DE19854955A1 - Verfahren zur differentiellen quantitativen Bestimmung alternativ gespleisster mRNAs unter Anwendung der isoformspezifischen Echtzeit-RT-PCR - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur differentiellen quantitativen Bestimmung alternativ gespleißter mRNAs durch Isoform-spezifische Echtzeit-RT-PCR unter Verwendung eines Paares fluoreszierend doppelt markierter Oligonucleotid-Sonden oder eines Satzes aus zwei Paaren einzeln fluoreszierend markierter Oligonucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, wobei eine doppelt markierte Oligonucleotid-Sonde oder ein Paar einzeln markierter Oligonucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, speziell so angepaßt ist, daß die Hybridisierung im wesentlichen über der Fusionsstelle einer kürzeren DNA-Variante, die durch Spleißen einer Teilsequenz erhalten wurde, zentriert erfolgt und die andere doppelt markierte Oligonucleotid-Sonde oder das andere Paar einzeln markierter Oligonucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, speziell so angepaßt ist, daß die Hybridisierung im wesentlichen mit der Teilsequenz einer längeren DNA-Variante, die in der kürzeren DNA-Variante fehlt, erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur differentiellen quan­ titativen Bestimmung alternativ gespleißter mRNAs unter Anwen­ dung der Isoform-spezifischen Echtzeit-RT-PCR gemäß Oberbegriff von Anspruch 1 und einen Kit zur Verwendung in dem Verfahren gemäß Anspruch 9.

Die Echtzeit-TaqMan-PCR-Technologie beruht auf der Fähigkeit von Taq-Polymerase, ein während der PCR-Amplifikation (5'- Nuklease-PCR-Assay (1)-(3); Übersicht in (4); die Ziffern in Klammern beziehen sich auf die Literaturaufstellung im Anschluß an die Beschreibung) an eine Target-Sequenz assoziiertes fluo­ reszenzmarkiertes Reporter-Oligonucleotid zu verdrängen und zu schneiden. Die Hydrolyse des doppelt markierten Oligonucleo­ tids, d. h. die Trennung von Reporter- und Quencher-Farbstoff, ergibt nach der Anregung ein von dem Reporter-Farbstoff emit­ tiertes nachweisbares Fluoreszenzsignal. Die normalisierte Emissionsintensität kann entweder nach der Amplifikation (End­ punkt) oder in Echtzeit, bezogen auf den Zyklus, verfolgt wer­ den. Die Echtzeit-Messung während der exponentiellen Phase der PCR gestattet die Bestimmung des Schwellenwertzyklus (C_T), d. h. der Teilzykluszahl, bei der die Fluoreszenzintensität einen festgelegten Schwellenwert übersteigt. Da der C_T-Wert dem Log­ arithmus der Kopien-Anfangszahl umgekehrt proportional ist, ge­ stattet die Echtzeit-Messung die spezifische und empfindliche Verfolgung des Amplifikationsprozesses und die Quantifizierung der Matrizen-Anfangszahl.

Die Echtzeit-PCR wird derzeit sowohl zur Analyse genomischer als auch komplementärer DNA für unterschiedliche klinische An­ wendungen benutzt, beispielsweise zur Gen-Typisierung (5), zur Bestimmung der Gen-Kopien-Anzahl (3), zum Nachweis und zur Quantifizierung infektiöser Agenzien in geringen Mengen (6), sowie zur Quantifizierung von Molekülmarkern zur Verfolgung der minimalen Resterkrankung bei hämatologischen Malignitäten (7).

Sämtliche dieser Anwendungen sind mit der Quantifizierung einer einzelnen (c)DNA-Spezies, z. B. dem bcr-abl-Transkript (7) ver­ bunden. Die Quantifizierung der relativen Mengen von zwei ähn­ lichen Molekülen, beispielsweise von Spleiß-Varianten, die sich nur in einem kleinen Teil des Moleküls unterscheiden, kann je­ doch zur Verfolgung des alternativen Spleissens und der Expres­ sionsmuster während der Entwicklung, der zellulären Dif­ ferenzierung oder einer Erkrankung sehr wichtig sein. Um diesen Punkten Rechnung zu tragen, erfolgt die qualitative und quanti­ tative Analyse von RNA derzeit durch Northern-Blotting, mit dem RNAse-Protection-Assay (RPA) oder durch reverse Transkription (RT) und mit verschiedenen, auf der PCR beruhenden Verfahren. Sämtliche dieser Verfahren sind mit zahlreichen arbeitsaufwen­ digen Schritten, wie Gelelektrophorese, Blotting- und Sondier­ arbeitsgängen, verbunden und gestatten nur die halbquantitative Analyse. Darüber hinaus erfordern sämtliche dieser Verfahren besondere Sorgfalt, wenn zwei ähnliche RNA-Spezies, wie Spleiß­ varianten, vorhanden sind. Durch RT-PCR und RPA ist entspre­ chend dem Aufbau des Experiments die Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Spleißvarianten oder deren gemeinsame Quanti­ fizierung möglich. Durch Northern-Blotting kann allgemein nur dann zwischen zwei oder mehreren RNA-Spezies unterschieden wer­ den, wenn sie nach der Größe durch Gelelektrophorese aufge­ trennt werden können. Sämtliche Verfahren fordern die densito­ metrische Analyse nach der Elektrophorese.

Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfah­ rens zur zuverlässigen und hochempfindlichen differentiellen quantitativen Bestimmung alternativ gespleißter mRNAs.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Kits zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur differentiellen quantitativen Bestimmung alternativ gespleißter mRNAs unter An­ wendung der Isoform-spezifischen Echtzeit-RT-PCR nach Anspruch 1 und einen Kit zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung nach Anspruch 9.

Weitere vorteilhafte und bevorzugte Ausführungsformen sind Ge­ genstand der Unteransprüche.

Das Verfahren und der Kit der Erfindung werden zwar konkret un­ ter Bezugnahme auf zwei Isoformen der β-Untereinheit des Human- GM-CSF-Rezeptors (β-GMR; GM-CSF: Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-bestimmender Faktor) beschrieben, was aber nicht als Beschränkung zu verstehen ist.

