CN105219884A - 猴逆转录病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

猴逆转录病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猴逆转录病毒RT-LAMP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测的引物组包括一对外引物、一对内引物；检测试剂盒包括引物组、RT-LAMP反应液、<i>Bst</i><i></i>DNA聚合酶、逆转录酶、阴阳性对照和显色液。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，在逆转录酶的作用下对RNA进行反转录，然后采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的<i>Bst</i><i></i>DNA聚合酶，在63～65℃对样品模板进行扩增，通过肉眼观察反应管颜色的变化来确定待检样品中是否含有猴逆转录病毒（SRV）RNA。本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于基层动物疫病监测单位和偏远地区的实验猴养殖企业中进行推广应用。

Description

猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及实验动物相关病原的检测方法，具体涉及一种猴逆转录病毒（SRV）的RT-LAMP（ReverseTranscriptionandLoop-mediatedIsothermalAmplification，反转录环介导等温扩增反应）检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
猴逆转录病毒（SimiantypeDretrovirus，SRV），属于逆转录病毒科、肿瘤病毒亚科的D型病毒。SRV具有逆转录病毒所共有的特性，是单链RNA病毒，内含逆转录酶，病毒颗粒呈球形，直径80-100nm，囊膜上缺乏明显的纤突，感染细胞浆内的病毒为A型颗粒，细胞外未成熟病毒的核心为圆形，成熟病毒的核心为圆柱状。病毒以出芽的方式从细胞膜上释放。SRV可在多种猴的细胞包括猴的B细胞、T细胞、成纤维细胞、唾液腺上皮细胞、胰腺细胞等中生长。SRV为猴艾滋病的主要病原体之一，.感染后临床上表现为顽固性腹泻、体重减轻、全身性淋巴腺病脾肿大、贫血、中性白细胞减少、淋巴细胞减少、坏死性口炎、腹膜后纤维瘤病等。
到目前为止，发现感染SRV病毒并产生猴艾滋病的非人灵长类动物主要是猕猴属的动物。近年来，已有SRV感染人的报道。SRV必须通过直接接触才能在猴间进行传播，主要通过猴间相互撕咬使含于唾液中的病毒进入伤口而传播，而在所有的分泌物和排泄物中，唾液含病毒量最高。SRV也能通过性传播和经胎盘传播。SRV对不同年龄的猴致病性有差异，3岁以上的猴抵抗力较未成年猴强，6个月至2岁半的猴最易感，6个月以下的猴有母源抗体的保护。雄猴和雌猴均易感染，但雌猴的病例较多。
SRV已经被确认为是导致SAIDS的病原体，因此，在猴艾滋病动物模型建立之前一定要排除这种病原体的干扰。SRV感染的诊断除了检查临床症状，还要结合实验室诊断方法，常用的实验室诊断方法有PCR法、酶联免疫吸附试验（ELISA）法、间接免疫荧光（IFA）法、免疫印迹（WB）法、病毒分离法等。PCR法快速、灵敏，但其扩增产物需要进行再一次验证。病毒分离需要进行细胞培养，周期长、对试验设备要求高，因此，该方法不适合一般的检测。目前，对SRV的检测常用ELISA法和IFA法作为初筛，还必须用WB检测特异性抗体才能最终确诊。ELISA法和IFA法检测的假阳性率高及WB法操作程序复杂，在一定程度上限制了其应用范围。因此，不论是为了保障整个猴群的健康还是饲养人员、科研人员的人身安全，都有必要建立一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组，其包括一对外引物和一对内引物，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
SRV-F3：TTTTTGTATGCGGTAATAACAAG（SEQIDNO:1）；
SRV-B3：AGATACTGCAGTAGTTATACCTAA（SEQIDNO:2）；
内引物：
SRV-FIP：ACCTGGAATAATGTCTATATCGGGT-GCATACACTTATCTACCCACA（SEQIDNO:3）；
SRV-BIP：GTGAACCTGTCCCCATTCCA-TATGACTAGGGGAATAAACTGG（SEQIDNO:4）。
一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其包括上述检测引物组。
进一步的，所述猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒中，外引物、内引物的摩尔比为1：8。
进一步的，所述猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒中还含有DNA聚合酶、逆转录酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照、显色液。
进一步的，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。
进一步的，所述RT-LAMP反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。
进一步的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
进一步的，所述显色液含有750mM钙黄绿素和5mMMnCl2的溶液。
一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：
1）待检样品RNA的提取；
2）利用权利要求1的引物组对待检样品进行反转录环介导等温扩增反应；
3）结果分析：根据反应液颜色变化判定结果，橙色为阴性，绿色为阳性；
进一步的，步骤2）反转录环介导等温扩增反应的25μl反应体系含有：SRV-F30.2μM，SRV-B30.2μM，SRV-FIP1.6μM，SRV-BIP1.6μM，RT-LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.5U，待检RNA1~100ng，显色液2.5μl，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应45～60min。
上述检测方法用于非疾病检测或诊断。
本发明的有益效果是：
本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果：
1）高特异性：
本发明根据猴逆转录病毒（SRV）（GenBank登录号为M11841.1）的主要包膜蛋白基因(env)的部分序列设计了4条特异性引物，应用上述4条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
