), 0,5 Units Omniscript-RT (QIAGEN) und 1 ng HeLa-Gesamt-RNA. Die Reaktionen wurden in Anwesenheit von 0 ng, 100 ng, 200 ng und 400 ng poly(U)-(Pharmacia) bzw. poly(C)-Homopolymer (Pharmacia) durchgeführt. Reverse Transkription wurde 30 min lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 60°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem Eppendorf Gradienten-Cycler durchgeführt.
  • Die Proben (in dreifacher Ausfertigung) wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Die 2a und 2b zeigen den Effekt von poly(U) bzw. poly(C), wenn 1 ng HeLa-Gesamt-RNA als Matrize und 0 ng, 100 ng und 400 ng der jeweiligen homopolymeren Ribonukleinsäure verwendet werden. Die Ergebnisse dieser Reihe von Experimenten bestätigen, dass die Zugabe von homopolymeren Ribonukleinsäuren den hemmenden Effekt von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation unterdrückt oder vermindert.
  • Beispiel 4: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch homopolymere Deoxyribonukleinsäuren
  • Die Experimente, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, wurden unter Verwendung einer homopolymeren Deoxyribonukleinsäure (poly(dA)) wiederholt, um zu beweisen, dass die Verminderung des hemmenden Effektes der Reversen Transkriptase auf die DNA-Replikation ein Merkmal ist, das homopolymeren Nukleinsäuren im Allgemeinen gemeinsam ist.
  • Es wurde das gleiche 626 bp lange Fragment der β-Actin-mRNA als die Matrizen-RNA ausgewählt. Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch umfasste 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 400 μM von jedem dNTP, 0,4 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 3 bzw. 4), 5 Units HotStarTaq-DNA-Polymerase (QIAGEN), 0,5 Units Omniscript-RT (QIAGEN) und 1 ng HeLa-Gesamt-RNA. Reaktionen wurden in Anwesenheit von 0 ng, 100 ng, 200 ng und 400 ng poly(dA)-Homopolymer (Pharmacia) durchgeführt. Reverse Transkription wurde 30 min lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 60°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem Eppendorf Gradienten-Cycler duchgeführt.
  • Die Proben (in dreifacher Ausfertigung) wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. 3 verdeutlicht, dass die Zugabe von poly(dA) RT-PCR wesentlich verbessert. Diese Ergebnisse bestätigen, dass der hemmende Effekt von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation durch Zugabe von homopolymeren Nukleinsäuren im Allgemeinen vermindert wird (von Deoxyribonukleinsäuren ebenso wie von Ribonukleinsäuen).
  • Beispiel 5: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch homopolymere Nukleinsäuren unter verschiedenen Reverse-Transkriptase-Bedingungen
  • Um zu zeigen, dass die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung bei der Verminderung des hemmenden Effektes von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation unabhängig ist von der Reversen Transkiptase, die verwendet wird, wurden die Experimente der vorhergehenden Beispiele unter Verwendung verschiedener Enzyme, die Reverse-Transkriptase-Aktivität zeigen, wiederholt.
  • Das gleiche 626 bp lange Fragment der β-Actin-mRNA wurde als die Matrizen-RNA ausgewählt. Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch umfasste 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 400 mM von jedem dNTP, 0,4 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 3 bzw. 4), 5 Units HotStar-Taq-DNA-Polymerase (QIAGEN), und 1 bzw. 10 ng HeLa-Gesamt-RNA. Drei Reverse Transkriptasen wurden getestet. Das Reaktionsgemisch enthielt entweder 10 Units AMV-RT (Roche Molecular Biochemicals), 50 Units M-MLV-RT (Promega, rekombinant), oder 50 Units M-MLV, RNaseH–-RT (SuperScript II-RT, LTI, rekombinant). Reaktionen wurden in Anwesenheit von 0 ng, 100 ng, 200 ng und 400 ng poly(A)-Homopolymer durchgeführt. Reverse Transkription wurde 30 min lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 60°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem Biometra Uno II Thermocycler durchgeführt.
