JP2002218999A - ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法 - Google Patents
ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）型小型球形ウイ
ルス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡを特異的に増幅したり、検出及
び同定を高感度で行なうために有効なオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせと、それらを用いたＧＩＩ型ＳＲＳＶ
ＲＮＡ検出法の提供。 【解決手段】ＲＮＡ増幅工程を利用した検出法におい
て、第一のプライマーとして増幅されるジェノグループ
ＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡ配列の一部と相同的な配
列を有する５種類の特定の配列で、いずれかの配列中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチド、第二のプライマーとして増幅されるジェノグル
ープＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡ配列の一部と相同的
な配列を有する５種類の特定の配列で、いずれかの配列
中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌ
クレオチドを用いることを特徴とする検出法。
ルス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡを特異的に増幅したり、検出及
び同定を高感度で行なうために有効なオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせと、それらを用いたＧＩＩ型ＳＲＳＶ
ＲＮＡ検出法の提供。 【解決手段】ＲＮＡ増幅工程を利用した検出法におい
て、第一のプライマーとして増幅されるジェノグループ
ＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡ配列の一部と相同的な配
列を有する５種類の特定の配列で、いずれかの配列中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレ
オチド、第二のプライマーとして増幅されるジェノグル
ープＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡ配列の一部と相同的
な配列を有する５種類の特定の配列で、いずれかの配列
中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌ
クレオチドを用いることを特徴とする検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】小型球形ウイルス（Ｓｍａｌ
ｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、
ＳＲＳＶ）は、一般にウイルス性食中毒の原因ウイルス
として知られている。本発明は、臨床検査、公衆衛生、
食品検査、食中毒検査におけるＳＲＳＶ特にジェノグル
ープＩＩ（ＧＩＩ）に属するウイルスの検出法に関する
ものである。
ｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、
ＳＲＳＶ）は、一般にウイルス性食中毒の原因ウイルス
として知られている。本発明は、臨床検査、公衆衛生、
食品検査、食中毒検査におけるＳＲＳＶ特にジェノグル
ープＩＩ（ＧＩＩ）に属するウイルスの検出法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕ
ｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）
はヒトカリシウイルスに属する。ヒトカリシウイルス
は、ジェノグループＩ（ＧＩ）、ジェノグループＩＩ
（ＧＩＩ）、ジェノグループＩＩＩ（ＧＩＩＩ）の３種
の遺伝子型に区別されてきた。一般に、ＧＩ、ＧＩＩは
ＳＲＳＶ、ＧＩＩＩは（狭義の）ヒトカリシウイルスと
呼ばれている。
ｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）
はヒトカリシウイルスに属する。ヒトカリシウイルス
は、ジェノグループＩ（ＧＩ）、ジェノグループＩＩ
（ＧＩＩ）、ジェノグループＩＩＩ（ＧＩＩＩ）の３種
の遺伝子型に区別されてきた。一般に、ＧＩ、ＧＩＩは
ＳＲＳＶ、ＧＩＩＩは（狭義の）ヒトカリシウイルスと
呼ばれている。
【０００３】我が国で届け出されている食中毒の約２０
％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイル
ス性食中毒例の約８０％以上からＳＲＳＶが検出され
る。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題とな
っている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎から
もＳＲＳＶが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性
も示唆されている。以上から、ＳＲＳＶの検査は、公衆
衛生上および食品の品質管理上大きな課題となってい
る。
％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイル
ス性食中毒例の約８０％以上からＳＲＳＶが検出され
る。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題とな
っている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎から
もＳＲＳＶが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性
も示唆されている。以上から、ＳＲＳＶの検査は、公衆
衛生上および食品の品質管理上大きな課題となってい
る。
【０００４】これまでＳＲＳＶの検出は、電子顕微鏡に
よる観察が基本であった。ただし、この方法は、検出す
るには１０6個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で、対象
が患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察でき
ても同定することはできなかった。
よる観察が基本であった。ただし、この方法は、検出す
るには１０6個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で、対象
が患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察でき
ても同定することはできなかった。
【０００５】近年、ヒトカリシウイルスのウイルス様中
空粒子が生産できるようになり、これを用いた特異抗体
検出ＥＬＩＳＡの検討も進められている。しかし、検出
感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度な方法とはい
えない。
空粒子が生産できるようになり、これを用いた特異抗体
検出ＥＬＩＳＡの検討も進められている。しかし、検出
感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度な方法とはい
えない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、従来法
では複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料中に
存在する極微量のＳＲＳＶを検出することは困難であ
り、食品検査等に必要な迅速かつ高感度な検出法の出現
が望まれている。さらには、検査をより簡便にするため
には、自動化された検査装置の開発が要求されている。
では複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料中に
存在する極微量のＳＲＳＶを検出することは困難であ
り、食品検査等に必要な迅速かつ高感度な検出法の出現
が望まれている。さらには、検査をより簡便にするため
には、自動化された検査装置の開発が要求されている。
【０００７】高感度な検出法としては標的核酸を増幅す
る方法の利用が可能である。ＳＲＳＶのようなゲノムが
ＲＮＡの特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメラ
ーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知られ
ている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤＮ
Ａを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端部
に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセンス
プライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮＡ
ポリメラーゼ存在下で、熱変性、プライマー・アニー
ル、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことに
よって特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。しかし、
ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写工程およびＰ
ＣＲ工程）、および、急激な昇温・降温を繰り返す操作
が必要であり、そのことが自動化への障害として挙げら
れる。
る方法の利用が可能である。ＳＲＳＶのようなゲノムが
ＲＮＡの特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメラ
ーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知られ
ている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤＮ
Ａを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端部
に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセンス
プライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮＡ
ポリメラーゼ存在下で、熱変性、プライマー・アニー
ル、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことに
よって特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。しかし、
ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写工程およびＰ
ＣＲ工程）、および、急激な昇温・降温を繰り返す操作
が必要であり、そのことが自動化への障害として挙げら
れる。
【０００８】一方、特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、
逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によ
って特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法
等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型と
し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、
およびリボヌクレアーゼＨにより、プロモーター配列を
含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型とし
てＲＮＡポリメラーゼにより、標的ＲＮＡの特定塩基配
列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモー
ター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応
を行なうものである。
逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によ
って特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法
等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型と
し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、
およびリボヌクレアーゼＨにより、プロモーター配列を
含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型とし
てＲＮＡポリメラーゼにより、標的ＲＮＡの特定塩基配
列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモー
ター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応
を行なうものである。
【０００９】このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的低
温（例えば４１℃）で反応を行なうために、標的ＲＮＡ
が分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反
応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、
増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行なうことで、標
的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を
向上させるための操作が必要であった。
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的低
温（例えば４１℃）で反応を行なうために、標的ＲＮＡ
が分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反
応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、
増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行なうことで、標
的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を
向上させるための操作が必要であった。
【００１０】そこで本願発明は、ＳＲＳＶ、その中でも
特にＧＩＩ型に属するウイルスのＲＮＡを比較的低温か
つ一定温度（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）で
特異的に切断したり、増幅したり、これらの検出および
同定を高感度で行なうために有用なオリゴヌクレオチド
の好適な組み合わせの提供を目的とするものである。
特にＧＩＩ型に属するウイルスのＲＮＡを比較的低温か
つ一定温度（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）で
特異的に切断したり、増幅したり、これらの検出および
同定を高感度で行なうために有用なオリゴヌクレオチド
の好適な組み合わせの提供を目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、ＧＩＩ型ＳＲＳＶＲ
ＮＡの増幅行程であり、試料中に存在するＧＩＩ型ＳＲ
ＳＶ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレ
アーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解
して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖のＤＮＡを鋳型と
してＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定
配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡ
を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを
生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存
在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引
き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤ
ＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅行程において、
ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡに相同的な配列を有する配列
番号１から５に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなる第一のプライマーと、配列
番号６から１２に示したいずれかの配列中の少なくとも
連続した１０塩基以上からなる、増幅されるＧＩＩ型Ｓ
ＲＳＶ ＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第二
のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのい
ずれか一方は、その５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含む）を用いることを特徴とする。
になされた本願請求項１の発明は、ＧＩＩ型ＳＲＳＶＲ
ＮＡの増幅行程であり、試料中に存在するＧＩＩ型ＳＲ
ＳＶ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレ
アーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解
して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖のＤＮＡを鋳型と
してＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定
配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡ
を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを
生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存
在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引
き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤ
ＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅行程において、
ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡに相同的な配列を有する配列
番号１から５に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなる第一のプライマーと、配列
番号６から１２に示したいずれかの配列中の少なくとも
連続した１０塩基以上からなる、増幅されるＧＩＩ型Ｓ
ＲＳＶ ＲＮＡ配列の一部と相補的な配列を有する第二
のプライマー（ここで第一または第二のプライマーのい
ずれか一方は、その５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含む）を用いることを特徴とする。
【００１２】本願請求項２の発明は、前記請求項１の発
明に係わり、前記ＲＮＡ増幅行程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することからなる（ただし該標識されたオリゴヌ
クレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異
なる配列である）。本願請求項３の発明は、前記請求項
２の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ
転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように
設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
特性が変化するものであることを特徴とする。そして本
