JP5083892B2 - ペルオキシレドキシン6(Prx6)に対するアプタマー - Google Patents
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Description
(1)配列番号1又は2に示す塩基配列を含むか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有することを特徴とするRNAアプタマー。
(2)配列番号3〜7のいずれかで示される塩基配列からなるか あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有することを特徴とするRNAアプタマー。
(3)配列番号8又は9に示す塩基配列を含むか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつ転写によって、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
(4)配列番号10〜14のいずれかで示される塩基配列からなるか あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
(5)5’末端にT7プロモータ配列が付加されている、上記(3)又は(4)に記載のDNA。
(6)上記(3)〜(5)のいずれかに記載のDNAと相補の塩基配列を有するDNA。
(7)上記(3)〜(5)のいずれかに記載のDNAと、その相補のDNAがハイブリダイズした2本鎖DNA。
(8)上記(1)又は(2)のRNAアプタマーからなる、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質の検出、定量用試薬。
(9)上記(8)に記載の検出、定量用試薬をペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質を含有するか、または含有する可能性のある試料と接触させることを含む、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質の検出及び/又は定量方法。
また、一般的に、アプタマーは、標的タンパク質中の認識部位のアミノ酸残基数は抗体に比較して少なく、アプタマーの高親和性モチーフは相同性の高いタンパク質同士を感度よく識別することができる。また、アプタマーは非変性条件下で標的分子を認識し、結合能を有することから、アプタマー分子を用いた結合アッセイにより、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質分子を非変性条件下で定量的に検出でき、生体内におけるのと類似の状態でペルオキシレドキシンを検出しうる。生体内におけるペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質を定量的に検出し、その分泌量の増減をモニタリングすることは生体が酸化ストレス状態になるのか否かの診断への途を拓くものである。
本発明の第1のアプタマーは、少なくとも配列番号1に示される塩基配列を含むRNAを包含する。その具体的なアプタマーとしては、例えば、配列番号3又は6に示されるRNAが挙げられ、これらRNAは上記配列番号1に示す配列を共通して有している。同第2のアプタマーは少なくとも配列番号2に示される塩基配列を含むRNAを包含し、その具体的なアプタマーとしては、配列番号4又は7に示されるRNAが挙げられ、これらRNAは配列番号2に示される塩基配列を共通して有している。また、他のアプタマーとしては、配列番号5に示される塩基配列からなるRNAが挙げられる。
また、本発明においては、本発明のアプタマーの塩基配列をヌクレオチド残基を1又は数個欠失、置換、あるいは付加させて改変したものであっても、上記ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質と結合するものであればこれを包含する。
SELEX法は、ランダム配列の核酸ライブラリの作成から出発し、標的とするタンパク質との結合性を指標に選別して、PCR増幅するサイクルを複数回繰り返すもので、これにより、標的とするタンパク質に対し高い結合能を有する核酸のみを選別することができる。上記選別及びPCR増幅はそれぞれ、自然界における「淘汰」及び「増殖」に相当し、自然界における進化を試験管内で短時間に再現させるものである。
本発明においてはこれら配列番号2及び配列番号5に示すRNAアプタマーをさらに短縮化して、配列番号6及び7に示されるRNAアプタマーを得ており、これら短縮化RNAアプタマーもペルオキシレドキシン6(Prx6)に対して、結合能を有する。本発明のアプタマーは、還元型のみでなく酸化型ペルオキシレドキシンを標的とした場合にも得られており、また、酸化型及びノ―マル型のいずれにも結合するが、測定された解離定数は、いずれのアプタマーにおいても、酸化型よりもノーマル型に対し同等もしくは高い結合性(最大10倍)を有していることを示している。
