JP4670343B2

JP4670343B2 - サイトケラチン２０ｍＲＮＡの検出および定量方法

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Publication number: JP4670343B2
Application number: JP2004376707A
Authority: JP
Inventors: 悟大仲; 俊典林
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2004-12-27
Filing date: 2004-12-27
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2024-12-27
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Description

本発明は、特定配列を利用したサイトケラチン２０ｍＲＮＡの検出および定量方法に関する。

サイトケラチン（ＣＫ）は、上皮細胞の細胞骨格を成す中間径（直径７〜１１ｎｍ）フィラメントであるが、単一のものではなく複数の遺伝子に支配される分子量４０〜６８ｋＤのタンパク質の総称であり、ＣＫ１８，ＣＫ１９、ＣＫ２０等がよく知られている。サイトケラチン２０（ＣＫ２０）は、主に胃腸組織と胃腸組織を原発巣とする癌、婦人科粘膜癌、移行上皮癌、Ｍｅｒｋｅｌ細胞癌でそのｍＲＮＡが発現していることが報告されている。したがって、リンパ節等の組織においてＣＫ２０ｍＲＮＡ発現の有無を調べることで、上記の癌の転移の有無を検索することができる。また、正常組織と癌組織でＣＫ２０ｍＲＮＡ発現量に差が生じている場合には、その発現量を比較することで癌転移の可能性を推察することができる。

癌細胞は原発巣部位から放出され、血流やリンパ液流を経由して広がり、遠方の臓器に微小転移を形成する。この微小転移によって原発巣の根治的切除が成功したにも関わらず再発する症例があることにより、原発巣のみならず周辺のリンパ節切除（リンパ節郭清）が標準術式となっているが、リンパ節郭清で再発を防ぐことができたとしても後遺症（むくみ等）で生活レベルの低下を余儀なくされている患者が多いことも問題となっている。そこで再発を防ぎ、かつ、切除範囲をできるだけ縮小することが現代の腫瘍外科手術の目標となっている。また、リンパ節転移の検出は、胃癌においては術後の治療方針選択の指針となり、食道癌では術式選択の指針にもなっている。これらのことから、微小転移を正確に、かつ、迅速に（手術中に）捕らえることは極めて重要な意義を有している。

従来のリンパ節への癌微小転移診断法としては、切除したリンパ節組織の切断面のＣＫタンパク質を免疫染色法で検出する病理学的方法がある。しかし、このような方法では、代表切片の検索であるため癌細胞の見落としの可能性がある。また、癌細胞か否かの判定には熟練を要する。

近年、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅、検出、定量が可能となっている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。これは、例えば、腫瘍組織からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、検出する方法であり、感度が高いという特徴がある。この方法により、切除組織からのＣＫ２０ｍＲＮＡの検出、定量が可能となり、病理学的方法の欠点である見落としをある程度防ぐことができる。しかし、この方法はＣＫ２０ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程が必要であり、操作に熟練を要し、検出結果を得るまでに長時間を要する。

また、最近、ＲＴ−ＬＡＭＰ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を利用したＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅、検出も可能となっている（特許文献３）。これは、２種類のインナープライマー、２種類のアウタープライマー、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を混合し、一定温度（６５℃前後）で保温することにより、ＣＫ２０ｍＲＮＡを増幅する方法である。この方法では、検出に必要な増幅産物が約３０分で得られ、ＲＴ−ＰＣＲ法より短時間ではあるが、まだ迅速性には問題がある。

一方、以下の方法が知られている。
ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡに変換した後、反応液を昇降温してＤＮＡを増幅するいわゆるＰＣＲを実施するＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、反応液の昇降温なしにＲＮＡをＲＮＡとして増幅し検出する方法である（例えば特許文献４に記載されたＮＡＳＢＡ法、特許文献５に記載されたＴＭＡ法、特許文献６に記載された増幅・検出法等）。これらの方法では、例えば、その転写によって特定配列のＲＮＡ転写産物を生成する、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成することを含む方法である。

