JP2006223194A - スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）ｍＲＮＡの測定方法 - Google Patents

スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）ｍＲＮＡの測定方法 Download PDF

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Abstract

【課題】スタニオカルシン１（ＳＴＣ１） ｍＲＮＡを一定温度かつ１段階で、簡便、迅速、高感度に測定する方法を提供する。
【解決手段】少なくとも一方の５’末端にプロモーター配列を有する第一のプライマー、第二のプライマー、および逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において増幅されたＲＮＡ産物量をインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブにて測定する。
【選択図】 図３

Description

本発明は、簡便、一定温度、一段階で、迅速にスタニオカルシン１ ｍＲＮＡを測定する方法に関する。本発明は、医学、特に臨床診断の分野に属し、白血病や癌の早期診断、微小残存病変診断、治療のモニタリング、予後判定、治療方針決定の指標に有用である。
スタニオカルシン（以後、ＳＴＣ）は、魚類の腎臓に付着する魚類特有の器官スタニウス小体から分泌され、エラに作用して血中カルシウムレベルを調節するホルモンとして同定された糖タンパク質である。近年、サカナＳＴＣと相同性の高いヒトＳＴＣ ｃＤＮＡがクローニングされた（非特許文献１および２参照）。該ヒトＳＴＣは、後にクローニングされたＳＴＣ２と区別するためＳＴＣ１と命名された。ＳＴＣ１は、カルシウム調節機能を担い、カルシウムの制御を通して細胞分化・増殖に関与すると推定されている。現在、ＳＴＣ１と様々な疾病との関連が推定されている。例えば、（１）ハンチントン病やワーナー症候群などの遺伝病に関与する可能性が示唆されている（非特許文献３参照）。（２）骨形成に関与することが示唆されている（非特許文献４参照）。（３）ＳＴＣ１ メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は脳梗塞で亢進がみられ、虚血、低酸素状態での神経細胞の保護に関与することが示唆されている（特許文献１、非特許文献５参照）。（４）動脈硬化症と関連する可能性が示唆されている（非特許文献６参照）。以上に関連する疾病の診断、経過観察のために、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡ発現レベルの測定が有効であると期待されるが、特に、近年、慢性白血病、乳癌、その他の癌においてＳＴＣ１ ｍＲＮＡ発現レベルの上昇が示され、白血病やその他の癌の早期診断、転移診断および微小残存病変診断のマーカーとしてＳＴＣ１ ｍＲＮＡ測定が有効であることが示唆された（特許文献２、非特許文献７および８参照）。以上に例示の疾病の診断に適用するために、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡの簡便、迅速、高感度、かつ高精度な測定法が望まれてきた。
ＳＴＣ１ ｍＲＮＡを高感度に測定する手段としてＳＴＣ１ ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられるが、この場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要で、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになる。また、前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。また、ＲＴ−ＰＣＲではＤＮＡも増幅してしまうため、ｍＲＮＡのみを増幅する場合は核酸抽出工程においてＤＮａｓｅ処理などにより染色体ＤＮＡを完全に除去する必要があり、核酸抽出操作の煩雑化をまねいた。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
標的ＲＮＡの定量法としては、ＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を測定するＫｉｎｅｔｉｃ ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されているが、該方法ではプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題があった。
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４参照）、およびＴＭＡ法（特許文献５参照）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なｍＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼイション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。また、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法等は反応の開始時に一度反応温度よりも高温にし、標的となるＲＮＡの高次構造を変性させる工程があるため、ＲＮＡ増幅反応の開始から終了までが完全に一定温度ではない。そのため、反応装置の複雑化を招き、工程が増えるために迅速な検出には課題が残る。 簡便に、反応中は完全に一定温度でｍＲＮＡを増幅および測定する方法としては、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献６および非特許文献９参照）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。しかし特許文献６の方法では完全に一定温度で反応を行なうため、標的となるｍＲＮＡが高次構造を形成してオリゴヌクレオチドの結合を阻害すると考えられる。したがってＳＴＣ１ ｍＲＮＡの簡便、迅速な測定を行なうためには、一定温度においても結合効率が低下せず、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡの増幅、検出を行い得るオリゴヌクレオチドの配列が必要であった。
