CN1316036C - 一种以聚合酶链式反应为基础的基因定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术，即一种以聚合酶链式反应为基础的基因定量方法。本发明PCR接续转录反应方法分二步进行。第一步为先作比通常循环数少5-10个循环数的低循环数PCR，当扩增产物呈直线累积、PCR平坡出现前结束反应。由于在PCR一个引物的5’端引入了RNA聚合酶识别顺序，PCR目标扩增产物可作为离体转录合成RNA的模板。第二步为在加入转录试剂后立刻启动RNA合成。在规定的转录条件下RNA的合成量与模板数量即PCR扩增产物量成正比，因而也反映了测定样品中原始模板的数量，并且，由转录反应合成的RNA量可达模板数量的几百至千倍，从而可方便地用溴乙锭或其它核酸染色剂定量测定。本基因定量方法不用放射性同位素，不涉及抗原抗体作用，也毋须进行核酸杂交，方法简单、准确，有广泛的应用价值。

Description

一种以聚合酶链式反应为基础的基因定量方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，即一种以聚合酶链式反应为基础的基因定量方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种简单，专一，灵敏，快速的扩增特定DNA的方法，但标准PCR方法的功能局限于定性扩增，其原因在于PCR的前阶段产物按指数方式扩增，产物增长呈直线，在此阶段目标扩增产物的累积量还相当低，尚不能用荧光染色剂、如溴乙锭对电泳后的条带作准确的定量测定。 PCR反应继续进行、扩增产物总量足够被测定时，反应已进入平坡期或饱和期，此时，扩增产物总量与样品中的原始模板已不成正此关系，难以定量。若干年来已发展了多种方法来克服标准PCR不能定量的缺陷。方法之一是应用同位素标记引物或同位素标记脱氧核糖核苷酸底物，由于同位素掺入到扩增产物使检测灵敏度大大提高，从而可以在PCR进入平坡前停止反应并进行测定。这种方法虽较简单，但是放射性同位素的安全性和由此带来的一系列操作问题使这一方法的应用受到极大的限制。方法之二是在引物上标记生物素或地高辛。方法之三是PCR之后进行核酸杂交，利用标记探针的信号放大作用来进行测定。从检测灵敏度看，后二种方法均可在进入平坡前停止PCR反应，但这二种方法的后续检测都涉及生物素与亲合素的反应，抗原与抗体的反应和酶促显色反应，程序复杂、操作麻烦。
发明内容
本发明的目的就是针对现有RNA生物技术存在的缺陷，提供一种较其它各种以PCR为基础的方法优越的基因定量方法。
本发明以PCR为基础的基因定量方法，是先作此通常循环数少5-10个的低循环数聚合酶链式反应，在进入平坡前停止反应，不经过任何纯化，在加入转录反应试剂后立即接续进行RNA合成，最后经电泳，染色和条带扫描定量测定RNA；本发明中的PCR的一个引物长40-50碱基，其5’端含T7，T3或SP6 DNA依赖的RNA聚合酶的识别顺序，该识别顺序与模板顺序至少有20-30碱基的互补；本发明PCR的引物终浓度0.01-1uM，4种脱氧核糖核苷酸的浓度均为0.01-0.2mM，Taq DNA聚合酶的用量为每50微升反应液0.5-5单位，其下限小于通常被采用的每50微升1个单位；本发明PCR和转录反应可以在同一反应试管中接续进行，PCR反应体积小于10微升。转录反应液总体积是PCR反应液的1.5倍以上，优选2-4倍。
本发明基因定量方法包括PCR反应和转录反应二个步骤，二个步骤相互接续，可以只用一个试管来完成，第一步用PCR来扩增目标基因，但PCR循环数比通常少5-10个循环，虽然此时反应液中扩增产物的总量较少，不能直接用通常的核酸染色剂来定量测定，但因为PCR反应仍处在直线阶段未进入平坡期，所以扩增产物总量与样品中原始模板的数量成正此例。本发明的原理在于用转录反应使PCR扩增产物进一步按线性增加的方式合成RNA。这一设想能付之实现的基础是发现PCR反应液的必要成份脱氧核糖核苷酸，正，反引物和DNA聚合酶等在相当宽的浓度范围内对转录反应没有可测见的显着影响。所以，在完成PCR反应后可以不经过任何分离步骤而进入转录反应。在RNA聚合酶和核糖核苷酸底物过量，反应温度和时间固定的条件下，RNA的合成量与转录反应的模板数量，即PCR扩增产物的数量成正比例，所以，最终合成的RNA量反映了样品中原始模板DNA的数量。由转录反应合成的RNA量可达到模板数量的几百至千倍，从而可以方便地用溴乙锭或其它核酸染色剂定量测定。