2）高灵敏度：最低检测极限可达到1fg/μl含SRV目标片段的质粒DNA；
3）快速高效：整个扩增只用45～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
4）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行反转录等繁琐步骤，只需要恒温水浴锅即可反应，条件比较温和；
5）结果易读：通过肉眼观察反应管内颜色变化即可判读检测结果，无需电泳等其他任何分析步骤，适合非专业人士的现场检测。
附图说明
图1是实施例3特异性的检测结果图（1：SRVRNA；2：SIVRNA；3：HTLVRNA；4：DEPC水对照）；
图2是实施例4灵敏度的检测结果图（SRVDNA，1：100pg/μl质粒DNA(SRV)；2：10pg/μl质粒DNA(SRV)；3：1pg/μl质粒DNA(SRV)；4：100fg/μl质粒DNA(SRV)；5：10fg/μl质粒DNA(SRV)；6：1fg/μl质粒DNA(SRV)；7：0.1fg/μl质粒DNA(SRV)；8：DEPC水对照）。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1猴逆转录病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立
猴逆转录病毒的RT-LAMP（ReverseTranscriptionandLoop-mediatedIsothermalAmplification，反转录环介导等温扩增反应）检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、阳性对照和阴性对照、显色液。
（1）RT-LAMP引物设计：以猴逆转录病毒（SRV）的主要包膜蛋白基因（env）为靶基因，利用软件在线设计SRV特异性RT-LAMP引物。引物序列见表1。
表1.SRV特异性的RT-LAMP引物序列表
（2）RT-LAMP反应液：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。
（3）BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶
（4）显色液为含有750mM钙黄绿素和5mMMnCl2溶液。
（5）阳性对照为含有猴逆转录病毒（SRV）主要包膜蛋白基因env基因片段的质粒DNA，其制备方法为：以分离鉴定的猴逆转录病毒RNA为模板，利用表1中的外引物（SEQIDNO:1和SEQIDNO:2）对SRVRNA进行反转录PCR，所得基因片段长度为235bp，序列如SEQIDNO:5所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中构建质粒，即为阳性对照。
TATGCGCCCCAAATAGCTCAGTTTTTGTATGCGGTAATAACAAGGCATACACTTATCTACCCACAAATTGGACGGGAAGCTGTGTACTTGCTACTCTTTTACCCGATATAGACATTATTCCAGGTAGTGAACCTGTCCCCATTCCAGCTATAGATCATTTTTTAGGTAGACCCAAAAGAGCAATCCAGTTTATTCCCCTAGTCATAGGATTAGGTATAACTACTGCAGTATCTAC（SEQIDNO:5）
（6）阴性对照为DEPC水。
实施例2猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法
用上述试剂盒按以下方法对待测猴逆转录病毒（SRV）进行检测：
（1）待检样品RNA的提取：采用美基生物公司的病毒RNA提取试剂盒提取待检样品的RNA；
（2）反转录环介导等温扩增反应：
25μl反应体系含有：SRV-F30.2μM，SRV-B30.2μM，SRV-FIP1.6μM，SRV-BIP1.6Μm,RT-LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，待检RNA1~100ng，显色液2.5μl，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，于65℃反应60min。
（3）结果判断：根据反应液颜色变化判定结果，橙色为阴性，绿色为阳性。
实施例3特异性实验
用实施例2的方法分别对分离纯化的猴逆转录病毒（SRV）RNA、猴免疫缺陷病毒（SIV）RNA、人淋巴细胞趋向性病毒（HTLV）RNA进行检测。
鉴定结果显示：以猴逆转录病毒（SRV）RT-LAMP引物组为引物，SRVRNA反应后呈现绿色，阴性水对照及SIV、HTLV等呈现橙色（见图1），显示出本发明检测引物及方法具有良好的特异性。
实施例4灵敏度实验
将已构建的猴逆转录病毒（SRV）质粒DNA作10倍梯度稀释，用实施例2的操作方法分别对稀释后的猴逆转录病毒（SRV）质粒DNA进行检测。
鉴定结果显示：以SRVRT-LAMP引物组为引物，SRV质粒DNA按10倍梯度进行稀释，结果显示100pg/μl到1fg/μl的浓度的SRV质粒DNA反应管均呈现绿色，0.1fg/μl的浓度及阴性水对照反应管呈现橙色。（见图2）。
以上实施例表明，本发明的方法具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于在各基层动物疫病监测单位和实验猴养殖企业中进行推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省实验动物监测所
<120>猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法
<130>
<160>5
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tttttgtatgcggtaataacaag23
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agatactgcagtagttatacctaa24
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
acctggaataatgtctatatcgggtgcatacacttatctacccaca46
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gtgaacctgtccccattccatatgactaggggaataaactgg42
<210>5
<211>235
<212>DNA
<213>SimiantypeDretrovirus
<400>5
tatgcgccccaaatagctcagtttttgtatgcggtaataacaaggcatacacttatctac60
ccacaaattggacgggaagctgtgtacttgctactcttttacccgatatagacattattc120
caggtagtgaacctgtccccattccagctatagatcattttttaggtagacccaaaagag180
caatccagtttattcccctagtcataggattaggtataactactgcagtatctac235