願請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係わり、前
記オリゴヌクレオチドが、配列番号１３から１６に示し
たいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなる、またはその相補配列であることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。
明に係わり、前記ＲＮＡ増幅行程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することからなる（ただし該標識されたオリゴヌ
クレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異
なる配列である）。本願請求項３の発明は、前記請求項
２の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ
転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように
設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
特性が変化するものであることを特徴とする。そして本
願請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係わり、前
記オリゴヌクレオチドが、配列番号１３から１６に示し
たいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなる、またはその相補配列であることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明は、試料中のＧＩＩ型ＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡを増幅するための核酸増幅行程や、核酸増幅行程に
よって生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供する。本
発明の増幅行程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法
を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ
の協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメ
ラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）Ｇ
ＩＩ型ＳＲＳＶの特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ
法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。
ＮＡを増幅するための核酸増幅行程や、核酸増幅行程に
よって生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供する。本
発明の増幅行程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法
を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ
の協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメ
ラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させ）Ｇ
ＩＩ型ＳＲＳＶの特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ
法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。
【００１４】例えばＮＡＳＢＡ法は、試料中に存在する
ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成
し、リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖
のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖Ｄ
ＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
り、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅行
程であるが、本発明はＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡに相同
的な配列を有する配列番号１から５に示したいずれかの
配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる第一
のプライマーと、配列番号６から１２に示したいずれか
の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる、
増幅されるＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡ配列の一部と相補
的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または
第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側に
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成
し、リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖
のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖Ｄ
ＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
り、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅行
程であるが、本発明はＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡに相同
的な配列を有する配列番号１から５に示したいずれかの
配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる第一
のプライマーと、配列番号６から１２に示したいずれか
の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる、
増幅されるＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡ配列の一部と相補
的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または
第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側に
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
【００１５】なお、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ
は特に限定しないが、これらの活性のすべてを有してい
るＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファ
ージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ
は特に限定しないが、これらの活性のすべてを有してい
るＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファ
ージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。
【００１６】上記増幅行程では、ＧＩＩ型ＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末領域と重複
（１〜１０塩基）して隣接する領域に対し相補的なオリ
ゴヌクレオチドを添加し、前記ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮ
Ａを特定配列の５’末領域で切断（リボヌクレアーゼＨ
による）して核酸増幅初期の鋳型とすることにより、特
定配列が５’末端に位置していないＧＩＩ型ＳＲＳＶ
ＲＮＡをも増幅することができる。この切断のために
は、たとえば、配列番号６から１２のオリゴヌクレオチ
ド（ただし、前記増幅行程において第二のプライマーと
して使用したもの以外のオリゴヌクレオチド）を使用す
ることができる。なお、前記切断用オリゴヌクレオチド
は、３’末端からの伸長反応をおさえるために３’末水
酸基が化学的に修飾（たとえばアミノ化）されたもので
あることが望ましい。
ＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末領域と重複
（１〜１０塩基）して隣接する領域に対し相補的なオリ
ゴヌクレオチドを添加し、前記ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮ
Ａを特定配列の５’末領域で切断（リボヌクレアーゼＨ
による）して核酸増幅初期の鋳型とすることにより、特
定配列が５’末端に位置していないＧＩＩ型ＳＲＳＶ
ＲＮＡをも増幅することができる。この切断のために
は、たとえば、配列番号６から１２のオリゴヌクレオチ
ド（ただし、前記増幅行程において第二のプライマーと
して使用したもの以外のオリゴヌクレオチド）を使用す
ることができる。なお、前記切断用オリゴヌクレオチド
は、３’末端からの伸長反応をおさえるために３’末水
酸基が化学的に修飾（たとえばアミノ化）されたもので
あることが望ましい。
【００１７】以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は
既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な
態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリン
カーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させ
たもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７）。