特表２００３−５３１１０７号公報 特開２０００−２７０９号公報 特許第２６５０１５９号 特許第３１５２９２７号 特許第３２４１７１７号 特開２０００−１４４００号公報 特開平８−２１１０５０号公報 特開２００１−１３１４７号公報 Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ−Ｍ．ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１１２，２４１−２４７ Ｏｌｓｅｎ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１７９２−１７９６ Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ−Ｍ．ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４７，３９３−３９８ Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０，２０７１−２０７６ Ｚｈａｎｇ，Ｋ−Ｚ．ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，３６３７−３６４２ Ｓａｔｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２３，１１１９−１１２６ Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１６，７９９−８０４ Ｗａｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９，１４２７−１４３５ Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６ Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７
前記スタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定は、白血病、乳癌およびその他の癌の早期診断、微小残存病変診断、経過観察に有用であるが、ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合は、二段階工程が必要で、操作が煩雑、急激な反応温度の昇降が必要などの課題があり、これらは二次汚染の危険性および再現性不良をまねくとともに簡便測定や自動化への展開の障壁となっていた。本発明は、前記課題を克服し、簡便、迅速、一定温度かつ一段階で前記スタニオカルシン１ ｍＲＮＡを測定する方法を提供する。
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、前記ＲＮＡ増幅方法を適用し、簡便、迅速、一定温度かつ一段階のスタニオカルシン１ ｍＲＮＡ測定方法を構築した。すなわち、第一のプライマーおよび第二のプライマー（少なくとも一方の５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成するＲＮＡ増幅工程において増幅されたＲＮＡ産物量を測定することによって、スタニオカルシン１ ｍＲＮＡを簡便、一定温度かつ一段階に測定することが可能となった。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、試料中に存在するスタニオカルシン１（ＳＴＣ１） ｍＲＮＡの測定法であって、該ＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマーおよび前記特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマー（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程、以上の各工程が同時に進行する条件で前記工程が繰り返される核酸増幅工程、および前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程からなる。
本発明中の試料とは、血液、血清、血漿、組織、その他の体液等の検体より既知の方法によって抽出された核酸である。
本発明中の特定塩基配列とはスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列あるいは該配列の相補配列からなり、第一のプライマーおよび第二のプライマーによって規定される領域の配列を有する。本発明では、前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅される。第一のプライマーにプロモーター配列を付加させる場合、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に特定核酸配列の５’末端で切断されていることが好ましい。このような切断方法は特に限定するものではないが、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素等により切断する方法が好ましく、該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨは伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。
本発明中の標的核酸とは、前記特定塩基配列において、第一および第二のプライマーに相同もしくは相補的でない領域を示し、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。そのため、たとえば本発明の一態様として、特定塩基配列がＳＴＣ１ ｍＲＮＡと相同な配列である場合は、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号３に示された配列の少なくとも連続した１５塩基を含む配列を有し、特定塩基配列がＳＴＣ１ ｍＲＮＡと相補な配列である場合は、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号３に示された配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基を含む配列を有するという態様があげられる。また、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブが相補的結合可能な標的核酸は、第一および第二のプライマーに相同もしくは相補的でない領域であるため、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブが第一および第二のプライマーと相補的結合して蛍光特性が変化することはない。
本発明中の第一および第二のプライマーは、少なくとも一方の５’末端にプロモーター配列を有しており、第一のプライマーはＳＴＣ１ ｍＲＮＡの相補配列に対して、第二のプライマーはＳＴＣ１ ｍＲＮＡに対して、それぞれ十分に相補的なオリゴヌクレオチドである。十分に相補的とは、本発明の核酸増幅工程の反応条件（反応温度および塩などの組成）において前記特定塩基配列あるいは該配列の相補配列に対して相補的結合が可能であることをさす。