より具体的には、例えば、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定配列に対して、（１）その３’端に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（２）この逆転写によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解し、１本鎖ＤＮＡを生成させ、（３）この１本鎖の３’端に相補的で、それ自身がその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記したプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（４）この２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させてＲＮＡ転写産物（特定配列のＲＮＡ）を生成するのである。ＲＮＡ転写産物は特定配列のＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（２）以降の反応が進行してＲＮＡ増幅の連鎖反応が引き起こされる。

これら方法の特徴は、ＰＣＲのように反応液を昇降温する必要がなく、またＲＮＡの逆転写とその後の連鎖的増幅反応を分けて実施することがない、という点にある。さらに、増幅された特定配列に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させ、特定配列またはそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる特許文献６に記載の増幅、検出法は一定温度、一段階操作で実施でき、迅速性に優れた定量法である。

しかし、この特許文献６の方法に適したＣＫ２０ｍＲＮＡ増幅用プライマー検出用のプローブは知られていない。これは、反応の開始時に一度反応温度よりも高温にし、標的となるＲＮＡの高次構造を変性させる工程を必要とするＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法等と比較し、特許文献６の方法が反応中は常に比較的低温の一定温度（３５〜５０℃、好ましくは４３℃）でｍＲＮＡの増幅、検出を行うことに由来する。そして、特許文献６の方法では標的となるｍＲＮＡが高次構造を形成してオリゴヌクレオチドの結合を阻害するため、増幅、検出効率が悪くなると考えられているからである。よって、一定温度（３５〜５０℃、好ましくは４３℃）においても結合効率が低下せず、ＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅、検出を行い得るオリゴヌクレオチドが必要であった。

ＷＯ９６１７０８０号ＷＯ０１７５１５３号特開２００４−０８９１８０号特許第２６５０１５９号特許第３２４１７１７号特開２０００−０１４４００号Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，２１．４．５５５−５６２（２００２）

そこで本発明の目的は、ヒト細胞や組織から得られた試料に対し、特許文献６のような方法を適用して、ＣＫ２０ｍＲＮＡを増幅、検出することにより、ＣＫ２０ｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に検出、定量可能な方法を提供することにある。

前記の目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、ヒト細胞や組織から得られた試料に対して、ＣＫ２０ｍＲＮＡに存在する特定配列について、特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー（配列番号７、８、または９で示される、いずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上を含むことを特徴とする）および特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（配列番号４、５または６で示される、いずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上を含むことを特徴とする。ここで第１または第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、
（１）ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、
（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列または特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、および、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）、
を行うことによるＣＫ２０ｍＲＮＡに存在する特定配列の増幅方法である。

本願請求項２の発明は、請求項１のＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅方法において、インターカレーター性蛍光色素で標識された配列番号１０または１１に示される、いずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドを作用させ、該オリゴヌクレオチドとＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して、反応液の蛍光強度を測定することによる、ＣＫ２０ｍＲＮＡの検出および定量方法である。

本願請求項３の発明は、請求項１の方法において、ＣＫ２０ｍＲＮＡを特定配列の５’末端で切断する際に、配列番号１、２または３で示されるいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする増幅方法である。

本願請求項４の発明は、配列番号７、８または９で示される、いずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の、少なくとも連続した１０塩基以上を含む、ＣＫ２０ｍＲＮＡまたはその相補配列に特異的なオリゴヌクレオチドである。

本願請求項５の発明は、配列番号４、５または６で示されるいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上を含む、ＣＫ２０ｍＲＮＡまたはその相補配列に特異的なオリゴヌクレオチドである。

本願請求項６の発明は、配列番号１０または１１で示される、いずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上を含む、ＣＫ２０ｍＲＮＡまたはその相補配列に特異的なオリゴヌクレオチドである。

本願請求項７の発明は、配列番号１、２または３で示される、いずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上を含む、ＣＫ２０ｍＲＮＡまたはその相補配列に特異的なオリゴヌクレオチドである。

本願請求項８の発明は、請求項４，５、６または７に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＫ２０ｍＲＮＡの検出および定量キットである。

