KR20070048784A - α 1, 4-Ｎ-아세틸 글루코사민 전이효소 (α4ＧｎＴ)ｍＲＮＡ의 측정 방법 - Google Patents

α 1, 4-Ｎ-아세틸 글루코사민 전이효소 (α4ＧｎＴ)ｍＲＮＡ의 측정 방법 Download PDF

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Abstract

시료 중에 존재하는 α1, 4-N-아세틸 글루코사민 전이효소(α4GnT) mRNA의 측정 방법으로서,
(1) 상기 RNA의 특정 염기서열의 5’말단으로부터 하류의 적어도 일부에 상동인 제1 프라이머 및 상기 특정 염기서열의 3’말단으로부터 상류의 적어도 일부에 상보적인 제2 프라이머에 의해 프로모터 서열과 상기 프로모터 서열 하류에 상기 특정 염기서열을 포함하는 2본쇄 DNA를 생성하는 공정, 여기에서 상기 제1 및 제2 프라이머의 적어도 일방은 5’말단에 프로모터 서열을 가지며,
(2) 상기 2본쇄 DNA를 주형으로 하여 RNA 전사 산물을 생성하는 공정,
(3) 상기 RNA 전사 산물이 계속해서 DNA 합성의 주형이 됨으로써 연쇄적으로 상기 RNA 전사 산물이 증폭하는 공정 및
(4) 상기 RNA 전사 산물량을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 α4GnT mRNA의 측정 방법을 제공한다.
α1, 4-N-아세틸 글루코사민 전이효소, α4GnT, mRNA 측정 방법

Description

α 1, 4-Ｎ-아세틸 글루코사민 전이효소 (α4ＧｎＴ) ｍＲＮＡ의 측정 방법 {METHOD OF ASSAYING α1, 4-N-ACETYLGLUCOSAMINE TRANSFERASE (α4GnT) mRNA}
본 발명은 간편하고, 일정 온도에서 1단계로 신속히 α1, 4-N-아세틸 글루코사민 전이효소(α4GnT) mRNA를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 의학, 특히 임상진단 분야에 속하고, 암의 조기진단, 치료의 모니터링, 예후 판정, 치료방침 결정의 지표에 유용하다.
α 1, 4-N-아세틸 글루코사민 전이효소(이하, α4GnT라 함)는 N-아세틸 글루코사민 공여체로부터 N-아세틸 글루코사민 수용체 당쇄의 비환원 말단에 존재하는 갈락토오스 잔기에 N-아세틸 글루코사민을 α1, 4 결합으로 전이하는 활성을 가지고, 위 조직에서 발현되고 있음이 밝혀졌다(Nakayama J. et al(1999) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96, 8991-8996 및 Zhang M. X. et al(2001) J. Histochem. Cytochem., 49, 587-596 참조). 이들 문헌에 있어서, α4GnT는 점막세포로부터 분비되는 당 단백의 0-글리칸 말단에 존재하는 특징적인 GlcNAcα1→4Galβ→R 구조의 생합성에 관여하는 것이 보고되어 있다. 또한 이들 문헌에 있어서, 상기 GlcNAcα1→4Galβ→R는 위암의 종상(腫傷) 관련 당쇄 항원으로 되어 있고, 전상기α4GnT가 위암 세포에서 고빈도로 발현되고 있음이 발견되었다.
최근, RT-PCR을 사용하여 말초혈의 단핵구 획분의 α4GnT 메신저 RNA(mRNA)의 측정에 의해 위암, 췌장암, 유두암, 담관암에서 α4GnT mRNA 레벨의 상승이 인지되고 있으며 나아가 조기 스테이지의 위암이 검출 가능함이 나타났다(일본국 공개특허공보 특개 2001-46077호 및 Shimizu F. et al(2003) Lab. Invest., 83, 1 87-197 참조). 즉, 이상의 지견은 α4GnT mRNA의 측정이 위암 등의 조기진단, 치료 효과의 모니터링, 예후 예측 등에 유효함을 시사하고 있다.
α4GnT mRNA을 고감도로 측정하는 수단으로서 α4GnT mRNA를 RT-PCR로 증폭하고, 증폭 산물량을 측정하는 방법을 들 수 있지만, 이 경우 일반적으로는 역전사(RT) 공정 및 PCR 공정의 2단계 공정이 필요하고, 이것은 조작을 번잡하게 해서 재현성을 악화시키는 요인이 될 뿐만 아니라, 이차오염의 위험성도 증가시키게 된다. 상기 RT 공정 및 PCR 공정을 합하면 일반적으로 2시간 이상의 시간을 요하고, 다수 검체 처리나 검사 비용의 저감에는 부합하지 않았다.
표적 RNA의 정량법으로서는 PCR 공정을 인터칼레이터성 형광색소 존재 하에서 실시하여 형광증가를 측정하는 Real-time RT-PCR 법이 범용되어 있지만, 상기 방법에서는 프라이머다이머 등의 비특이 증폭 산물도 검출해 버리는 문제도 있다. 또한 RT-PCR에서는 DNA도 증폭해 버리기 때문에 mRNA 만을 증폭하는 경우에는 핵산 추출 공정에 있어서 DNase 처리 등에 의해 염색체 DNA를 완전하게 제거할 필요가 있어 핵산추출 조작의 번잡화를 초래하였다. 나아가, PCR은 급격하게 반응온도를 승강시킬 필요가 있어 자동화 경우의 반응장치의 절력화나 저비용화를 위한 장벽이 되고 있다.
한편, RNA 만을 증폭하는 방법으로서는, NASBA법(특허 2650159호 및 특허 3152927호 참조) 및 TMA법(특허 3241717호 참조) 등이 보고되어 있다. 상기 RNA 증폭 방법은 표적이 되는 RNA에 대하여 프로모터 서열을 포함하는 프라이머, 역전사 효소 및 필요에 따라 리보뉴클레아제 H(RNase H)에 의해 프로모터 서열을 포함하는 2본쇄 DNA를 합성하고, RNA 중합효소에 의해 표적이 되는 RNA의 특정 염기 서열을 포함하는 RNA를 합성하고, 상기 RNA가 계속해서 프로모터 서열을 포함하는 2본쇄 DNA 합성의 주형이 되는 연쇄반응을 행하는 것이다. 그리고, RNA 증폭 후, 전기영동 또는 검출가능한 표지를 결합시킨 핵산 프로브를 채용한 혼성화법 등에 의해 증폭된 RNA를 검출한다.