なお、前記第一のプライマーはＳＴＣ１ ｍＲＮＡの相補配列に対して、前記第二のプライマーはＳＴＣ１ ｍＲＮＡに対して、および前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは標的核酸に対して、それぞれ十分に相補的であるために、前記第一のプライマーは配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１５塩基を含むこと、前記第二のプライマーは配列番号２に示す配列の少なくとも連続した１５塩基を含むこと、前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号３に示す配列あるいは該配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基を含むことがそれぞれ好ましく、前記第一のプライマー、第二のプライマーおよびインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの組み合わせで用いることがさらに好ましい。
前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、および前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３の範囲内で任意な連続する１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを設定することが可能である。該オリゴヌクレオチドの長さは特に限定しないが、１５〜３５塩基が好ましい。またＴｍ値などを考慮して適切に設定する必要はあるが、それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３の範囲内であればいかなるオリゴヌクレオチドを設定しても、本発明における機能および効果はいずれも同等である。
本発明中のプロモーター配列とはＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始する配列であり、ＲＮＡポリメラーゼの種類に対応する特異配列が既知である。このようなＲＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、汎用されているＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼなどが好適であり、これらに対応するプロモーター配列が使用可能である。
本発明中のＳＴＣ１ ｍＲＮＡの測定方法においては、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）が必要である。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、たとえば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素をさらに添加して補足すること等も可能である。前記逆転写酵素には、汎用性からいってＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、およびこれらの誘導体が特に好ましい。
前記第一のプライマーおよび第二のプライマー（第一のプライマーあるいは第二のプライマーは５’末端にプロモーター配列を有する）の存在下で逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＳＴＣ１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合しＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。このとき、例えば染色体ＤＮＡのような２本鎖ＤＮＡが存在しても前記第一および第二のプライマーは本発明記載の条件で２本鎖ＤＮＡに結合できないため、前記２本鎖ＤＮＡに対してプロモーター配列の付加は起こらない。
引き続いて、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素により特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５℃〜６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０℃〜４５℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識（例えば、色素や酵素など）で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼイション法などが利用できる。しかし、これらはＢＦ分離が必要で操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好適な方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献６および非特許文献９参照）。
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端−ＯＨからの伸長を防止する目的で該３’末端−ＯＨが適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献７および非特許文献１０参照）。
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献８および非特許文献１０参照）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いることも可能である。
本発明の一態様として、試料に、少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１に示す配列の連続した１５塩基を含む）、第二のプライマー（配列番号２に示す連続した１５塩基を含む）、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号３に示す配列の連続した１５塩基を含む）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１３に示された配列の連続した１５塩基を含み、かつ特定塩基配列の５’末端と重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５〜６５℃（好ましくは４０〜４５℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
前記態様において、蛍光強度の増幅曲線は、初期ＲＮＡ量の対数値に比例した時間のずれを示すことから、既知濃度の標準ＲＮＡを用いて前記時間を指標とした検量線を作成することによって未知試料の初期ＲＮＡ量を定量することも可能である。さらに、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定を通例１時間以内、最適な系では３０分以内に測定結果を得ることが可能である。