既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な
態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリン
カーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させ
たもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７）。
【００１８】該オリゴヌクレオチドの配列は、増幅産物
の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に
限定しないが、配列番号１３から１６に示した配列中の
少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはそ
の相補配列であることが好ましい。また、該オリゴヌク
レオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該
オリゴヌクレオチドの３’末の水酸基は化学的に修飾
（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に
限定しないが、配列番号１３から１６に示した配列中の
少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはそ
の相補配列であることが好ましい。また、該オリゴヌク
レオチドをプライマーとした伸長反応を抑えるために該
オリゴヌクレオチドの３’末の水酸基は化学的に修飾
（たとえばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００１９】これにより、ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの
中の特定配列と同じ配列からなるＲＮＡを、一チューブ
内、一定温度、一段階で増幅し、検出することが可能と
なり、自動化への適用も容易となる。
中の特定配列と同じ配列からなるＲＮＡを、一チューブ
内、一定温度、一段階で増幅し、検出することが可能と
なり、自動化への適用も容易となる。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。
【００２１】実施例１ ＧＩＩ型ＳＲＳＶのＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌ
クレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。 （１）ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの塩基配列のうち、Ｒ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の全域と構造蛋白
遺伝子の一部を含む合計２８４３塩基の領域、および
５’末端側にベクター（ｐＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ製）由来の部分領域６９塩基を含む標準ＲＮＡ
（配列番号１７）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／
μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）、
５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０4コピー／５μＬとなる
よう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液
のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２０．８ μＬを０．５ ｍ
Ｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗ
ａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキン
エルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを
添加した。
クレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。 （１）ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの塩基配列のうち、Ｒ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の全域と構造蛋白
遺伝子の一部を含む合計２８４３塩基の領域、および
５’末端側にベクター（ｐＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ製）由来の部分領域６９塩基を含む標準ＲＮＡ
（配列番号１７）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／
μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）、
５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０4コピー／５μＬとなる
よう希釈した。コントロール試験区（陰性）には希釈液
のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２０．８ μＬを０．５ ｍ
Ｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗ
ａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキン
エルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを
添加した。
【００２２】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
１の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせにな
るよう溶液を調製した。 （４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成の酵素液４．２μＬを添加した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
１の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表１に示す組み合わせにな
るよう溶液を調製した。 （４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成の酵素液４．２μＬを添加した。
【００２３】酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０
μＬにおける値） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。 （６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造製）により行なった。標的ＲＮＡの特定部位にオリゴ
ヌクレオチドプローブが結合すると第２オリゴヌクレオ
チドと第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮＡ
が増幅され、特定バンドが観察される。
μＬにおける値） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。 （６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造製）により行なった。標的ＲＮＡの特定部位にオリゴ
ヌクレオチドプローブが結合すると第２オリゴヌクレオ
チドと第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮＡ
が増幅され、特定バンドが観察される。
【００２４】電気泳動結果の写真（白黒反転）を図１か
ら図３に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖
長は表１に示した通りである。これより表１に示したオ
リゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応
において、組み合わせ（ａ）から（ｈ）、（ｋ）から
（ｌ）にて特定バンドが確認できたため、これらの組み
合わせで使用したオリゴヌクレオチドはＧＩＩ型ＳＲＳ
Ｖの検出に有効であることが示された。
ら図３に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖
長は表１に示した通りである。これより表１に示したオ
リゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応
において、組み合わせ（ａ）から（ｈ）、（ｋ）から
（ｌ）にて特定バンドが確認できたため、これらの組み
合わせで使用したオリゴヌクレオチドはＧＩＩ型ＳＲＳ
Ｖの検出に有効であることが示された。
【００２５】
【表１】 表１は本実験系で用いた第１、第２、第３オリゴヌクレ
オチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いてＲ
ＮＡ増幅反応させたときに増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち、５’末端第１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモー
ター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。ま
た塩基番号は配列番号１７のうち、ＧＩＩ型ＳＲＳＶの
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子開始位置を１と
したときの番号である。
オチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いてＲ
ＮＡ増幅反応させたときに増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち、５’末端第１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモー
ター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。ま
た塩基番号は配列番号１７のうち、ＧＩＩ型ＳＲＳＶの