为了使PCR扩增产物能作为转录RNA的模板，必须在PCR的一个引物的5’接上T7，T3或SP6的DNA依赖的RNA聚合酶的识别顺序。这一方法已被用于制备反义RNA探针，但涉及克隆，质粒线性化或核酸分离步骤。因为PCR反应液的组成成份不影响转录反应，如果经PCR反应产物中不含可能干扰转录反应的非专一扩增产物，就可在PCR完成后直接进入转录反应。本发明采用含RNA聚合酶识别顺序的引物进行PCR，其特征在于不经过任何纯化和其它步骤，在添加已预配好的转录试剂后就直接开始转录反应。为了消除非专一扩增产物，本发明在引物设计和反应条件等方面具有如下一些特征：第一，本发明的聚合酶链式反应应用一对引物，其中一个引物在5’端含RNA聚合酶识别顺序，引物长40-50碱基。该引物的3’端与目标基因顺序完全匹配，长度为20-30碱基。该引物的5’端为RNA聚合酶识别顺序与目标基因顺序有至少20-30的互补碱基数，从面使整个引物具有高严谨性，高解链温度和高的与模板专一结合强度。另一引物长31-40碱基，其顺序与目标基因完全匹配，其严谨性，解链温度和与模板专一结合强度与带RNA聚合酶识别顺序的引物接近。如此设计的引物对能在68℃以上的温度下退火，PCR产物不含任何非专一扩增产物，避免了对转录反应的干扰。第二，PCR反应液体积可以采用通常的50或100微升，反应结束后取一定体积至另一试管并按1∶1至1∶4的比例加入转录反应试剂。为了使PCR和转录反应能在同一个试管内完成并节约大量试剂，PCR反应液体积可降低为5或10微升，反应结束后加15或10微升转录试剂，使转录反应液总体积为通常使用的20微升。第三，PCR反应液引物的终浓度范围为0.01-1uM，4种脱氧核糖核苷酸的浓度范围均为0.01-0.2mM，DNA聚合酶的用量范围可为每50微升反应液0.5-5单位，这三种试剂浓度范围的下限均比标准PCR的通常范围低，这是因为本发明的PCR只需进行15-20循环，引物和脱氧核糖核苷酸的消耗比通常PCR少几十至几百倍，无论试剂的初始浓度是高还是低，其消耗量相对于起始量都可以忽略不计。采用较低浓度的试剂既增强了PCR反应参数的严谨性，有利于减少非专一产物，又节约了试剂，同时降低了转录反应液中这些试剂的浓度。第四，PCR反应与转录反应均需要镁离子但最适浓度不尽相同。由于镁离子在反应中无消耗，反应前后浓度不变，PCR反应液带入转录反应的镁离子量在管与管之间没有区别，不影响整个测定的准确性。为了使PCR反应和转录反应均能在各自的最佳镁离子浓度下工作，可以增大转录反应体积与PCR反应体积之比，或者在配制转录反应溶液时，PCR反应会带入的镁离子量考虑进去。第五，PCR反应的最适pH比转录反应高0.5-1个单位，PCR反应液的加入不会影响测定的准确性，但会使转录反应pH值偏高而影响反应速度。为了使转录反应能在最佳pH下工作，可适当降低PCR缓冲液的浓度或适当提高转录反应缓冲液的浓度来减少PCR反应液对转录反应pH的影响，或者增加转录反应液体积对PCR反应液体积的比值，或者配制转录缓冲液时使其pH值比最佳反应pH值略低，预配的转录试剂加入到PCR反应管后就达到转录反应的最佳pH值。
本发明较现有其它各种以PCR为基础的基因定量方法简单，方便，准确。整个检测过程既不涉及放射性同位素操作，又不必制备探针和进行核酸杂交，也母需抗原抗体作用和酶促显色反应。
附图说明
图1为DNA模板的加量与RNA条带扫描值关系图。
图2为c-DNA加量与RNA条带扫描值关系图。
具体实施方式
本发明以对甘油-3-磷酸脱氢酶基因(基因库编号XM_006959)的定量测定为实施例，PCR反应引物的特性和顺序列于表一。
表一 引物特性和顺序(表中含底线_的核苷酸为T7DNA聚合酶识别顺序)
符号 引物位置 引物长度 Tm 引物顺序
A5’ 348-367 20 70.0 CGC TGA GTA CGT CGT GGA GT
A3’ 772-788 17 70.4 GCA GTG GGG ACA CGG AA
B5’ 339-367 29 86.7 CGA TGC TGG CGC TGA GTA CGT CGTGGA GT
B3’ 772-811 40 86.9 TTG  TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
GCA GTG GGG ACA CGG AA
