CN117143972A - 一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，包括以下步骤，步骤一、在EP管内配置上述的反应体系；步骤二、通过微量移液器吸取1μLmiRNA加入反应体系的EP管内；步骤三、DNA单链的形成；步骤四、扩增反应；步骤五、flap序列的形成；步骤六、循环切割放大：步骤七、荧光信号的循环放大，切割下的flap序列会与FRET探针结合，再次形成单碱基侵入结构，该结构被FEN1酶切割，产生荧光信号，同时释放flap序列，释放后的flap序列在与未被切割的FRET探针结合，循环放大。该检测方法具有操作简便、特异性强、成本低廉和不易造成检测样本污染的优点。

Description

一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法
技术领域
本发明涉及检测方法，特别涉及一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类短小的非编码RNA分子，在基因表达调控、细胞发育和疾病发生等生物学过程中发挥着重要的调控作用。miRNA的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关，因此，开发灵敏、特异、准确的miRNA检测方法对于深入理解miRNA功能以及疾病的诊断和治疗具有重要意义。
传统的miRNA检测方法包括逆转录-PCR法、质谱法和Northern blotting等，这些方法在一定程度上能够满足miRNA的检测需求，但存在一些局限性，如操作复杂、特异性差、灵敏度低或需要大量的起始RNA材料等。新的检测方法也不断出现，例如：基于滚环扩增的方法，这类方法操作相对简单，能够实现单个miRNA的定量检测，但该方法需要设计特定的引物，并且若要实现高灵敏的检测其扩增时间要求较长；基于同位素标记的方法，这类方法可以同时检测多个miRNA，并具有较高的准确性，但放射性同位素使用可能存在安全性和环境污染的问题，需要严格的操作控制；基于纳米材料的检测方法，这类方法具有高灵敏度、反应速度快的优点，但纳米材料的制备和修饰可能需要额外的步骤和技术支持。基于电化学的检测技术，这类方法响应速度快，但操作和数据分析相对复杂。因此，研究人员一直致力于开发新的miRNA检测方法，以克服这些限制，并提高miRNA检测的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，具有操作便捷、灵敏度高、特异性强、成本低廉和不易造成检测样本污染的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，包括以下步骤，
步骤一、配置反应体系：该反应体系的配比为，
10mM Tris-HCl生物缓冲液(pH 8.0)、
0.05％(v/v)细胞组织裂解液NP-40、
0.05％(v/v)Tween-20非离子型表面活性剂、
7.5mM MgCl2、
200μM of each dNTP、
4nM of第一连接探针La和第二连接探针Lb、
0.4μM of each primer、
1U单位的Taq聚合酶、
80U单位的FEN1酶,
50nM的上游探针UP、
250nM的下游探针DP、
250nM的FRET探针、
25U的Splint R连接酶；
其余为DEPC水；
步骤二、通过微量移液器吸取1μLmiRNA加入反应体系的EP管内；
步骤三、DNA单链的形成：反应温度16℃，时间25min，第一连接探针La和第二连接探针Lb与标靶miRNA序列互补，形成RNA/DNA互补双链结构，同时连接酶识别RNA/DNA互补双链结构；
步骤四、扩增反应：DNA单链与反应体系内的PCR扩增引物结合，进行扩增反应，同时,上游探针UP和下游探针DP会与结合到DNA单链中的靶标检测区域，形成单碱基侵入结构；
步骤五、flap序列的形成：单碱基侵入结构会被FEN1酶特异性识别，并切割单碱基侵入结构的下游探针DP的5’端(不结合的序列)，形成flap序列；
步骤六、循环切割放大：切割下的下游探针DP会由于Tm值的变化被未切割的下游探针DP替换，再次形成核酸侵入结构；
步骤七、荧光信号的循环放大，切割下的flap序列会与FRET探针结合，再次形成单碱基侵入结构，该结构被FEN1酶切割，产生荧光信号，同时释放flap序列，释放后的flap序列在与未被切割的FRET探针结合，循环放大。
作为优选，所述步骤一至步骤七在同一EP管内实现。
作为优选，所述步骤三至步骤七是同时进行的。
作为优选，所述连接酶为SplintR Ligase连接酶或T4连接酶。
作为优选，所述步骤三至步骤七的反应条件为95℃时间为10min的预变性阶段；扩增反应的条件为温度95℃时长20s、温度63℃时长60s和温度72℃时长20s的40次循环。
作为优选，所述PCR扩增引物包括F扩增引物与R扩增引物，所述F扩增引物的核酸序列包括GCTCGACCTCTCTATGGGC，所述R扩增引物的核酸序列包括TTAAGCCCTGCGTGTCTCC。
作为优选，所述miRNA的核酸序列包括UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG，所述第一连接探针La的核酸序列包括CTCGACCTCTCTATGGGCAGTCACGACCAAACACCAT，所述第二连接探针Lb的核酸序列包括TGTCACACTCCACTGAGTCGGAGACACGCAGGGCTTAA。
