CN111088375A - 基于rpa技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于RPA技术的检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的试剂盒及方法，该试剂盒及方法特异性好、灵敏度高、检测时间短和不需要特殊的仪器即可针对胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌进行检测，检测低限为12.22copies/μL，对Lso早期诊断和基层单位初筛实验室的快速检测存在一定的优越性，同时对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。

Description

基于RPA技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法 及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及基于RPA技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒。

背景技术

马铃薯斑纹片病菌(Candidatus Liberibacter solanacearum，简称Lso)，自1994年在墨西哥首次报道以来，目前该病菌已在全世界范围内蔓延，已在北美洲、中美洲、欧洲、大洋洲、非洲和亚洲等十几个国家发生。Lso以马铃薯木虱(Bactericera cockerelli)、胡萝卜木虱(Trioia apicalis)、Bactericera trigonica和茄子木虱(Acinia solanicola)为媒介进行田间扩散传播，通过种薯、嫁接苗和带菌种子进行远距离传播。Lso天然寄主不仅是马铃薯，而且侵染其他茄科作物如番茄、辣椒等，以及胡萝卜、芹菜等伞形科作物，引起寄主矮化，叶片褪绿发紫，节间缩短变粗膨大，果实畸形，发育停滞或不结果，导致作物严重减产，构成巨大经济损失。

2004年，欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)将马铃薯斑纹片病菌及其媒介昆虫马铃薯木虱列为A1类检疫性有害生物。Lso同柑橘黄龙病一样，可防可控不可治，有效的控制方法很大程度上依赖于早发现早处理。2017年8月以来，我国口岸多次从进境种子中截获该病菌。

Ravindran等开发了基于Lso的16S-23S rRNA基因的普通PCR检测方法，根据其反应条件，PCR检测时间长达2h左右。Liefting等基于Lso的16S rRNA基因开发了巢式PCR检测方法。该方法需要两轮PCR扩增，耗时长，操作繁琐，容易发生污染。Wenbin等采用多重荧光PCR建立Lso的检测方法，该方法检测时长约1.5h,且需要较为昂贵的仪器—实时荧光定量PCR仪。Ravindran等于建立了LAMP技术用于检测Lso，基于16S rRNA序列的6个独立区域设计了LAMP引物，可直接通过在扩增过程中形成不溶性的焦磷酸镁沉淀进行结果判断。该方法检测时长60min，且设计6条具有高特异性的引物难度较大。

综上，加强Lso早期诊断，探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA技术的检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短和不需要特殊的仪器的针对胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的RPA检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种用于检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的试剂盒，包括由SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列组成的引物对；包括来自天根生物科技有限公司货号为DP350的高效植物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂；包括来自TwistDX公司的货号为TABAS03KIT的TwistAmp Basic试剂盒所包含的试剂。

本发明第二方面提供了一种检测或辅助检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法，包括使用权利要求1试剂盒的步骤。

优选的，包括如下步骤：

1)DNA提取

采用来自天根生物科技有限公司货号为DP350的高效植物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂从待测胡萝卜种子中提取DNA；

2)RPA扩增

以提取的DNA模板采用来自TwistDX公司的货号为TABAS03KIT的TwistAmp Basic试剂盒所包含的试剂进行RPA扩增；

3)根据RPA扩增的结果判断胡萝卜种子是否感染马铃薯斑纹片病菌。

所述RPA扩增的反应体系如下：

含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管

再水化缓冲液 29.5μL

SEQ ID NO：11所示的引物和SEQ ID NO：12所示的引物浓度均为10μM/μL，各2.4μL

DNA 50ng

醋酸镁溶液 2.5μL，浓度为280mmol/L

去离子水 补足至50μL

所述RPA扩增的反应条件如下：所述RPA扩增的温度为40℃，时间为40min。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明首次建立了针对马铃薯斑纹片病菌RPA检测方法，可对胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌进行定性检测。