In der Erfindung werden zwei Isoformen der β-Untereinheit des Human-GM-CSF-Rezeptors analysiert: die Wildtyp-Isoform und. eine Spleißvariante von β-GMR, der ein Exon fehlt, das 104 Nucleo­ tide (nt) in der kodierenden Region der cytoplasmatischen Domä­ ne (8) kodiert. Durch diese Deletion entsteht vorzeitig ein Stopcodon und dadurch ein verkürzter Rezeptor mit 46 intrazel­ lulären Aminosäuren anstelle von 432. Der Mutantenrezeptor ist nur unvollkommen zur Signalübermittlung befähigt, und über un­ terschiedliche Expressionsstärken dieser Rezeptorvariante bei akuter myeloidischer Leukämie (8) ist berichtet worden. Hier wird zum erstenmal gezeigt, daß die Echtzeit-PCR-Technologie zur zuverlässigen quantitativen Bestimmung von zwei mRNA- Spleißvarianten aus der zellulären Gesamt-cDNA angewendet wer­ den kann, und daß diese quantitative Bestimmung selbst dann möglich ist, wenn eine Isoform in hohem Überschuß vorliegt.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1: Eine schematische Darstellung der β-GMR-cDNA-Isoformen mit der Lage der PCR-Primer (P1: Sinn, P2: Antisinn) und der TaqMan-Reporter-Sonden (REP). mut bezeichnet die Mutanten-Iso­ form (A), wt die Wildtyp-Sequenz (B), wobei das leere Kästchen das Exon darstellt, das in der mut-Variante durch Spleissen entfernt ist. Die Zahlen beziehen sich auf die Nucleotide nach Hayashida et al. (10) und Gale et al. (8). C. Agarose-Gel der PCR-Amplifikationsprodukte, die mit der Mutanten(mut)- oder Wildtyp(wt)-β-GMR-Matrize mit den in A und B beschriebenen Pri­ merpaaren erhalten wurden. Die mut-PCR-Primer amplifizieren Se­ quenzen sowohl von der mut(Bahn 1, 83 nt)- als auch der wt- Matrize(Bahn 2, 187 nt). Die wt-PCR-Primer amplifizieren nur Sequenzen von der wt-Matrize (Bahn 3, 68 nt und Bahn 4). M: Molekulargewichtsmarker, 100-bp-Leiter.

Fig. 2: Die Echtzeit-PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der in Fig. 1 charakterisierten TaqMan-Sonde und PCR-Primer durchgeführt. (A) Graphische Darstellung der Amplifikation von 10⁵ Wildtyp-Matrizen-Molekülen (wt-GMR), die mit der wt-TaqMan- Sonde und den PCR-Primern (*, Dreifachwerte) bestimmt werden. 10⁵ Kopien der Mutanten-Matrize und Nicht-Matrizen-Kontrollen ergeben kein Amplifikationssignal (o). Die y-Achse gibt das normalisierte Reportersignal (Rn) und die x-Achse die Zyklusan­ zahl an. (B) 10⁵ Moleküle der Mutanten-Matrize (mut-GMR) werden unter Verwendung der mut-TaqMan-Sonde und PCR-Primer (*, Drei­ fachwerte) nachgewiesen, wohingegen 10⁵ wt-Matrizen-Kopien und Nicht-Matrizen-Kontrollen kein Amplifikationssignal (o) erge­ ben. (C) Spezifischer Nachweis von 1 × 10⁶ bis 5 × 10¹ wt-β-GMR- Molekülen. 1: 1 × 10⁶, 2: 1 × 10⁵, 3: 1 × 10⁴, 4: 5 × 10³, 5: 1 × 10³, 6: 5 × 102, 7: 1 × 10², 8: 5 × 10¹. Der Regressionskoeffizient der ent­ sprechenden Standardkurve beträgt 0,995, wie im unteren Bild dargestellt.

Fig. 3: Nach der Echtzeit-PCR-Amplifikation in einem wie in der Beschreibung und in Tab. 1 beschrieben durchgeführten Versuch zur quantitativen Bestimmung wurden Aliquots der Reak­ tionsgemische auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. Erwar­ tungsgemäß amplifizieren die mut-PCR-Primer aufgrund der Kon­ struktion der PCR-Primer sowohl ein Produkt von der wt-Matrize in signifikanten Mengen ( in den Bahnen 3, 5, 7) als auch das mut-spezifische Amplifikationsprodukt ( in den Bahnen 1-7). Das wt-Primerpaar amplifiziert ausschließlich die wt-Matrize (, Bahn 8 und 9). M: Molekulargewichtsmarker, 100-bp-heiter..

Fig. 4: Quantitative Bestimmung der β-GMR-Isoformen aus zellu­ lärer mRNA. Die cDNA wurde aus U-937-Zellen und BaF3-Zellen, die mit einem chimären Human-α/β-GMR transfiziert waren (11), präpariert. (A) Die herkömmliche RT-PCR wurde mit Primern durchgeführt, die ein 529-nt-Amplifikationsprodukt von wt-β-GMR und ein 425-nt-Fragment von mut-β-GMR amplifizieren. Die U-937- Zellen exprimieren beide Isoformen, wohingegen die BaF3-Zellen, die mit einem chimären Human-α/β-Rezeptor transfiziert sind, ausschließlich die wt-Bande des transfizierten Konstrukts ex­ primieren. M: Molekulargewichtsmarker, 100-bp-Leiter. (B, C). Die entweder mit der wt-TaqMan-Sonde und -PCR-Primern oder der mut-Sonde und -Primern erhaltenen graphischen Darstellungen der Amplifikation sind sowohl für U-937-cDNA (B) als auch cDNA aus transfizierten BaF3-α/β-GMR-Zellen (C) dargestellt. Die y- Achse gibt das normalisierte Reportersignal abzüglich des wäh­ rend den PCR-Zyklen 3-15 bestimmten Untergrundrauschens (ΔRn) und die x-Achse die Zyklusanzahl an T: Schwellenwert von ΔRn, der als positiv anzusehen ist. Die U-937-Zellen exprimieren beide Isoformen, wohingegen in BaF3-α/β-GMR-Zellen von dem transfizierten Konstrukt nur die wt-β-GMR-Sequenz amplifiziert werden kann.

MATERIAh UND METHODEN Reagenzien

Die Restriktionsenzyme, DNA-modifzierenden Enzyme und DNA-Mole­ kulargewichtsmarker wurden von MBI Fermentase (Vilnius, Litau­ en) oder New England Biolabs (Schwalbach, Deutschland) bezogen. Sämtliche PCR-Primer wurden von MWG-BIOTECH (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und vor der Verwendung für die Echt­ zeit-PCR durch HPLC gereinigt. Die fluoreszenzmarkierten Sonden für die Echtzeit-PCR und die TaqMan^TM-Kit-Kernreagenzien wurden von Perkin Elmer/Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) bezogen. Die Magnesiumchloridlösung und sämtliche Feinchemika­ lien wurden von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen und hatten analytische oder molekularbiologische Reinheit. Die Aga­ rose für die Gelelektrophorese stammte von Gibco BRL (Eggen­ stein, Deutschland).

