CN101001950A - 用于测定α1,4－N－乙酰葡糖胺转移酶(α4GnT)mRNA的方法 - Google Patents

用于测定α1,4－N－乙酰葡糖胺转移酶(α4GnT)mRNA的方法 Download PDF

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Abstract

样品中存在的α1，4－N－乙酰葡糖胺转移酶(α4GnT)mRNA的测定方法，所述方法包括：(1)使用与所述RNA的特定碱基序列5’末端下游的至少部分同源的第一引物和与所述特定碱基序列3’末端上游的至少部分互补的第二引物，以形成含有启动子序列和该启动子序列下游的前述特定碱基序列的双链DNA的步骤，其中所述第一引物和第二引物中的至少一方在5’末端具有启动子序列；(2)使用所述双链DNA作为模板形成RNA转录产物的步骤；(3)接下来使用所述RNA转录产物作为DNA合成的模板，链式扩增RNA转录产物的步骤；以及(4)测定前述RNA转录产物量的步骤。

Description

用于测定α1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α4GnT)mRNA的方法
技术领域
本发明涉及用于以简便、等温和一步方式快速测定α1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α4GnT)mRNA的方法。本发明属于医药领域并且尤其是临床诊断领域，并且提供了用于早期诊断癌、监测治疗、判断预后和确定治疗方针提供有用指标。
背景技术
已经发现α1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶(此后称为α4GnT)具有将N-乙酰葡糖胺自N-乙酰葡糖胺供体通过α1，4键转移至N-乙酰葡糖胺受体糖链的非还原末端存在的半乳糖残基的活性，在胃组织中表达(参见Nakayama，J.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，8991-8996；Zhang，M.X.等人(2001)J.Histochem.Cytochem.，49，587-596)。在这些文献中，据报导α4GnT参与自粘膜细胞分泌的糖蛋白的O-聚糖末端存在的特征性GlcNAcα1→4Galβ→R结构的生物合成。此外，在这些文献中，发现所述GlcNAcα1→4Galβ→R为胃癌的肿瘤相关糖链抗原，并且前述α4GnT在胃癌细胞中高频率表达。
近年，通过使用RT-PCR测定末稍血单核细胞级分的α4GnT信使RNA(mRNA)，观察到在胃癌、胰腺癌、乳头癌、胆管癌中α4GnT mRNA水平上升，进而暗示可检出早期胃癌(参见特开2001-46077号公报和ShimizuF.等人(2003)Lab.Invest.，83，187-197)。即，以上发现教导测定α4GnTmRNA可有效地对胃癌等进行早期诊断、监测治疗效果、预测预后等。
用于高敏感性测定α4GnT mRNA的一种方法是通过RT-PCR扩增α4GnT mRNA并测定扩增产物的量，但这通常需要两阶段步骤，包括逆转录(RT)步骤和PCR步骤，这不仅使此方法复杂化和较低可再现性，而且增加二次污染的风险。另外，大部分情况下组合的RT和PCR阶段花费超过2小时的时间，因此该方法不适合于处理多个样品或降低检查成本。
作为目的RNA的定量法，广泛使用在嵌入性荧光色素存在下实施PCR步骤并测定荧光增加的实时RT-PCR法，但该方法存在也检测到了引物二聚体等非特异扩增产物的问题。此外，因为RT-PCR中DNA也扩增，故如果目的是仅扩增mRNA，则染色体DNA必须在核酸提取步骤期间通过DNA酶处理等彻底除去，并且这已经导致用于提取核酸的更复杂方法。此外，PCR需要在反应温度上剧烈升高/降低，这对于自动化反应装置节省动力和降低成本构成障碍。
另一个方面，仅扩增RNA的方法已经报导，如NASBA方法(见日本专利号2650159和日本专利号3152927)和TMA方法(见日本专利号3241717)。这些RNA扩增方法使用链式反应，其中使用针对靶RNA的包含启动子序列的引物、逆转录酶和根据需要核糖核酸酶H(RNA酶H)以合成含有启动子序列的双链DNA，使用RNA聚合酶以合成含有靶RNA的特定核苷酸序列的RNA，并随后使用此RNA作为模板以合成含有启动子序列的双链DNA。RNA扩增后，通过电泳方法或使用与可检测标记结合的核酸探针通过杂交方法检测扩增的RNA。
这些RNA扩增方法适用于简便的mRNA测定因为它们以等温、一步方式仅扩增RNA，但是通过杂交方法等检测需要复杂过程并且不允许高度可再现性的定量。
作为用于扩增和测定mRNA的简便方法，可提及特开2000-14400号公报和Ishiguro，T.，等，(2003)Anal.Biochem.， 314，77-86)描述的方法。在所述方法中，于存在核酸探针时实施前述RNA扩增，其中该核酸探针以嵌入性荧光色素标记并如此设计以至在探针与靶核酸形成互补双链时，嵌入性荧光色素部分通过嵌入至互补双链而在荧光特性上发生改变，并且测定荧光特性上的改变，因而有可能以简便、等温和一步方式在密封容器内同时完成RNA扩增和测定。
发明公开
