CN1333465A - 用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒 - Google Patents

用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用同组异序引物延伸法检测和/或定量样品中存在的靶DNA或RNA的方法。本方法包括于不存在某一游离核苷酸时进行引物延伸反应,从而当不存在的该核苷酸要被插入时,引物延伸反应被终止。所以,检测引物延伸产物中标记的核苷酸掺入的量,就可确定样品中靶RNA或DNA的量。

Description

用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒
本发明涉及用同组异序引物延伸(iPE)法检测和定量特异性DNA或RNA的方法。
常规用于检测和定量核酸(如DNA和RNA)特异性序列的方法包括Southern印迹，Northern分析和RNA酶保护分析和聚合酶链式反应(PCR)及其他方法。但如果考虑到样品中的某个特异性RNA的检测，Northern印迹和RNA酶保护分析就存在以下缺陷：有效性有限、劳动强度大、精确度低、成本高、灵敏度低、需要较多的RNA样品、特定的设备，且将产生大量生物危险性和放射性废物。具体的说，Northern印迹和RNA酶保护分析都需要2-3天来完成分析。另外，Northern印迹需要RNA凝胶跑样、将RNA转移到固相载体上、制备探针、和进行杂交反应。敏感性则需要5μg样品以保证足够的敏感度。Northern印迹的理论基础是靶核酸与探针核酸间的杂交。另外，每次反应的成本非常高，而且产生的生物危险性和放射性废物的量也非常多。
类似的，RNA酶保护分析需要2-3天得到适合的结果。试验步骤需要制备模板DNA、制备RNA探针、进行杂交反应、酶消化反应和凝胶跑样。为了得到良好的结果，需要1μg靶RNA样品。RNA酶保护分析的理论基础是将杂交和酶消化反应联合。与Northern印迹方法相同，进行这种反应的成本也很昂贵。另外也产生大量生物危险性和放射性废物。表1列出了Northern印迹、RNA酶保护分析和本发明多引物延伸方法各种因素的比较。
美国专利No.5,846,710公开了用引物延伸方法来筛选变异的DNA分子。但该专利并未公开对样品中靶DNA或RNA的检测。
美国专利No.5,994,079公开了将DNA引物与特异性RNA退火形成RNA/DNA杂交体，并用逆转录酶延伸引物。用对RNA/DNA杂交体的特异性抗体检测杂交体。但该专利未公开如本发明所述的检测样品中靶DNA或RNA的方法。
可以看出本领域需要一种简单、节约时间的检测核酸的方法，而且这种方法敏感、成本低、有效，且对环境的影响小。以下所述的本发明满足了这些要求。
本发明满足了上述要求。
本发明涉及检测和定量样品中靶核酸的方法，该方法包括：
(a)制备特异性配对于靶核酸预定位点的一种或多种引物；
(b)在高度严谨条件下将(a)的一种或多种引物与靶核酸退火，在靶核酸预定位点得到引物-靶核酸双链体；
(c)将(b)的引物-核酸双链体与一混合物混合，该混合物含有：
    (1)一种或两种或三种类型游离非终止子核苷酸，和至少一种类型的非终止子核苷酸，它任选地标记有可检测标记物，和
    (2)有或无某一类型的终止子核苷酸，该核苷酸与(1)中的一种或两种或三种非终止子核苷酸不同；
(d)通过酶促或化学反应在适当的缓冲液中进行引物延伸；和
(e)检测或定量引物延伸的核苷酸上标记信号的量，或
(f)用质谱分析检测或定量延伸的引物的量。
在上述方法中，引物可以是一种核酸引物、寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。感兴趣核酸可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
在一优选实施例中，该方法包括用含有如下非终止子和终止子核苷酸的组合：
(a)dATP、dCTP、dGTP、ddTTP或ddUTP，
(b)dATP、dCTP、dTTP或dUTP、ddGTP，
(c)dATP、dGTP、dTTP或dUTP、ddCTP，
(d)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP、ddATP，
(e)dATP、dCTP、dGTP
(f)dATP、dCTP、dTTP或dUTP，
(g)dATP、dGTP、dTTP或dUTP或