Plasmide

β-GMR-cDNA in voller Länge (wt-β-GMR) wurde wie vor kurzem be­ schrieben (9) in den Vektor pREP4 kloniert. Die Deletions­ mutante, der die bp 1493-1596 fehlten, wurde durch Ausschneiden des BssHII/BglII-Fragments (1319-1705) aus wt-β-GMR und Aus­ tausch gegen das in U-937-Zellen amplifizierte Mutantenfragment kloniert, nämlich wie von Gale et al. (8) ausgeführt. Das Plas­ mid mit und ohne die Deletion wurde in großem Maßstab unter Verwendung des Qiagen-Midi-Kits (Hilden, Deutschland) herge­ stellt. Die Identität der alternativ gespleißten β-GMR-Sequenz wurde durch Restriktionsenzym-Analyse und Sequenzierung der mu­ tierten Region sichergestellt. Die Plasmide wurden durch UV- Spektrometrie bei 260 nm quantitativ bestimmt und zur Verwen­ dung als PCR-Matrizen in Wasser verdünnt. Die Nucleotid-Posi­ tionen des β-GMR-cDNA-Inserts sind nach Hayashida et al. (10) und Gale et al. (8) angegeben.

Zellkulturen und Herstellung zellulärer RNA

Die menschliche histiozytäre Lymphom-Zellinie U-937 wurde von der ATCC erhalten und in RPMI-1640-Medium, das mit einem Anti­ biotikum, L-Glutamin und 10%igem fötalen Kälberserum ergänzt war, bei 37°C und 5% CO₂ angezogen. Die Erzeugung und Kultivie­ rung von BaF3-Zellen, die einen chimären Human-α/β-GMR mit der cytoplasmatischen Domäne von wt-β-GMR exprimieren, ist bereits an anderer Stelle (11) beschrieben worden. Die Gesamt-RNA aus U-937- und BaF3-α/β-GMR-Zellen ergab sich unter Verwendung des TriazolTM-Reagenzes (Gibco BRL) nach den Anleitungen des Her­ stellers. Die mit Isopropanol präzipitierte RNA wurde in RNAse­ freiem Wasser gelöst und durch UV-Spektrometrie bei 260 nm quantitativ bestimmt.

cDNA-Synthese

Die cDNA wurde von 2,5 µg der zellulären Gesamt-RNA in 50 µl eines Reaktionsgemisches transkribiert, das 100 Einheiten der reversen Transkriptase (RT) aus MMLV unter geeigneten Puffer­ bedingungen (Stratagene), 40 Einheiten RNAse-Inhibitor (Rnase- Block, Stratagene), 1 µg Oligo-dT (Pharmacia), 10 mM DTT und Nucleotide in einer Konzentration von jeweils 1 mM (Boehringer Mannheim) enthielt. Aliquots der gleichen cDNA-Präparation wur­ den entweder für die herkömmliche oder für die Echtzeit-PCR verwendet.

Herkömmliche PCR

Ein die Deletionsregion 1493-1596 enthaltendes β-GMR-Fragment wurde unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: 5'- (1281)-GCACCGGCTACAACGGGATCT (Sinn) und 5'-(1810)- CAGGTAGGGCCCATTGAAGTC (Antisinn) (8). Die Amplifikation erfolg­ te mit 10 µl der RT-Reaktion in einem Volumen von 50 µl, in dem 50 pMol jedes Primers, 4 µl 10×PCR-Puffer mit 15 mM MgCl₂ und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Sigma) enthalten waren, durch 40 1-minütige Denaturierungszyklen (95°C) 1-minütiges Annealing (55°C) und 2-minütige Extension (73°C). 10 µl des Reaktionsge­ misches wurden auf ein Ethidiumbromid enthaltendes 2%iges Aga­ rosegel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde das Gel un­ ter Anwendung der Software E.A.S.Y. und E.A.S.Y. Win32 (Hero­ lab, Wiesloch, Deutschland) zur Dokumentation und quantitativen Bestimmung der betreffenden Banden auf einem UV-Durchleuch­ tungsschirm analysiert.

Echtzeit-PCR

Die Echtzeit-PCR wurde mit einem "ABI PRISM^TM 7700 Sequence De­ tector" unter Anwendung der "ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detec­ tion Software 1.6" und der vom Hersteller (Perkin Elmer/Applied Biosystems) zur Verfügung gestellten Informationen durchge­ führt. Die folgenden Reaktionsbedingungen waren optimal: 40 Zy­ klen einer zweiphasigen PCR (Denaturierung: 95°C, 15 s, Annea­ ling und Elongation: 63°C, 60 s) nach anfänglicher Denaturie­ rung (95°C, 10 min) mit 1× TaqMan^TM-PCR-Reaktionspuffer, dATP, dCTP, dGTP: 200 pH, dUTP: 400 pH, MgCl₂: 9 mM, Primer jeweils: 2 pH, Sonde: 100 nM, AmpliTaq-Gold: 0,025 U/µl. Als Matrizen wurden routinemäßig zwischen 100 und 1.000.000 Plasmidkopien oder 2 µl einer cDNA-Synthesereaktion verwendet. Die Primer- Sequenzen wurden unter Anwendung der "PRIMER EXPRESS^TM"- Software, Version 1.0 (Perkin Elmer/Applied Biosystems) wie folgt konstruiert: wt-β-GMR/Sinn, 5'-CAAGAGCCACCTGTTCCAGAA (Tm 59°C), wt-β-GMR/Antisinn, 5'-TAGTGAAGGCCGACATGCTG (Tm 58°C), mut-β-GMR/Sinn, 5'-GAGAAGATCCCCAACCCCA (Tm 58°C), mut-β- GMR/Antisinn, 5'-TGAGAGGTGACACCTCGCTGT (Tm 59°C). Die TaqMan- Sonden wurden mit 6-Carboxy-Fluorescein (FAM) als Reporter- Fluoreszenz-Farbstoff und 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) als Quencher-Fluoreszenz-Farbstoff, wobei sich die Gruppen wie von Livak et al. (12) empfohlen, am 5'- bzw. 3'-Ende befanden, markiert gekauft. Sie hatten die folgenden Sequenzen: wt-β-GMR, 5'-AGCGCAGAGCTTTTGGCCCCC (Tm 69°C), mut-β-GMR, 5'- CACCTGTTCCAGGGTGTTCCCTGTAGGA (Tm 70°C). Die TaqMan-Sonden waren zur Verhinderung der Elongation während der PCR 3'-phos­ phoryliert.