测定α4GnT mRNA对于胃癌、胰腺癌和其它癌早期诊断有用，但是RT-PCR的使用需要具有复杂过程的两步骤方法并且需要反应温度剧烈升高/降低。这导致二次污染风险和可再现性不好，同时对开发简便的自动化测定法构成障碍。本发明通过提供用于以简便、迅速、等温和一步方式测定α4GnT mRNA的方法克服了前述困难。
作为旨在解决前述困难的锐意研究成果，本发明人已经建立了应周如上所述的RNA扩增方法以简便、迅速、等温和一步方式测定α4GnT mRNA的方法。即，通过测定RNA扩增方法中所扩增的RNA产物量，有可能以简便、迅速、等温和一步方式测定α4GnT mRNA，在所述RNA扩增方法中使用第一引物和第二引物(至少其一在5’末端具有启动子序列)以产生含有启动子序列的双链DNA，使用该双链DNA作为模板以产生RNA转录产物并且随后使用此RNA转录产物作为DNA合成的模板以产生双链DNA。
附图简述
图1显示实施例2中所制备的嵌入性荧光色素标记的核酸探针的结构。B1、B2、B3和B4代表碱基。
A)根据Ishiguro等的方法(见Ishiguro，T.，等，(1996)Nucleic AcidsRes.，24，4992-4997)，使嵌入性荧光色素(唑黄)通过接头结合至磷酸二酯部分的探针。为防止自3′-末端-OH基的延伸反应，以羟乙酸修饰3′-末端-OH基。
B)使用商业可获得的Label-ON试剂(Clontech)导入氨基，根据Ishiguro等的方法(见如前引证的Ishiguro等(1996))，使其结合有唑黄的探针。这里将氨基导入于导入位置缺少核苷的部分(图中B3)。为防止自3′-末端-OH基的延伸反应，以生物素修饰3′-末端-OH基。
图2显示作为实施例3测定结果所得到的荧光曲线。
显示的是根据本发明实施RNA扩增同时定时测定荧光强度(激发波长：470)nm，荧光波长520nm)的结果。水平轴代表反应时间，并且垂直轴代表荧光强度比(反应混合液的荧光强度/背景荧光)。图中的拷贝数代表每一试验中所用α4GnT RNA(包含碱基编码7-1242)的起始拷贝数(通过在260nm的吸光度计算)。
图3显示作为实施例4测定结果所得到的荧光曲线。
显示的是根据本发明实施RNA扩增同时定时测定荧光强度(激发波长：470nm，荧光波长520nm)的结果。水平轴代表反应时间，并且垂直轴代表荧光强度比(反应混合液的荧光强度/背景荧光)。本图说明中的数字代表一次试验所用α4GnT RNA(包含碱基编码7-1242)的起始拷贝数(通过在260nm的吸光度计算)。
图4是自图3的结果所得到的校准曲线。将检测时间定义为在图3结果中荧光强度比达到1.2的时间，将检测时间相对标准RNA的起始拷贝数的对数作图。图中的等式显示了线性回归等式和相关系数。未知样品的起始拷贝数自该校准曲线和通过本方法得到的未知样品的检测时间计算。
用于实施本发明的最佳实施方案
本发明是用于测定样品中存在的α4GnT mRNA的方法，该方法包括使用与RNA的特定碱基序列5’末端下游的至少部分同源的第一引物和与所述特定碱基序列3’末端上游的至少部分互补的第二引物(其中第一引物和第二引物至少之一在5，末端具有启动子序列)以产生含有启动子序列和该启动子序列下游的特定碱基序列的双链DNA的步骤；使用所述双链DNA作为模板以形成RNA转录产物的步骤；接下来使用所述RNA转录产物作为DNA合成的模板以产生双链DNA的步骤；在允许同时进行前述各步骤的条件下重复前述步骤的核酸扩增步骤；以及测定前述RNA转录产物量的步骤。
本发明的样品为通过已知方法自样本如血液、血清、血浆、组织或怀疑含有癌细胞的洗净液等中提取的核酸。
本发明的特定核苷酸序列包含α4GnT mRNA的至少部分序列或其互补序列，并且具有由第一引物和第二引物所定义区域的序列。根据本发明，来自此特定核苷酸序列的RNA转录物得以扩增。当将启动子序列添加至第一引物时，α4GnT mRNA在充当用于cDNA合成的模板前优选地在特定核酸序列的5’端切割。不特别限制切割方法，但是它优选地是使用具有RNA酶H活性的酶切割RNA-DNA杂交体的RNA部分的方法，其中所述RNA-DNA杂交体通过添加具有与α4GnT mRNA的特定核苷酸序列5’端重复的相邻区域互补的序列的寡核苷酸(切割用寡核苷酸)形成，并且优选地所用的切割用寡核苷酸3’-末端-OH得以合适修饰例如胺化以防止延伸反应。
本发明的靶核酸是指在所述特定碱基序列中的显示与第一引物和第二引物不同源或不互补的区域，但具有允许与嵌入性荧光色素标记的核酸探针互补性结合的序列。因此，嵌入性荧光色素标记的核酸探针是与本发明特定核苷酸序列的部分互补的序列。因此根据本发明的一个实施方案，当特定的核苷酸序列是同源于α4GnT mRNA的序列时，嵌入性荧光色素标记的核酸探针具有SEQ ID NO：5所示序列中至少15个连续碱基的序列，并且当特定的核苷酸序列是互补于α4GnT mRNA的序列时，嵌入性荧光色素标记的核酸探针具有包含SEQ ID NO：5所示序列的互补序列中至少15个连续碱基的序列。
本发明的第一引物和第二引物至少其中之一在5’端具有启动子序列。即第一引物和第二引物之一具有启动子序列即已足够，但两者均具有启动子序列也是可行的。此外，第一引物对于α4GnT mRNA的互补序列、第二引物对于α4GnT mRNA，分别为具有充分互补性的寡核苷酸。″充分的互补性″意指在本发明核酸扩增步骤的反应条件(反应温度和盐的组成等)下可以与所述特定核苷酸序列或该序列的互补序列进行互补性结合。此类反应条件可以是例如在43℃存在60mM Tris、17mM氯化镁、100mM氯化钾和1mM DTT的杂交条件。