实施例1，比较两对引物在相同条件下的最高允许退火温度。第一对引物(A5’和A3’)是用引物设计软件选取的20碱基左右的具有高严谨性的优秀引物。第二对引物(B5’和B3’)与第一对同源，其中B3’引物是在A3’引物的5’端加上含20碱基的T7 RNA聚合酶识别顺序，而B5’引物则是在A5’引物的5’端延伸9个碱基，B5’的解链温度(Tm)为86.7℃，比A5’高近17度。PCR反应液组成成份的终浓度为：缓冲液40mM Tricine-KOH，pH8.7，镁离子35mM，引物浓度0.5uM，腺嘌呤脱氧核糖核酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dGTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dCTP和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP等四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为0.2mM，DNA聚合酶每50微升反应液2.5U，c-DNA每50微升反应液5微升，c-DNA由商品人组织总RNA用反转录商品试剂盒合成。 PCR反应首次变性为95℃1分钟，循环变性为95℃30秒钟，延伸为72℃(退火温度为63.4-72℃时)或74℃(退火温度为73-74℃时)1分钟，反应30循环，PCR反应液用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色后用商品图像仪扫描检测。试验结果列于表二
表二 PCR最高允许退火温度的比较
退火温度(℃)
引物 63.4 65.2 67.2 68.9 70.2 71.1 72 73 73.7 74
A5’/3’ 有 有 有 有 有 有 无 无 无 无
B5’/3’ 有 有 有 有 有 有 有 有 有 无
结果表明普通引物长引物对A最高能在71℃退火，而同源的含RNA聚合酶识别顺序引物对B能在73℃以上退火。在如此高温下退火只形成可作为转录模板的目标扩增产物而无任何非专一扩增产物。
实施例2，比较两对引物在相同条件下的检测灵敏度。PCR反应液的组成和反应条件与实施例1相同，引物对A和引物对B的退火温度分别为70和72℃，c-DNA按对半稀释后加入反应液。结果列于表三
表三PCR反应的检测灵敏度
c-DNA稀释度
引物 20 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9
A5’/3’B5’/3’ 有有 有 有 有 有 有 有 有 有 无
有 有 有 有 有 有 有 有 无
结果表明含有RNA识别顺序的引物与其同源普通引物对一样，当c-DNA被稀释250倍后仍有目标扩增产物形成。
实施例3，测试分析不同浓度的脱氧核糖核苷酸，引物和镁离子对转录反应的影响。首先以引物对B按实施例1和2所示条件得到PCR产物，用商品PCR纯化柱去除残留的引物、脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶和缓冲剂成分，纯化的PCR扩增产物的浓度调节至200pg/ul，用作转录反应的DNA模板。转录反应液的组成见表四。
表四 转录反应液的组成和配制
试剂名称、浓度 加量 最终浓度
10X缓冲液 400mM Tris pH 7.5 2微升 40mM
60mM MgCl2 6mM
20mM supermidine 2mM
50mM NaCl2 5mM
T7RNA聚合酶10U/ul 0.5微升 5U/20ul
核酸酶抑制剂10U/ul 0.5微升 5U/20ul
100mM dithiothreitol 2微升 10mM
牛血清白蛋白2mg/ml 1微升 0.05mg/ml
4种核糖核苷酸底物 10mM腺嘌呤核糖核苷酸 1微升 0.5uM
10mM鸟嘌呤核糖核苷酸 1微升 0.5uM
10mM尿嘧啶核糖核苷酸 1微升 0.5uM
10mM胞嘧啶核糖核苷酸 1微升 0.5uM
DNA模板200pg/ul 5微升 1ng/20ul
水或待分析试剂 5微升
在37℃保温二小时后用8M尿素5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，经溴乙锭染色后扫描RNA条带。结果表明当外源加入的镁离子浓度为0.5和2mM，4种脱氧核糖核苷酸浓度各为0.1，0.2和0.4mM，正、反引物浓度各为0.1，0.2和0.4uM时对RNA合成均没有影响。