Analyse der Daten

Die quantitative Bestimmung erfolgte jeweils mit Hilfe von Plasmid-Standardkurven mit mindestens 5 Werten, die einen Be­ reich von 4 Größenordnungen oder mehr abdeckten. Bei sämtlichen Versuchen betrugen die Korrelationskoeffizienten der Standard­ kurven mindestens 0,97. Die Standard- als auch die Probenwerte wurden jeweils dreifach bestimmt. Die folgenden Kriterien wur­ den als Qualitätsstandards zur weiteren Analyse angewendet. Zu­ erst wurden einzelne Werte ausgeschlossen, die sich um mehr als das 2,5-fache vom Mittelwert der zwei anderen unterschieden. Zweitens wurden Dreifachwerte mit relativen Standardabweichun­ gen (an 1) von größer als 45% ihres Mittelwertes als ungenau an­ gesehen und nicht weiter analysiert. Aufgrund dieser Kriterien wurden 2 Einzelwerte und ein Dreifachwert bei der Quantifizie­ rung einer Gesamtanzahl von 144 Einzelbestimmungen in drei un­ abhängigen Versuchen, mit denen jede β-GMR-Variante in Gegen­ wart der anderen Isoform spezifisch quantitativ bestimmt werden sollte, ausgeschlossen, nämlich wie im Detail in den auf den folgenden Seiten 20 bis 23 angegebenen Beispielen erläutert.

Konstruktion der Isoform-spezifischen TaqMan-Sonden und PCR- Primer zur Amplifikation von B-GMR-Spleißvarianten

Die TaqMan-Sonden und PCR-Primer zum spezifischen Nachweis je­ der der zwei Spleißvarianten der β-Untereinheit des Human-GM- CSF-Rezeptors (β-GMR) wurden unter Anwendung der "PRIMER EXPRESST^TM"-Software konstruiert. Die TaqMan-Sonde zum Nachweis der β-GMR-Deletionsmutante, der ein 104-nt-Exon fehlte (mut-β- GMR), überdeckte die sich durch alternatives Spleissen ergeben­ de Fusionsregion (Fig. 1A). Die PCR-Primer wurden unter Erhalt eines 83-nt-Amplifikationsproduktes von der mut-β-GMR-Matrize stromaufwärts und stromabwärts der TaqMan-Sonde angeordnet (Fig. 1C, Bahn 1). Diese Primer erlauben auch die Amplifikatton einer Sequenz des Wildtyp-β-GMR (wt-β-GMR), was ein Amplifika­ tionsprodukt ergibt, das 104 nt länger als das Amplifikations­ produkt des mut-β-GMR (Fig. 1C, Bahn 2) ist. Somit ergibt sich der spezifische Nachweis von mut-β-GMR während der Echtzeit-PCR ausschließlich durch die Spezifität der TaqMan-Sonde.

Die zur Amplifikation und zum Nachweis von wt-β-GMR eingesetzte TaqMan-Sonde und PCR-Primer würden maximale Spezifität garan­ tieren, wenn sie vollständig in dem in mut-β-GMR fehlenden Exon angeordnet würden. Die Sequenz des 104-nt-Exons beungünstigt jedoch stark derartige TaqMan-Sonde/PCR-Primer-Kombinationen, was mit der "PRIMER EXPRESS^TM"-Software festgestellt wurde. Da­ her wurden die TaqMan-Sonde und der Antisinn-Primer in dem in mut-β-GMR fehlenden Exon angeordnet, wohingegen der Sinn-Primer stromaufwärts von der Spleißstelle angeordnet wurde (Fig. 1B). Dieses Paar von PCR-Primern gestattet spezifisch die Amplifika­ tion eines 68-nt-Amplifikationsproduktes von wt-β-GMR ohne Am­ plifikation von Sequenzen von mut-β-GMR (Fig. 1C, Bahnen 3 und 4).

Differentieller Nachweis und quantitative Bestimmung von wt- und mut-β-GMR-Plasmiden unter Verwendung von Isoform-spezifi­ schen TaqMan-Sonden

Zur Einstellung von optimalen Bedingungen zur spezifischen Am­ plifikation und zum spezifischen Nachweis von wt-β-GMR und mut­ β-GMR wurden Plasmide verwendet, welche die entsprechende β- GMR-cDNA kodierten, und ansteigende Konzentrationen an Mg²⁺, unterschiedliche Annealing-Temperaturen und verschiedene Kon­ zentrationen an Primern und TaqMan-Sonden (Daten nicht gezeigt) untersucht. Unter Anwendung der in Material und Methoden be­ schriebenen Reaktionsbedingungen ist es möglich, entweder die wt- oder mut-β-GMR-Sequenz mit dem geeigneten TaqMan-Sonde/Pri­ mer-Satz spezifisch nachzuweisen, und zwar ohne daß es bei der höchsten untersuchten Konzentration (10⁵ Matrizenmoleküle) zu einem Kreuznachweis kommt (Fig. 2A und B). Die Standardkurven, in denen der Schwellenwertzyklus (C_T) gegen die anfängliche Ma­ trizen-Anzahl eines einzelnen Plasmides (10² bis 10⁶ Moleküle) graphisch dargestellt ist, haben routinemäßig Korrelations­ koeffizienten von 0,97 bis zu 0,99, wobei die Nachweisgrenze jeder β-GMR-Sequenz weniger als 50 Moleküle beträgt, nämlich wie in Fig. 2C für wt-β-GMR dargestellt. Die Daten für mut-β- GMR sind nicht dargestellt.

Spezifischer Nachweis und quantitative Bestimmung von wt- und mut-β-GMR-Plasmiden in Gegenwart der alternativen Isoform

Zur Untersuchung des spezifischen Nachweises und der quantita­ tiven Bestimmung von entweder wt- oder mut-β-GMR in Gegenwart der anderen Isoform wurden die entsprechenden Plasmide ver­ mischt und unter Verwendung des spezifischen TaqMan-Sonde/PCR- Primer-Satzes für jede Isoform amplifiziert. In Gegenwart oder Abwesenheit eines 20-fachen oder 100-fachen Überschusses der anderen Isoform wurden 500, 1000, 2000 und 5000 Moleküle wt- oder mut-β-GMR amplifiziert und durch Vergleich mit Standard­ kurven quantitativ bestimmt. Tabelle 1 zeigt die Daten eines von drei repräsentativen Versuchen. In diesem Versuch unter­ schied sich die berechnete Anzahl an wt- und mut-β-GMR- Molekülen, die durch Echtzeit-PCR quantifiziert worden waren, von der pipettierten eingesetzten Anzahl im Mittel um 10,8% (wt-β-GMR) bzw. 13,2% (mut-β-GMR). In sämtlichen drei Versuchen war der spezifische Nachweis von mut-β-GMR im Vergleich zu wt­ β-GMR weniger genau, und zwar insbesondere in Gegenwart eines 100-fachen Überschusses an wt-β-GMR (Tabelle 1 und nicht ge­ zeigte Daten).