이상과 같이 상기 RNA 증폭 방법은 일정 온도, 1단계로 RNA 만을 증폭하므로 간편한 mRNA 측정에 적합하지만, 혼성화법 등에 의한 검출은 번잡한 조작을 필요로 하고 재현성이 높게 정량할 수 없다고 하는 과제가 있다.
간편하게 mRNA를 증폭 및 측정하는 방법으로서는, 일본국 공개특허공보 특개2000-14400호 및 Ishiguro T. et al(2003) Anal. Biochem., 314, 77-86에 기재된 방법을 들 수 있다. 상기 방법은 인터칼레이터성 형광색소로 표지된 핵산 프로브로 표적 핵산과 상보적 2본쇄를 형성하면, 인터칼레이터성 형광색소부분이 상기 상보적 2본쇄 부분에 인터칼레이트 함으로써 형광특성이 변화되도록 설계된 핵산 프로브의 존재 하에서, 상기 RNA 증폭 방법을 실시하고, 형광특성의 변화를 측정하는 것으로, 간편하고 일정 온도에서 1단계로 밀폐용기 내에서 RNA 증폭 및 측정을 동시에 실시하는 것이 가능하다.
발명의 개시
α4GnT mRNA의 측정은 위암, 췌장암 및 기타 암을 빠른 시기에 진단하기 위해서 유용하지만, RT-PCR를 이용한 경우에는, 2단계 공정이 필요하여 조작이 번잡하고, 급격한 반응온도의 승강이 필요한 등의 과제가 있어, 이들은 이차오염의 위험성 및 재현성 불량을 초래하는 동시에 간편한 측정이나 자동화로의 전개에 대한 장벽이 되어 왔다.
본 발명은, 상기 과제를 극복하여 간편하고, 신속하며, 일정 온도에서 또한 1단계로 상기α4GnT mRNA를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 상기RNA 증폭 방법을 적용하여 간편하고, 신속하며, 일정 온도에서 또한 1단계의 α4GnT mRNA 측정 방법을 구축하였다. 즉, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 (적어도 일방의 5’말단에 프로모터 서열을 가진다)에 의해 프로모터 서열을 포함하는 2본쇄DNA를 생성하고, 상기 2본쇄 DNA를 주형으로 하여 RNA 전사 산물을 생성하고, 상기RNA 전사 산물이 계속해서 상기 DNA 합성의 주형이 되어 상기 2본쇄 DNA를 생성하는 RNA 증폭 공정에 있어서 증폭된 RNA 생산량을 측정함으로써, α4GnT mRNA를 간편하고 일정 온도에서 또한 1단계로 측정하는 것이 가능해졌다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 시료 중에 존재하는 α4GnT mRNA의 측정방법으로, 상기 RNA의 특정 염기서열의 5’말단으로부터 하류의 적어도 일부에 상동인 제1 프라이머 및 상기 특정 염기서열의 3’말단으로부터 상류의 적어도 일부에 상보적인 제2 프라이머(상기 제1 및 제2 프라이머의 적어도 일방은 5’말단에 프로모터 서열을 가진다)에 의해 프로모터 서열과 상기 프로모터 서열 하류에 상기 특정 염기서열을 포함하는 2본쇄 DNA를 생성하는 공정, 상기 2본쇄 DNA를 주형으로 하여 RNA 전사 산물을 생성하는 공정, 상기 RNA 전사 산물이 계속해서 상기 DNA 합성의 주형이 되어 상기 2본쇄 DNA를 생성하는 공정, 이상의 각 공정이 동시에 진행하는 조건으로 상기 공정이 되풀이되는 핵산 증폭 공정, 상기 RNA 전사 산물량을 측정하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명중의 시료로는 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 암 세포의 존재가 의심되는 세정액 등의 검체로부터 기지의 방법에 의해 추출된 핵산이다.
본 발명 중의 특정 염기서열은 α4GnT mRNA의 적어도 일부의 서열 혹은 상기서열의 상보 서열로 이루어지고, 제1 프라이머 및 제2 프라이머에 의해 규정되는 영역의 서열을 가진다.
본 발명에서는 상기 특정 염기서열에서 유래하는 RNA 전사 산물이 증폭된다.제1 프라이머에 프로모터 서열이 부가될 경우, α4GnT mRNA는 cDNA 합성의 주형이 되기 전에 특정 핵산 서열의 5’말단에서 절단되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 절단 방법은 특별하게 한정되는 것은 아니지만, α4GnT mRNA의 특정 염기서열의 5’말단에 중복해서 인접하는 영역에 대하여 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드(절단용 올리고뉴클레오티드)를 첨가함으로써 형성된 RNA-DNA 하이브리드의 RNA 부분을 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성을 가지는 효소 등에 의해 절단하는 방법이 바람직하고, 상기 절단용 올리고뉴클레오티드의 3’말단-0H는 신장 반응을 방지하기 위해서 적당한 수식이 구비된 것, 예를 들면 아미노화 등이 되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명 중의 표적 핵산은 상기 특정 염기서열에 있어서, 제1 및 제2 프라이머에 상동 혹은 상보적이 아닌 영역을 나타내고, 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브와의 상보적 결합이 가능한 서열을 가진다. 따라서, 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 본 발명 중의 특정 염기서열의 일부와 상보적인 서열이 된다. 그 때문에 예를 들면 본 발명의 일 태양으로서, 특정 염기서열이 α4GnT mRNA와 상동인 서열인 경우에는 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 서열번호 5에 나타낸 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함하는 서열을 가지고, 특정 염기서열이 α4GnT mRNA와 상보적인 서열의 경우에는, 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 서열번호 5에 나타낸 서열의 상보 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함하는 서열을 가진다고 하는 태양을 들 수 있다.
본 발명 중의 제1 및 제2 프라이머는 적어도 일방의 5’말단에 프로모터 서열을 가지고 있다. 즉 제1 및 제2 프라이머의 일방에 프로모터 서열이 있으면 충분하지만, 양쪽에 있어도 문제는 없다. 또한 제1 프라이머는 α4GnT mRNA의 상보 서열에 대하여, 제2 프라이머는 α4GnT mRNA에 대하여 각각 충분하게 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 충분하게 상보적이라 함은, 본 발명의 핵산증폭 공정의 반응 조건(반응 온도 및 염 등의 조성)에 있어서 상기 특정 염기서열 혹은 상기 서열의 상보 서열에 대하여 상보적 결합이 가능한 것을 가리킨다. 이러한 반응 조건은, 예를 들면 60mM의 Tris, 17mM의 염화마그네슘, 100mM의 염화칼륨, lmM의 DTT의 존재 하, 43℃에서의 혼성화 조건이면 좋다.