为了使第一引物对于α4GnT mRNA的互补序列、第二引物对于α4GnT mRNA、以及嵌入性荧光色素标记的核酸探针对于靶核酸分别充分互补，第一引物优选地包含SEQ ID NO：1或3所示序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基，第二引物优选地包含SEQ ID NO：2或4所示序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针优选地包含SEQ ID NO：5或6所示序列或与该序列互补序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基。
又，一种序列组合为第一引物优选地包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基，第二引物优选地包含SEQ IDNO：2所示序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针优选地包含SEQ ID NO：5所示序列或与该序列互补序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基；或者也可为这样的序列组合，其中第一引物优选地包含SEQ ID NO：3所示序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基，第二引物优选地包含SEQ ID NO：4所示序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针优选地包含SEQ ID NO：6所示序列或与该序列互补序列的至少15个并且更优选地至少20个连续碱基。虽然这些组合为与α4GnT mRNA互补结合的序列的位置关系较优选的实施方案，但使用其它组合也可能扩增并测定α4GnT mRNA。
备选地，前述第一引物、第二引物和嵌入性荧光色素标记的核酸探针可以是分别具有这样碱基序列的序列，所述碱基序列为在高严格条件下例如在前述用于本发明核酸扩增步骤的反应条件下分别与SEQ ID NO：1或3、SEQ ID NO：2或4、以及SEQ ID NO：5或6所示序列的互补链杂交的碱基序列。
本发明所用的启动子序列是与RNA聚合酶结合以启动转录的序列，并且对应于不同RNA聚合酶的特异性序列为已知。对RNA聚合酶没有特别限制，但优选常用的RNA聚合酶如T7噬菌体RNA聚合酶、T3噬菌体RNA聚合酶和SP6噬菌体RNA聚合酶，并且可以使用它们对应的启动子序列。
本发明用于测定α4GnT mRNA的方法需要某些酶(以单链RNA为模板具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶(逆转录酶)、具有RNA酶H活性的酶、以单链DNA为模板具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶、以及具有RNA聚合酶活性的酶)。各种酶可以使用具有多种活性的一种酶，也可以使用具有分别的活性的多种酶。例如向同时对单链RNA模板具有依赖RNA的DNA聚合酶活性、具有RNA酶H活性、并对单链DNA模板具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的逆转录酶不仅添加具有RNA聚合酶活性的酶，根据需要进一步添加具有RNA酶H活性的酶作为补充。从广泛使用的观点优选AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶和它们的衍生物作为逆转录酶。
当在第一引物和第二引物存在下实施逆转录反应时，第二引物与α4GnT mRNA的特定碱基序列结合并以具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶实施cDNA合成。所得到RNA-DNA杂交体的RNA部分由具有RNA酶H活性的酶降解，并解离以至第一引物可与cDNA结合。
随后，通过具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶产生自特定碱基序列衍生并在5’端含有启动子序列的双链DNA。此双链DNA含有该启动子序列下游的特定碱基序列并且自该特定碱基序列衍生的RNA转录物通过具有RNA聚合酶活性的酶产生。RNA转录物充当模板用于通过第一引物和第二引物合成双链DNA，以至作为链式反应的一系列反应进行并且导致扩增RNA转录物。
为促进链式反应，当然需要至少添加如对每种酶为必需的已知成分即缓冲剂、镁盐、钾盐、核苷三磷酸和核糖核苷三磷酸。此外，可以添加添加剂如二甲基亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)、糖等以调节反应效率。
例如，当使用AMV逆转录酶和T7 RNA聚合酶时，反应温度优选地设定在35℃-65℃范围，并且最优选地将其设置为40℃-44℃范围。RNA扩增步骤等温地进行，并且可以将反应温度设置为逆转录酶和RNA聚合酶发挥它们活性的任意所需温度。