Die während der Echtzeit-PCR erzeugten Amplifikationsprodukte wurden auch durch Gelelektrophorese nach der Amplifikation ana­ lysiert. Wie bereits oben beschrieben (Fig. 1C) kann das Mutan­ ten-PCR-Primerpaar neben dem von der mut-β-GMR-Matrize erzeug­ ten 83-nt-Amplifikationsprodukt (Fig. 3, Bahnen 1-7) auch eine Sequenz von wt-β-GMR (Fig. 3, Bahnen 3, 5 und 7) amplifizieren. Erwartungsgemäß erzeugt der TaqMan-Sonde/PCR-Primer-Satz für wt-β-GMR das 68-nt-Amplifikationsprodukt von der wt-β-GMR- Sequenz, amplifiziert aber nicht mut-β-GMR (Fig. 3, Bahnen 8 und 9). Darüber hinaus ergibt der Vergleich der von mut-β-GMR erzeugten Amplifikationsprodukte in den Bahnen 6 und 7, daß die Anzahn an mut-β-GMR-Molekülen durch kinetische Echtzeit-Fluo­ reszenz-Bestimmung (Echtzeit-PCR), zumindest unter den unter­ suchten Bedingungen, genauer quantifiziert werden kann als durch Densitometrie der nach der Amplifikation nach der Größe aufgetrennten Produkte (was der herkömmlichen Endpunkt-PCR ent­ spricht) (Tabelle 1, Fig. 3). In zwei weiteren Versuchen ergab die Gelelektrophorese bei der quantitativen Bestimmung von so­ wohl wt-β-GMR als auch mut-β-GMR heterogenere und ungenauere Ergebnisse als die Echtzeit-PCR (Datennicht gezeigt).

Quantitative Bestimmung von in vivo exprimierten β-GMR-mRNA- Isoformen

Es wurde mRNA von U-937-Zellen, die sowohl wt-β-GMR- als äuch mut-β-GMR-mRNA exprimieren (8), und von Maus-BaF3-Zellen, die einen chimären Human-a/b-GMR mit der cytoplasmatischen Domän e von wt-β-GMR exprimieren (11), verwendet, um die Mengen an bei­ den mRNA-Varianten entweder mit Hilfe eines herkömmlichen RT- PCR-Ansatzes als Standardverfahren oder durch Echtzeit-RT-PCR zu vergleichen (Fig. 4A und B). Unter Anwendung der herkömmli­ chen RT-PCR mit einem identischen PCR-Primerpaar zur Amplifika­ tion von sowohl wt-β-GMR als auch mut-β-GMR waren zwei PCR- Produkte mit 529 nt (wt) bzw. 425 nt (mut) bei den U-937-Zellen nachweisbar, wohingegen bei den BaF3-α/β-GMR-Zellen nur das 529-nt-Fragment von dem transfizierten Gen amplifiziert werden konnte (Fig. 4A). Die U-937-Zellen exprimieren beide β-GMR- Isoformen im Verhältnis mut : wt = 131/1131 willkürlichen Einhei­ ten, was sich quantitativ aus der Intensität der mit Ethidium­ bromid gefärbten Banden ergibt (= 10,3% mut : insgesamt). Ali­ quots der gleichen cDNA-Präparationen wurden durch Isoform­ spezifische Echtzeit-PCR analysiert und durch Vergleich mit Standardkurven, die mit den entsprechenden Plasmiden erzeugt wurden, quantifiziert. Bei einem Versuch mit U-937-cDNA ent­ sprach der Schwellenwertzyklus C_T von 27,93 + 0,04 für wt-β-GMR 32624 Molekülen und der Schwellenwertzyklus C_T von 30,49 ± 0,14 für mut-β-GMR 4433 Molekülen (Fig. 4B). Das Verhältnis mut- zu Gesamt-β-GMR beträgt 12,0%. In zwei anderen unabhängigen Versu­ chen wurden die Verhältnisse zu 9,2% und 9, 9% bestimmt (Mittel­ wert von drei unabhängigen Versuchen: 10,4% mut). Die transfi­ zierten BaF3-α/β-GMR-Zellen exprimierten wiederum nur die wt­ β-GMR-Isoform (Fig. 4C). Die Kontrollen ohne RT wurden negativ getestet.

Dies ist die erste Offenbarung eines Verfahrens unter Anwendung der Isoform-spezifischen Echtzeit-PCR-Technologie zur quantita­ tiven Bestimmung von alternativen Spleißprodukten der zellulä­ ren Gesamt-mRNA. Durch Untersuchung von zwei β-GMR-mRNA-Varian­ ten wurde gezeigt, daß Plasmide, welche die entsprechenden cDNAs enthalten, durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von sorg­ fältig konstruierten PCR-Primerpaaren und TaqMan-Sonden spezi­ fisch nachweisbar sind. Die quantitative Bestimmung ist selbst bis zu einem 100-fachen Überschuß an der alternativen Isoform zuverlässig. Des weiteren wurde unter Anwendung der Echtzeit- RT-PCR in U-937-Zellen ein Verhältnis Wildtyp- zu Mutanten-β- GMR-mRNA von 9 : 1 festgestellt. Dieses Verhältnis wurde auch durch herkömmliche Standard-RT-PCR und densitometrische Analyse der nach der Größe aufgetrennten und mit Ethidiumbromid gefärb­ ten Amplifikationsprodukte bestimmt und entsprach den von Gale et al. (8) angegebenen Daten. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß durch kinetische Echtzeit-Bestimmung des während der experimen­ tellen Phase der PCR erzeugten Fluoreszenzsignals die einge­ setzte Matrizenanzahl zumindest unter den untersuchten Bedin­ gungen genauer bestimmt werden kann als durch herkömmliche den­ sitometrische Endpunkt-Analyse nach der Amplifikation und Gele- lektrophorese.