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＳＴＣ１ ｍＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。しかし、一方でＲＴ−ＰＣＲのような熱変性およびアニールを実施せず、３５〜６５℃という比較的低温の一定温度で反応させるため、プライマーダイマーなどの非特異増幅産物や標的ＲＮＡの高次構造の影響を受けやすく、測定系を構築するにはＲＴ−ＰＣＲの場合に比べてきわめて綿密な設計が必要であり、前記ＲＮＡ増幅・測定方法を用いた迅速、簡便、一定温度かつ一段階のＳＴＣ１ ｍＲＮＡ測定は未だに実現されていなかった。本発明によりＳＴＣ１ ｍＲＮＡの高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度かつ一段階の測定が初めて可能となった。
本発明は、白血病、乳癌およびその他の癌の早期診断、化学療法等の治療効果モニタリング、微小残存病変診断、予後予測および治療方針決定のための指標として適用することが可能である。また、ワーナー症候群などの遺伝病、骨代謝異常、脳梗塞などのＳＴＣ１が関連する疾病においても、研究、診断、治療経過観察などの目的で適用可能であることはいうまでもない。
本発明により、ＳＴＣ１ ｍＲＮＡを一定温度かつ一段階で、簡便、迅速、高感度に測定することが可能となった。したがって、本発明は、白血病、乳癌、その他の癌の早期診断、化学療法などの治療効果モニタリング、微小残存病変診断、予後の予測などに適用可能であり、治療方針の決定の指標としても有用である。本発明は、一段階かつ密閉容器内で実施することが可能であるため、二次汚染の原因となる増幅産物による環境の汚染の危険性を最小限にすることが可能である。また、一段階、簡便かつ迅速であることから、用手法の場合でも多数の検体処理が可能であり、再現性を悪化させる要因である煩雑操作を最小限にすることができる。さらに、本発明のＲＮＡ増幅法はＲＮＡのみを増幅することから、ＲＴ−ＰＣＲのように２本鎖ＤＮＡを完全に除去する工程なしに、厳密にｍＲＮＡを増幅、測定することが可能である。すなわち、本発明の方法は高感度かつ迅速な発現解析に最適である。また、反応の開始から終了まで完全に一定温度かつ一段階で実施できることから、ＰＣＲのようなサーマルサイクリング機構を設ける必要がなく、自動化が容易である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１
ＳＴＣ１ ＲＮＡは、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター下流にＳＴＣ１ ｃＤＮＡ（塩基番号２４２〜１０２８を含む、塩基番号はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０２９２４４に従った）を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写を実施し、引き続いてＤＮａｓｅI処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
以下の実施例では該ＲＮＡを測定対象としているが、本発明の測定対象であるＳＴＣ１ ｍＲＮＡの測定に十分適用可能であることはいうまでもない。
実施例２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。配列番号１０および１１に記載の配列の５’末端から１３番目の塩基（配列番号１０においてはＣ、配列番号１１においてはＴ）の位置にＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基に非特許文献１０に記載の方法でオキサゾールイエローを結合させた（図１Ｂ）。さらに、非特許文献１０に記載の方法で、配列番号１１に記載の配列の５’末端から１０番目のＣと１１番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１Ａ）。
実施例３
本願発明の方法を用いて、種々の初期コピー数のＳＴＣ１ ＲＮＡの検出を行った。
（１）前記ＳＴＣ１ ＲＮＡ（塩基番号２４２〜１０２８を含む）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター、５ｍＭ ＤＴＴ）を用いて、５０、１００、１０００コピー／５μｌとなるようそれぞれ希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。陰性標準（０コピー）はＲＮＡ希釈液を用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
１μＭの第一のプライマー（配列番号５）：第一のプライマーは、配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号１７）が付加されてなる
１μＭ 第二のプライマー（配列番号８）
２５ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号１１）：該核酸プローブは実施例２においてＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いて調製したもの
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１５）：該オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）
１３％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度
２％ ソルビトール
８Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ社製）
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （ＧＩＢＣＯ社製）
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図２に示した。なお、バックグラウンドの蛍光強度値は各サンプルの測定開始時から９０、１２０、１５０秒後の蛍光強度値の平均値とした。図２の結果では、ＳＴＣ１ ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、５０コピー／テストのＳＴＣ１ ＲＮＡの場合で約１２分から蛍光増加が認められた。以上のことは、本発明の方法によればＳＴＣ１ ＲＮＡを高感度かつ迅速に定量可能であることを示している。
実施例４
本願発明の方法において、種々の組合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、ＳＴＣ１ ＲＮＡの測定を行った。