(2)本发明针对胡萝卜种子中马铃薯斑纹片病菌仅用一对引物即可完成扩增，省去了LAMP等其它恒温扩增方法需要的多对引物的复杂设计过程；本发明的引物扩增只需要40℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需40min，检测时间短；不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带，其结果易于判断。

(3)本发明建立的胡萝卜种子中马铃薯斑纹片病菌RPA检测方法，灵敏、准确、简便和快速，检测低限为12.22copies/μL，对Lso早期诊断和基层单位初筛实验室的快速检测存在一定的优越性，同时对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。

附图说明

图1是采用nrdB 1引物、nrdB 2引物、nrdB 3引物、nrdB 4引物、nrdB 5引物和nrdB6引物进行RPA有效性验证的扩增电泳图，其中M：分子标记DL 2000；1：nrdB 1引物扩增结果；2：nrdB 2引物扩增结果；3：nrdB 3引物扩增结果；4：nrdB 4引物扩增结果；5：nrdB 5引物扩增结果；6：nrdB 6引物扩增结果；7：阳性对照；8：空白对照。

图2是采用nrdB 1引物、nrdB 2引物、nrdB 3引物和nrdB 6引物进行RPA特异性验证的扩增电泳图。其中图2a：nrdB 1引物特异性验证结果，图2b：nrdB 2引物特异性验证结果，图2c：nrdB 3引物特异性验证结果，图2d：nrdB 6引物特异性验证结果，图2a、2b、2c、2d中，M：分子标记DL 2000，1：Lso DNA，2：柑橘黄龙病菌DNA，3：恶臭假单孢DNA，4：阴沟肠杆菌DNA，5：成团泛菌DNA。

图3是采用nrdB 6引物进行RPA灵敏度验证的扩增电泳图，其中图3a:RPA灵敏度检测；图3b:普通PCR灵敏度检测；图3a、3b中，M：分子标记DL 2000，1～10：拷贝数为1.22×10⁹coyies/μL～1.22coyies/μL，11：空白对照。

图4是采用nrdB 6引物进行RPA应用效果验证的扩增电泳图，其中M：分子标记DL2000；1～20：种子样品DNA；21：阳性质粒对照；22：空白对照。

具体实施方式：

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，本发明所用的冷冻离心机购于德国Sima公司，金属浴购于中国TIANGEN公司，电泳仪购于美国BIO-RAD，凝胶成像系统购于法国VILBER，Multiskan GO全波长读数仪购于美国Thermo公司。

需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种检测或辅助检测马铃薯斑纹片病菌的方法，例如检测或辅助检测待测植物样品是否感染马铃薯斑纹片病菌，或检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为马铃薯斑纹片病菌。本实施例提供了对部分设计的RPA引物(举例)进行筛选的过程，从而对RPA引物和方法均进行了有效性验证。

上述方法包括如下步骤：

1、DNA的提取

采用文献方法(田沂民，魏霜，钱俊婷，等.意大利进境芫荽种子中马铃薯斑纹片病菌的检测.植物检疫，2019,33(1)：24-30.)对胡萝卜种子(即Lso阳性胡萝卜种子，由广州海关技术中心保存)前处理，种子处理液10000r/min离心15min，再用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒根据其说明书方法提取DNA，-20℃保存备用。

2、引物设计

参照马铃薯斑纹片病菌的Ribonucleotide reductase(RNR)β-subunit基因(下简称nrdB基因)序列(GenBank ID:CP002371.1)，设计引物6对(实际设计数量不限于此，此数量仅为举例)，具体引物序列见表1。

表1

3、RPA扩增

以提取的DNA为模板，分别采用上述六对引物nrdB 1、nrdB 2、nrdB 3、nrdB 4、nrdB 5和nrdB 6，采用TwistDX公司的货号为TABAS03KIT的TwistAmp Basic试剂盒按照其试剂盒说明书进行RPA扩增，RPA扩增体系(50μL)的配制方法如下：上下游引物各2.4μL(10μM/μL)，再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，将以上体系混匀移入含有冻干酶粉的0.2mL反应管中，再加入50ng DNA模板，加入2.5μL(280mmol/L)醋酸镁溶液,去离子水补足至50μL。以TwistAmpTM basic kit试剂盒中提供的引物和模板DNA作为阳性对照来监控扩增反应是否正常、灭菌超纯水作为空白对照。

RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于40℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。

步骤三：RPA扩增产物的电泳检测

RPA反应结束后，RPA扩增产物采用货号为DP204-03的天根普通DNA产物纯化试剂盒按其说明书进行纯化，最后用2％琼脂糖凝胶进行电泳分析。

结果显示(图1):nrdB 1引物扩增出104bp的目标条带，但条带微弱；nrdB 2引物扩增出225bp的目标条带，且条带单一明亮；nrdB 3引物扩增出136bp的目标条带，且条带单一明亮；nrdB 4引物扩增出251bp的目标条带，但有非特异性条带产生；nrdB 5引物没有目标条带扩增；nrdB 6引物扩增出354bp的目标条带，且条带单一明亮。由于nrdB 4引物存在和目标片段大小近似的非特异性扩增，nrdB5引物没有扩增，故选择nrdB 1引物、nrdB 2引物、nrdB 3引物和nrdB 6引物对进行实施例2的特异性验证。

实施例2

本实施例对实施例1的nrdB 1引物、nrdB 2引物、nrdB 3引物和nrdB 6引物进行了特异性验证，所用的供试材料如下：1株近缘细菌柑橘黄龙病菌Candidatus Liberobacterasiaticum(华南农业大学柑橘黄龙病研究室提供)和3株分离自胡萝卜种子的非病原细菌—恶臭假单孢Pseudomonas putida、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、成团泛菌Pantoea agglomerans(3株均由广州海关技术中心提供)，并以Lso DNA(Lso阳性胡萝卜种子由广州海关技术中心保存，按照实施例1的方法提取DNA)为对照。采用实施例1的方法进行RPA扩增。将特异性最佳的引物扩增产物送华大基因公司测序。

结果分析：

结果如图2所示，供试4组引物(nrdB 1引物、nrdB 2引物、nrdB 3引物和nrdB 6引物)对3株分离自胡萝卜种子的非病原细菌均未扩增出目标条带，nrdB 1引物(图2a)、nrdB2引物(图2b)、nrdB 3引物(图2c)均对近缘细菌柑橘黄龙病菌扩增出和目的片段大小一致的条带，nrdB 6引物(图2d)对柑橘黄龙病菌、恶臭假单孢、阴沟肠杆菌和成团泛菌均未出现扩增。同时，nrdB 6引物产物的测序结果在NCBI上对比结果显示，与马铃薯斑纹片病菌(Candidatus Liberibacter solanacearum)相似性达99％以上，因此，nrdB 6引物将作为最优引物。

实施例3

本实施例对实施例2的筛选的最优nrdB 6引物进行了灵敏度的验证，其方法如下：

Lso质粒标准品的构建：将nrdB 6引物按实施例1的方法扩增上述的Lso DNA，采用Vector Cloning Kit试剂盒(Takara，6011)根据试剂盒说明进行质粒构建，最后使用Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒(Takara，9760)并根据试剂盒说明进行质粒的抽提，采用Multiskan GO全波长读数仪检测质粒DNA的浓度，-20℃保存备用。

PRA灵敏度验证：将构建的Lso质粒标准品用灭菌超纯水以10倍梯度稀释，得到10个稀释度(拷贝数为1.22×10⁹coyies/μL～1.22coyies/μL)，引物为nrdB 6引物，以灭菌超纯水为阴性对照，按实施例1方法所示反应体系，待39℃金属浴20min后，扩增产物采用货号为DP204-03的天根普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，最后用2％琼脂糖凝胶进行电泳分析。

普通PCR灵敏度验证：将构建的Lso质粒标准品用灭菌超纯水以10倍梯度稀释，得到10个稀释度(拷贝数为1.22×10⁹coyies/μL～1.22coyies/μL)，引物为nrdB 6引物，以灭菌超纯水为阴性对照，进行普通PCR扩增与产物分析。扩增体系为：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，上下游引物各1.0μL(10μM/μL)，Ex TaqDNA聚合酶0.25μL，质粒模板1μL，补足水至25μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min；PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，并与PRA灵敏度验证结果作比较。