インビトロ転写法:合成目的のアプタマーRNAに対応する上記DNAを化学合成し、これをPCR増幅し、増幅されたDNAからRNAポリメラーゼによる転写反応によりRNAアプタマーを合成する。例えば、T7プロモータの下流側に上記DNAを連結してPCR増幅し2本鎖DNAを得て、該2本鎖DNAを鋳型として、5’-末端側プライマー、T7RNAポリメラーゼ、およびATP、GTP、CTP及びUTPからなる該RNAポリメラーゼ基質を含む反応溶液中で、RNA伸長反応を行うことにより、RNAアプタマーを得ることができる。
例えば、本発明のRNAアプタマーをフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光色素で標識し、被験試料と接触、結合反応を行い、結合しなかったものを除去した後、蛍光あるいはその強度を検出、測定することにより、ペルオキシレドキシン6(PrX6)タンパク質の検出、あるいはその量を測定できる。この際、例えば、標識RNAアプタマーあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことができる。
標識としては、上記蛍光色素に限らず、放射性標識でもよく、また、アビジンやストレプトアビジンで修飾することも可能で、アプタマーペルオキシレドキシン6(PrX6)タンパク質複合体の検出、定量にはビオチンを用いればよい。
このように、アプタマーは核酸であるため合成が簡便で様々な修飾や標識も付加しやすく、当業者であれば標的分子とアプタマーの結合を検出するための方法として、当分野で通常行われている方法を適宜利用することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
Prxタンパク質に特異的に結合するアプタマーのin vitroでの選別
選別に用いたRNAプール(30N)は既に報告したようにして調製した(Fukudaら, Eur. J. Biochem., 267, 3685-3694 (2000))。このRNAプールは次のようにプライマー結合領域ではさまれたランダムな30塩基のコアを含んでいる:
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG-N30-CCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'(配列番号18)。RNAプールの増幅に用いたプライマーは:5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG-3'((配列番号19)、以下39.N30と表記する。)
と5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'((配列番号20)、以下、24.N30と表記する。)である。選別サイクルにおいては大腸菌tRNA(Boehringer-Mannheim)を非特異的な競争阻害剤として用いた。
具体的には、ニッケルキレートコートのマイクロプレート(Xenopore社)を200 ulの緩衝液( 10 mM Tris-HCl; 7.5, 50 mM NaCl)で2回洗浄の後、標的タンパク質である還元型ペルオキシレドキシン6(nPrX6)タンパク質(1uM)および酸化型ペルオキシレドキシン(oxPrx)6タンパク質(1uM)を200ulずつ加えて4度で10時間インキュベート。その後、上記の200 ulの緩衝液で3回洗浄する。
各選別条件について、以下の表1,2に示す。
クローンA(配列番号15)、クローンB(配列番号16)、クローンC(配列番号5)、クローンD(配列番号17)、クローンE(配列番号3)、クローンF(配列番号4)。
このうち、クローンC、クローンE及びクローンFの2次構造は、それぞれ順に図3、4、5に示される。
上記各クローンの占有率を以下の表3に示す。
Prx6タンパク質に対する単離されたアプタマーの結合特異性
単離されたクローンA-Fの6種類のRNAアプタマーのPrxタンパク質に対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴装置(BIAcore T100(Biacore 社))を用いて測定した。結果を図6、7に示す。
これによれば、クローンC、E及びFは、クローンA、B及びDよりも酸化型ペルオキシドキシン6(oxPrx6)及び還元型ペルオキシドキシン6(nPrx6)のいずれに対しても高い結合能を有することが分かる。なお、クローンEは、還元型ペルオキシドキシン6(nPrx6)を標的として得られ、クローンFは酸化型ペルオキシドキシン6(oxPrx6)を標的として得られており、クローンCは還元型ペルオキシドキシン6(nPrx6)と酸化型ペルオキシドキシン6(oxPrx6)を標的とする場合の双方から得られたものである。
表面プラズモン共鳴法によるアプタマーの解離定数の測定