本願請求項９の発明は、試料中のＣＫ２０ｍＲＮＡ内の特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマーおよび特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（ここで第２のプライマーにはその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、
（１）ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、
（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列または特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、および、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行う、試料中のＣＫ２０ｍＲＮＡを増幅する方法において、
第１のプライマーが配列番号７で示される塩基配列の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであり、
第２のプライマーが配列番号４で示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであり、
ＣＫ２０ｍＲＮＡの特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する配列番号１の塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、ＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅方法である。

本願請求項１０の発明は、請求項９に示されるオリゴヌクレオチドを含有するＣＫ２０ｍＲＮＡの検出および定量キットである。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＲＮＡをＲＮＡとして増幅する方法を採用することにより、ＣＫ２０ｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に検出可能である。特にＲＮＡ転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させておけば、特定配列またはそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる。モニタリングに用いるプローブは、特定配列またはそれに相補的な配列と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドに、該オリゴヌクレオチドがＲＮＡ転写産物と相補結合すると、結合していない状態と比較して蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素を結合したものであり、本発明を実施するにおいて前記モニタリングは最も好適な形態である。なお、オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識方法は特に限定はないが、リン原子からリンカーを介して結合する方法が望ましい。結合方法としてはまず、オリゴヌクレオチドの鎖内または末端にアミノ基等の官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素にも必要であればオリゴヌクレオチドへ導入した官能基と反応または結合可能な官能基を導入し、双方の官能基同士を結合させることが例示できる。より詳細には、特願２０００−１５４４３１号またはＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７に記載されている。

本発明は、一定温度で実施することができるが、その温度は３５℃から５０℃（好ましくは４３℃）と比較的低温である。

本発明中の特定配列とはＣＫ２０ｍＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列からなり、第１のプライマーおよび第２のプライマーによって規定される領域の配列を有する。本発明では、特定配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅される。

本発明の実施に当たっては、まずＣＫ２０ｍＲＮＡ中に存在する特定配列を決定する。次に、ＣＫ２０ｍＲＮＡ内の特定配列に基づいて本発明の実施に使用する第１および第２プライマー等の配列をデザインする。例えば配列番号４〜９で示される塩基配列の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、実施例において述べるように、ＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅用プライマーとして好適な配列の一例を示したものであり、配列番号１０または１１で示される塩基配列またはその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、検出用プローブとして好適な配列の一例を示したものである。

ここで試料とは、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明では、ヒト細胞や組織を材料として、例えば特開平７−５９５７２号等に記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、前記例示したようなＲＮＡを直接的な増幅・検出対象とすることで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織中のＣＫ２０ｍＲＮＡの検出および定量を行うのである。

以下に本願発明をさらに具体的に説明する。試料中に、増幅・検出対象としたＣＫ２０遺伝子のｍＲＮＡが存在した場合には、
（１）ＣＫ２０ｍＲＮＡ中に存在する特定配列を鋳型として、第１のプライマー（特定配列の３’末端領域に相補的な配列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、
（２）次いでリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡが分解されて１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、
（３）該１本鎖ＤＮＡに対し第２のプライマー（特定配列の５’末端領域に相同的な配列で、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、
（４）該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素存在下で特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡ転写産物が生成されるが、このＲＮＡ転写産物は特定配列からなるＲＮＡであるため（１）の反応における鋳型となり、結果として上記（１）から（４）の反応はＲＮＡやＤＮＡを生成する際の酵素基質が使い尽くされるか、または、上記の各種酵素が失活するまで連鎖的に生じることになる。

上記例は第２プライマーとしてその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたものを用いる例（以下第１形態という）である。本発明では、第１プライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加して使用しても良い（以下第２形態という）。第１形態で本発明を実施する場合には、特定配列の増幅効率を高めてその検出感度を向上させるために、前記（１）の反応に先立って、特定配列を含むＲＮＡを特定配列の５’末端で切断しておくことが好ましい（例えば特許文献６参照）。