또한, 상기 제1 프라이머는 α4GnT mRNA의 상보 서열에 대하여, 상기 제2 프라이머는 α4GnT mRNA에 대하여 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 표적핵산에 대하여, 각각 충분하게 상보적이기 위하여 상기 제1 프라이머는 서열번호 1 또는 3에 나타내는 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기를 포함하는 것, 상기 제2 프라이머는 서열번호 2 또는 4에 나타내는 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기를 포함하는 것, 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 서열번호 5 또는 6에 나타내는 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기를 포함하는 것이 각각 바람직하다.
그리고, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1에 나타내는 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 보다 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 2에 나타내는 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브가 서열번호 5에 나타낸 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기를 각각 포함하는 서열의 조합이던지 또는, 상기 제1 프라이머가 서열번호 3에 나타내는 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 4에 나타내는 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브가 서열번호 6에 나타낸 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 바람직하게는 적어도 연속한 15 염기, 더 바람직하게는 적어도 연속한 20 염기를 각각 포함하는 서열의 조합인 것이 바람직하다. 이들의 조합은 α4GnT mRNA에 상보적 결합하는 서열의 위치 관계에 따라 바람직한 태양이 되지만, 다른 조합에서도 α4GnT mRNA의 증폭, 측정은 가능하다.
또는, 상기의 제1 프라이머, 제2 프라이머 및 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 각각 서열번호 1 또는 3, 서열번호 2 또는 4 및 서열번호 5 또는 6에 나타내는 서열의 상보 사슬에 대하여 고 스트린젠트 조건 하에서, 예를 들면 본 발명의 핵산증폭 공정의 상기 반응 조건하에서 혼성화하는 염기서열을 가지고 있는 것이 좋다.
본 발명 중의 프로모터 서열은 RNA 중합효소가 결합하여 전사를 시작하는 서열이며, RNA 중합효소의 종류에 대응하는 특이 서열이 이미 알려져 있다. 이러한 RNA 중합효소는 특별하게 한정되는 것은 아니지만, 범용되어 있는 T7 파지 RNA 중합효소, T3 파지 RNA 중합효소, SP6 파지 RNA 중합효소 등이 바람직하며, 이들에 대응하는 프로모터 서열이 사용가능하다.
본 발명 중의 α4GnT mRNA의 측정 방법에 있어서, 각 효소(1본쇄 RNA를 주형으로 하는 RNA 의존 DNA 중합효소 활성을 가지는 효소(역전사 효소), RNase H 활성을 가지는 효소, 1본쇄 DNA를 주형으로 하는 DNA 의존 DNA 중합효소 활성을 가지는 효소 및 RNA 중합효소 활성을 가지는 효소)가 필요하게 된다.
각 효소는 몇 개의 활성을 겸비하는 효소를 사용해도 좋고, 각각의 활성을 가지는 복수의 효소를 사용해도 좋다. 또한 예를 들면, 1본쇄 RNA를 주형으로 하는 RNA 의존 DNA 중합효소 활성, RNase H 활성 및 1본쇄 DNA를 주형으로 하는 DNA 의존 DNA 중합효소 활성을 겸비하는 역전사 효소에, RNA 중합효소 활성을 가지는 효소를 첨가할 뿐만 아니라, 필요에 따라 RNase H 활성을 가지는 효소를 더 첨가해서 보충하는 것 등도 가능하다. 상기 역전사 효소에는, 범용성으로부터 AMV 역전사 효소, M-MLV 역전사 효소 및 이들의 유도체가 특히 바람직하다.
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 존재 하에서 역전사 반응을 실시하면, 제2 프라이머가 α4GnT mRNA 내의 특정 염기서열에 결합하여 RNA 의존 DNA 중합효소 활성을 가지는 효소에 의해 cDNA 합성이 행하여진다. 얻어진 RNA-DNA 하이브리드는 RNase H 활성을 가지는 효소에 의해 RNA 부분이 분해되고, 분해함에 따라 제1 프라이머가 상기 cDNA에 결합한다.
계속하여 DNA 의존 DNA 중합효소 활성을 가지는 효소에 의해 특정 염기서열 유래로 5’말단에 프로모터 서열을 가지는 2본쇄 DNA가 생성된다. 상기 2본쇄 DNA는 프로모터 서열 하류에 특정 염기서열을 포함하고, RNA 중합효소 활성을 가지는 효소에 의해 특정 염기서열에서 유래하는 RNA 전사 산물을 생산한다. 상기 RNA 전사 산물은, 상기 제1 및 제2 프라이머에 의한 상기 2본쇄 DNA 합성을 위한 주형이 되어 일련의 반응이 연쇄적으로 진행하고, 상기 RNA 전사 산물이 증폭되어 간다.
이러한 연쇄반응을 진행시키기 위해서, 상기 각 효소에 필수적인 기지의 요소로서 적어도, 완충제, 마그네슘 염, 칼륨 염, 뉴클레오시드 3인산, 리보뉴클레오시드―3인산을 포함하는 것은 말할 필요도 없다. 또한 반응 효율을 조절하기 위한 첨가제로서 디메틸술폭시드(DMSO), 디티오스레이톨(DTT), 소혈청 알부민(BSA), 당 등을 첨가하는 것도 가능하다.
예를 들면, AMV 역전사 효소 및 T7 RNA 중합효소를 사용하는 경우에는 35℃∼65℃의 범위에서 반응온도를 설정하는 것이 바람직하고, 40℃∼44℃의 범위에서 설정하는 것이 특히 바람직하다. 상기 RNA 증폭 공정은 일정 온도에서 진행하고, 역전사 효소 및 RNA 중합효소가 활성을 나타내는 임의의 온도로 반응온도를 설정하는 것이 가능하다.
증폭된 RNA 전사 산물량은 기지의 핵산측정법에 의해 측정하는 것이 가능하다. 이러한 측정 방법으로서는, 전기영동이나 액체크로마토그래피를 이용한 방법, 검출가능한 표지로 표지된 핵산 프로브에 의한 혼성화법 등을 이용할 수 있다.