表面プラズモン共鳴法ではフィルター結合測定より感度が高く、より精度の高い解離定数の測定が可能と期待されたので、予備実験により親和性が高いと判断された3種類のRNAアプタマー(クローンC,E,F)とnPrx6タンパク質およびoxPrx6タンパク質との結合の解離定数を、表面プラズモン共鳴装置BIAcore T100(Biacore社)によって測定した。
RNAアプタマーによるPrx6酵素活性の阻害
単離されたRNAアプタマーがPrx6タンパク質と結合し、相互作用することで、Prx6タンパク質が本来持っている酵素活性を阻害するかどうかを以下のようにして検定した。
1mM EDTA、1.5μMチオレドキシン、0.3μM チオレドキシン還元酵素、0.2 mM NADPH を含む50mM Hepes-NaOH(pH7.0)に可変量のペルオキシレドキシンを添加し、30℃で3分間反応した。反応後、基質として100μMの過酸化水素を添加して反応を開始し,NADPH の消費を340 nm における吸光度の減少としてUV-2450(島津製作所)を用い経時的に測定した。NADPH の吸光係数は6.22 mM-1 cm-1 の値を用いて、酵素反応速度を求めた。試料を含まない対照を測定し,添加されている試薬による自発的な活性としてこれを差し引いた。RNAアプタマーによる酵素の阻害活性を検討する場合には、ペルオキシレドキシンと共存させ、同様の実験を行った。
図9は図8の検定におけるRNaseの影響を調べた結果であり、RNaseによる検定中のRNAアプタマーの分解が懸念されたものの、RNase阻害剤を加えた場合と加えなかった場合で優位差が見られないことから、本検定中のRNAアプタマーの分解はほとんどないと考えられた。
図10はクローンCのRNAアプタマーによる酵素阻害活性がアプタマーの濃度依存的に行われるかどうかを検定した結果で、加えるアプタマー濃度が2 μMまでは著しい濃度依存性が、それより高濃度では緩やかな濃度依存性が確認された。
上記一連の酵素阻害活性測定を基にしてPrx6タンパク質に対するクローンCアプタマーの阻害定数を求めたところ、ki値は1.4 μMとなった。
単離されたRNAアプタマーのミニマイズ化
単離されたRNAアプタマーの配列から全てのクローン間で共通であるプライマー領域を削除し、アプタマー分子の短縮化を行った。二次構造予測からもミニマイズされたアプタマーが全長のものと構造的に大きく変わらないことを確認して、ミニマイズされたアプタマーが標的分子との特異的な結合領域を含有すると想定した。調整法は以下の通りである。
このミニマイズされたRNAアプタマー配列に対応するDNAを化学合成し、さらにその上流にT7プロモーター領域を付加してこれをPCR増幅し、増幅されたDNAからRNAポリメラーゼによる転写反応によりRNAアプタマーを合成した。
これらミニマイズ化アプタマーについて、実施例3と同様にして、表面プラズモン共鳴装置を用いて、これらミニマイズ化アプタマーと還元型ペルオキシドキシン6(NPrx6)及び酸化型ペルオキシドキシン6との解離定数を求めた。結果は実施例3中の表3に併せて記載した。
Claims (9)
- 配列番号1又は2に示す塩基配列を含み、かつペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有することを特徴とするRNAアプタマー。
- 配列番号3〜7のいずれかで示される塩基配列からなる、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有することを特徴とするRNAアプタマー。
- 配列番号8又は9に示す塩基配列を含み、かつ転写によって、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
- 配列番号10〜14のいずれかで示される塩基配列からなる、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質に対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
- 5’末端にT7プロモータ配列が付加されている、請求項3又は4に記載のDNA。
- 請求項3〜5のいずれかに記載のDNAと相補の塩基配列を有するDNA。
- 請求項3〜5のいずれかに記載のDNAと、その相補のDNAがハイブリダイズした2本鎖DNA。
- 請求項1又は2のRNAアプタマーからなる、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質の検出、定量用試薬。
- 請求項8に記載の検出、定量用試薬をペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質を含有するか、または含有する可能性のある試料と接触させることを含む、ペルオキシレドキシン6(Prx6)タンパク質の検出及び/又は定量方法。
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