ＲＮＡを切断する方法としては、例えば、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を共存させ、後の反応でも使用されるリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させて切断する方法を例示することができる。ＣＫ２０ｍＲＮＡの切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１、２または３に示す配列の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ここで、切断用オリゴヌクレオチドの３’末端は、このオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能しないよう、例えばアミノ化等の処理を施しておくことが好ましい。

ＣＫ２０ｍＲＮＡを検出および定量するためには、上記のようにして増幅された特定配列の存在を検出してその存否を確認し、または、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定する必要がある。特定配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行った反応液に対して、特定配列に対して相補的に結合し得る固定化および標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定配列に特異的に結合する、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。またこのプローブは前記（１）から（４）の反応を阻害しないため、その存在下で上記特定配列の増幅を実施して、特定配列の増幅の様子をモニタリングすることが特に好ましい。なお、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定配列の増幅を行う場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加する等しておくことが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが特定配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出機によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した増幅反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、その存否を確認し、または、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。ＣＫ２０ｍＲＮＡ検出用のインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列としては、配列番号１０または１１に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列であることが好ましい。

以上に記載した本発明の方法は、予め検出キットを用意しておくことにより、極めて簡単に実施することが可能である。検出キットは、好ましくは、第１のプライマー、第２のプライマー、（第１形態で本発明を実施するのであれば）切断用プライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、及びこれら酵素の基質等の特定配列を増幅し検出するために必要な全ての試薬を含むものであるが、これら全ての試薬を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。すなわち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＣＫ２０遺伝子のｍＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。

以上の説明のように、本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４３℃）の条件下で、増幅反応から検出までを完全に一段階の操作で、短時間に、ＣＫ２０遺伝子のｍＲＮＡを増幅、検出、定量することができる。したがって、反応の開始時にも反応温度以上に温度を上昇させる必要がなく、操作を簡便なものとし、反応装置の複雑化を防ぐことができる。また、短時間の検出を達成することで、癌細胞の微小転移を迅速に捕らえることを可能とする。本発明では、試料中のＣＫ２０遺伝子のｍＲＮＡをもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光特性が変化する過程を解析することにより、簡便かつ、短時間に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。

本発明は、一段階操作でＣＫ２０遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドの組合せを提供すること、すなわち高次構造を変性させることなくＣＫ２０ｍＲＮＡに相補的結合可能な増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、および検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合せを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＣＫ２０ｍＲＮＡ発現細胞の検出および定量方法ならびに検出および定量キットを医療分野に提供する。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。使用した第１のプライマー、第２のプライマーおよび切断用プライマーの組合せは表１に示した。ただし本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。

配列番号１１に記載の配列中の５’末端から１３番目の塩基（Ｃ）と１４番目の塩基（Ｔ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１１）を調製した（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７参照）。

実施例２
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて、ＣＫ２０ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。

（１）ＣＫ２０ＲＮＡの調製を行った。
ＣＫ２０ＲＮＡとは、ＣＫ２０の塩基配列（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．：ＮＭ＿０１９０１０の１８１７塩基中の４０番目〜１７１０番目の１６７１塩基の２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。

ＣＫ２０ＲＮＡ（１６７１ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭＤＴＴ）を用い１．０×１０^６コピー／５μｌ〜３０コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。

（２）以下の組成の反応液２０．０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＰＣＲｔｕｂｅｗｉｔｈｄｏｍｅｃａｐ、フナコシ製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。

反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ塩化カリウム
１．０ｍＭＤＴＴ
各０．２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭＧＴＰ
３．６ｍＭＩＴＰ
各１．０μＭの第１のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７）と第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４）。なお、第２オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号１６（Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター配列）を付加して使用した。
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１；ＣＫ２０ＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化）
６ユニットリボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３．０％ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
６．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（実施例１で調製したもの）。

（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μｌを添加した。

酵素液の組成（反応時の最終濃度）
２．０％ソルビトール
６．４ユニットＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
１４２ユニットＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水。