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子開始位置を１と
したときの番号である。
【００２６】 第１オリゴヌクレオチド Ｇ２−１Ｓ（配列番号１８、塩基番号４から４２） Ｇ２−２Ｓ（配列番号１９、塩基番号２９から６７） Ｇ２−３Ｓ（配列番号２０、 塩基番号８７から１２５） Ｇ２−１０Ｓ（配列番号２１、塩基番号７０７から７４５） Ｇ２−１１Ｓ（配列番号２２、塩基番号７９２から８３１） Ｇ２−１２Ｓ（配列番号２３、塩基番号１３０３から１３２２） 第２オリゴヌクレオチド Ｇ２−１Ｆ１（配列番号２４、塩基番号３７から５９） Ｇ２−１Ｆ２（配列番号２５、塩基番号３４から５６） Ｇ２−２Ｆ１（配列番号２６、塩基番号６２から８４） Ｇ２−２Ｆ２（配列番号２７、塩基番号５９から８１） Ｇ２−３Ｆ１（配列番号２８、塩基番号１２０から１４２） Ｇ２−３Ｆ２（配列番号２９、塩基番号１１７から１３９） Ｇ２−１０Ｆ１（配列番号３０、塩基番号７４０から７６２） Ｇ２−１０Ｆ２（配列番号３１、塩基番号７３７から７５９） Ｇ２−１１Ｆ１（配列番号３２、塩基番号８２６から８４８） Ｇ２−１１Ｆ２（配列番号３３、塩基番号８２３から８４５） Ｇ２−１２Ｆ１（配列番号３４、塩基番号９４７から９６９） Ｇ２−１２Ｆ２（配列番号３５、塩基番号９４４から９６６） 第３オリゴヌクレオチド Ｇ２−８Ｒ（配列番号９、塩基番号３２４から３４４） Ｇ２−１２Ｒ（配列番号１１、塩基番号９３０から９５２） Ｇ２−１７Ｒ（配列番号１２、塩基番号１３０３から１３２２） 実施例２ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、標的ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの様々な初期コピー
数における検出を行なった。 （１）実施例１と同様のＧＩＩ型ＳＲＳＶ標準ＲＮＡ
（配列番号１７）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ
／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造
製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０5コピー／５μＬ
から１０1コピー／５μＬまでとなるよう希釈した。コ
ントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２０．８μＬをＰＣＲ用チュ
ーブ（容量０．５ ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ
−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パー
キンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μ
Ｌを添加した。
て、標的ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの様々な初期コピー
数における検出を行なった。 （１）実施例１と同様のＧＩＩ型ＳＲＳＶ標準ＲＮＡ
（配列番号１７）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ
／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造
製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０5コピー／５μＬ
から１０1コピー／５μＬまでとなるよう希釈した。コ
ントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２０．８μＬをＰＣＲ用チュ
ーブ（容量０．５ ｍＬ；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ
−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パー
キンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μ
Ｌを添加した。
【００２７】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（Ｇ２−１Ｓ、
配列番号１８、３’末端の水酸基はアミノ化されてい
る。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（Ｇ２−１Ｆ２、
配列番号２５） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（Ｇ２−８Ｒ、配
列番号９） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−Ｇ２ ＳＲＳＶ−Ｓ−Ｇ、
配列番号１６、５’末端から７番目の「Ｔ」と８番目の
「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が
標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基
で修飾されている。）１３％ ＤＭＳＯ容量調整用蒸留
水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μＬを添加した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（Ｇ２−１Ｓ、
配列番号１８、３’末端の水酸基はアミノ化されてい
る。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（Ｇ２−１Ｆ２、
配列番号２５） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（Ｇ２−８Ｒ、配
列番号９） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−Ｇ２ ＳＲＳＶ−Ｓ−Ｇ、
配列番号１６、５’末端から７番目の「Ｔ」と８番目の
「Ａ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が
標識されている。また３’末端の水酸基はグリコール基
で修飾されている。）１３％ ＤＭＳＯ容量調整用蒸留
水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μＬを添加した。
【００２８】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
μＬにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
【００２９】酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図４（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図４（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／試験から１０5コピ
ー／試験である。
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図４（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図４（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／試験から１０5コピ
ー／試験である。
【００３０】図４より、１０3コピーが約２０分で検出
された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファ
イルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＧＩＩ型
ＳＲＳＶ ＲＮＡの定量が可能であることが示された。
以上より、本法により、ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの迅
速・高感度な検出が可能であることが示された。
された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファ
イルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＧＩＩ型
ＳＲＳＶ ＲＮＡの定量が可能であることが示された。
以上より、本法により、ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡの迅
速・高感度な検出が可能であることが示された。
【００３１】
【発明の効果】以上の説明のように本発明によれば、試
料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプロ
ーブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温度
（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、
ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合し、標的ＲＮ
Ａを迅速に増幅し、かつ検出等するためのオリゴヌクレ
オチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブの組み
合わせとして有用である。
料中のＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーやプロ
ーブの結合を阻害しかねない、比較的低温かつ一定温度
（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）条件下でも、
ＧＩＩ型ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合し、標的ＲＮ
Ａを迅速に増幅し、かつ検出等するためのオリゴヌクレ
オチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブの組み
合わせとして有用である。
【００３２】本願発明の組み合わせにおけるオリゴヌク
レオチドの塩基長は、具体的に記載した長さに限られ
ず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドを含む。これは、比較的低温
（好ましくは４１℃）条件下で、プライマーまたはプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基