Die Echtzeit-PCR unterliegt hinsichtlich des Längenunterschie­ des der Spleißvarianten keinen grundsätzlichen Beschränkungen. Zum Nachweis der längeren Varianten erscheint es vorteilhaft, die TaqMan-Sonde und/oder zumindest einen PCR-Primer in der Se­ quenz anzuordnen, die in der kürzeren Variante durch Spleissen entfernt ist. Im Gegensatz dazu ist der spezifische Nachweis der kürzeren Variante möglich, indem entweder die TaqMan-Sonde (wie hier gezeigt) oder ein PCR-Primer die für die spezifische Spleißvariante einmalige Sequenz umfaßt, solange solche Reakti­ onsbedingungen gefunden werden können, unter denen eine Sonde mit der anderen Matrize kein Signal ergibt. Wenn das gespleißte Exon sehr kurz ist, kann das gleiche Paar PCR-Primer für beide Amplifikationsprodukte verwendet werden, und die Reaktionsgemi­ sche unterscheiden sich lediglich in der Identität der TaqMan- Sonden. Da unterschiedliche Längen der Amplifikationsprodukte den Wirkungsgrad der PCR-Reaktion beeinflussen können (13), wurden zwei unabhängige Primerpaare verwendet, die ein 68-nt- bzw. 83-nt-Amplifikationsprodukt ergeben. Unter allen Bedingun­ gen ist es unerläßlich, daß sorgfältig geeignete Reaktions­ bedingungen eingestellt werden, indem die Konzentration an Mg²⁺ titriert, die Annealing-Temperatur variiert und die Konzentra­ tion der PCR-Primer und TaqMan-Sonden angepaßt wird, um eine genaue und spezifische quantitative Bestimmung zu garantieren. Aufgrund der obigen Beschreibung ist klar, daß die quantitative Bestimmung der kürzeren Variante trotz des Umstandes, daß deren Primerpaar auch die längere Isoform mit hohem Wirkungsgrad am­ plifizieren kann, durchführbar ist. Daher sind höhere Mengen an PCR-Primern (und eine angepaßte Konzentration an Mg²⁺) als im Vergleich zu Standardempfehlungen zur zuverlässigen quantitati­ ven Bestimmung unerläßlich. Tatsächlich ergibt die quantitative Bestimmung von mut-β-GMR in Gegenwart eines 100-fachen Über­ schusses an wt-β-GMR mit niedriger Primer-Konzentration (d. h. 200 nM) falsch-niedrige Bestimmungen für mut-β-GMR (Daten nicht gezeigt). Ferner kann es unerläßlich sein, daß auch die mar­ kierten Oligomer-Sonden für die kürzere DNA-Variante in einem 10-fachen Überschuß im Vergleich zu Standardempfehlungen ver­ wendet werden, wenn ein Satz von zwei fluoreszenzmarkierten Oligomer-Sonden verwendet wird, die benachbarte interne Sequen­ zen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen (wie z. B. beim "Lightcycler"(Handelsname von Boehringer Mannheim)-System).

Da in verschiedenen Proben nur das Verhältnis der zwei β-GMR- Isoformen wichtig ist und nicht die absolute Anzahl, ist für die quantitative Bestimmung keine weitere Normalisierung durch Vergleich mit einer konstitutiv exprimierten mRNA erforderlich.

Beide Isoformen können in bezug auf Standardkurven, die durch Plasmid-Verdünnungen erstellt wurden, in dem gleichen Versuch quantitativ bestimmt werden. In drei unabhängigen Versuchen mit unterschiedlichen Verhältnissen der zwei β-GMR-Varianten betrug der mittlere Unterschied zwischen der pipettierten eingesetzten Anzahl und der mit Echtzeit-PCR quantitativ bestimmten für wt­ β-GMR 8,5% bzw. für mut-β-GMR 18,9%. Der höhere Fehler bei der quantitativen Bestimmung von mut-β-GMR, insbesondere in Gegen­ wart eines großen Überschusses an wt-β-GMR, beruht höchst­ wahrscheinlich auf dem unvermeidlichen Primer-Verbrauch durch die exponentielle Amplifikation der wt-β-GMR-Sequenzen durch das mut-Primerpaar. Somit erweist sich unser Echtzeit-PCR- System, im Rahmen der oben angegebene Genauigkeit, als wertvol­ les Werkzeug zur Bestimmung des Verhältnisses zweier β-GMR- Isoformen, und zwar selbst dann, wenn eine im Verhältnis zur anderen in großem Überschuß vorliegt.

Im Vergleich zu anderen derzeit angewendeten Techniken zur quantitativen Bestimmung des alternativen Spleissens, z. B. mit Northern-Blotting, RNAse-Protection- und herkömmlichen RT-PCR- Assays, ist die Echtzeit-RT-PCR sehr schnell und eignet sich zur gleichzeitigen Verarbeitung einer großen Probenanzahl. Dar­ über hinaus ist die zeitaufwendige Verarbeitung nach der PCR nicht länger erforderlich. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Echtzeit-PCR ist die Empfindlichkeit des spezifischen Nachwei­ ses in Gegenwart eines großen Überschusses einer sehr ähnlichen Matrize. Einige Amplifikationsprodukte, die durch Echtzeit-PCR während der exponentiellen Phase der PCR genau quantitativ be­ stimmt werden können, können in mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegelen nicht sichtbar gemacht werden, Southern-Blotting und Sondierung zur Sichtbarmachung erforderlich machen und nach der Amplifikation immer noch nicht genau quantitativ bestimmt werden. Schließlich ist durch zwei(oder mehr)farbigen Nachweis die Multiplex-Echtzeit-PCR und die gleichzeitige Verfolgung der Amplifikation von zwei (oder mehreren) Matrizen unter Verwen­ dung von spektral unterschiedlich auflösbaren TaqMan-Sonden in der gleichen Probe möglich.

Folglich ist die Echtzeit-RT-PCR ein wertvolles Werkzeug zur spezifischen quantitativen Bestimmung von Spleißvarianten von zellulärer Gesamt-mRNA auf genaue und schnelle Weise ohne Ver­ arbeitung nach der PCR, und zwar selbst dann, wenn sich die Va­ rianten nur gering in der Länge unterscheiden und eine im Ver­ hältnis zu anderen in großem Überschuß vorliegt.