作为优选，所述上游探针UP的核酸序列包括TCTCCGACTCAGTGGAGTGTT，所述下游探针的核酸序列包括CGCGCCGAGGGACAATG GTGTTTGGTC，所述FRET探针的核酸序列包括FAM-TCT/iBHQ1dT/AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-spacer C3。
作为优选，所述步骤一中DEPC水补充至总反应体系体积至20μL。
综上所述，设计了具有通用区域和特异性靶标识别区域的连接探针，利用SplintR连接酶对RNA和DNA结合序列的高效连接能力，使探针与目标miRNA形成互补序列的连接产物。然后通过核酸侵入信号扩增反应，对连接产物进行高灵敏、高特异的检测，从而实现对miRNA的定量检测；
该方法的优势包括：
操作简便：全部反应在1个反应管内进行，无需大量操作步骤；
灵敏度高：PCR扩增偶联级联核酸侵入反应对连接产物进行了双重循环信号放大，使反应可检测到低至10E1拷贝的miRNA模板；
特异性强：核酸侵入反应具有单碱基识别能力，保证了检测的特异性；
成本低廉：该反应无需昂贵的检测设备，仅需一台荧光PCR即可，且引物和荧光探针具有序列通用性，不受检测模板影响；
不易造成检测样本污染：反应不是对模板进行直接扩增，采用信号扩增放大方式，降低生物样本模板扩增污染的可能；
可根据不同的序列，进行不同的探针和实验设计，采用相同的双重循环信号方法的方法。
附图说明
图1是连接反应可行性示意图；
图2是连接反应偶联核酸侵入反应可行性示意图；
图3是灵敏性考察示意图；
图4是定量范围与线性示意图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例：
miRNA-122的检测，是一类短小的非编码RNA分子，在基因表达调控、细胞发育和疾病发生等生物学过程中发挥着重要的调控作用。miRNA的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关。
其中个序列如下：
F:GCTCGACCTCTCTATGGGC
R:TTAAGCCCTGCGTGTCTCC
miRNA-122:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG
miRNA-122-La:CTCGACCTCTCTATGGGCAGTCACGACCAAACACCAT
miRNA-122-Lb:TGTCACACTCCACTGAGTCGGAGACACGCAGGGCTTAA
miRNA-122-UP:TCTCCGACTCAGTGGAGT GTT
miRNA-122-DP:CGCGCCGAGGGACAATG GTGTTTGGTC
miRNA-122-FRET:FAM-TCT/iBHQ1dT/AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-spacerC3
反应体系为：
10mM Tris-HCl生物缓冲液(pH 8.0)、
0.05％(v/v)细胞组织裂解液NP-40、
0.05％(v/v)Tween-20非离子型表面活性剂、
7.5mM MgCl2、
200μM of each dNTP、
4nM of第一连接探针La和第二连接探针Lb、
0.4μM of each primer、
1U单位的Taq聚合酶、
80U单位的FEN1酶,
50nM的上游探针UP、
250nM的下游探针DP、
250nM的FRET探针、
25U的Splint R连接酶，最后通过DEPC水补充总反应体系的体积至20μL；
0.4μM of each primer是指扩增反应中的F引物和R引物。
反应体系中的连接酶为SplintR Ligase连接酶或T4连接酶，本实施例中连接酶选用SplintR Ligase连接酶。
一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，包括以下步骤，
步骤一、在EP管内配置上述的反应体系；
步骤二、通过微量移液器吸取1μLmiRNA加入反应体系的EP管内；
步骤三、DNA单链的形成：反应温度16℃，时间25min，第一连接探针La和第二连接探针Lb与标靶miRNA序列互补，形成RNA/DNA互补双链结构，然后进行反应条件为95℃时间为10min的预变性反应，连接酶识别RNA/DNA互补双链结构；
步骤四、扩增反应：DNA单链与反应体系内的PCR扩增引物结合，进行扩增反应，同时,上游探针UP和下游探针DP会与结合到DNA单链中的靶标检测区域，形成单碱基侵入结构，扩增反应的条件为温度95℃时长20s、温度63℃时长60s和温度72℃时长20s，并进行40次循环；
步骤五、flap序列的形成：单碱基侵入结构会被FEN1酶特异性结合，并切割单碱基侵入结构的下游探针DP的5’端(不结合的序列)，形成flap序列；
步骤六、循环切割放大：切割下的下游探针DP会由于Tm值的变化被未切割的下游探针DP替换，再次形成核酸侵入结构；
步骤七、荧光信号的循环放大，切割下的flap序列会与FRET探针结合，再次形成单碱基侵入结构，该结构被FEN1酶切割，产生荧光信号，同时释放flap序列，释放后的flap序列在与未被切割的FRET探针结合，循环放大。
步骤一至步骤七在同一EP管内实现，同时步骤三至步骤七是同时进行的,全部反应在1个反应管内进行，操作更加方便。
反应结果判断，如图1至图4所示，
图1：连接反应电泳图。泳道1-泳道9上样在右测列出，其中泳道5、泳道6、泳道7和泳道8均产生连接产物(Lab链)，说明采用SplintR连接酶和T4连接酶均可进行连接反应，同时采用Invader反应Buffer也可以进行连接反应。