程度の塩基配列があれば十分であることから明らかであ
る。
レオチドの塩基長は、具体的に記載した長さに限られ
ず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなるオリゴヌクレオチドを含む。これは、比較的低温
（好ましくは４１℃）条件下で、プライマーまたはプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０塩基
程度の塩基配列があれば十分であることから明らかであ
る。
【００３３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> ジェノグループＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡの検出法 <130> PA211-0383 <160> 35 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> Ｇ２−１Ｆ <400> 1 ccaatcttag gtccaggcag tgcccc 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−２Ｆ <400> 2 caaaactcag caccaagact aaattt 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−３Ｆ <400> 3 tacctatgaa ccagcctacc ttggcg 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１０Ｆ <400> 4 gggactcaac acaacagagg gccgta 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１２Ｆ <400> 5 tcctcactct ctgtgcactt tctgag 26 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１Ｒ <400> 6 taagattggt gcaccacagt 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−２Ｒ <400> 7 tgagttttgg ggcactgcct gg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−３Ｒ <400> 8 tcataggtac caggtgggag tg 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−８Ｒ <400> 9 ttgtcgaggg atgcgcatgc t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１０Ｒ <400> 10 ttgagtccca ccgagagtaa t 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１２Ｒ <400> 11 gagtgaggag ccagtgggcg atg 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１７Ｒ <400> 12 attaattgta tgggtctttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> プローブ（ａ） <400> 13 agtggtgctg tggatgatct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> プローブ（ｂ） <400> 14 ggacattgat gatggttttc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> プローブ（ｃ） <400> 15 aattgtttgt tcaaggacat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ＹＯ−Ｇ２ ＳＲＳＶ−Ｓ−Ｇ <400> 16 ccaaggtagg ctggttcata 20 <210> 17 <211> 2910 <212> RNA <213> Human calicivirus <220> <223> ジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）型小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の標準Ｒ ＮＡ <400> 17 gcgaauuggg cccucuagau gcaugcucga gcggccgcca gugugaugga uaucugcaga 60 auucggcuug gcggugacaa uaagggaacc uacuguggug caccaaucuu agguccaggc 120 agugccccaa aacucagcac caagacuaaa uuuuggagau cauccacagc accacuccca 180 ccugguaccu augaaccagc cuaccuuggc ggcaaggacc ccagagucaa gggugguccu 240 ucauugcaac aaguuaugag ggaccagcug aaaccauuca cugaacccag ggguaaacca 300 ccaaaaccaa guguguuaga agcugccaag aaaaccauca ucaauguccu ugaacaaaca 360 auugauccac cucaaaagug gucauucgcg caagcaugcg caucccucga caagaccacc 420uc uagugguc acccgcauca caugcggaaa aaugacugcu ggaacgggga guccuucaca 480 ggcaaauugg cagaccaggc uuccaaggcc aaccugaugu acgaagaggg aaagaacaug 540 accccaguuu acacgggugc gcuuaaggac gagcugguca agacugacaa aauuuauggc 600 aaaaucaaaa agaggcuucu cuggggcucg gaccuggcga ccaugauccg gugcgcucgg 660 gcuuuugggg gccugaugga ugaauucaag gcacauugug ucacacuccc cgucagagug 720 gguaugaaua ugaaugagga ugguccuauc aucuuugaga gacacuccag auauaaauau 780 cacuaugaug cugauuacuc ucggugggac ucaacacaac agagggccgu auuagcagca 840 gccuuagaaa ucaugguuaa guucucccca gaaccucauc uggcccaaaa gguugcagaa 900 gaccuucucu cucccagcgu gauggaugua ggugacuuca gaauaucaau caaugagggu 960 cuccccuccg ggguacccug caccucccaa uggaacucca ucgcccacug gcuccucacu 1020 cucugugcac uuucugaggu uacaaaccug uccccugaca uuauccaggc caacucccuc 1080 uuuuccuucu auggugauga ugaaauugug agcacagacg uaaagcugga cccagagaag 1140 uugacagcaa aacucaagga auacgggcug aaaccaaccc gcccugacaa gacugaggga 1200 ccccuuguua ucucugagga ccugaauggc uugaccuucc ugcggaggac ugugacccgc 1260 gauccagcug gcugguuugg aaaauuggaa cagaguucaa uacuuaggca aauguacugg 1320 acuaggggcc cuaaucauga agacccaucu gaaacaauga uaccacacuc ccaaagaccc 1380 auacaauuaa ugucuuugcu gggcgaggcu gcccuccacg gcccagcauu cuacagcaaa 1440 aucagcaagu uggucauugc agaacuaaag gaagguggca uggauuucua cgugcccaga 1500 caagagccaa uguucagaug gaugagauuc ucagaucuga gcacguggga gggcgaucgc 1560 aaucuggcuc ccaguuuugu gaaugaagau ggcgucgaau gacgccgcuc caucaaauga 1620 uggugcagcu agucucguac cagagggcau uaaugagacu augccauugg aacccguugc 1680 uggcgcaucu auugcugccc caguggcggg acaaaccaac auaauugacc ccuggauaag 1740 aacaaauuuu guacaagccc ccaauggaga guuuacagug ucaccaagaa auuccccugg 1800 agaaauuuua uuaaauuuag aauuaggacc agaucugaau ccuuauuugg cccaucuuuc 1860 aagaauguac aaugguuaug cuggaggugu ugaggugcaa gugcuccuug cugggaacgc 1920 guucacagca gguaagauau uguuugcagc aaucccaccu aacuuuccug uagauaugau 1980 uagcccagcu caaauuacua ugcuucccca uuugauugua gauguuagga cuuuggaacc 2040 uauuaugaua cccuugccug auguuaggaa uguguucuau cauuuuaaua aucaaccuca 2100 accuagaaug agguuagugg cuaugcucua caccccauug aggucuaaug guucaggaga 2160 ugaugucuuc acugugucuu guagaguacu aacuaggcca acuccugauu uugaauuuau 2220 uuaccuggug cccccuucug uagaguccaa aacuaaacca