已扩增的RNA转录物的量可以通过已知的核酸测定法测定。应用电泳或液相层析的方法，或应用以可检测标记物标记的核酸探针的杂交方法作为此类测定方法可以使用。但这些方法包括多重步骤，并且因为自系统中取出扩增产物用于分析，存在扩增产物逃逸至环境引起二次污染原因的高风险。为克服这些问题，优选使用如此设计的探针以至于一旦与靶核酸互补性结合，它的荧光特性即改变。作为更优选的方法，可提到这样的方法，其中在核酸探针存在时实施核酸扩增步骤，其中所述核酸探针以嵌入性荧光色素标记并如此设计以致其与靶核酸形成互补双链时，嵌入性荧光色素分子通过嵌入互补双链而在荧光特性上发生改变，并且测定荧光特性上的改变(见特开2000-14400号公报(Kokai)和Ishiguro，T.，等，(2003)，参见上文)。
不存在对嵌入性荧光色素的特别限制，并且可以使用常用色素如唑黄、噻唑橙、溴化乙锭及其衍生物。荧光特性上的改变可以是荧光强度上的改变。例如，已知在唑黄时，嵌入双链DNA引起在510nm处荧光(490nm激发波长)的显著增加。嵌入性荧光色素标记的核酸探针是与RNA转录物具有充分互补性的寡核苷酸，并且它具有这样的结构：嵌入性荧光色素通过适宜的接头结合至末端、磷酸二酯部分或碱基部分，并且具有适当修饰的3’末端-OH基，以防止自3’-末端-OH的延伸(见特开平8-211050号公报(Kokai)和Ishiguro，T.，等，(1996)，参见上文)。
向寡核苷酸标记嵌入性荧光色素可以通过已知方法将官能团导入寡核苷酸，从而使嵌入性荧光色素结合而完成(见特开2001-13147号公报(Kokai)和Ishiguro，T.，等，(1996)，参见上文)。导入官能团的方法可以使用常用的Label-ON试剂(Clontech Laboratories，Inc.)。
作为本发明的一个实施方案，可以向样品添加这样的测定试剂，其至少含有在5’端具有T7启动子序列的第一引物(包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个连续碱基)、第二引物(包含SEQ ID NO：2所示序列的至少15个连续碱基)、嵌入性荧光色素标记的核酸探针(包含SEQ ID NO：5所示序列的至少15个连续碱基)、切割用寡核苷酸(包含SEQ ID NO：22所示序列的至少15个碱基并具有与特定磁基序列5’端重复的邻接区域互补的序列)、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、缓冲剂、镁盐、钾盐、三磷酸核苷、三磷酸核糖核苷和二甲基亚砜(DMSO)，并且在35-65℃(优选地40-44℃)的恒定反应温度实施反应同时定时测定反应溶液的荧光强度。
作为本发明的另一实施方案，可以向样品添加这样的测定试剂，其至少含有在5’端具有T7启动子序列的第一引物(包含SEQ ID NO：3所示序列的至少15个连续碱基)、第二引物(包含SEQ ID NO：4所示序列的至少15个连续碱基)、嵌入性荧光色素标记的核酸探针(包含SEQ ID NO：6所示序列的至少15个连续碱基)、切割用寡核苷酸(包含选自SEQ ID NO：23-25的序列的至少15个碱基并具有与特定碱基序列5’端重复的邻接区域互补的序列)、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、缓冲剂、镁盐、钾盐、三磷酸核苷、三磷酸核糖核苷和二甲基亚砜(DMSO)，并且在35-65℃(优选地40-44℃)的恒定反应温度实施反应同时定时测定反应溶液的荧光强度。
在前述任一实施方案中，荧光强度作为自起始RNA量的增加曲线的结果，并且因此通过使用已知浓度的标准RNA绘制出校准曲线，可以定量未知样品中RNA的起始量。此外，因为定时测定荧光强度，所以可以在检测到荧光显著增加的任意时间点终止测定，通常可以在一小时内，并且用优化系统在30分钟内得到测定结果。
尤其值得注意的是可以在同一容器内包含测定试剂中所有的试验材料。即，预定量的试验材料分注至单个容器的简单操作将允许此后自动化扩增并检测α4GnT mRNA。容器可有由例如允许从外部测定荧光色素所发出信号的至少部分的透明性材料构成，并且尤其优选可以在分注试验材料后密封的容器以防止污染。
由于根据如上所述实施方案的RNA扩增和测定方法可以以一步和等温方式实施，因此其比RT-PCR更方便并且适合于自动化。然而，由于反应在相对低的35-65℃恒定温度在没有如RT-PCR中的变性和复性步骤时实施，反应易受非特异性扩增产物如引物二聚体或待测定RNA的高级结构影响，并且因此需要更复杂的设计以构建与RT-PCR可比较的测定系统，因为这个原因以前不可能使用前述RNA扩增和测定方法以快速、简便、等温和一步方式测定α4GnT mRNA。根据本发明，首次有可能以快速、简便、等温和一步方式高特异性和高敏感地测定α4GnT mRNA。
本发明可应用作为早期诊断胃癌、胰腺癌和其它癌、监测化学疗法等的治疗效果、诊断微小转移、预测预后和决定治疗方针的指标。
实施例
本发明将通过实施例进一步解释，并应理解本发明不受实施例限制。
实施例1