  • Eine deutliche Sensitivitätszunahme (d.h. verminderte Hemmung der PCR in der Ein-Schritt-RT-PCR) wurde für alle drei Reverse Transkriptasen beobachtet, die getestet wurden. 4 fasst die Ergebnisse (in dreifacher Ausfertigung) mit β-Actin als Matrize in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit von 400 ng poly(A)-Homopolymer (+) zusammen. Für AMV-RT und MMLV-RT sind die Ergebnisse mit 1 ng Gesamt-RNA als Matrize gezeigt. Für M-MLV, RNaseH–-RT sind die Ergebnisse gezeigt, die mit 10 ng Matrizen-RNA erhalten wurden.
  • Diese Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung zur Verminderung des hemmenden Effektes von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation, unabhängig von der im Reaktionsgemisch verwendeten Reversen Transkriptase. Die vorliegende Erfindung kann als eine allgemeine Komponente zur Optimierung der RT-PCR, unabhängig von der verwendeten Reversen Transkriptase, verwendet werden.
  • Beispiel 6: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch homopolymere Nukleinsäuren unter verschiedenen DNA-Polymerase-, Puffer- und Salzbedingungen
  • Um des weiteren die allgemeine Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung zur Verminderung des hemmenden Effektes von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation bei einer Menge von Reaktionsgemischen zu zeigen, wurden Versuche unter Verwendung unterschiedlicher DNA-Polymerasen, Pufferagenzien und Salzlösungen durchgeführt.
  • Zwei DNA-Polymerasen wurden getestet: unmodifizierte, rekombinante Taq-DNA-Polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer), und rekombinante Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Eine Versuchsreihe verwendete 5 Units AmpliTaq-DNA-Polymerase in einem Reaktionsgemisch, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 400 μM von jedem dNTP und 1 ng HeLa-Gesamt-RNA umfasste. Die zweite Versuchsreihe verwendete 5 Units Pfu-DNA-Polymerase in einem Reaktionsgemisch, das 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 200 μM von jedem dNTP und 1 ng oder 100 ng HeLa-Gesamt-RNA umfasste. Alle Reaktionsgemische enthielten 2 mM DTT, 0,4 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 3 bzw. 4) und 0,5 Units Omniscript-RT. Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt.
  • Reaktionen wurden in Anwesenheit von 0 ng, 100 ng, 200 ng und 400 ng poly(A)-Homopolymer durchgeführt. Reverse Transkription wurde 30 min lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungsschritt am Anfang (5 min, 94°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 60°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem Biometra Uno II Thermocycler durchgeführt.
  • Die Ergebnisse bestätigen, dass in Anwesenheit der homopolymeren Nukleinsäure verbesserte Nukleinsäure-Amplifikation auftrat, ungeachtet der DNA-Polymerase, dem Pufferagens oder der Salzlösung, die in dem endgültigen Reaktionsgemisch verwendet wurden. 5a und 5b zeigen die Ergebnisse unter Verwendung von 1 ng Gesamt-HeLa-RNA in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von 400 ng poly(A). Der hemmungsvermindernde Effekt von homopolymeren Nukleinsäuren bei gekoppelter RT-PCR ist nicht auf eine besondere hitzestabile DNA-Polymerase, ein besonderes Pufferagens oder Salzlösung beschränkt. Es wurde also gezeigt, dass die vorliegende Erfindung unter verschiedenen Ionenbedingungen, verschiedenen pH-Werten von Nutzen ist und bei verschiedenen DNA-Polymerasen angewendet werden kann.
  • Beispiel 7: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch homopolymere Nukleinsäuren bei unterschiedlichen Ziel-Ribonukleinsäuren
  • Um zu zeigen, dass die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung zur Verminderung des hemmenden Effektes von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation unabhängig von der gesuchten Ziel-RNA und den verwendeten Oligonukleotidprimern ist, wurden Versuche durchgeführt mit dem Ziel, ein anderes Gen-Fragment revers zu transkribieren und zu replizieren. Für diese Versuche wurde ein 690 bp langes Fragment der α-Catenin-mRNA aus der Gesamt-HeLa-RNA als RNA-Matrize für die RT-PCR ausgewählt.
  • Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch umfasste 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 400 μM von jedem dNTP, 0,4 μM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 5 bzw. 6), 5 Units HotStarTaq-DNA-Polymerase (QIAGEN), 0,5 Units Omniscript-RT und 5 ng Gesamt-HeLa-RNA. Reaktionen wurden in Anwesenheit von entweder 0 ng oder 500 ng poly(A)-Homopolymer durchgeführt. Reverse Transkription wurde 30 min lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 50°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem MJR PTC 200 Thermocycler durchgeführt.
  • Die Proben (in dreifacher Ausfertigung) wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Eine klare Verbesserung der Wirksamkeit und der Spezifität bei Zugabe von poly(A) wurde für die Reverse Transkription und Amplifikation der α-Catenin-Matrize aus 5 ng der HeLa-Gesamt-RNA beobachtet (siehe 6). Die Ergebnisse bestätigen, dass die hemmungsvermindernde Wirkung von homopolymeren Nukleinsäuren bei der gekoppelten RT-PCR für eine besondere Matrizen-RNA oder die Verwendung eines besonderen Oligonukleotidprimers spezifisch ist.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von poly(A)-Homopolymer die hemmende Wirkung von Omniscript-RT (Qiagen) auf HotStarTaq-DNA-Polymerase (Qiagen) vermindert, wodurch sie zu höherer Sensitivität und Spezifität bei der Ein-Schritt-RT-PCR beiträgt.
  • Beispiel 8: Verminderung der Reverse-Transkriptase-Hemmung der Nukleinsäure-Amplifikation durch homopolymere Nukleinsäure im Vergleich zu anderen Nukleinsäuren
  • Die vorhergehenden Beispiele haben überzeugend gezeigt, dass der positive Effekt von homopolymerer Nukleinsäure, der im Vermindern des hemmenden Effektes der Reversen Transkriptase auf die DNA-Replikation besteht, unabhängig ist von der Reversen Transkriptase, der DNA-Polymerase, dem Oligonukleotidprimer, der RNA-Matrize, dem Pufferagens oder der Salzlösung, die im Reaktionsgemisch verwendet werden.
  • Um die einzigartigen Vorteile der vorliegenden Erfindung, die in der Verminderung des hemmendes Effektes von Reverser Transkriptase auf die DNA-Replikation bestehen, zu zeigen, wurden gleichzeitige Versuche durchgeführt, die den Effekt auf homopolymere Nukleinsäuren mit anderen Nukleinsäuren, besonders mit nicht-homologen RNA-Molekülen, verglichen.
  • Das 690 bp lange Fragment der α-Catenin-mRNA wurde als RNA-Matrize ausgewählt. Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch umfasste 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,001% Gelatine, 2,5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 400 μM von jedem dNTP, 0,4 mM Sense- und Antisense-Primer (SEQ ID Nr.: 5 bzw. 6), 5 Units HotStarTaq-DNA-Polymerase (QIAGEN), 0,5 Units Omniscript-RT (QIAGEN) und 5 ng HeLa-Gesamt-RNA.
  • Die Versuchsreihe bestand aus Reaktionsgemischen, die entweder keine zusätzliche Nukleinsäure, 500 ng poly(A) (Pharmacia), 500 ng tRNA (Sigma) oder 500 ng E. coli-16S,23S-rRNA (Roche Molecular Biochemicals) enthielten. Reverse Transkription wurde 30 min lang bei 42°C durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einem RT-Denaturierungs/HotStarTaq-Aktivierungsschritt am Anfang (15 min, 95°C), 40 Zyklen (1 min, 94°C; 1 min, 50°C, 1 min, 72°C) und einem Verlängerungsschritt am Ende (10 min, 72°C). RT-PCR wurde in einem MJR PTC 200 Thermocycler durchgeführt.