图2：连接反应偶联核酸侵入反应。考差了在不同反应buffer条件下，连接反应偶联核酸侵入反应的结果。其中每种反应Buffer条件下，分别加入miRNA模板(Target)和无模板空白对照(NTC)。结果显示，采用Invader Buffer条件下，连接反应偶联核酸侵入反应的阳性信号反应效率最高，且空白对照的信号最低。
图3：所建方法的检测灵敏度。采用miRNA122合成序列作为检测模板，梯度稀释至105拷贝-101拷贝，加入反应体系进行检测，结果显示该方法可检测到低至101拷贝的miRNA靶标，并且和NTC(无模板对照)可以区分。
图4：定量范围与线性。该方法的靶标浓度的log值与ct值在靶标浓度为105拷贝-101拷贝之间成线性关系，关系式为：Ct值＝-5.3308*Log(靶标浓度)+31.243，R2＝0.9869,可通过ct值进行靶标浓度的定量。(该线性关系式只适用于miRNA122,对于不同的miRNA靶标，由于检测探针的不同，反应效率会不同，线性关系式不同，但都会产生一个相应的关系式可以进行定量检测。

Claims (9)

1.一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一、配置反应体系：该反应体系的配比为，
10mM Tris-HCl生物缓冲液(pH 8.0)、
0.05％(v/v)细胞组织裂解液NP-40、
0.05％(v/v)Tween-20非离子型表面活性剂、
7.5mM MgCl 2、
200μM of each dNTP、
4nM of第一连接探针La和第二连接探针Lb、
0.4μM of each primer、
1U单位的Taq聚合酶、
80U单位的FEN1酶,
50nM的上游探针UP、
250nM的下游探针DP、
250nM的FRET探针、
25U的Splint R连接酶、
其余为DEPC水；
步骤二、通过微量移液器吸取1μLmiRNA加入反应体系的EP管内；
步骤三、DNA单链的形成：反应温度16℃，时间25min，第一连接探针La和第二连接探针Lb与标靶miRNA序列互补，形成RNA/DNA互补双链结构，同时连接酶识别RNA/DNA互补双链结构；
步骤四、扩增反应：DNA单链与反应体系内的PCR扩增引物结合，进行扩增反应，同时上游探针UP和下游探针DP会结合到DNA单链中的靶标检测区域，形成单碱基侵入结构；
步骤五、flap序列的形成：单碱基侵入结构会被FEN1酶特异性识别，并切割单碱基侵入结构的下游探针DP的5’端(不结合的序列)，形成flap序列；
步骤六、循环切割放大：切割下的下游探针DP会由于Tm值的变化被未切割的下游探针DP替换，再次形成核酸侵入结构；
步骤七、荧光信号的循环放大，切割下的flap序列会与FRET探针结合，再次形成单碱基侵入结构，该结构被FEN1酶切割，产生荧光信号，同时释放flap序列，释放后的flap序列在与未被切割的FRET探针结合，循环放大。
2.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述步骤一至步骤七在同一EP管内实现。
3.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述步骤三至步骤七是同时进行的。
4.根据权利要求3所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述步骤三至步骤七的反应条件为95℃时间为10min的预变性阶段；扩增反应的条件为温度95℃时长20s、温度63℃时长60s和温度72℃时长20s的40次循环。
5.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述连接酶为SplintR Ligase连接酶或T4连接酶。
6.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述PCR扩增引物包括F扩增引物与R扩增引物，所述F扩增引物的核酸序列包括GCTCGACCTCTCTATGGGC，所述R扩增引物的核酸序列包括TTAAGCCCTGCGTGTCTCC。
7.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述miRNA的核酸序列包括UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG，所述第一连接探针La的核酸序列包括CTCGACCTCTCTATGGGCAGTCACGACCAAACACCAT，所述第二连接探针Lb的核酸序列包括TGTCACACTCCACTGAGTCGGAGACACGCAGGGCTTAA。
8.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述上游探针UP的核酸序列包括TCTCCGACTCAGTGGAGTGTT，所述下游探针的核酸序列包括CGCGCCGAGGGACAATG GTGTTTGGTC，所述FRET探针的核酸序列包括FAM-TCT/iBHQ1dT/AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-spacer C3。
9.根据权利要求1所述的一种基于连接反应偶联核酸侵入反应的miRNA检测方法，其特征在于：所述步骤一中DEPC水补充至总反应体系体积至20μL。
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