α4GnT RNA通过体外(in vitro)转录位于SP6噬菌体RNA聚合酶启动子下游的具有α4GnT eDNA(包含碱基编号7-1242，具有根据国家生物技术信息中心(National Center Biotechnology Information)登录号AF141315的编号)的双链DNA为模板制备，随后通过DNA酶I处理彻底消化双链DNA并纯化RNA。RNA通过在260nm测定吸光度定量。
如下实施例以所述RNA作为测定对象，但是它们完全适用于测定作为本发明测定对象的α4GnT mRNA。
实施例2
制备了以嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针。在SEQ ID NO：18、19和21所示序列5’端的第13位碱基(SEQ ID NO：18中的A，SEQ ID NO：19中的C，以及SEQ ID NO：21中的G)位置使用Label-ON试剂(Clontech)导入氨基，并且以生物素修饰3′端。唑黄通过Ishiguro等(见上文，1996)中所述方法与该氨基结合(图1B)。此外，唑黄通过Ishiguro等(见上文，1996)中所述方法经接头与SEQ ID NO：20所示序列5，端笫9位的C和第10位的T间的磷酸二酯部分结合以制备唑黄-标记的核酸探针(图IA)。
实施例3
将本发明的方法用于检测α4GnT RNA的不同起始拷贝数。
(1)使用RNA稀释剂(10mM Tris/HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.25U/μl核糖核酸酶抑制剂、5mM DTT)将前述的α4GnT RNA(包含碱基编号7-1242)稀释至25、50、100和100O个拷贝/5μl作为RNA样品使用。使用RNA稀释剂作为阴性标准(0拷贝)。
(2)将具有如下组分的20μl反应混合液分配至0.5ml体积PCR管(Gene Amp薄壁反应管，Perkin-Elmer)后，添加5μl RNA样品。
反应混合液的组成：添加酶溶液后(30μl中)终浓度如下：
60mM Tris/HCl(pH8.6)
17mM氯化镁
100mM氯化钾
1mM DTT
0.25mM每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP
3mM每种ATP、CTP、UTP
2.25mM GTP
3.6mM ITP
1μM第一引物(SEQ ID NO：7)：第一引物具有添加至如这种SEQID NO所示核苷酸序列5’端的T7聚合酶启动子序列(SEQ ID NO：26)。
1μM第二引物(SEQ ID NO：8)
25nM嵌入性荧光色素标记的核酸探针(SEQ ID NO：19)：该核酸探针使用实施例2中的Label-ON试剂制备。
0.16μM切割用寡核苷酸(SEQ ID NO：22)：此寡核苷酸的3′-OH基以氨基修饰。
6U/30μl核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio，Inc.)
13％DMSO。
(3)将反应混合液在43℃维持5分钟，随后添加在43℃维持2分钟的5μl具有如下组成的酶溶液。
酶溶液组成：反应时(在30μl中)的终浓度
2％山梨醇
8U/30μl AMV逆转录酶(Takara Bio，Inc.)
142U/30μl T7 RNA聚合酶(GIBCO)
3.6μg/30μl牛血清白蛋白
(4)接下来，将配置了热调节功能并允许直接测定PCR管的荧光分光光度计用于在43℃的反应，同时定时测定反应混合液的荧光强度(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。将反应混合液的荧光强度比随时间相关的改变(在预设时间时的荧光强度值÷背景荧光强度值)示于图2，其中将添加酶的时间点定义为0分钟。图2中的结果显示取决于α4GnT RNA起始浓度的荧光曲线，其中可以在约12分钟检测出25个拷贝/试验的α4GnTRNA。这提示α4GnT RNA可以通过本发明方法以高灵敏度快速测定。
实施例4
使用第一引物、第二引物、嵌入性荧光色素标记的核酸探针和切割用寡核苷酸的不同组合通过本发明方法测定α4GnT RNA。
(1)使用RNA稀释剂(10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.25U/μl核糖核酸酶抑制剂、5mM DTT)将前述的α4GnT RNA(包含碱基编号7-1242)稀释至103或102个拷贝/5μl以制备RNA样品。
(2)将具有如下组分的20μl反应混合液分注入0.5ml体积PCR管(Gene Amp薄壁反应管，Perkin-Elmer)后，添加5μl RNA样品。
反应混合液组成：添加酶溶液后(30μl中)终浓度如下：
60mM Tris/HCl(pH8.6)
17mM氯化镁
100mM氯化钾
1mM DTT
0.25mM每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP
3mM每种ATP、CTP、UTP
2.25mM GTP
3.6mM ITP
1μM第一引物(表1中所示SEQ ID NO.)：第一引物具有添加至相应SEQ ID NO.所示核苷酸序列5’端的T7聚合酶启动子序列(SEQ ID NO：26)。
1μM第二引物(表1中所示SEQ ID NO.)