  • 6 zeigt die vergleichenden Ergebnisse der RT-PCR in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von zusätzlichen Nukleinsäuren. Wenn, außer Matrizen-RNA, keine weitere RNA im Reaktionsgemisch vorhanden war, konnte kaum irgendein DNA-Produkt nachgewiesen werden. Ähnliche, negative Ergebnisse wurden erhalten, wenn 500 ng tRNA zum Reaktionsgemisch zugegeben wurden, wodurch die Beobachtungen von Chandler et al. (1998) bestätigt wurden, die den von Sellner et al. (1992) postulierten, positiven Effekt von tRNA in der Ein-Schritt-RT-PCR nicht bekräftigen konnten. Die Zugabe von 500 ng rRNA zur Reaktion führte zur Amplifikation des erwünschten Nukleinsäureproduktes. Jedoch erschien auch eine zweite, unspezifische Bande in der Größenordnung von 400 bp. Dieses Ergebnis verdeutlicht klar die offensichtlichen Nachteile, die mit der Verwendung von rRNA als hemmungsverminderndes Agens verbunden sind, basierend auf den theoretischen Überlegungen, dass solche Moleküle als mögliche Ziele für Mispriming dienen. Nur die Verwendung der homopolymeren Nukleinsäure resultierte in einer klaren Verbesserung der RT-PCR, wodurch die Überlegenheit der Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung zur Verminderung des hemmenden Effektes der Reversen Transkriptase auf die DNA-Replikation bestärkt wird.
  • Die vorliegende Erfindung schließt durch Bezugnahme Techniken in ihrem ganzen Umfang ein, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt sind. Diese Techniken schließen Techniken ein, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind, sind aber nicht auf diese beschränkt:
    • Old, R.W. und S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3. Auflage 1985), Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2: 409 S. (ISBN 0-632-01318-4).
    • Sambrook, J. et al. (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laboratoary Manual (2. Auflage, 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Bände 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
    • Winnacker, E.L., From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (übersetzt von Horst Ibelgaufts). 634 S. (ISBN 0-89573-614-4).
  • Literatur
    • Chadwick et al. Comparison of three RNA amplification methods as sources of DNA for sequencing. BioTechniques 25(5): 818-822 (Nov. 1998).
    • Chandler et al. Reverse transcriptase (RT) inhibition of PCR at low concentrations of template and its implications for quantitative RT-PCR. Appl. and Environm. Microbiol. 64(2):669-677 (Feb. 1998).
    • Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 350:91-92 (1991).
    • Cusi et al. Comparison of M-MLV reverse transcriptase and Tth polymerase activity in RT-PCR of samples with low virus burden. BioTechniques 17:1034-1036 (1994).
    • Guatelli et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modelled alter retroviral replication. PNAS USA 87:1874-1878 (1990).
    • Juhasz et al. Sensitivity of tyrosinase mRNA detection by RT-PCR: rTth DNA polymerase vs. MMLV-RT and Amplitaq® polymerase. BioTechniques 20:592-600 (1996).
    • Mallet et al. Continuous RT-PCR using AMV-RT and Taq DNA polymerase: characterization and comparison to uncoupled procedures. BioTechniques 18:678-687 (1995).
    • Myers and Gelfand. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30:7661-7666 (1991).
    • Saiki et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anaemia. Science 230:1350-1354 (1985).
    • Sellner and Turbett. Comparison of three RT-PCR methods. BioTechniques 25(2):230-234 (Aug. 1998).
    • Sellner et al. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucl. Acids Res. 20(7):1487-1490 (Apr. 11, 1992)
    • Sellner et al. A one-tube, one manipulation RT-PCR reaction for detection of Ross River virus. J. Virol. Methods 40:255-264 (1992).