（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定した。
各サンプルに酵素を順次添加していき、全てのサンプルに酵素を添加した後、測定開始した。酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図１に示した。なお、バックグラウンドの蛍光強度値は各サンプルの測定開始時から９０、１２０、１５０秒後の蛍光強度値の平均値とした。ＲＮＡサンプル濃度は１０^６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌである。図１より、ＣＫ２０ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するＣＫ２０遺伝子のｍＲＮＡ量を検出、定量することが可能であることが示唆された。また、ＲＮＡ転写産物生成量に依存した蛍光強度比の増加開始時間は、１０^２コピー／３０μｌで約１１分だった。
なお検出時間は、酵素添加時から蛍光強度比が１．２に達した時間を意味する。

実施例３
第１のプライマー、第２のプライマーおよび切断用プライマーにおいて表１の各組合せの比較を行なった。オリゴヌクレオチドプライマーを除く試薬組成および検出方法は実施例２と同様にし、ＣＫ２０ＲＮＡの１０^４コピーの検出時間を表１に示した。表１の全ての組合せにおいて、短時間でＣＫ２０ＲＮＡの検出を達成し、２０分以内での検出も十分可能であることが示された。特に組合せの１番において最も迅速なＣＫ２０ｍＲＮＡの検出が可能であることが示唆された。

実施例４
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて、実際の培養細胞株ＳＷ１１１６が発現するＣＫ２０ｍＲＮＡを測定した。

（１）細胞の培養、回収
ヒト結腸腺癌培養細胞株ＳＷ１１１６（ＣＫ２０ｍＲＮＡ発現細胞）とヒト慢性骨髄性白血病培養細胞株Ｋ５６２（ＣＫ２０ｍＲＮＡ非発現細胞）をそれぞれＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬社製）に１０％ウシ胎児血清を加えた培地で培養した。ＳＷ１１１６はトリプシン処理とピペットによる吸引、吐出によって、細胞を培養ディッシュから剥離し回収した。Ｋ５６２はピペットによる吸引、吐出によって、細胞を培養ディッシュから剥離し回収した。それぞれの細胞について、遠心分離（３００ｇ、５分）により培地を取り除き、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した後、再度、遠心分離を行い、細胞ペレットを得た。

（２）サンプル調製
上記、ＳＷ１１１６とＫ５６２の細胞ペレットを２ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水に溶解した後、血球計算盤を用いて細胞数を求めた。得られた細胞数より、以下の５種類のサンプルを作製した。（１）１０^５個のＫ５６２のみ、（２）１０個のＳＷ１１１６に１０^５個のＫ５６２を加えたもの、（３）１０^２個のＳＷ１１１６に１０^５個のＫ５６２を加えたもの、（４）１０^３個のＳＷ１１１６に１０^５個のＫ５６２を加えたもの、（５）１０^４個のＳＷ１１１６に１０^５個のＫ５６２を加えたもの。
これらのサンプルを遠心分離し、上清を廃棄後、細胞ペレットにＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士フィルム製）付属のＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１％βメルカプトエタノール含有）３５０μＬを加えた。以降の操作は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００の操作方法に従い、上記サンプル（１）〜（５）のＲＮＡ抽出物を得た。抽出物の容量は１００μＬだった。

（３）サンプルの測定
試薬組成は実施例２と同様の条件で実施した。サンプルは（１）〜（５）をそれぞれ５μＬ使用した。ＣＫ２０ＲＮＡは、１０^２コピー／５μＬ、１０^４コピー／５μＬ、１０^６コピー／５μＬを測定した。測定は酵素添加時から３０分間実施した。

（４）サンプル中のポルフォビリノーゲン・デアミナーゼｍＲＮＡの測定
抽出操作の誤差を補正するために、ハウスキーピング遺伝子であるポルフォビリノーゲン・デアミナーゼ（ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎｄｅａｍｉｎａｓｅ、以降ＰＢＧＤと略す）遺伝子のｍＲＮＡを同様のサンプルについて実施例２と同様の方法で測定した。オリゴヌクレオチドプライマーとインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを除く試薬組成は実施例２と同様である。