25nM嵌入性荧光色素标记的核酸探针(表1中所示SEQ ID NO.)
0.16μM切割用寡核苷酸(表1中所示SEQ ID NO.)：此寡核苷酸的3’-OH基以氨基修饰。
6U/30μl核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio，Inc.)
13％DMSO
(3)将反应混合液在43℃维持5分钟，随后添加在43℃维持2分钟的5μl具有如下组成的酶溶液。
酶溶液组成：反应时(在30μl中)的终浓度
2％山梨醇
8U/30μl AMV逆转录酶(Takara Bio，Inc.)
142U/30μl T7 RNA聚合酶(GIBCO)
3.6μg/30μl牛血清白蛋白
(4)接下来，将配置了热调节功能并允许直接测定PCR管的荧光分光光度计用于在43℃的反应，同时定时测定反应混合液的荧光强度(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。表1显示结果，其中(+)表示超过1.2的反应混合液的荧光强度比，并且将该点处的时间作为检测时间，将添加酶的点定义为0分钟。
当使用表1中所列的第一引物、第二引物、嵌入性荧光色素标记的核酸探针和切割用寡核苷酸的组合，在20分钟内检出了103个拷贝/试验的α4GnT RNA。即，α4GnT RNA可以在使用任一下述组合时迅速检测到，所述组合由如下序列组成：SEQ ID NO：7所示的作为第一引物的序列、自SEQ ID NO：8-10中所选作为第二引物的序列、自SEQ ID NO：18-20中所选作为嵌入性荧光色素标记的核酸探针的序列、SEQ ID NO：22所示的作为切割用寡核苷酸的序列；或者所述组合由如下序列组成：自SEQ ID NO：11-13中所选作为第一引物的序列、自SEQ ID NO：14-17中所选作为第二引物的序列、SEQ ID NO：21所示的作为嵌入性荧光色素标记的核酸探针的序列、自SEQ ID NO：23-25中所选作为切割用寡核苷酸的序列。其中SEQ ID NO：7是SEQ ID NO：1的部分序列，SEQ ID NO：8-10分别是SEQID NO：2的部分序列，SEQ ID NO：18-20分别是SEQ ID NO：5的部分序列，SEQ ID NO：11-13分别是SEQ ID NO：3的部分序列，SEQ ID NO：14-17分别是SEQ ID NO：4的部分序列，SEQ ID N0：21所示序列是SEQID NO：6的部分序列。以上表明使用本发明的第一引物、第二引物和嵌入性荧光色素标记的核酸探针的RNA扩增和测定方法允许快速检测α4GnTRNA。
表1显示使用不同寡核苷酸组合的测定结果。
表1
                           寡核苷酸组合       测定结果
    第一引物(SEQ ID NO)     第二引物(SEQ ID NO)     嵌入性荧光色素标记的核酸探针(SEQID NO)     切割用寡核苷酸(SEQ ID NO)     检测时间(分钟)    判定
    7     8     18     22     17.5    +
    7     8     19     22     9.5    +
7 8 20 22 7.8 +
    7     9     18     22     11.8    +
7 9 19 22 11.6 +
7 10 19 22 13.0 +
    11     14     21     23     14.1    +
11 15 21 23 15.9 +
    12     14     21     24     13.4    +
12 16 21 24 16.9 +
13 14 21 25 19.9 +
    13     15     21     25     17.4    +
13 16 21 25 14.7 +
    13     17     21     25     11.6    +
将这些寡核苷酸组合用于使用103个拷贝/试验的α4GnT RNA作为样品的RNA扩增和荧光测定。将具有超过1.2的荧光强度比的样品判定为(+)，并且将该点处的时间记录为检测时间。
实施例5
将本发明的方法用于定量α4GnT RNA。
(1)使用RNA稀释剂(10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.25U/μl核糖核酸酶抑制剂、5mM DTT)将前述的α4GnT RNA(包含碱基编号7-1242)稀释至102、103、104、105和106个拷贝/5μl，作为绘制校准曲线用的标准RNA。使用RNA稀释剂作为阴性标准(NEG)。以类似方式制备样品A(102个拷贝/5μl)、B(103个拷贝/5μl)、C(104个拷贝/5μl)、D(105个拷贝/5μl)、E(106个拷贝/5μl)。
(2)将具有如下组分的20μl反应混合液分注入0.5ml体积PCR管(Gene Amp薄壁反应管，Perkin-Elmer)后，加入5μl每种标准RNA和样品。
反应混合液组成：添加酶溶液后(30μl中)终浓度如下。
60mM Tris/HCl(pH8.6)
17mM氯化镁
100mM氯化钾
1mM DTT
0.25mM每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP
3mM每种ATP、CTP、UTP
2.25mM GTP
3.6mM ITP
1μM第一引物(SEQ ID NO：7)：第一引物具有添加至这种SEQ IDNO所示核苷酸序列5’端的T7聚合酶启动子序列(SEQ ID NO：26)。
1μM第二引物(SEQ ID NO：8)
25nM嵌入性荧光色素标记的核酸探针(SEQ ID NO：20)：此核酸探针是具有如实施例2中所述通过接头结合至磷酸二酯的唑黄的核酸探针。
0.16μM切割用寡核苷酸(SEQ ID NO：22)：该寡核苷酸的3′-OH基以氨基修饰。
6U/30μl核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio，Inc.)