    • Sooknanan et al. Fidelity of nucleic acid amplification with avian myeloblastosis virus reverse transcriptase and T7 RNA polymerase. BioTechniques 17:1077-1085 (1994).
    • Xu et al. The application of polymerase chain reaction to the detection of rotaviruses in faeces. J. Virol. Methods 27:29-38 (1990).
    • Young et al. Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcriptionpolymerase chain reaction assay. J. Clin. Microbiol. 31:882-886 (1993).
  • Sequenzen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wurde
    • SEQ ID Nr.: 1: ATGTTAGTGA AGAAGAGGAG GATG
    • SEQ ID Nr.: 2: CTTGGCTTGT AGAATCTGTA TCAA
    • SEQ ID Nr.: 3: CCTTGCCTTT GCCGATCC
    • SEQ ID Nr.: 4: GGATCTTCAT GAGGTAGTCA GTC
    • SEQ ID Nr.: 5: AGCTGAAAGT TGTGGAAGAT G
    • SEQ ID Nr.: 6: GGAGCTGTCT ACGCAAGTC
  • EP_Sequenzliste Sequenzliste
    Figure 00350001
  • Figure 00360001

Claims (29)

  1. Zusammensetzung, geeignet für die Erzeugung von Nukleinsäuren von einer Ribonukleinsäurematrize, enthaltend eine homopolymere Nukleinsäure, einen oder mehrere Oligonukleotidprimer, irgendein Nukleotid oder mehrere Nukleotide oder Derivate davon, und zwei oder mehr unterschiedliche Polymerasen, von denen mindestens eine Reverse Transkriptase-Aktivität aufweist, wobei die homopolymere Nukleinsäure homopolymeres poly(A), homopolymeres poly(U), homopolymeres poly(C), homopolymeres poly(G), homopolymeres poly(dA), homopolymeres poly(dI), homopolymeres poly(dC) oder homopolymeres poly(dG) oder ein Gemisch aus zwei oder mehr von diesen ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, enthaltend des weiteren ein Puffermittel, ein Salz und/oder Zusätze, die bei der RT-PCR nützlich sind.
  3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung mindestens 10 ng oder mindestens 200 ng/ml homopolymere Nukleinsäure enthält.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Zusammensetzung zwischen 10 und 2000 ng oder zwischen 200 und 40000 ng/ml homopolymere Nukleinsäure enthält.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die die Reverse Transkriptase-Aktivität zeigende Polymerase AMV-RT, M-MLV-RT, HIV-RT, EIAV-RT, RAV2-RT, C. hydrogenoformans DNA Polymerase, SuperScript I, SuperScript II und/oder Mutanten, Varianten und Derivate davon ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der Polymerasen DNA Polymerase ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die DNA Polymerase Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENTTM, DEEPVENTTM DNA Polymerase und/oder Mutanten, Varianten und Derivate davon ist.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Primer Zufallsprimer, Homopolymere und/oder für eine Ziel-RNA-Matrize spezifische Primer sind.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Puffermittel ausgewählt ist aus der Gruppe TRIS, TRINCE, BIS-TRINCE, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES, CAPS oder ein Gemisch davon ist.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe Kaliumchlorid, Kaliumacetat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Manganacetat, Mangansulfat, Natriumchlorid, Natriumacetat, Lithiumchlorid, Lithiumacetat oder ein Gemisch davon ist.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der bei der RT-PCR nützliche Zusatz ausgewählt ist aus der Gruppe DMSO, Glycerol, Formamid, Betain, Tetramethylammoniumchlorid, PEG, Tween 20, NP 40, Ectoin, Polyole, E. coli SSB Protein, Phage T4 Gen 32 Protein, BSA oder ein Gemisch davon ist.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Nukleotide ausgewählt sind aus der Gruppe dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, alpha-Thio-dNTPs, Biotin-dUTP, Fluoreszein-dUTP, Digoxigenin-dUTP oder ein Gemisch davon sind.