（１）前記ＳＴＣ１ ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて１０３コピー／５μｌとなるよう希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
１μＭ 第一のプライマー（配列番号は表１に記載）：第一のプライマーは、配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号１７）が付加されてなる
１μＭ 第二のプライマー（配列番号は表１に記載）
２５ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号は表１に記載）：該核酸プローブは実施例２において調製したもの
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号は表１に記載）：該オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）
１３％ ＤＭＳＯ。
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μｌ中）の最終濃度
２％ ソルビトール
８Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ社製）
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１に示した。
表１に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合、すべての組み合わせで１０３コピー／テストのＳＴＣ１ ＲＮＡが２０分以内に検出された。すなわち、第一のプライマーとして配列番号４〜６より選ばれた配列、第二のプライマーとして配列番号７〜９より選ばれた配列、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号１０〜１１より選ばれた配列、および切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号１４〜１６より選ばれた配列からなる組合わせを用いた場合、いずれもＳＴＣ１ ＲＮＡが迅速に検出可能であった。ここで、配列番号４〜６はそれぞれ配列番号１の部分配列、配列番号７〜９はそれぞれ配列番号２の部分配列、配列番号１０〜１１はそれぞれ配列番号３の部分配列、配列番号１４〜１６のそれぞれは配列番号１３の部分配列である。よって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号１３に記載の配列の範囲内で設定されたオリゴヌクレオチドならば本発明において同一の機能および効果を有することが示された。以上から、本発明に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブを用いたＲＮＡ増幅・測定法により、ＳＴＣ１ ＲＮＡが迅速に検出可能であることが示された。
Figure 2006223194
 上表の組合わせのオリゴヌクレオチドを用い、１０３コピー／テストのＳＴＣ１ ＲＮＡをサンプルとして前記ＲＮＡ増幅・蛍光測定を実施した。蛍光強度比１．２を超えたものを（＋）と判定し、そのときの時間を検出時間とした。
実施例５
本願発明の方法を用いて、ＳＴＣ１ ＲＮＡの定量を行った。
（１）前記ＳＴＣ１ ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて１０２、１０３、１０４、１０５、１０６コピー／５μｌとなるよう希釈し、検量線用標準ＲＮＡとして用いた。陰性標準（ＮＥＧ）は希釈液を用いた。同様に、サンプルＡ（１０２コピー／５μｌ）、Ｂ（１０３コピー／５μｌ）、Ｃ（１０４コピー／５μｌ）、Ｄ（１０５コピー／５μｌ）、Ｅ（１０６コピー／５μｌ）を調製した。
（２）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記標準ＲＮＡおよびサンプル５μｌをそれぞれ添加した。
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μｌ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
１μＭ 第一のプライマー（配列番号５）：第一のプライマーは、配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列（配列番号１７）が付加されてなる
１μＭ 第二のプライマー（配列番号８）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（配列番号１２）：該核酸プローブは実施例２においてリン酸ジエステルにリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたもの
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１５）：該オリゴヌクレオチドの３’末端−ＯＨはアミノ基で修飾
６Ｕ／３０μｌ リボヌクレアーゼ・インヒビター（タカラバイオ社製）
１３％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μｌ）の最終濃度
２％ ソルビトール
８Ｕ／３０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ社製）
１４２Ｕ／３０μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （ＧＩＢＣＯ社製）
３．６μｇ／３０μｌ 牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示した。
図３の結果において、蛍光強度比が１．２に達する時間を検出時間とし、該検出時間と初期コピー数の対数値から作成した検量線を図４に示した。さらに、該検量線およびサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの検出時間から前記サンプルのコピー数を定量した結果を表２に示した。
図３の結果では、１０２コピー／テストが約１０分で検出されており、検出時間と初期コピー数の対数値との間に良好な直線性が得られた（図４）。また、表２の結果において、サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの定量結果はＳＴＣ１ ＲＮＡの添加量に相当する値を示した。以上より本発明の方法により、ＳＴＣ１ ＲＮＡを迅速、高感度、かつ特異的に定量可能であることが示された。
Figure 2006223194
 サンプルＡ（１０２コピー／５μｌ）、Ｂ（１０３コピー／５μｌ）、Ｃ（１０４コピー／５μｌ）、Ｄ（１０５コピー／５μｌ）、Ｅ（１０６コピー／５μｌ）を測定した場合の蛍光プロファイルから得られた検出時間と図４の検量線よりコピー数を算出した結果。
