CN106244730B

CN106244730B - 猴嗜t淋巴细胞病毒i型的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN106244730B
Application number: CN201610839392.XA
Authority: CN
Inventors: 刘助红; 王静; 郭鹏举; 张钰; 黄韧
Original assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2018-08-14
Anticipated expiration: 2036-09-21
Also published as: CN106244730A

Abstract

本发明公开了一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT‑LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。检测的引物组包括一对外引物、一对环引物、一对内引物；检测试剂盒包括引物组、RT‑LAMP反应液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、阴阳性对照。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，在逆转录酶的作用下对RNA进行反转录，然后采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在63～65℃对样品模板进行扩增，通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或电泳是否有梯状条带来确定待检样品中是否含有猴嗜T淋巴细胞病毒I型（STLV‑I）RNA。本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于基层动物疫病监测单位和偏远地区的实验猴养殖企业中进行推广应用。

Description

猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及实验动物相关病原的检测方法，具体涉及一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)的RT-LAMP(Reverse Transcription and Loop-mediated Isothermal Amplification，反转录环介导等温扩增反应)检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

1982年STLV首次在日本猕猴体内发现，该病毒与人T淋巴白血病病毒I型(humanT-celllymphotropicvirus，HTLV-I)的相关抗体有交叉反应。之后，在亚洲和非洲超过20种非人灵长类中发现了STLV。在中国，恒河猴和食蟹猴中也发现有STLV-I血清阳性抗体存在。李绍东等对我国恒河猴的STLV-I流行病学特征进行调查发现，我国野生和饲养恒河猴血清中广泛存在STLV-I抗体。饶军华等对华南地区一个大型灵长类繁育中心恒河猴、食蟹猴猴群近3年的STLV-I感染状况的检测结果也证实这一观点，并且发现猴群STLV-I的平均感染率为4.97％，食蟹猴比恒河猴更容易感染STLV-I。

STLV-I为单股RNA病毒，其前病毒基因组全长大约9kb，具有逆转录病毒的典型结构。STLV-1病毒主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变或免疫机能紊乱，从而干扰实验研究，是SPF猴必须排除的几种病毒之一。随着国际市场对SPF猴需求量的增加，STLV-1病毒的排除也成了急待解决的问题。

目前，对STLV-I的诊断方法主要采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法、间接免疫荧光(IFA)等，该方法特异性差，灵敏度低，需要结合免疫印迹(WB)法才能进行确诊，而WB法步骤繁琐，操作复杂，非一般人员可进行操作，在一定程度上限制了其应用范围。另外，也有部分科研人员建立了PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等方法，但该方法均需要特定的设备才可以进行反应，因此，不论是为了保障整个猴群的质量还是饲养人员、科研人员的人身安全，都有必要建立一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物。其核苷酸序列分别如下所示：

外引物：

STLV-F3：5’-GTGCCAATCATGGACCTG-3’(SEQ ID NO:1)；

STLV-B3：5’-GAGGATGTGGTCTAGGTTAGA-3’(SEQ ID NO:2)；

内引物：

STLV-FIP：5’-AGTGAGGCGTGAAACTTCCTGCTATACAGGAGCCATCTCCA-3’(SEQ ID NO:3)；

STLV-BIP：5’-ATGCGGTTTTCCCTTCTCCCTTCGGTATTAAGGAACCAGATG-3’(SEQ ID NO:4)；

环引物：

STLV-LF：5’-TTGCTGAAATTTCCAGTAAGGG-3’(SEQ ID NO:5)

STLV-LB：5’-CGACGCTCCAGGATATGAC-3’(SEQ ID NO:6)。

一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述所述的检测引物组。

优选的，检测试剂盒还包含DNA聚合酶、逆转录酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

优选的，外引物、环引物、内引物的摩尔比为1：4：8。

优选的，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

优选的，逆转录酶为AMV逆转录酶。

优选的，RT-LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液。

优选的，阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。

:一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：

1)提取待检样品RNA；

2)反转录环介导等温扩增反应：配制25μl反应体系，含有STLV-F3 0.2μM，STLV-B30.2μM，STLV-FIP 1.6μM，STLV-BIP 1.6μM，STLV-LF 0.8μM，STLV-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.5U，待检DNA 1～100ng，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应45～60min；

3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出

现梯状条带。如反应管中溶液变浑浊或电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性。

本发明的有益效果是：

本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果：

1)高特异性：

本发明根据猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV)(GenBank登录号为AF074966.1)的主要囊膜蛋白基因(env)的部分序列设计了6条特异性引物，应用上述6条引物，扩增靶序列的8个区域，8个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；

2)高灵敏度：最低检测极限可达到0.1～1fg/μl含STLV-I目标片段的质粒DNA；

3)快速高效：整个扩增只用45～60min即可完成，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝；