그러나, 이들 조작은 다공정이며, 또 증폭 산물을 계외(係外)에 꺼내서 분석하기 위해서 이차오염의 원인이 되는 증폭 산물의 환경에의 비산(飛散) 위험성이 크다.이들 과제를 극복하기 위해서는 표적 핵산과 상보 결합함으로써 형광특성이 변화되도록 설계된 핵산 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 한층 더 바람직한 방법으로서, 인터칼레이터성 형광색소로 표지된 핵산 프로브로 표적 핵산과 상보적 2본쇄를 형성하면 인터칼레이터성 형광색소 부분이 상기 상보적 2본쇄 부분에 인터칼레이트 함으로써 형광특성이 변화되도록 설계된 핵산 프로브의 존재 하, 상기 핵산 증폭 공정을 실시하고, 형광특성의 변화를 측정하는 방법을 들 수 있다 (일본국 공개특허공보 특개 2000-14400호 및 Ishiguro T. et al (2003) 전술 참조).
상기 인터칼레이터성 형광색소로서는 특별하게 한정되지 않지만 범용되어 있는 옥사졸 옐로우, 티아졸오렌지, 에티디움브로마이드 및 이들의 유도체 등을 이용할 수 있다. 상기 형광특성의 변화로서는 형광강도의 변화를 들 수 있다. 예를 들면 옥사졸 옐로우의 경우, 2본쇄 DNA에 인터칼레이트 함으로써 510nm의 형광(여기파장 490nm)이 현저하게 증가하는 것이 이미 알려져 있다. 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브는 상기 RNA 전사 산물에 대하여 충분하게 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 말단 혹은 인산 디에스테르 부분 혹은 염기 부분에 적당한 링커를 개재하여 인터칼레이터성 형광색소가 결합되고 나아가, 3’말단-0H으로부터의 신장을 방지할 목적으로 상기 3’말단-0H가 적당한 수식이 되어 있는 구조를 가진다 (일본국 공개특허공보 특개평 8-211050호 및 Ishiguro T. et al (1996) 전술).
올리고뉴클레오티드로의 인터칼레이터성 형광색소의 표지는 기지의 방법으로 올리고뉴클레오티드에 관능기를 도입하고, 인터칼레이터성 형광색소를 결합시키는 것이 가능하다 (일본국 공개특허공보 특개 2001-13147호 및 Ishiguro T. et a1 , (1996) 전술 참조). 또한, 상기 관능기의 도입방법으로서는 범용되어 있는 Label-ON Reagents(Clontech 사제) 등을 이용하는 것도 가능하다.
본 발명의 일 태양으로서, 시료에 적어도 5’말단에 T7 프로모터 서열을 가지는 제1 프라이머(서열번호 1에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함한다), 제2 프라이머(서열번호 2에 나타내는 적어도 연속한 15 염기를 포함한다), 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브(서열번호 5에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함한다), 절단용 올리고뉴클레오티드(서열번호 22에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함하고, 특정 염기서열의 5’말단과 중복해서 인접하는 영역에 대하여 상보적인 서열을 가진다), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충제, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드―3인산, 리보뉴클레오시드―3인산, 디메틸술폭시드(DMSO)를 포함하는 증폭 시약을 첨가하고, 반응온도 35∼65℃（바람직하게는 40∼44℃）의 일정 온도에서 반응시킴과 동시에 반응액의 형광강도를 경시적으로 측정하는 방법을 제공한다.
또한 별개의 태양으로서, 시료에 적어도 5’말단에 T7 프로모터 서열을 가지는 제1 프라이머(서열번호 3에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함한다), 제2 프라이머(서열번호 4에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함한다), 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브(서열번호 6에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함한다), 절단용 올리고뉴클레오티드(서열번호 23∼25에서 선택된 서열의 적어도 연속한 15 염기를 포함하고, 특정 염기서열의 5’말단과 중복하여 인접하는 영역에 대하여 상보적인 서열을 가진다), AMV 역전사 효소, T7 RNA 중합효소, 완충제, 마그네슘염, 칼륨염, 뉴클레오시드-3인산, 리보뉴클레오시드―3인산, 디메틸술폭시드(DMSO)를 포함하는 증폭 시약을 첨가하고, 반응온도 35∼65℃（바람직하게는 40∼44℃）의 일정 온도로 반응시킴과 동시에 반응액의 형광강도를 경시적으로 측정하는 방법을 제공한다.
상기한 각각의 태양 중 어느 쪽의 경우에 있어서도, 형광강도는 초기 RNA량에 상응한 증가 곡선을 나타내는 것으로부터, 기지 농도의 표준 RNA를 사용하여 검량선을 작성함으로써 미지 시료의 초기 RNA량을 정량하는 것도 가능하다. 나아가, 형광강도를 경시적으로 측정하는 것으로부터 유의한 형광증가가 인지되는 임의의 시간에서 측정을 종료하는 것이 가능하고, 핵산 증폭 및 측정을 일반적으로 1시간이내, 최적의 계에서는 30분 이내에 측정 결과를 얻는 것이 가능하다.
또한 상기 측정 시약에 포함되는 모든 시료를 단일 용기에 봉입가능한 점은 특필해야 한다. 다시 말해, 일정량의 시료를 관계된 단일용기에 분주하는 조작만 실시하면, 그 후는 자동적으로 α4GnT mRNA를 증폭하여 검출할 수 있다. 이 용기는 예를 들면 형광색소가 발하는 신호를 외부에서 측정 가능하게, 적어도 그 일부분이 투명한 재료로 구성되어 있으면 좋고, 시료를 분주한 후에 밀폐하는 것이 가능한 것은 컨태미네이션의 방지 차원에서 특히 바람직하다.
상기 태양의 RNA 증폭·측정 방법은, 1단계로 일정 온도에서 실시가능하기 때문에, RT-PCR과 비교해서 간편하고 자동화에 적합한 방법이라고 할 수 있다. 그러나, 한편으로 RT-PCR과 같은 열변성 및 어닐링을 실시하지 않고, 35∼65℃ 라는 비교적 저온의 일정 온도로 반응시키기 때문에 프라이머다이머 등의 비특이 증폭 산물이나 표적 RNA의 고차구조의 영향을 받기 쉽고, 측정계를 구축하기에는 RT-PCR의 경우와 비교하여 지극히 면밀한 설계가 필요해서, 상기 RNA 증폭·측정 방법을 이용한 신속하고, 간편하며, 일정 온도의 또한 1단계의 α4GnT mRNA 측정은 아직도 실현되지 않고 있다. 본 발명에 의해 α4GnT mRNA를 고특이성, 고감도로 신속, 간편하게 일정 온도로 또한 1단계로 측정하는 것이 처음으로 가능해졌다.