13％DMSO
(3)反应混合液在43℃维持5分钟，随后添加在43℃维持2分钟的5μl具有如下组成的酶溶液
酶溶液组成：反应时(在30μl中)的终浓度
2％山梨醇
8U/30μl AMV逆转录酶(Takara Bio，Inc.)
142U/30μl T7 RNA聚合酶(GIBCO)
3.6μg/30μl牛血清白蛋白
(4)接下来，将配置了热调节功能并允许直接测定PCR管的荧光分光光度计用于在43℃的反应，同时定时测定反应混合液的荧光强度(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。将反应混合液荧光强度比随时间相关的改变(在预设时间时的荧光强度值÷背景荧光强度值)示于图3，其中添加酶的时间点定义为0分钟。
在图3的结果中，将荧光强度比达到1.2时的时间点定义为检测时间，由检测时间和起始拷贝数的对数绘制出校准曲线，如图4中所示。此外，自该校准曲线定量样品A、B、C、D和E的拷贝数并且结果示于表3。
在示于图4的结果中，在大约10分钟时检测到102个拷贝/试验，并且在检测时间和起始拷贝数的对数之间得到令人满意的相关性。表3中对于样品A、B、C、D和E的定量结果也是对应于添加的α4GnT RNA量的值。因此，这证实本发明的方法以快速、高敏感和特异性方式定量了α4GnTRNA。
表2α4GnT RNA的定量结果
               测定结果
    样品     检测时间(分钟)     拷贝数/试验
    ABCDE     9.097.857.006.485.90     5.8×101.3×1031.4×1047.7×1046.6×105
通过来自于样品A(102个拷贝/5μl)、B(103个拷贝/5μl)、C(104个拷贝/5μl)、D(105个拷贝/5μl)、E(106个拷贝/5μl)测定结果的荧光曲线得到的检测时间以及图4的校准曲线而计算的拷贝数的结果。
工业可应用性
根据本发明，有可能以等温、一步、方便和快速方式完成高敏感地测定α4GnT mRNA。本发明因此适合作为用于早期诊断胃癌、胰腺癌和其它癌，并且用于监测化学治疗等的治疗效果，用于预测预后及用作决定治疗方针的指标。因为本发明可以在单个步骤并在密封容器内实施，故可以使作为二次污染原因的扩增产物污染环境的风险最小化。此外，还因为本方法以一步、方便和快速方式实施，多种样品甚至可以通过人工方法处理，并且可以使可能降低再现性的操作数最小化。此外，由于本发明的RNA扩增方法仅扩增RNA，故可以实现精确扩增和测定mRNA，无需RT-PCR中所需的完全除去双链DNA的步骤。总之，本发明的方法适用于高度敏感和快速的表达分析。此外，由于该方法可以在等温和一步方式实施，无需提供如PCR中的热循环机制，并且因此容易自动化。
                                     序  列  表
<110>东曹株式会社
<120>用于测定α1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α4 GnT)mRNA的方法
<130>R779
<150>JP2004-239781
<151>2004-08-19
<160>26
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>1
ggcttcctct accagttcac cctgaagtcc agctgcctct tctgt    45
<210>2
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>2
cactcaggat aaatcttggc agcagactct acggaacagg agaccaaatg gggtggctcc    60
attctctctg ag                                                        72
<210>3
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>3
atgaaaaggc tgcttgaaga cacaccattg ttttcatggt acaatcaaat caacgccagc    60
gcagagagaa actggctcca catc                                           84
<210>4
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>4
tccattacta gagtaccgag aagcctgcgc agccaaaaag ttctcctcag ggatgggcct    60
gatggagatg acatcggtgt ccatgta                                        87
<210>5
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌入性荧光色素标记的核酸探针
<400>5
gccacgtctg tggctcagga gggcttccag cccctggtgg gacttgaaag aaggcaaa    58
<210>6
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌入性荧光色素标记的核酸探针
<400>6
gccaccgtat ttccagatga tggccaggcg ggatgcatcc gagct    45
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>7
accctgaagt ccagctgcct ctt    23
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>8
aaatggggtg gctccattct ctct    24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>9
cagactctac ggaacaggag acca    24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>10
cactcaggat aaatcttggc agca    24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>11
atgaaaaggc tgcttgaaga caca    24
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>12
cattgttttc atggtacaat caa    23
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一引物
<400>13
gcagagagaa actggctcca cat    23
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>14