4)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行反转录等繁琐步骤，只需要恒温水浴锅即可反应，条件比较温和；

5)结果易读：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带对检测结果进行判读，适合非专业人士的现场检测。

附图说明

图1是实施例3特异性的检测结果图(M-Marker DL2000，A：猴嗜T淋巴细胞病毒I型STLV-I质粒DNA；B：猴嗜T淋巴细胞病毒I型STLV-I RNA；C：猴D型逆转录病毒SRV1 RNA；D：猴D型逆转录病毒SRV2RNA；E：猴D型逆转录病毒SRV3RNA；F：猴免疫缺陷病毒SIV RNA；G：猴B病毒BV DNA；H：DEPC水对照)。

图2是实施例4灵敏度的检测结果图(1：100pg/μl质粒DNA(STLV-I)；2：10pg/μl质粒DNA(STLV-I)；3：1pg/μl质粒DNA(STLV-I)；4：100fg/μl质粒DNA(STLV-I)；5：10fg/μl质粒DNA(STLV-I)；6：1fg/μl质粒DNA(STLV-I)；7：100ag/μl质粒DNA(STLV-I)；8：100ag/μl质粒DNA(STLV-I)；9、DEPC水对照)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1猴嗜T淋巴细胞病毒I型RT-LAMP检测试剂盒的建立

猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP(Reverse Transcription and Loop-mediatedIsothermal Amplification，反转录环介导等温扩增反应)检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、阳性对照和阴性对照。

(1)RT-LAMP引物设计：以猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)的主要囊膜蛋白基因(env)为靶基因，利用软件设计STLV-I特异性RT-LAMP引物。引物序列见表1。

表1.STLV-I特异性的RT-LAMP引物序列表

(2)RT-LAMP反应液：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液。

(3)Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶。

(4)阳性对照为含有猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)主要囊膜蛋白基因(env)片段的质粒DNA，其制备方法为：以分离鉴定的猴嗜T淋巴细胞病毒I型RNA为模板，利用表1中的外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对STLV-IRNA进行反转录PCR，所得基因片段长度为253bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中构建质粒，即为阳性对照。

GTGCCAATCATGGACCTGCCCCTATACAGGAGCCATCTCCAGCCCTTACTGGAAATTTCAGCAAGATGTCAATTTTACTCAGGAAGTTTCACGCCTCACTATTAATCTCCATTTTTCAAAATGCGGTTTTCCCTTCTCCCTTCTAATCGACGCTCCAGGATATGACCCCATCTGGTTCCTTAATACCGAACCCAGCCAACTGCCTCCCACCGCCCCTCCTCTACTCCCCCACTCTAACCTAGACCACATCCTC(SEQ ID NO:7)

(5)阴性对照为DEPC水。

实施例2猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测方法

用上述试剂盒按以下方法对猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)进行检测：

(1)待检样品RNA的提取：采用天根生化科技有限公司的病毒RNA提取试剂盒提取待检样品的RNA。

(2)反转录环介导等温扩增反应：

25μl反应体系含有：STLV-F3 0.2μM，STLV-B3 0.2μM，STLV-FIP 1.6μM，STLV-BIP1.6Μm,STLV-LF 0.8μM，STLV-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，AMV逆转录酶2.5U，待检RNA1～100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，于65℃反应60min。

(3)结果判断：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如反应管中溶液变浑浊或电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性。

实施例3特异性实验

用实施例2的方法分别对猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)RNA、猴D型逆转录病毒(SRV)RNA、猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA、猴B病毒(BV)DNA进行检测。

鉴定结果显示：以猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)RT-LAMP引物组为引物，STLV-IRNA及质粒DNA反应管中溶液均变浑浊，电泳后出现梯状条带，阴性对照及SRV、SIV、BV等反应管中溶液未变浑浊，同时电泳未出现梯状条带，显示出本发明检测引物及方法具有良好的特异性。(见图1)

实施例4灵敏度实验

将已构建的猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)质粒DNA作10倍梯度稀释，用实施例2的操作方法分别对稀释后的猴嗜T淋巴细胞病毒I型(STLV-I)质粒DNA进行检测。

鉴定结果显示：以STLV-IRT-LAMP引物组为引物，STLV-I质粒DNA按10倍梯度进行稀释，结果显示100pg/μl到10fg/μl的浓度的STLV-I质粒DNA反应管中溶液均变浑浊，电泳后出现明显梯状条带，另外，1fg/μl及100ag/μl浓度的反应管2个重复中有1个出现梯状条带，而10ag/μl的浓度及阴性水对照等反应管中溶液未变浑浊，同时电泳未出现梯状条带。(见图2)。