본 발명은 위암, 췌장암 및 기타 암의 조기진단, 화학요법 등의 치료 효과 모니터링, 미소전이 진단, 예후 예측 및 치료 방침 결정을 위한 지표로서 적용하는 것이 가능하다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
α4GnT RNA는 SP6 파지 RNA 중합효소·프로모터 하류에 α4GnT cDNA(염기번호 7∼1242를 포함한다. 염기번호는 National Center Biotechnology Information accession No. AF141315를 따랐다)를 가지는 2본쇄 DNA를 주형으로 하여 in vitro 전사를 실시하고, 계속하여 DNase I 처리에 의해 상기 2본쇄 DNA를 완전 소화한 후 RNA를 정제하여 조제하였다. 상기 RNA는 260nm에 있어서의 흡광도를 측정해서 정량하였다.
이하의 실시예에서는 상기 RNA를 측정 대상으로 하고 있지만, 본 발명의 측정 대상인 α4GnT mRNA의 측정에 충분히 적용가능하다.
실시예 2
인터칼레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 제작하였다. 서열번호 18, 19 및 21에 기재된 서열의 5’말단으로부터 13번째의 염기(서열번호 18에 있어서는 A, 서열번호 19에 있어서는 C, 서열번호 21에 있어서는 G)의 위치에 Labe1-ON Reagents(Clontech 사제)를 이용해서 아미노기를 도입하고, 또 3’말단을 비오틴으로 수식했다. 상기 아미노기에 Ishiguro T. et al, (1996) 에 기재된 방법으로 옥사졸 옐로우를 결합시켰다 (도 1B). 또한 Ishiguro T. et al (1996) 에 기재된 방법으로, 서열번호 20에 기재된 서열의 5’말단으로부터 9번째의 C과 10번째의 T의 사이의 인산 디에스테르 부분에 링커를 개재하여 옥사졸 옐로우를 결합시킨 옥사졸 옐로우 표지 핵산 프로브를 조제하였다 (도 1A).
실시예 3
본원발명의 방법을 이용하여 각종 초기 카피수의 α4GnT RNA를 검출하였다.
(1) 상기α4GnT RNA(염기번호 7∼1242를 포함한다)를 RNA 희석액(10mM Tris·HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.25 U/μ1 리보뉴클레아제·인히비터, 5mM DTT)을 이용하여 25, 50, 100, 1000 카피/5μ1이 되도록 각각 희석하고, RNA 시료로 이용하였다. 음성 표준(0 카피)은 RNA 희석액을 이용하였다.
(2) 이하 조성의 반응액 20μl을 0.5 ml 용량 PCR용 튜브(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨엘머사 제)에 분주하고, 이것에 상기 RNA 시료 5μ1을 첨가했다.
반응액의 조성: 농도는 효소액 첨가 후 (30μl 중)의 최종 농도
60mM Tris HCl(pH 8.6)
17mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
각 0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
각 3mM ATP, CTP, UTP
2.25mM GTP
3.6mM ITP
1μM의 제1 프라이머(서열번호 7): 제1 프라이머는 서열번호 기재의 염기서열의 5’말단에 T7 중합효소 프로모터 서열(서열번호 26)이 부가된다
1μM 제2 프라이머(서열번호 8)
25nM 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브(서열번호 19): 상기 핵산 프로브는 실시예 2에서 Label-ON Reagents를 이용하여 조제한 것
0.16μM 절단용 올리고뉴클레오티드(서열번호 22): 상기 올리고뉴클레오티드의 3’말단-0H는 아미노기로 수식
6U/30μl 리보뉴클레아제·인히비터 (다카라 바이오사제)
13% DMSO.
(3) 상기의 반응액을 43℃에서 5분간 보온 후, 이하의 조성으로 미리 43℃에서 2분간 보온한 효소액 5μl을 첨가하였다.
효소액의 조성: 반응시(30μl 중)의 최종 농도
2％ 소르비톨
8U/30μl AMV 역전사 효소(다카라 바이오사제)
142U/30μl T7 RNA 중합효소(GIBCO제)
3.6μg/30μl 소혈청 알부민.
(4) 계속하여 PCR 튜브를 직접 측정가능한 온도 조절기능 부착 형광분광광도계를 이용하여 43℃에서 반응시킴과 동시에 반응 용액의 형광강도(여기파장 470nm, 형광파장 520nm)을 경시적으로 측정하였다. 효소첨가시를 0분으로 하고, 반응액의 형광강도비(소정시간의 형광강도값÷백그라운드의 형광강도값)의 시간에 따른 변화를 도 2에 나타냈다. 도 2의 결과에서는 α4GnT RNA의 초기 농도에 의존한 형광 프로파일이 얻어지고, 25 카피/테스트의 α4GnT RNA가 약 12분에서 검출할 수 있었다. 이상은 본 발명의 방법에 의하면 α4GnT RNA를 고감도로 신속히 정량가능한 것을 나타내고 있다.
실시예 4
본원발명의 방법에 있어서, 각종 조합의 제1 프라이머, 제2 프라이머, 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브, 절단용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 α4GnT RNA의 측정을 행하였다.
(1) 상기α4GnT RNA(염기번호 7∼1242을 포함한다)을 RNA 희석액(10mM Tris·HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.25 U/μl 리보뉴클레아제·인히비터, 5.OmM DTT)을 이용하여 103 혹은 102 카피/5μl이 되도록 희석하고, RNA 시료로 이용하였다.
(2) 이하 조성의 반응액 20μl을 0.5ml 용량 PCR용 튜브(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨엘머사 제)에 분주하고, 이것에 상기 RNA 시료 5μl을 첨가하였다.