(h)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。
本发明的方法可使用至少一种标记有可检测标记物的非终止子核苷酸。可检测的标记物包括酶或蛋白质部分、放射性同位素、荧光部分或化学基团(如生物素)。另外，检测或定量方法的步骤中还可用质谱分析进行。
用于本发明引物延伸反应的酶包括模板依赖性酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I或其克列诺片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、逆转录病毒逆转录酶、或它们的组合。
可从以下本发明的描述、附带的参考图和权利要求，对本发明的这些和其他目的有更全面的理解。
图1-多引物延伸反应以检测和定量特异性DNA序列的模式图。图2-用多引物延伸方法检测和定量RNA的模式图。图中直线表示引物序列，小写字母a、g、c和t是从引物延伸的碱基，其中一些标记有可检测的标记物。u和t可交换使用。
本发明涉及用同组异序引物延伸(iPE)法检测和定量特异性核苷酸序列的方法。概括而言，本发明是将样品中的靶DNA或RNA与单个或多个寡核苷酸引物杂交。然后在存在一种、两种或三种类型预标记的游离核苷酸时，用DNA聚合酶或逆转录酶延伸引物。连续延伸所需的四种类型的核苷酸中至少一种未参与反应，或被相应类型的终止子核苷酸(如双脱氧核苷酸)替代。然后通过确定延伸的引物上是否存在标记物产生的信号，检测和定量特异性靶核酸。因为延伸的引物与游离核苷酸分开，延伸的引物可用于分析标记物的掺入量。
延伸相应于靶核酸某一位置的引物，将产生许多相同长度(同组异序)的引物延伸的核酸，因为序列依赖性地掺入了确定量的核苷酸。定量这些同等延伸的引物，就能精确定量靶核酸的数目或数量。如果样品中有许多靶DNA或RNA的拷贝，掺入带标记核苷酸的引物延伸产物的拷贝数也相应地增加，从而产生更强的总信号。因此，将未知样品中观察到的信号强度与已知DNA或RNA量的标准样品相比较，就可检测和/或定量样品中的靶DNA或RNA。在另一实施例中，用质谱分析测定这些相同长度引物延伸核酸的数量，即可检测或定量特异性靶核酸。
反应缓冲液中无某一游离核苷酸将使引物延伸终止，这里原应插入缺少的核苷酸。这样就可得到不连续长度的引物延伸产物。
本发明范围中可有许多显而易见的改变。例如，在引物延伸反应中不仅可缺少一种类型的核苷酸，也可以缺少两种或三种类型核苷酸。同样也可使用各种标记物，不仅仅限于放射性核苷酸，也可以是荧光的或酶促的。
这里所用的“核酸”或“核苷酸”可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。核酸样品可以是天然的或合成的。核酸样品可以是天然来源的核酸，也可来自任何生物体。可用于本发明方法的一些生物体为：植物、微生物、病毒、鸟、脊椎动物、无脊椎动物、哺乳动物、人、马、狗、牛、猫、猪或羊。靶核酸可以是天然的，或可以是体内酶促合成的、体外酶促合成的或非酶促合成的。
含有一种感兴趣的核酸或多种感兴趣的核酸的样品可以含有来自生物体的基因组DNA、它们的RNA转录物、或由这些RNA转录物制备的cDNA。含有一种感兴趣的核酸或多种感兴趣的核酸的样品也可含有生物体基因组外的DNA、它们的RNA转录物、或由这些RNA转录物制备的cDNA。同样，该感兴趣的核酸或这些感兴趣的核酸可通过聚合酶链式反应合成。
感兴趣的核酸可包括非天然核苷酸类似物，如脱氧肌苷或7-脱氮-2’-脱氧鸟苷。这些类似物使DNA双链失去稳定，且可以在双链样品中与引物退火，并发生延伸反应，而无需完全分离链。
感兴趣的核酸可以包括一种或更多组成成分，使得可以从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。例如，感兴趣的核酸可以含有生物素，使得可以通过使生物素结合于抗生物素蛋白或其类似物(附着于固相载体)，从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。感兴趣的核酸序列可包括的DNA或RNA序列，可通过与存在于核酸中的互补序列配对的碱基(附着于固相载体)，从未掺入的试剂和/或引物中亲和分离出感兴趣的核酸。感兴趣的核酸可标记有可检测的标记物；该可检测标记物可不同于试剂中存在的或附着于引物的任何可检测标记物。