uucacacuac caauauuaac 2280 cauuucugaa uugaccaacu cccgguuccc cauuccaauc gagcaauugu auacggcucc 2340 aaaugaaacc aauguugucc agugucagaa uggcaggugc accuuagaug gagagcucca 2400 gggcacaacc cagcuguuau caagugcagu uugcucuuac aggggcagga cuguggcuaa 2460 uaauggggau aauugggacc aaaauuugcu ccagcugacc uauccaaaug gugcaagcua 2520 ugaccccacu gaugaagugc cagcaccauu gggcacucag gauuuuagug ggauguugua 2580 uggaguguug acccaggaca augugaaugu gagcacagga gaggccaaaa augcuaaggg 2640 aauauacaua uccaccacua guggaaaauu caccccaaaa auugggucaa uuggauugca 2700 uucaauaacu gagcaugugc accccaacca acagucgcgg uucacccccg ucggagucgc 2760 cgugaaugag aacacccccu uccagcaaug gguucugcca cauuaugcag guagucucgc 2820 ucucaacacc aauuuggcac cugcuguugc cccgacuuuc ccuggugagc aauugcuguu 2880 cuucaggucc cgugucccau gcguucaagg 2910 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１Ｓ <400> 18 taagattggt gcaccacagt aggttccctt attgtcacc 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−２Ｓ <400> 19 tgagttttgg ggcactgcct ggacctaaga ttggtgcac 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−３Ｓ <400> 20 tcataggtac caggtgggag tggtgctgtg gatgatctc 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１０Ｓ <400> 21 ttgagtccca ccgagagtaa tcagcatcat agtgatatt 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artifiial sequence <220> <223> Ｇ２−１１Ｓ <400> 22 ttctgcaacc ttttgggcca gatgaggttc tggggagaa 39 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１２Ｓ <400> 23 gagtgaggag ccagtgggcg atggagttcc attgggagg 39 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１Ｆ１ <400> 24 aattctaata cgactcacta tagggagaat cttaggtcca ggcagtgccc c 51 <210> 25 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１Ｆ２ <400> 25 aattctaata cgactcacta tagggagacc aatcttaggt ccaggcagtg c 51 <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−２Ｆ１ <400> 26 aattctaata cgactcacta tagggagaaa ctcagcacca agactaaatt t 51 <210> 27 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−２Ｆ２ <400> 27 aattctaata cgactcacta tagggagaca aaactcagca ccaagactaa a 51 <210> 28 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−３Ｆ１ <400> 28 aattctaata cgactcacta tagggagact atgaaccagc ctaccttggc g 51 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−３Ｆ２ <400> 29 aattctaata cgactcacta tagggagata cctatgaacc agcctacctt g 51 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１０Ｆ１ <400> 30 aattctaata cgactcacta tagggagaac tcaacacaac agagggccgt a 51 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１０Ｆ２ <400> 31 aattctaata cgactcacta tagggagagg gactcaacac aacagagggc c 51 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１１Ｆ１ <400> 32 aattctaata cgactcacta tagggagagc agaagacctt ctctctccca g 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１１Ｆ２ <400> 33 aattctaata cgactcacta tagggagagt tgcagaagac cttctctctc c 51 <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１２Ｆ１ <400> 34 aattctaata cgactcacta tagggagatc actctctgtg cactttctga g 51 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ｇ２−１２Ｆ２ <400> 35 aattctaata cgactcacta tagggagatc ctcactctct gtgcactttc t 51
【００３４】
【図１】実施例１で行なった初期ＲＮＡ量１０4コピー
／試験において、表２の組み合わせ（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の電
気泳動写真（白黒反転）。レーン１・２が組み合わせ
（ａ）、レーン４・５が組み合わせ（ｂ）、レーン７・
８が組み合わせ（ｃ）、レーン１０・１１が組み合わせ
（ｄ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９・１
２が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１
７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用
いても特定バンドが確認できた。
／試験において、表２の組み合わせ（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の電
気泳動写真（白黒反転）。レーン１・２が組み合わせ
（ａ）、レーン４・５が組み合わせ（ｂ）、レーン７・
８が組み合わせ（ｃ）、レーン１０・１１が組み合わせ
（ｄ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９・１
２が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１
７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用
いても特定バンドが確認できた。
【００３５】
【図２】実施例１で行なった初期ＲＮＡ量１０4コピー
／試験において、表２の組み合わせ（ｅ）〜（ｈ）のオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の電
気泳動写真（白黒反転）。レーン１・２が組み合わせ
（ｅ）、レーン４・５が組み合わせ（ｆ）、レーン７・
８が組み合わせ（ｇ）、レーン１０・１１が組み合わせ
（ｈ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９・１
２が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１
７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用
いても特定バンドが確認できた。
／試験において、表２の組み合わせ（ｅ）〜（ｈ）のオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の電
気泳動写真（白黒反転）。レーン１・２が組み合わせ
（ｅ）、レーン４・５が組み合わせ（ｆ）、レーン７・
８が組み合わせ（ｇ）、レーン１０・１１が組み合わせ
（ｈ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９・１
２が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１
７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用
いても特定バンドが確認できた。
【００３６】
【図３】実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０4コピー
／試験において、表２の組み合わせ（ｉ）〜（ｌ）のオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の電
気泳動写真（白黒反転）。レーン１・２が組み合わせ
（ｉ）、レーン４・５が組み合わせ（ｊ）、レーン７・
８が組み合わせ（ｋ）、レーン１０・１１が組み合わせ
（ｌ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９・１