반응액의 조성: 농도는 효소액 첨가 후 (30μ1 중)의 최종 농도
60mM Tris HCl(pH 8.6)
17mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
각 0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
각 3mM ATP, CTP, UTP
2.25mM GTP
3.6mM ITP
1μM 제1 프라이머(서열번호는 표 1에 기재): 제1 프라이머는 서열번호 기재의 염기서열의 5’말단에 T7 중합효소 프로모터 서열(서열번호 26)이 부가되어 이루어진다
1μM 제2 프라이머(서열번호는 표 1에 기재)
25nM 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브(서열번호는 표 1에 기재): 상기 핵산 프로브는 실시예 2에서 조제한 것
0.16μM 절단용 올리고뉴클레오티드(서열번호는 표 1에 기재): 상기 올리고뉴클레오티드의 3’말단-0H는 아미노기로 수식
6U/30μl 리보뉴클레아제·인히비터(다카라 바이오사제)
13% DMSO
(3) 상기의 반응액을 43℃에서 5분간 보온 후, 이하의 조성으로 미리 43℃에서 2분간 보온한 효소액 5μl을 첨가하였다.
효소액의 조성: 반응시(30μ1 중)의 최종 농도
2％ 소르비톨
8U/30μl AMV 역전사 효소(다카라 바이오사제)
142U/30μl T7 RNA 중합효소(GIBCO제)
3.6μg/30μ1 소혈청 알부민.
(4) 계속하여 PCR 튜브를 직접 측정가능한 온도 조절기능 부착 형광분광광도계를 이용하여, 43℃에서 반응시킴과 동시에 반응 용액의 형광강도(여기파장 470nm, 형광파장 520nm)를 경시적으로 측정하였다. 효소첨가시를 O분으로 하고, 반응액의 형광강도비가 1.2를 초과했을 경우를 (+) 판정으로 하여 그때의 시간을 검출 시간으로 한 결과를 표 1에 나타냈다.
표 1에 기재된 제1 프라이머, 제2 프라이머, 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브, 절단용 올리고뉴클레오티드의 조합을 이용한 경우, 103 카피/테스트의 α4GnT RNA가 20분 이내로 검출되었다. 즉, 제1 프라이머로서 서열번호 7로 나타낸 서열 및 제2 프라이머로서 서열번호 8∼10로부터 선택된 서열 및 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브로서 서열번호 18∼20으로부터 선택된 서열 및 절단용 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 22로 나타낸 서열로 이루어지는 조합 또는 제1 프라이머로서 서열번호 11∼13으로부터 선택된 서열 및 제2 프라이머로서 서열번호 14∼17로부터 선택된 서열 및 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브로서 서열번호 21로 나타낸 서열 및 절단용 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 23∼25으로부터 선택된 서열로부터 이루어지는 조합을 채용했을 경우, 모두 α4GnT RNA가 신속히 검출가능했다. 여기에서, 서열번호 7은 서열번호 1의 부분 서열, 서열번호 8∼10의 각각은 서열번호 2의 부분 서열, 서열번호 18∼20은 각각 서열번호 5의 부분 서열, 서열번호 11∼13의 각각은 서열번호 3의 부분 서열, 서열번호 14∼17의 각각은 서열번호 4의 부분 서열, 서열번호 21에 나타낸 서열은 서열번호 6의 부분 서열이다. 이상으로부터 본 발명에 기재된 제1 프라이머, 제2 프라이머, 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브를 이용한 RNA 증폭·측정법에 의해 α4GnT RNA가 신속히 검출 가능함이 나타났다.
각종 조합의 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우의 측정 결과
올리고뉴클레오티드 조합 측정결과
제1프라이머(서열번호) 제2프라이머(서열번호) 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브 (서열번호) 절단용 올리고뉴클레오티드 (서열번호) 검출시간(분) 판정
7 8 18 22 17.5 +
7 8 19 22 9.5 +
7 8 20 22 7.8 +
7 9 18 22 11.8 +
7 9 19 22 11.6 +
7 10 19 22 13.0 +
11 14 21 23 14.1 +
11 15 21 23 15.9 +
12 14 21 24 13.4 +
12 16 21 24 16.9 +
13 14 21 25 19.9 +
13 15 21 25 17.4 +
13 16 21 25 14.7 +
13 17 21 25 11.6 +
상기 표의 조합의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 103 카피/테스트의 α4GnT RNA를 샘플로 하여 RNA 증폭·형광측정을 실시했다. 형광강도비가 1.2를 넘은 것을 (+)라고 판정하고, 그때의 시간을 검출 시간으로 하였다.
실시예 5
본원발명의 방법을 이용하여 α4GnT RNA를 정량하였다.
(1) 상기α4GnT RNA(염기번호 7∼1242을 포함한다)를 RNA 희석액(10mM Tris·HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.25U/μl 리보뉴클레아제·인히비터, 5.0mM DTT)을 사용하여 102, 103, 104, 105, 106 카피/5μl이 되도록 희석하고, 검량선용 표준 RNA로서 이용하였다. 음성 표준(NEG)은 희석액을 사용하였다. 마찬가지로, 샘플 A(102 카피/5μl), B(103 카피/5μl), C(104 카피/5μl), D(105·카피/5μl), E(106 카피/5μ1)을 조제하였다.
(2) 이하 조성의 반응액 20μl을 0.5ml 용량 PCR용 튜브(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨엘머사 제)에 분주하고, 이것에 상기 표준 RNA 및 샘플 5μl을 각각 첨가하였다.
반응액의 조성: 농도는 효소액 첨가 후 (30μl 중)의 최종 농도
60mM Tris HCl(pH 8.6)
17mM 염화마그네슘
100mM 염화칼륨
1mM DTT
각 0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
각 3mM ATP, CTP, UTP
2.25mM GTP
3.6mM ITP
1μM 제1 프라이머(서열번호 7): 제1 프라이머는 서열번호 기재의 염기서열의 5’말단에 T7 중합효소·프로모터 서열(서열번호 26)이 부가되어 이루어진다
1μM 제2 프라이머(서열번호 8) 25nM의 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브(서열번호 20): 상기 핵산 프로브는 실시예 2에 있어서 인산 디에스테르에 링커를 개재하여 옥사졸 옐로우를 결합시킨 것
0.16μM의 절단용 올리고뉴클레오티드(서열번호 22): 상기 올리고뉴클레오티드의 3’말단-0H는 아미노기로 수식
6U/30μl 리보뉴클레아제·인히비터(다카라 바이오사제)
13% DMSO.
(3) 상기의 반응액을 43℃에서 5분간 보온 후, 이하의 조성으로 미리 43℃에서 2분간 보온한 효소액 5μl을 첨가하였다.
효소액의 조성: 반응시(30μl)의 최종 농도
2％ 소르비톨
8U/30μl AMV 역전사 효소(다카라 바이오사제)
142U/30μl T7 RNA 중합효소(GIBCO 제)
3.6μg/30μl 소혈청 알부민.