实施例4，测试RNA合成量与DNA模板含量的线性关系。现行离体转录方法制备RNA探针所用的线性化质粒的模板浓度通常为500-1000ng。而本发明PCR接续转录反应方法的模板量小于1ng。本实施例所用DNA模板与实施例3相同，浓度调节至100pg/ul，在几个测试管分别加100-400pg的DNA模板。转录反应液的组成，反应条件和测定方法与实施例3相同。RNA条带扫描强度显示于图1。
图一表明RNA的合成量与加入的DNA模板量呈良好线性关系，R2＝0.9771。比较RNA条带与标准RNA的扫描值可测知RNA合成速度，结果表明在测试条件下，每一份DNA模板在2小时内可合成约250拷贝RNA。
实施例5，说明本发明PCR接续转录反应基因定量方法的整个过程。先用引物对B对含不同量原始模板的样品进行扩增。引物浓度为0.1uM，4种脱氧核糖核苷酸的浓度均为0.1mM，缓冲液为40mM Tris，pH8.3，镁离子浓度为1.5mM，Taq DNA聚合酶每50微升反应液2U，PCR反应体积每管5微升。 PCR反应条件与实施例1相同，退火延伸为70℃2分钟，反应20循环。PCR反应结束后每一管加15微升预先配制的转录反应液，使混合后溶液中的核糖核苷酸浓度、镁离子浓度，RNA聚合酶浓度，DDT浓度和核酸酶抑制浓度均与表四所示相同。配制转录反应预混液用的Tris缓冲剂储液浓度与表四所列相同，但pH为7.3，PCR反应液与转录溶液按比例混合后pH值接近7.5。 37℃保温2小时后按实施例3和4的方法测定。结果显示于图二。结果表明，当c-DNA量为每管1-4微升时，c-DNA加量与最终得到的RNA条带扫描值成良好线性关系，R2＝0.9748。

Claims (4)

1.一种以聚合酶链式反应PCR为基础的基因定量方法，其特征在于先作比通常循环数少5-10个循环的低循环数聚合酶链式反应，在进入平坡前停止聚合酶链式反应，在加入转录反应试剂后立即接续转录反应合成RNA、进行测定，其中一个PCR引物长40-50碱基，其5’端含T7、T3或SP6 DNA依赖的RNA聚合酶的识别顺序，该识别顺序与模板顺序至少有20-30碱基互补，PCR引物对退火温度大于68℃，引物终浓度为0.01-1uM，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为0.01-0.2mM，Taq DNA聚合酶的用量为每50微升反应液0.5-5个单位。
2、根据权利要求1所述的基因定量方法其特征在于所说的PCR反应体积小于10微升。
3、根据权利要求1所述的基因定量方法，其特征在于所述的转录反应液总体积是PCR反应液体积的1.5倍以上。
4、根据权利要求1所述的基因定量方法，其特征在于所述的转录反应液总体积是PCR反应液体积的2-4倍。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181551B (zh) * 2011-04-20 2014-04-16 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 朱砂叶螨scar标记及其特异性pcr检测方法
CN103642919B (zh) * 2013-12-06 2015-03-25 亚能生物技术（深圳）有限公司 基于变性沉淀的样本处理液及其应用、核酸释放方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955271A (en) * 1995-07-21 1999-09-21 Boehringer Mannheim Gmbh Method and kits for determining messenger RNA molecules in a sample
CN1238456A (zh) * 1999-02-12 1999-12-15 中山医科大学科技开发公司 用于核酸检测的荧光定量pcr方法及其试剂盒
DE19854955A1 (de) * 1998-11-27 2000-05-31 Arnold Ganser Verfahren zur differentiellen quantitativen Bestimmung alternativ gespleisster mRNAs unter Anwendung der isoformspezifischen Echtzeit-RT-PCR