実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ａ）Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献１０）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。Ｂ）市販のＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献１０）の方法に従ってオキサゾールイエローを結合させたプローブ。この場合、導入位置（図中Ｂ３部分）のヌクレオシド部分が欠失してアミノ基が導入される。なお、３’末端−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端−ＯＨはビオチン修飾がなされている。 実施例３の測定の結果得られた蛍光プロファイル。本発明記載のＲＮＡ増幅を行うと同時に経時的に蛍光強度（励起光：４７０ｎｍ、蛍光：５２０ｎｍ）を測定した結果。横軸は反応時間、縦軸は蛍光強度比（反応液の蛍光強度／バックグラウンド蛍光）を示す。図中のコピー数は１テストに使用したＳＴＣ１ ＲＮＡ（塩基番号２４２〜１０２８を含む）の初期コピー数（２６０ｎｍの吸光度より算出）を示す。 実施例４の測定の結果得られた蛍光プロファイル。本発明記載のＲＮＡ増幅を行うと同時に経時的に蛍光強度（励起光：４７０ｎｍ、蛍光：５２０ｎｍ）を測定した結果。横軸は反応時間、縦軸は蛍光強度比（反応液の蛍光強度／バックグラウンド蛍光）を示す。図中凡例の数字は１テストに使用した前記ＳＴＣ１ ＲＮＡの初期コピー数（２６０ｎｍの吸光度より算出）を示す。ｎｅｇａは陰性（希釈液）を示す。 図３の結果から得られた検量線。図３の結果において、蛍光強度比が１．２に達する時間を検出時間とし、標準ＲＮＡの初期コピー数の対数値に対する検出時間をプロットした。図中の式は、１次回帰式と相関係数を示した。本検量線と得られた未知試料の検出時間より未知試料の初期コピー数を算出する。

Claims (7)

  1. 試料中に存在するスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定法であって、
    （１）該ＲＮＡの特定塩基配列の５’末端から下流の少なくとも一部に相同な第一のプライマー、および前記特定塩基配列の３’末端から上流の少なくとも一部に相補的な第二のプライマー（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）により、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
    （２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成する工程、
    （３）該ＲＮＡ転写産物が引き続きＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物が増幅する工程、
    （４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
    からなることを特徴とするスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定方法。
  2. 前記第一のプライマーが配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基および前記第二のプライマーが配列番号２に記載の配列の少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含む組み合わせからなることを特徴とする請求項１に記載のスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定方法。
  3. 前記ＲＮＡ転写産物量の測定が、インターカレーター性色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする請求項１あるいは請求項２に記載のスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定方法。
  4. 前記第一のプライマーが配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基、および前記第二のプライマーが配列番号２に記載の配列の少なくとも連続した１５塩基、および前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブが配列番号３に記載の配列あるいは該配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基を含むオリゴヌクレオチドの組み合わせからなることを特徴とする請求項３に記載のスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定方法。
  5. 第一のプライマーが配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基および第二のプライマーが配列番号２で示された配列の少なくとも連続した１５塩基（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）をそれぞれ含む配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを構成要素とすることを特徴とするスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定試薬。
  6. 前記第一のプライマーが配列番号１に示された配列の少なくとも連続した１５塩基および前記第二のプライマーが配列番号２に記載の配列の少なくとも連続した１５塩基（前記第一および第二のプライマーの少なくとも一方は５’末端にプロモーター配列を有する）および前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブが配列番号３に記載の配列あるいは該配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含む配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを構成要素とすることを特徴とするスタニオカルシン１ ｍＲＮＡの測定試薬。
  7. 配列番号１から３に記載の、いずれかの塩基配列あるいは該配列の相補配列の少なくとも連続した１５塩基からなることを特徴とするスタニオカルシン１ ｍＲＮＡまたはその相補鎖に特異的なオリゴヌクレオチド。

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