Zusammengefaßt wurde zur quantitativen Bestimmung alternativ gespleißter mRNAs die Echtzeit-PCR-Technologie zur quantitati­ ven Bestimmung der Wildtyp-Isoform der β-Untereinheit des Hu­ man-GM-CSF-Rezeptors (wt-β-GMR) und einer alternativ gespleiß­ ten Form, der ein 104-Nucleotid-Exon fehlt (mut-β-GMR), ange­ wendet. Zur Unterscheidung zwischen wt-β-GMR und mut-β-GMR wur­ den Isoform-spezifische fluoreszierende TaqMan-Sonden und Paare von PCR-Primern konstruiert. Unter Verwendung von wt-β-GMR bzw.. mut-β-GMR enthaltenden Plasmiden ist es möglich, spezifisch we­ niger als 50 Moleküle der entsprechenden Matrize nachzuweisen. Die durch Plasmid-Verdünnungen erhaltenen Standardkurven haben routinemäßig Eorrelationskoeffizienten von 0,97 bis 0,99. Das zum Nachweis von wt-β-GMR konstruierte TaqMan-Sonde/PCR- Primerpaar ergibt bei bis zu 105 Molekülen mut-β-GMR keinen Nachweis und umgekehrt. Darüber hinaus ist die spezifische quantitative Bestimmung selbst bei einem 100-fachen Überschuß der alternativen β-GMR-Isoform möglich. Die Analyse der mRNA- Expression in zwei Zellinien durch sowohl herkömmliche RT-PCR mit sich anschließender densitometrischer Analyse der amplifi­ zierten Produkte als auch durch Echtzeit-PCR bestätigt den spe­ zifischen Nachweis und validiert die quantitative Bestimmung durch Echtzeit-RT-PCR. Die Daten zeigen, daß die Echtzeit-RT- PCR unter Verwendung von Isoform-spezifischen TaqMan-Sonden zur raschen und genauen quantitativen Analyse alternativ gespleiß­ ter mRNAs ohne Gelelektrophorese und mit großer Empfindlichkeit in einem breiten Konzentrationsbereich anwendbar ist.

Tabelle 1

Quantitative Bestimmung von wt-β-GMR (w) und mut-β- GMR (m) in Gegenwart der anderen Isoform

Die eingesetzte Anzahl an Plasmidkopien wurde alleine bestimmt (100%) oder in Gegenwart eines 20-fachen (5%) bzw. 100-fachen (1%) Überschusses an der alternativen Variante. Der mittlere Schwellenwertzyklus (CT) ist zusammen mit der mittleren Matri­ zenanzahl ±0 Standardabweichung (σn-1), die aus den entsprechen­ den Standardkurven berechnet wurden (r_wt = 0,98, r_mut = 0,98, Daten nicht gezeigt), angegeben. Der Unterschied zwischen der berechneten und der pipettierten Matrizenanzahl in % ist in Form der normalisierten Abweichung von der eingesetzten Anzahl angegeben. §: Werte, die voreingestellt und zur Berechnung der Standardkurve verwendet wurden. §§: Wert, der entsprechend den in "Material und Methoden" angegebenen Kriterien weggelassen wurde.

Detaillierte Beispiele

Zur Demonstration der Qualität des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Daten von drei unabhängigen Versuchen (16, 17, 18) in den folgenden Tabellen aufgeführt, die angeben:

• - Die eingesetzte Anzahl ("vorg.") an Mutanten(m)- oder Wild­ typ(w)-β-GMR-Plasmid
• - Das Verhältnis der Matrize in bezug auf die alternative Isoform ("Anteil%")
• - Die Einzelwerte ("Wert 1, Wert 2, Wert 3"), die durch Ver­ gleich mit den Standardkurven berechnet wurden
• - Die Qualitätsparameter (A1, A2, A3) für jeden der Einzel­ werte [A1 = W1/((W2+W3)/2) usw.]. Wenn A1, A2 oder A3 < 2,5 oder < 0,4 war, wurde der entsprechende Einzelwert bei der Berechnung nicht berücksichtigt
• - Der Mittelwert der Einzelwerte ("MiWe")
• - Die Stanardabweichung (absolut: "Sigma" und relativ: "Sig­ ma%", Sigma% = Varianz)
• - Die normalisierte Abweichung von der eingesetzten Anzahl, berechnet in Form des Unterschiedes zwischen der bestimmten und der pipettierten Matrizenanzahl in % ("AbwStd(%)").

Die Vorsilben bedeutedn: w = Wildtyp (oberes Feld), m = Mutante (unteres Feld), wm = Wildtyp und Mutante, zusammengenommen; N: Anzahl der untersuchten Dreifachwerte, "Anz"; "Anzahl".

Zusammenfassung der Daten auf den folgenden Seiten

Die Mittelwerte der normalisierten Abweichung von den einge­ setzten Anzahlen /"Abw(MiWe)"), die für jede Tabelle berechnet wurden, sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt und stellen den mittleren Fehler bei der quantitativen Bestimmung von wt- oder mit-β-GMR in den drei Versuchen dar.

Literatur

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3. Heid, C.A., J. Stevens, K.J. Livak, and P.M. Williams. 1996. Real time quantitative PCR. Gercome Res. 6: 986-994.
4. Lie, Y.S. and C.J. Petropoulos. 1998. Advances in quantitative PCR technology: 5' nucle-. ase assays. Curr. Opin. Biotechnology 9: 43-48.
5. Lay, M.J. and C.T. Wittwer. 1997. Real time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR. Clin. Chem. 43: 2262-2267.
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8. Gale, R.E., R.W. Freeburn, A. Khwaja, R. Chopra, and D.C. Linch. 1998. A truncated Isoform of the Human β Chain Common to the Receptors for Granulocyte-Macrophage Col­ ony-Sfimulating Factor, Interleukin-3 (IL-3), and IL-5 With Increased mRNA Expression in Some Patients With Acute Lcukemia. Blood 91: 54-63.
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10. Hayashida, K., T. Kitamura, D.M. Gorman, K.-I. Arai, T. Yokota, and A. Miyajima. 1990. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macro­ phage colonystimulating factor (GM-CSF): Reconstitution of a high-affinity GM-CSF re­ ceptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9655-9659.
11. Eder, M., T.J. Ernst, A. Ganser, P.T. Jubinsky, R. Inhorn, D. Hoelzer, and J. D. Griffin. 1994. A low affinity chimeric human α/β-Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Fac­ tor receptor induces ligand-dependent proliferation in a murine cell line. J. Biol. Chem. 269: 30173-30180.
12. Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, and K. Deetz. 1995 Oligonucleotides. with Fluorescent Dyes at Opposite Ends Provide a Quenched Probe System UsefuI for Detec­ tion PCR Product and Nucleic Acid Hybridization. PCR Metlrods and Applications 4: 357-362.
13. McCulloch, R.K., C.S. Choong, and D.M. Hurley. 1995. An Evaluation of Competitor Type and Size for Use in the Detennination of mRNA by Competitive PCR. PCR Methods and Applications 4: 219-226.