这里的“正常核苷酸”或“正常碱基”是试图在该碱基位点鉴定突变的野生型或以前已知的标准核苷酸碱基。“标准核苷酸碱基”包括任何已知的碱基，可以是野生型或已知的突变型碱基(只要该碱基是已知的并希望了解其变体)。所以作为例子，正常碱基可以是已知的野生型碱基，而想在该位点寻找突变。相反，已知的碱基可以是已知的突变体，则在该位点寻找野生型碱基的存在。另外，已知的正常碱基可以是已知的突变体，而对其寻找另一个突变体变异碱基。所以，本发明的方法可应用于用于确定该位点是否存在任何其它碱基变体的任何已知的序列。
这里的术语“引物”或“寡核苷酸引物”指一种寡核苷酸，当处于存在各种因子如核苷酸和酶(如DNA聚合酶)以及适合的温度和pH允许合成与核酸(模板)链互补的引物延伸产物的条件下，其具有作为合成起始点的能力。
术语“引物”也可定义为从任何来源得到的任何核酸片段。例如，引物可以通过破碎较大的核酸片段(如基因组DNA、cDNA、或从PCR得到的DNA)产生。也就是说，引物的特性不受如何得到该引物的限制，无论其是破碎天然或合成核酸或由合成核酸引物得到的。另外，引物可以是寡脱氧核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸共聚物、寡核糖核苷酸、核糖核苷酸共聚物、或脱氧核苷酸和核糖核苷酸共聚物。引物可以是天然或合成的。寡核苷酸引物可以是体内酶促合成的、体外酶促合成的、或体外非酶促合成的。引物可标记有可检测的标记物；该可检测的标记物可不同于试剂中存在的或附着于感兴趣的核酸的任何可检测标记物。另外，引物的序列必须相应于感兴趣的特定位置的侧翼序列，该位置毗邻被鉴定的核苷酸碱基或为其上游。
另外，引物必须具有与感兴趣的核酸中的核苷酸杂交或退火的能力。一种实现所希望的杂交的途径是，让模板依赖性引物实际上或完全互补于已知的碱基序列。
寡核苷酸引物可包括一种或多种成分，将引物连接于固相载体，使得可以从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。这些亲和成分包括，但不限制于，毛地黄皂苷、磁珠、和配体，如蛋白配体(包括抗体)。较佳的成分是生物素。在用生物素的实验中，含有生物素的引物通过生物素结合于链霉抗生物素蛋白(附着于固相载体)，可从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。寡核苷酸引物序列可包括的DNA序列，通过与核酸中互补序列配对的碱基(附着于固相载体)，能从未掺入试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
这里所用的术语“引物延伸反应”指的是在反应条件下可进行模板依赖性核酸合成反应。部分地通过适当的模板依赖性酶的存在，可创造发生模板依赖性引物延伸反应的条件。一些适合的模板依赖性酶是DNA聚合酶。DNA聚合酶可以有许多类型。但DNA聚合酶必须是引物和模板依赖性的。例如可以用大肠杆菌DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶(“测序酶”)、水生栖热菌DNA聚合酶、或逆转录病毒的逆转录酶。同样在一些方案中可用RNA聚合酶，如T3或T7 RNA聚合酶。在杂交和延伸反应中，不同的聚合酶必须用不同的条件和不同的温度范围。
这里所用的术语“引物延伸链”包括，在引物被加入后，形成的与双链体中模板相反的链。较佳的是，通过终止子掺入引物延伸链终止引物延伸。
这里所用的术语“模板”指的核酸，包括双链DNA、单链DNA和RNA，或任何它们的修饰，而且可以是任何长度或序列。
这里所用的术语“终止子”或“链终止子”指核酸碱基，如A、G、C、T、或U，或类似物，它在掺入与模板链相反的引物延伸链时能有效地终止引物延伸反应。较佳的终止子是双脱氧核苷酸。同样较佳的是，终止子或者无标记物或者有标记物，但应区别于非终止子的标记物。当这里所用的术语“终止子”或“链终止子”为单数时，并不意味所用的是单个核苷酸分子。术语“终止子”的单数形式是指用于分析的核苷酸、核酸碱基或核酸类似物的类型。例如，如果终止子是ddA，则单数形式指所有ddA整体，而不是ddA单分子。另外，“终止子”可以是特定类型核苷酸的缺乏，这样可以通过基因座上缺少特定核苷酸而终止引物的延伸。例如，如果希望引物延伸反应终止于模板链上“C”的对面，则在引物延伸反应混合物中应包括非终止碱基A、T和C，但不能有“G”(与“C”互补)。所以，缺乏互补碱基将终止引物延伸反应，其效果与加入双脱氧终止子核苷酸的效果一样。