ggagatgaca tcggtgtcca tgta    24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>15
agttctcctc agggatgggc ctga    24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>16
cctgcgcagc caaaaagttc tcct    24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二引物
<400>17
cattactaga gtaccgagaa gcct    24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌入性荧光色素标记的核酸探针
<400>18
tggtgggact tgaaagaagg caaa    24
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌入性荧光色素标记的核酸探针
<400>19
ccacgtctgt ggctcaggag ggct    24
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌入性荧光色素标记的核酸探针
<400>20
gtctgtggct caggagggct    20
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌入性荧光色素标记的核酸探针
<400>21
tttccagatg atggccaggc ggga    24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切割用寡核苷酸
<400>22
cagggtgaac tggtagagga agcc    24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切割用寡核苷酸
<400>23
tttcatatcc aaagggaaga ggaa    24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切割用寡核苷酸
<400>24
caatggtgtg tcttcaagca gcct    24
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>切割用寡核苷酸
<400>25
ctctgcgctg gcgttgattt gatt    24
<210>26
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T7聚合酶启动子序列
<400>26
aattctaata cgactcacta tagggaga    28

Claims (7)

1.用于测定存在于样品中的α1，4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α4GnT)mRNA的方法，该方法包括：
(1)使用与所述RNA的特定碱基序列5’末端下游的至少部分同源的第一引物和与所述特定碱基序列3’末端上游的至少部分互补的第二引物，以形成含有启动子序列和该启动子序列下游的前述特定碱基序列的双链DNA的步骤，其中所述第一引物和第二引物中的至少一方在5’末端具有启动子序列，
(2)使用所述双链DNA作为模板形成RNA转录产物的步骤；
(3)接下来使用所述RNA转录产物作为DNA合成的模板，在链式反应中扩增RNA转录产物的步骤；和
(4)测定所述RNA转录产物的量的步骤。
2.根据权利要求1的用于测定α4GnT mRNA的方法，其特征在于使用了这样的组合，其中第一引物包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个连续碱基，且第二引物包含SEQ ID NO：2所示序列的至少15个碱基；或者使用了这样的组合，其中第一引物包含SEQ ID NO：3所示序列的至少15个连续碱基，且第二引物包含SEQ ID NO：4所示序列的至少15个碱基。
3.根据权利要求1的用于测定α4GnT mRNA的方法，其特征在于通过测定核酸探针在荧光特性上的变化实现测定所述RNA转录产物的量，所述核酸探针以嵌入性色素标记并如此设计从而当其与靶核酸形成互补双链时嵌入性荧光色素部分通过嵌入互补双链部分而在荧光特性上发生改变。
4.根据权利要求3的用于测定α4GnT mRNA的方法，其特征在于使用了这样的组合，其中第一引物包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个连续碱基，第二引物包含SEQ ID NO：2所示序列的至少15个碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针包含SEQ ID NO：5所示序列或与该序列互补序列的至少15个碱基；或者使用了这样的组合，其中第一引物包含SEQ ID NO：3所示序列的至少15个连续碱基，第二引物包含SE Q ID NO：4所示序列的至少15个碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针包含SEQ ID NO；6所示序列或与该序列互补序列的至少15个碱基。
5.α4GnT mRNA的测定试剂，其特征在于构成要素为包含如下组合的寡核苷酸：其中第一引物包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个连续碱基，且第二引物包含SEQ ID NO：2所示序列的至少15个连续碱基；或者其中第一引物包含SEQ ID NO：3所示序列的至少15个连续碱基，且第二引物包含SEQ ID NO：4所示序列的至少15个连续碱基；其中第一引物和第二引物的至少之一在5’末端具有启动子序列。
6.α4GnT mRNA的测定试剂，其特征在于构成要素为包含如下组合的寡核苷酸：其中第一引物包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个连续碱基，第二引物包含SEQ ID NO：2所示序列的至少15个碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针包含SEQ ID NO：5所示序列或与该序列互补序列的至少15个碱基；或者其中第一引物包含SEQ ID NO：3所示序列的至少15个连续碱基，第二引物包含SEQ ID NO：4所示序列的至少15个碱基，并且嵌入性荧光色素标记的核酸探针包含SEQ ID NO：6所示序列或与该序列互补序列的至少15个碱基；其中第一引物和第二引物的至少之一在5’末端具有启动子序列。
7.对α4GnT mRNA或其互补链特异的寡核苷酸，其特征在于包含任一SEQ ID NO：1-6所示碱基序列或该序列互补序列的至少15个连续碱基。
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