(4) 계속하여 PCR 튜브를 직접 측정가능한 온도 조절기능 부착 형광분광광도계를 이용하여 43℃에서 반응시킴과 동시에 반응 용액의 형광강도(여기파장 470nm, 형광파장 520nm)를 경시적으로 측정하였다. 효소첨가시를 0분으로 하고, 반응액의 형광강도비(소정 시간의 형광강도값÷백그라운드의 형광강도값)의 시간에 따른 변화를 도 3에 나타냈다.
도 3의 결과에 있어서, 형광강도비가 1.2에 달하는 시간을 검출 시간으로 해서 상기 검출 시간과 초기 카피수의 대수값으로부터 작성한 검량선을 도 4에 나타냈다. 나아가, 상기 검량선으로부터 샘플 A, B, C, D, E의 카피수를 정량한 결과를 표 3에 나타냈다.
도 4의 결과에서는 102 카피/테스트가 약 10 분에서 검출되고 있고, 검출 시간과 초기 카피수의 대수값과의 사이에 양호한 상관성이 얻어졌다. 또한, 표 3의 결과에 있어서, 샘플 A, B, C, D, E의 정량결과는 α4GnT RNA의 첨가량에 상당하는 값을 얻을 수 있었다. 이상에서 본 발명의 방법에 의해 α4GnT RNA를 신속, 고감도로 특이적으로 정량가능함이 나타났다.
α4GnT RNA의 정량결과
샘플 측정결과
검출시간(분) 카피수/테스트
A 9.09 5.8 × 10
B 7.85 1.3 × 103
C 7.00 1.4 × 104
D 6.48 7.7 × 104
E 5.90 6.6 × 105
샘플 A(102 카피/5μ1), B(103 카피/5μ1), C(104 카피/5μ1), D(105 카피/5μ1), E(106 카피/5μ1)의 측정 결과의 형광 프로파일로부터 얻어진 검출 시간과 도 4의 검량선으로부터 카피수를 산출한 결과.
도 1은 실시예 2에서 제작한 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브의 구조를 나타낸다. B1, B2, B3, B4은 염기를 나타낸다.
A) Ishiguro 등(Ishiguro T, et al (1996) Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997 참조)의 방법을 따라 인산 디에스테르 부분에 링커를 개재시켜 인터칼레이터성 형광색소(옥사졸 옐로우)를 결합시킨 프로브. 또한, 3’말단-0H로부터의 신장 반응을 방지하기 위해서 3’말단-0H는 글리콜 산 수식이 되어 있다.
B) 시판되는 Label-ON Reagents(Clontech 사제)을 이용해서 아미노기를 도입하고, Ishiguro 등(Ishiguro T. et a1, (1996) 전술)의 방법에 따라 옥사졸 옐로우를 결합시킨 프로브. 이 경우, 도입 위치(도면 중 B3 부분)의 뉴클레오티드 부분이 결실하여 아미노기가 도입된다. 또한, 3’말단-0H로부터의 신장 반응을 방지하기 위해서 3’말단-0H는 비오틴 수식이 되어 있다.
도 2는 실시예 3의 측정 결과 얻어진 형광 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 RNA 증폭을 행함과 동시에 경시적으로 형광강도(여기광: 470nm, 형광: 520nm)를 측정한 결과. 가로축은 반응시간, 세로축은 형광강도비(반응액의 형광강도/백그라운드 형광)를 나타낸다. 도면 중의 카피수는 1 테스트에 사용한 α4GnT RNA(염기번호 7∼1242을 포함한다)의 초기 카피수(260nm의 흡광도로부터 산출)를 나타낸다.
도 3은 실시예 4의 측정 결과 얻어진 형광 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 RNA 증폭을 행함과 동시에 경시적으로 형광강도(여기광: 470nm, 형광: 520nm)을 측 정한 결과. 가로축은 반응시간, 세로축은 형광강도비(반응액의 형광강도/백그라운드 형광)를 나타낸다. 도면 중 범례의 숫자는 1 테스트에 사용한 α4GnT RNA(염기번호 7∼1242을 포함한다)의 초기 카피수(260nm의 흡광도로부터 산출)를 나타낸다.
도 4는 도 3의 결과로부터 얻어진 검량선을 나타낸다. 도 3의 결과에 있어서, 형광강도비가 1.2에 달하는 시간을 검출시간으로 하고 표준 RNA의 초기 카피수의 대수값에 대한 검출 시간을 플롯팅 하였다. 도면 중의 식은 1차 회귀식과 상관계수를 나타냈다. 본 검량선과 본 방법에 의해 얻어진 미지 시료의 검출 시간으로부터 미지 시료의 초기 카피수를 산출한다.
본 발명에 의해 α4GnT mRNA를 일정 온도에서 또한 1단계로, 간편, 신속, 고감도로 측정하는 것이 가능해졌다. 따라서, 본 발명은 위암, 췌장암, 그 밖의 암의 조기진단에 적용 가능하고, 화학요법 등의 치료 효과 모니터링, 예후의 예측, 치료 방침의 결정의 지표로서 유용하다. 본 발명은, 1단계로 밀폐용기 내에서 실시하는 것이 가능하기 때문에 이차오염의 원인이 되는 증폭 산물에 의한 환경의 오염의 위험성을 최소한으로 하는 것이 가능하다. 또한 1단계이며, 간편하고 또 신속하므로손을 이용한 경우에도 다수의 검체 처리가 가능하여 재현성을 악화시키는 요인인 조작수를 최소한으로 할 수 있다. 나아가, 본 발명의 RNA 증폭법은 RNA 만을 증폭하기 때문에 RT-PCR과 같이 2본쇄 DNA를 완전하게 제거하는 공정없이, 엄밀하게 mRNA를 증폭, 측정하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 방법은 고감도의 또한 신속 한 발현 해석에 최적이다. 또한 일정 온도로 1단계로 실시할 수 있기 때문에 PCR과 같은 열순환(thermal cycling) 기구를 마련할 필요가 없고, 자동화가 용이하다.