结果分析：

nrdB 6引物扩增产物片段按照1.4.4方法制成质粒标准样品，测得浓度为102ng/μL，依据拷贝数计算公式((copies/ul)＝(6.02×10²³)×(质粒浓度×10^-9)/(DNA片段长度×660)，计算得到10个稀释度RPA反应拷贝数为1.22×10⁹coyies/μL～1.22coyies/μL。结果显示：RPA检测低限为12.22coyies/μL(图3a)，普通PCR检测低限为1.22×10²coyies/μL(图3b)，因此，马铃薯斑纹片病菌RPA灵敏度是普通PCR的10倍。

实施例4

本实施例对实施例2和3的筛选的最优nrdB 6引物进行了应用效果的验证，供试样品信息如下：选取本实验室2019检测留样的茄科和伞形科样品20批次，其中经复核检出Lso的阳性样品6批次，非阳性样品14批次(见表2)，以质粒样品为阳性对照，灭菌超纯水为空白对照，采用实施例1方法提取供试样品DNA以及进行RPA反应，通过检测结果的一致性来评价RPA的应用效果。

表2

注：种子属性中，“+”表示Lso阳性种子；“-”表示Lso阴性种子。

结果分析：

结果如图4所示：样品1、4、7、10、15和17号种子均扩增出同阳性质粒对照一致的354bp目标条带，其余样品均未扩增，结果与留样样品已知结果一致，说明该方法具有较好的应用效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 广州海关技术中心

<120> 基于RPA技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒

<130> 191224

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：1

<400> 1

gtgatcttat tgctttctat gtggtatttg ag 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：2

<400> 2

ggcaatacct accattttat tatatcgtcc t 31

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：3

<400> 3

gtgatcttat tgctttctat gtggtatttg ag 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：4

<400> 4

ttacttcttg ttggaaatct tctgtccaca gg 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：5

<400> 5

gtgatcttat tgctttctat gtggtatttg ag 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：6

<400> 6

gattcatctc gcatgatata ttggtattgt tc 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：7

<400> 7

tgatgatcgt gaccaagatt ttcttcgtga tc 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：8

<400> 8

ttacttcttg ttggaaatct tctgtccaca gg 32

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：9

<400> 9

tatataccga catatttcta atcccgaatg c 31

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：10

<400> 10

gattcatctc gcatgatata ttggtattgt tc 32

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：11

<400> 11

ccttcctcaa ataagattgc agatactgtg 30

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> SEQ ID NO ：12

<400> 12

gcattcggga ttagaaatat gtcggtatat a 31

Claims (3)

1.一种用于检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的试剂盒，其特征在于：

包括由SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列组成的引物对；

包括来自天根生物科技有限公司货号为DP350的高效植物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂；

包括来自TwistDX公司的货号为TABAS03KIT的TwistAmp Basic试剂盒所包含的试剂。

2.一种检测或辅助检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法，其特征在于：包括使用权利要求1试剂盒的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)DNA提取

采用来自天根生物科技有限公司货号为DP350的高效植物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂从待测胡萝卜种子中提取DNA；

2)RPA扩增

以提取的DNA模板采用来自TwistDX公司的货号为TABAS03KIT的TwistAmp Basic试剂盒所包含的试剂进行RPA扩增；

3)根据RPA扩增的结果判断胡萝卜种子是否感染马铃薯斑纹片病菌。

所述RPA扩增的反应体系如下：

含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管

再水化缓冲液 29.5μL

SEQ ID NO：11所示的引物和SEQ ID NO：12所示的引物浓度均为10μM/μL，各2.4μL

DNA 50ng

醋酸镁溶液 2.5μL，浓度为280mmol/L

去离子水 补足至50μL

所述RPA扩增的反应条件如下：所述RPA扩增的温度为40℃，时间为40min。

Images