  13. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure von einer RNA Matrize mit den Schritten: a) Zugabe der RNA Matrize zu einem Reaktionsgemisch, wobei das Reaktionsgemisch mindesten eine Reverse Transkriptase und mindestens eine Nukleinsäurepolymerase, oder Derivate davon, und eine homopolymere Nukleinsäure und einen Nukleinsäureprimer enthält, wobei die homopolymere Nukleinsäure homopolymeres poly(A), homopolymeres poly(U), homopolymeres poly(C), homopolymeres poly(G), homopolymeres poly(dA), homopolymeres poly(dI), homopolymeres poly(dC) und/oder homopolymeres poly(dG) ist; und b) Inkubieren des Reaktionsgemischs unter Bedingungen, die ausreichen, die Polymerisierung eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einem Teil der RNA Matrize ist, zu erlauben.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reaktionsgemisch von Schritt a) des weiteren ein Ribonukleotidtriphosphat oder mehrere Ribonukleotidtriphosphate oder Derivate davon enthält.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure DNA und die Polymerase DNA Polymerase ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Ribonukleinsäuretriphosphatderivat dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, alpha Thio-dNTPs, Biotin-dUTP, Fluoreszein-dUTP und/oder Digoxigenin-dUTP ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die DNA Polymerase eine thermostabile Polymerase ist, wobei die thermostabile Polymerase vorzugsweise Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENTTM, DEEPVENTTM DNA Polymerase und/oder Mutanten, Varianten und Derivate davon ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Reverse Transkriptase AMV-RT, M-MLV-RT, HIV-RT, EIAV-RT, RAV2-RT, C. hydrogenoformans DNA Polymerase, SuperScript I, SuperScript II und/oder Mutanten, Varianten und Abkömmlinge davon ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Nukleinsäureprimer komplementär zu einem Teil der RNA Matrize ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die DNA komplementär zu einem Teil der RNA Matrize ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die DNA durch einen DNA Replikationsprozess amplifiziert wird, wobei der DNA Replikationsprozess vorzugsweise eine Polymerasekettenreaktion (PCR) enthält.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die verbundenen Reaktionen der DNA Erzeugung und Amplifikation in einem gekoppelten Reaktionsgemisch erfolgen.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Reaktion zwischen etwa 23°C und etwa 100°C abläuft.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Reverse Transkription zwischen etwa 37°C und etwa 70°C und die PCR Amplifikation zwischen etwa 60°C und etwa 95°C stattfinden.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die PCR Amplifikation mindestens 25 Zyklen der Denaturierung, des Annealens und der Polymerisierung umfasst.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 25, wobei die Reverse Transkription zwischen etwa 37°C und etwa 60°C, die Denaturierung bei etwa 94°C, das Annalen bei etwa 60°C und die Polymerisierung bei etwa 72°C stattfinden.
  27. Reagenzienkit zur Durchführung einer gekoppelten RT-PCR nach einem der Ansprüche 13 bis 26, enthaltend mindestens eine Reverse Transkriptase, eine DNA Polymerase, und eine homopolymere Nukleinsäure ausgewählt aus homopolymerem poly(A), homopolymerem poly(U), homopolymerem poly(C), homopolymerem poly(G), homopolymerem poly(dA), homopolymerem poly(dI), homopolymerem poly(dC) oder homopolymerem poly(dG) oder einem Gemisch aus zwei oder mehr von diesen.
  28. Reagenzienkit nach Anspruch 27, wobei die Reverse Transkriptase, die DNA Polymerase und die homopolymere Nukleinsäure in einem Behälter vereint sind, oder wobei die Reverse Transkriptase und die DNA Polymerase in einem Behälter vereint sind und die homopolymere Nukleinsäure in einem zweiten Behälter ist.
  29. Reagenzienkit nach Anspruch 27 oder 28, weiterhin enthaltend ein Gemisch aus zwei oder mehr von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und/oder einem bei der RT-PCR nützlichen Zusatz oder mehreren bei der RT-PCR nützlichen Zusätzen und/oder einem Puffermittel.
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