第１のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号１４を、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号１３を使用した。なお、第２オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号１６（Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター配列）を付加して使用した。切断用オリゴヌクレオチドプライマーは（ＰＢＧＤＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化）、配列番号１２を使用した。

インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブは配列番号１５を使用した（配列番号１５に記載の配列中の５’末端から８番目の塩基（Ｃ）と９番目の塩基（Ａ）の間のリンに、インターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識してある）。

ＰＢＧＤＲＮＡは、ＰＢＧＤの塩基配列（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．：ＮＭ＿０００１９０）を含む２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製することにより調製した。得られたＰＢＧＤＲＮＡ（１５０１ｍｅｒ）を、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭＤＴＴ）を用い１０^２コピー／５μＬ、１０^４コピー／５μＬ、１０^６コピー／５μＬに希釈して測定した。

サンプル（１）〜（５）について、ＣＫ２０ｍＲＮＡとＰＢＧＤｍＲＮＡの測定結果を図２に示した。Ｋ５６２のみの抽出物（サンプル（１））からはＣＫ２０ｍＲＮＡは検出されなかった。また、ＳＷ１１１６細胞数に依存した「ＣＫ２０コピー数／ＰＢＧＤコピー数」が得られ、本発明は、ＣＫ２０ｍＲＮＡ非発現細胞中のＣＫ２０ｍＲＮＡ発現細胞を検出、定量しうることが証明された。

初期ＣＫ２０ＲＮＡ量１０^６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ｃａｌ３０はＣＫ２０ＲＮＡ３０コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾２はＣＫ２０ＲＮＡ１０^２コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾３はＣＫ２０ＲＮＡ１０^３コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾４はＣＫ２０ＲＮＡ１０^４コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾５はＣＫ２０ＲＮＡ１０^５コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾６はＣＫ２０ＲＮＡ１０^６コピー/５μＬである。ｎｅｇａはＲＮＡ試料の代わりにＲＮＡ希釈液のみを用いた。サンプル（１）〜（５）（実施例４（２）サンプル調製の項を参照）について、ＣＫ２０ｍＲＮＡの検出時間（酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２に達したときの反応時間）とＰＢＧＤｍＲＮＡの検出時間を図２のカラムＡとＣに示した。非検出は、酵素添加時から３０分以内に蛍光強度比が１．２に達しなかったことを意味する。また、ＣＫ２０ＲＮＡまたはＰＢＧＤＲＮＡの濃度と検出時間より作成した検量線から算出したコピー数を、カラムＢとＤに示した。各サンプルのＣＫ２０ＲＮＡコピー数をＰＢＧＤＲＮＡコピー数で補正した値（ＣＫ２０コピー数／ＰＢＧＤコピー数ｘ１０＾５）をカラムＥに示した。ｃａｌ１０＾２はＣＫ２０ＲＮＡまたはＰＢＧＤＲＮＡ１０^２コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾４はＣＫ２０ＲＮＡまたはＰＢＧＤＲＮＡ１０^４コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾６はＣＫ２０ＲＮＡまたはＰＢＧＤＲＮＡ１０^６コピー/５μＬである。

Claims

試料中のサイトケラチン２０（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ２０、以降ＣＫ２０と略す）ｍＲＮＡ内の特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマーおよび特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（ここで第２のプライマーはその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、
（１）ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、
（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列または特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、および、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）、
を行う、試料中のＣＫ２０ｍＲＮＡを増幅する方法において、第１のプライマーが配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドであり、第２のプライマーが配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドであり、ＣＫ２０ｍＲＮＡの特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する配列番号１で示されるオリゴヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、ＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅方法。
請求項１のＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅方法において、インターカレーター性蛍光色素で標識された、配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドを作用させ、該オリゴヌクレオチドとＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して、反応液の蛍光強度を測定することによる、ＣＫ２０ｍＲＮＡの検出および定量方法。
配列番号１、配列番号７及び配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを含有するＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅用キット。
配列番号１、配列番号７、配列番号４および配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドを含有するＣＫ２０ｍＲＮＡの増幅用キット。