Claims (10)

1.一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组，其包括一对外引物和一对内引物，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
SRV-F3：TTTTTGTATGCGGTAATAACAAG（SEQIDNO:1）；
SRV-B3：AGATACTGCAGTAGTTATACCTAA（SEQIDNO:2）；
内引物：
SRV-FIP：ACCTGGAATAATGTCTATATCGGGT-GCATACACTTATCTACCCACA（SEQIDNO:3）；
SRV-BIP：GTGAACCTGTCCCCATTCCA-TATGACTAGGGGAATAAACTGG（SEQIDNO:4）。
2.一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。
3.根据权利要求2所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、内引物的摩尔比为1：8。
4.根据权利要求2所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有DNA聚合酶、逆转录酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照、显色液。
5.根据权利要求4所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。
6.根据权利要求4所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。
7.根据权利要求4所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。
8.根据权利要求4所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述显色液含有750mM钙黄绿素和5mMMnCl2的溶液。
9.一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）待检样品RNA的提取；
2）利用权利要求1的引物组对待检样品进行反转录环介导等温扩增反应；
3）结果分析：根据反应液颜色变化判定结果，橙色为阴性，绿色为阳性；
上述所用到的所有试剂均来自权利要求2~8任一所述的检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：步骤2）反转录环介导等温扩增反应的25μl反应体系含有：SRV-F30.2μM，SRV-B30.2μM，SRV-FIP1.6μM，SRV-BIP1.6μM，RT-LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.5U，待检RNA1~100ng，显色液2.5μl，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应45～60min。
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