实施例5不同检测引物及方法检测效果的比较

用实施例2的方法采用不同LAMP检测按照实施例4中的步骤进行检测，同时采用及荧光定量PCR引物进行检测，比较不同检测引物及不同检测方法的检测效果，检测引物及检测效果分别见表2和表3。

表2其他LAMP检测引物组及荧光定量PCR引物

表3不同检测引物及方法检测效果

	本发明检测引物A	检测引物组B	检测引物C	检测引物D	荧光定量PCR引物
						检测灵敏度	100ag/ul(+/-)1fg/ul(+/-)	100fg/ul(+/-)	1fg/ul(+/-)	10fg/ul(+/+)	10fg/ul(+/-)
阴性对照结果	阴性(-/-)	阴性(-/-)	阳性(+/-)	阴性(-/-)	阴性(-/-)

备注：(+/+)代表2次重复均为阳性，(+/-)代表2次重复有一次为阴性，一次为阳性，(-/-)代表两次重复均为阴性

检测结果显示：本发明的引物组与其他引物组及荧光定量PCR检测方法相比，具有灵敏度高特点，同时也无假阳性现象出现。

以上实施例表明，本发明的方法具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于在各基层动物疫病监测单位和实验猴养殖企业中进行推广应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广东省实验动物监测所

<120> 猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgccaatca tggacctg 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggatgtgg tctaggttag a 21

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtgaggcgt gaaacttcct gctatacagg agccatctcc a 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcggtttt cccttctccc ttcggtatta aggaaccaga tg 42

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgctgaaat ttccagtaag gg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgacgctcca ggatatgac 19

<210> 7

<211> 253

<212> DNA

<213> Simian T-virus lymphotropic

<400> 7

gtgccaatca tggacctgcc cctatacagg agccatctcc agcccttact ggaaatttca 60

gcaagatgtc aattttactc aggaagtttc acgcctcact attaatctcc atttttcaaa 120

atgcggtttt cccttctccc ttctaatcga cgctccagga tatgacccca tctggttcct 180

taataccgaa cccagccaac tgcctcccac cgcccctcct ctactccccc actctaacct 240

agaccacatc ctc 253

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccagcagcta gatagcct 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggagtaggc taaggatcg 19

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgagccagag ttgctggtat ttgttcaagc caacaatcca 40

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggagtgccaa agacccttcc tgagacgttc tacgaaggt 39

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgccttaat ccttgttgct 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctggaggag ccttacca 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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agtttatgca gaccatccg 19

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccagagttgc tggtattctc 20

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

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aggctatcta gctgctggtg aaagacctcc aagacctcc 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggccgaaact cgaggtatta catccttgtt gctgtggatt g 41

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agggaggagc aaaggtact 19

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctccgtgtt caagccaa 18

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gaaactcgag gtattacagg tt 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tctttgtttg cgttggagta 20

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctttggcact ccctggtagg tccacagcaa caaggattaa g 41

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gcctggagga gccttaccag gcagtccatt gtcaagg 37

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agagttgctg gtattctcgc 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

caccttcgta gaacgtctca a 21

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tcgcccatgg caaatga 17

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gggctgcctg ggagactt 18

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

acaggccatt aagcaa 16

Claims

1.一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物：

STLV-F3：5’-GTGCCAATCATGGACCTG-3’（SEQ ID NO:1）；

STLV-B3：5’-GAGGATGTGGTCTAGGTTAGA-3’（SEQ ID NO:2）；

内引物：

STLV-FIP：5’-AGTGAGGCGTGAAACTTCCTGCTATACAGGAGCCATCTCCA-3’（SEQ ID NO:3）；

STLV-BIP：5’-ATGCGGTTTTCCCTTCTCCCTTCGGTATTAAGGAACCAGATG-3’（SEQ ID NO:4）；

环引物：

STLV-LF：5’-TTGCTGAAATTTCCAGTAAGGG-3’（SEQ ID NO:5）

STLV-LB：5’-CGACGCTCCAGGATATGAC-3’（SEQ ID NO:6）。

2.一种猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。

3.根据权利要求2所述的猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒还包含DNA聚合酶、逆转录酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、环引物、内引物的摩尔比为1：4：8。

5.根据权利要求3所述的猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

6.根据权利要求3所述的猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液。

7.根据权利要求3所述的猴嗜T淋巴细胞病毒I型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。

8.根据权利要求2~7任一项所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1）提取待检样品RNA；

2）反转录环介导等温扩增反应：配制25μl反应体系，含有STLV-F3 0.2μM，STLV-B3 0.2μM，STLV-FIP 1.6μM，STLV-BIP 1.6μM，STLV-LF 0.8μM，STLV-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.5U，待检RNA 1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应45～60min；

3）结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如反应管中溶液变浑浊或电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性；

该使用方法用于非疾病诊断目的。