<110> TOSOH Corporation <120> Method for Assay of alpha-1,4-N-Acetylglucosamine Transferase (alpha-4GnT) mRNA <130> TOP07114 <150> JP2004-239781 <151> 2004-08-19 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 1 ggcttcctct accagttcac cctgaagtcc agctgcctct tctgt 45 <210> 2 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 2 cactcaggat aaatcttggc agcagactct acggaacagg agaccaaatg gggtggctcc 60 attctctctg ag 72 <210> 3 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 3 atgaaaaggc tgcttgaaga cacaccattg ttttcatggt acaatcaaat caacgccagc 60 gcagagagaa actggctcca catc 84 <210> 4 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 4 tccattacta gagtaccgag aagcctgcgc agccaaaaag ttctcctcag ggatgggcct 60 gatggagatg acatcggtgt ccatgta 87 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intercalator Fluorescene Dye Labelled Nucleic Acid Probe <400> 5 gccacgtctg tggctcagga gggcttccag cccctggtgg gacttgaaag aaggcaaa 58 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intercalator Fluorescene Dye Labelled Nucleic Acid Probe <400> 6 gccaccgtat ttccagatga tggccaggcg ggatgcatcc gagct 45 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 7 accctgaagt ccagctgcct ctt 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 8 aaatggggtg gctccattct ctct 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 9 cagactctac ggaacaggag acca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 10 cactcaggat aaatcttggc agca 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 11 atgaaaaggc tgcttgaaga caca 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 12 cattgttttc atggtacaat caa 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Primer <400> 13 gcagagagaa actggctcca cat 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 14 ggagatgaca tcggtgtcca tgta 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 15 agttctcctc agggatgggc ctga 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 16 cctgcgcagc caaaaagttc tcct 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Primer <400> 17 cattactaga gtaccgagaa gcct 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intercalator Fluorescene Dye Labelled Nucleic Acid Probe <400> 18 tggtgggact tgaaagaagg caaa 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intercalator Fluorescene Dye Labelled Nucleic Acid Probe <400> 19 ccacgtctgt ggctcaggag ggct 24 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intercalator Fluorescene Dye Labelled Nucleic Acid Probe <400> 20 gtctgtggct caggagggct 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intercalator Fluorescene Dye Labelled Nucleic Acid Probe <400> 21 tttccagatg atggccaggc ggga 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleaving Oligonucleotide <400> 22 cagggtgaac tggtagagga agcc 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleaving Oligonucleotide <400> 23 tttcatatcc aaagggaaga ggaa 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleaving Oligonucleotide <400> 24 caatggtgtg tcttcaagca gcct 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleaving Oligonucleotide <400> 25 ctctgcgctg gcgttgattt gatt 24 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Polymerase Promoter Sequence <400> 26 aattctaata cgactcacta tagggaga 28

Claims (7)

  1. 시료 중에 존재하는 α1, 4-N-아세틸 글루코사민 전이효소(α4GnT) mRNA의 측정 방법으로서,
    (1) 상기 RNA의 특정 염기서열의 5’말단으로부터 하류의 적어도 일부에 상동인 제1 프라이머 및 상기 특정 염기서열의 3’말단으로부터 상류의 적어도 일부에 상보적인 제2 프라이머에 의해 프로모터 서열과 상기 프로모터 서열 하류에 상기 특정 염기서열을 포함하는 2본쇄 DNA를 생성하는 공정, 여기에서 상기 제1 및 제2 프라이머의 적어도 일방은 5’말단에 프로모터 서열을 가지며,
    (2) 상기 2본쇄 DNA를 주형으로서 RNA 전사 산물을 생성하는 공정,
    (3) 상기 RNA 전사 산물이 계속해서 DNA 합성의 주형이 됨으로써 연쇄적으로 상기 RNA 전사 산물이 증폭하는 공정 및
    (4) 상기 RNA 전사 산물량을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 α4GnT mRNA의 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 서열번호 1에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 2에 기재된 서열의 적어도 15 염기를 각각 포함하는 조합 혹은 상기 제1 프라이머가 서열번호 3에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 4에 기재된 서열의 적어도 15 염기를 각각 포함하는 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 α4GnT mRNA 의 측정 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RNA 전사 산물량의 측정이, 인터칼레이터성 색소로 표지된 핵산 프로브로 표적 핵산과 상보적 2본쇄를 형성하면 인터칼레이터성 형광색소 부분이 상기 상보적 2본쇄 부분에 인터칼레이트 함으로써 형광특성이 변화되도록 설계된 핵산 프로브의 형광특성의 변화를 측정함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 α4GnT mRNA의 측정 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 서열번호 1에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 2에 기재된 서열의 적어도 15 염기 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브가 서열번호 5에 기재된 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 적어도 15 염기를 각각 포함하는 서열의 조합 혹은 상기 제1 프라이머가 서열번호 3에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 4에 기재된 서열의 적어도 15 염기 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브가 서열번호 6에 기재된 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 적어도 15 염기를 각각 포함하는 서열의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 α4GnT mRNA의 측정 방법.
  5. 제1 프라이머가 서열번호 1에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 제2의 프라이머가 서열번호 2로 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 각각 포함 하는 서열의 조합 또는 제1 프라이머가 서열번호 3에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 제2의 프라이머가 서열번호 4로 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기를 각각 포함하는 서열의 조합으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 구성요소로 하는 것을 특징으로 하며, 여기에서 상기 제1 및 제2 프라이머의 적어도 일방은 5’말단에 프로모터 서열을 가지는 α4GnT mRNA의 측정 시약.
  6. 제1 프라이머가 서열번호 1에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 2에 기재된 서열의 적어도 15 염기 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브가 서열번호 5에 기재된 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 적어도 15 염기를 각각 포함하는 서열의 조합으로 이루어지거나 혹은 상기 제1 프라이머가 서열번호 3에 나타내는 서열의 적어도 연속한 15 염기 및 상기 제2 프라이머가 서열번호 4에 기재된 서열의 적어도 15 염기 및 상기 인터칼레이터성 형광색소 표지 핵산 프로브가 서열번호 6에 기재된 서열 혹은 상기 서열의 상보 서열의 적어도 15 염기를 각각 포함하는 서열의 조합으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 구성요소로 하는 것을 특징으로 하며, 여기에서 상기 제1 및 제2 프라이머의 적어도 일방은 5’말단에 프로모터 서열을 가지는α4GnT mRNA의 측정 시약.
  7. 서열번호 1 내지 6에 기재된 어느 하나의 염기서열 또는 상기 서열의 상보 서열의 적어도 연속한 15 염기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 α4GnT mRNA 또는 그 상보 사슬에 특이적인 올리고뉴클레오티드.
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