２が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１
７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。このうち組み合わせ
（ｋ）と（ｌ）で特定バンドが確認できた。
／試験において、表２の組み合わせ（ｉ）〜（ｌ）のオ
リゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の電
気泳動写真（白黒反転）。レーン１・２が組み合わせ
（ｉ）、レーン４・５が組み合わせ（ｊ）、レーン７・
８が組み合わせ（ｋ）、レーン１０・１１が組み合わせ
（ｌ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９・１
２が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液の
みを用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１
７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ
４）を使用した（レーンＭ）。このうち組み合わせ
（ｋ）と（ｌ）で特定バンドが確認できた。
【００３７】
【図４】図４は実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０1
コピー／試験から１０5 コピー／試験において、反応時
間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加比のグラフ
（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間と
の間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コピー数１０
3 コピー／試験のＲＮＡが反応約２０分で検出でき、初
期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のあるこ
とが示された。
コピー／試験から１０5 コピー／試験において、反応時
間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加比のグラフ
（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間と
の間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コピー数１０
3 コピー／試験のＲＮＡが反応約２０分で検出でき、初
期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のあるこ
とが示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA01 CA04 CA09 CA11 FA02 FA06 HA12 4B063 QA01 QA07 QA18 QA19 QQ03 QQ10 QQ16 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR39 QR41 QR42 QR44 QR48 QR56 QR62 QS03 QS16 QS25 QS32 QS36 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】試料中に存在するジェノグループＩＩ型小
型球形ウイルスＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リ
ボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前
記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなる
ＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラ
ーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産
物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
るｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利
用した検出法において、配列番号１から５に示したいず
れかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
る、増幅されるジェノグループＩＩ型小型球形ウイルス
ＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライ
マーと、配列番号６から１２に示したいずれかの配列中
の少なくとも連続した１０塩基以上からなるジェノグル
ープＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡの配列の一部と相補
的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または
第二のプライマーのいずれか一方は、５’側にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列を付加した配列を有する
プライマーである）を用いることを特徴とするジェノグ
ループＩＩ型小型球形ウイルスＲＮＡの増幅行程。 - 【請求項２】前記ＲＮＡ増幅工程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつ
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌク
レオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測
定することからなる請求項第１項に記載の工程（ただし
該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一および第
二のプライマーとは異なる配列である）。 - 【請求項３】前記プローブが、ＲＮＡ転写産物の少なく
とも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体
を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するも
のであることを特徴とする請求項第２項に記載の検出方
法。 - 【請求項４】前記プローブが、配列番号１３から１６に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
からなる配列、あるいはその相補配列であることを特徴
とする請求項第３項に記載の検出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001020231A JP2002218999A (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法 |
| US09/989,002 US6630300B2 (en) | 2000-11-21 | 2001-11-21 | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting Genogroup II type small round structured virus |
| EP01309779A EP1209242A3 (en) | 2000-11-21 | 2001-11-21 | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting genogroup II type small round structured virus (SRSV) |
| US10/441,126 US7339041B2 (en) | 2000-11-21 | 2003-05-20 | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting Genogroup II type small round structured virus |
| US10/678,124 US20040063096A1 (en) | 2000-11-21 | 2003-10-06 | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting genogroup II type small round structured virus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001020231A JP2002218999A (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002218999A true JP2002218999A (ja) | 2002-08-06 |
Family
ID=18885971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001020231A Pending JP2002218999A (ja) | 2000-11-21 | 2001-01-29 | ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002218999A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245434A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-09-15 | Tosoh Corp | ノロウイルスの検出試薬 |
| JP2009000063A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 |
-
2001
- 2001-01-29 JP JP2001020231A patent/JP2002218999A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245434A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-09-15 | Tosoh Corp | ノロウイルスの検出試薬 |
| JP2009000063A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 |
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