Claims (13)

1. Verfahren zur differentiellen quantitativen Bestimmung al­ ternativ gespleißter mRNAs unter Anwendung der Isoform­ spezifischen Echtzeit-RT-PCR, bei dem

• a) die zelluläre Gesamt-RNA unter Verwendung einer rever­ sen Transkriptase (RT) in einem geeigneten Reaktions­ system in die entsprechende cDNA transkribiert wird,
• b) mehrere Zyklen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Denaturierungs-, Annealing- und Elongations­ schritte mit einer thermostabilen Polymerase umfaßt, in einem PCR-Reaktionssystem durchgeführt werden, das geeignete Konzentrationen an jedem Nucleotid, Mg²⁺, einem Paar Sinn/Antisinn-Oligonucleotrid-Primern, das sich zur spezifischen Amplifikation einer Target-DNA eignet, und einer mit einem Reporter- und Quencher- Fluoreszenz-Farbstoff doppelt markierten Oligonucleo­ tid-Sonde oder einem Paar Oligonucleotid-Sonden, die einzeln mit einem Reporter-Fluoreszenz-Farbstoff bzw. einem Quencher-Fluoreszenz-Farbstoff markiert sind und benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target- DNA-Sequenz erkennen, enthält,
• c) das durch Anregung von dem Reporter-Farbstoff nach der Hydrolyse der doppelt markierten Sonde(n) oder der einzeln markierten Oligonucleotid-Sonde(n), falls die­ se nahe zueinander assoziieren, emittierte Fluores­ zenzsignal nachgewiesen wird und
• d) der Schwellenwertzyklus bestimmt und die anfängliche Kopienanzahl der der Target-DNA entsprechenden RNA be­ rechnet wird,

dadurch gekennzeichnet, daß

• a) ein Paar doppelt markierter Oligonucleotid-Sonden oder ein Satz aus zwei Paaren einzeln markierter Oligo­ nucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, verwendet wird,
  wobei eine doppelt markierte Oligonucleotid-Sonde oder ein Paar einzeln markierter Oligonucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target- DNA-Sequenz erkennen, speziell so angepaßt ist, daß die Hybridisierung im wesentlichen über der Fusions­ stelle einer durch Spleissen einer Teilsequenz erhal­ tenen kürzeren DNA-Variante zentriert erfolgt,
  und die andere doppelt markierte Oligonucleotid-Sonde oder das andere Paar von separat markierten Oligo­ nucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, speziell so angepaßt ist, daß die Hybridisierung im wesentli­ chen mit der Teilsequenz einer längeren DNA-Variante, die in der kürzeren DNA-Variante fehlt, erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die alternativ gespleiß­ ten mRNAs zwei Lsoformen der β-Untereinheit des Rezeptors für den menschlichen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-sti­ mulierenden Faktor (GM-CSF)(β-GMR) sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zwei Isoformen der Wildtyp(wt)-β-GMR und ein Mutanten(mut)-β-GMR, dem die Ba­ senpaare 1493 bis 1596 fehlen, sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei zur PCR-Amplifikation des wt-β-GMR als Primer 5'-CAAGAGCCACCTGTTCCAGAA (Sinn) und 5'-TAGTGAAGGCCGACATGCTG (Antisinn), und des mut-β-GMR
5'-GAGAAGATCCCCAACCCCA (Sinn) und
5'-TGAGAGGTGACACCTCGCTGT (Antisinn)
und als Paar doppelt markierter Sonden für den wt-β-GMR
5'-AGCGCAGAGCTTTGGCCCCC
und für den mut-β-GMR
5'-CACCTGTTCCAGGGTGTTCCCTGTAGGA
verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die doppelt markierten Olignucleotid-Sonden mit 6-Carboxy- Fluoreszein (FAM) als Reporter-Fluoreszenz-Farbstoff und mit 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) als Quencher- Fluoreszenz-Farbstoff markiert sind.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die doppelt markierten Olignucleotid-Sonden 3'-phosphory­ liert sind.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das PCR-Reaktionssystem Mg²⁺ in einer Konzentration von 9 rttl enthält und die PCR-Oligonucleotid-Primer in einer Kon­ zentration von 2 µM verwendet werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei der Polymerase-Kettenreaktion der Annealing-Schritt bei 63°C durchgeführt wird.

9. Kit zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprü­ che 1 bis 8, der enthält:

• a) eine reverse Transkriptase (RT) in einem zur cDNA- Synthese geeigneten Reaktionssystem,
• b) eine thermostabile Polymerase in einem PCR-Reaktions­ system, das geeignete Konzentrationen an jedem Nucle­ otid, Mg²⁺, einem Paar Sinn/Antisinn-Oligonucleotid- Primer, die sich zur spezifischen Amplifikation von Target-DNA eignen, und einem Paar fluoreszierend dop­ pelt markierter Oligonucleotid-Sonden oder einem Satz von zwei Paaren einzeln fluoreszierend markierter Oligonucleotid-Sonden, die benachbarte interne Se­ quenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, enthält,
  wobei eine doppelt markierte Oligonucleotid-Sonde oder ein Paar einzeln markierter Oligonucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target- DNA-Sequenz erkennen, speziell so angepaßt ist, daß die Hybridisierung im wesentlichen über der Fusions­ stelle einer durch Spleissen einer Teilsequenz erhal­ tenen kürzeren DNA-Variante zentriert erfolgt,
  und die andere doppelt markierte Oligonucleotid-Sonde oder das andere Paar von einzeln markierten Oligo­ nucleotid-Sonden, die benachbarte interne Sequenzen innerhalb einer Target-DNA-Sequenz erkennen, speziell so angepaßt ist, daß die Hybridisierung im wesentli­ chen mit der Teilsequenz einer längeren DNA-Variante., die in der kürzeren DNA-Variante fehlt, erfolgt.

10. Kit nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Paar aus Sinn/Antisinn-Oligonucleotid-Primern um
5'-CAAGAGCCACCTGTTCCAGAA (Sinn) und
5'-TAGTGAAGGCCGACATGCTG (Antisinn) und
5'-GAGAAGATCCCCAACCCCA (Sinn) und
5'-TGAGAGGTGACACCTCGCTGT (Antisinn) und bei dem Paar aus doppelt markierten Oligonucleotid-Sonden um
5'-AGCGCAGACCTTTGGCCCCC und
5'-CACCTGTTCCAGGGTGTTCCCTGTAGGA handelt.

11. Kit nach Anspruch 9 oder 10, wobei die doppelt markierten Oligonucleotid-Sonden mit 6-Carboxy-Fluoreszein (FAM) als Reporter-Fluoreszenz-Farbstoff und 6-Carboxytetramethyl­ rhodamin (TAMRA) als Quencher-Fluoreszenz-Farbstoff mar­ kiert sind.

12. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die doppelt markierten Oligonucleotid-Sonden 3'-phosphoryliert sind.

13. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das PCR-Reaktionssystem Mg²⁺ in Konzentrationen von 9 mM und die PCR-Oligonucleotid-Primer in einer Konzentration von 2 µM enthält.