CN1265155A (zh) * 1997-06-16 2000-08-30 俄亥俄医学院 利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法
WO2000058505A1 (de) * 1999-03-26 2000-10-05 Artus Gesellschaft für molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung mbH Detektion von nukleinsäure-amplifikaten
US6300069B1 (en) * 1999-05-03 2001-10-09 Qiagen Gmbh Generation and amplification of nucleic acids from ribonucleic acids
CN1353199A (zh) * 2000-11-15 2002-06-12 吴昌 一种核酸分子扩增和标记方法
CN1356551A (zh) * 2001-11-08 2002-07-03 郭占军 定量pcr和免疫pcr通用检测方法和试剂盒
CN1381588A (zh) * 2002-05-17 2002-11-27 徐定邦 改用超长引物以提高基因扩增效能的聚合酶链式反应方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6033369A (en) * 1998-09-23 2000-03-07 Goldenberg; Alec Disposable handle and needle assembly

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955271A (en) * 1995-07-21 1999-09-21 Boehringer Mannheim Gmbh Method and kits for determining messenger RNA molecules in a sample
CN1265155A (zh) * 1997-06-16 2000-08-30 俄亥俄医学院 利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法
DE19854955A1 (de) * 1998-11-27 2000-05-31 Arnold Ganser Verfahren zur differentiellen quantitativen Bestimmung alternativ gespleisster mRNAs unter Anwendung der isoformspezifischen Echtzeit-RT-PCR
CN1238456A (zh) * 1999-02-12 1999-12-15 中山医科大学科技开发公司 用于核酸检测的荧光定量pcr方法及其试剂盒
WO2000058505A1 (de) * 1999-03-26 2000-10-05 Artus Gesellschaft für molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung mbH Detektion von nukleinsäure-amplifikaten
US6300069B1 (en) * 1999-05-03 2001-10-09 Qiagen Gmbh Generation and amplification of nucleic acids from ribonucleic acids
CN1353199A (zh) * 2000-11-15 2002-06-12 吴昌 一种核酸分子扩增和标记方法
CN1356551A (zh) * 2001-11-08 2002-07-03 郭占军 定量pcr和免疫pcr通用检测方法和试剂盒
CN1381588A (zh) * 2002-05-17 2002-11-27 徐定邦 改用超长引物以提高基因扩增效能的聚合酶链式反应方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
定量聚合酶链工反应技术检测溃疡创面纤维连接蛋白表达水平的变化 杨银辉，中国修复重建外科杂志，第14卷第1期 2000 *

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