这里所用的术语“非终止子”或“非链终止子”包括的核苷酸碱基，在掺入引物延伸链时不终止引物延伸反应。较佳的是，在引物延伸反应中至少标记一种非终止子。如这里所用，当术语“非终止子”或“非链终止子”为单数时，并不意味所用的是单个核苷酸分子。术语“非终止子”的单数形式是指用于分析的核苷酸、核酸碱基或核酸类似物的类型。例如，如果终止子是G，则单数形式是指所有的G的整体，而不是指单分子G。
这里所用的术语“突变体”或“突变”指模板链上任何不同于野生型或正常碱基的碱基。用本发明方法检测的突变可以是任何类型的突变，包括单碱基突变、插入、缺失、或基因易位，只要与紧靠退火的引物3’位的碱基直接相对的模板上的碱基受到影响。
这里所用的术语“标记物”指任何连接于终止子或非终止子核苷酸来提供检测信号的分子。标记物可以是放射性的、化学发光的，蛋白配体如抗体，或者如果用荧光基团时，每一类型的非终止子核苷酸碱基可用不同的荧光基团。这些荧光标记物的发射光谱应可分辨。
另外，确定在引物延伸产物中掺入核苷酸碱基的水平的方法，可用质谱技术测定，在美国专利No.5,885,775中已列举，这里引用作为参考。
这里所用的短语“高度严谨的杂交条件”指核酸杂交条件如，但不限制于，42℃用0.1XSSC洗涤条件。在常规分子生物学手册中一般可找到杂交条件，如Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology，Greene和Wiley，pub.(1994)，这里引用作为参考。
这里所用的“薄层层析(TLC)”可在以纤维素产品为基础的纸介质上进行，但可由能让分子很好分散并形成均匀一层的任何物质组成。该物质包括，但并不限制于，无机物如硅胶、氧化铝、硅藻土或硅酸镁。有机物包括，但并不限制于，纤维素、聚酰胺或聚乙烯粉末。薄层层析方法一般描述于化学手册，如阐述于Freifelder，Physical Biochemistry-Applications to Biochemistry and Molecular Biology，second ed.，由Freeman和Co.出版(1982)，这里引用作为参考，特别是第8章在229-232页讨论了层析技术尤其是薄层层析。
对感兴趣的核酸鉴定和/或定量方法的一种改变是，在合适的变性条件下进行延伸反应后，分离出来自感兴趣核酸的引物延伸链。这种变性条件可以包括加热、碱性条件、甲酰胺、尿素、乙二醛、酶和它们的组合。这种变性条件还可包括用2.0N NaOH处理。
本领域技术人员将理解，终止子可标记有不同于非终止子的标记物，用于辨别引物延伸链中终止子或非终止子的掺入。本发明申请中为简化说明，终止子示例为缺少特定类型的核苷酸，但该说明对权项无任何形式的限制。本发明还包括不同标记的或未标记的终止子，只要终止子上的标记物不同于非终止子上的标记物。
本领域技术人员同样可以理解，只要模板序列至少有部分已知就可设计一种引物，该引物能结合于模板链而发生引物在模板链上的结合。本领域的技术人员还可理解，本发明的方法可通过用一支或更多支分析试管中的若干引物实践。
本发明方法的一个特性为，如果几种非终止子同样被标记的话，就可产生强信号，因为几种标记的非终止子掺入引物延伸链将产生有加和作用的信号。当各种终止子或非终止子有特异的不同标记物时，观察其信号可提高精确度。
本发明的另一目的是提供一种试剂盒和试剂，用于如所需要的定量或非定量地、迅速且精确地确定样品中是否存在靶核酸。可将试剂盒的各成分各自装在适合的容器中。各容器也可以识别其内含物的形式贴上标签。另外，可将各包装好的成分置于一较大的能储存所有需要成分的容器中。且试剂盒附带有说明如何使用此试剂盒的说明书。这种说明书可以印在试剂盒上或附在其中。
以下实施例用于说明本发明，但对权项无任何限制。
实施例
用RNAzol B(Tels-tel，TX)方法从大鼠脑提取全RNA。用O.D.260nm吸光度测定全RNA的浓度。用无RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水稀释全RNA。将5μl各种含量的RNA稀释液(如表2所示)置于各管中，然后与1μl合成的寡核苷酸引物5’-GTGGGAACCGTGTCA-3’(SEQ ID NO：1)混合，此序列是与大鼠脑特异性cDNA配对的序列(未发表资料)。70℃加热此RNA-引物混合物3分钟，在冰上培育3分钟。将这些管迅速旋动后，加入14μl含终浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、15单位的RNA酶抑制剂、0.5mM dATP、dGTP、1μl dCTPα32P和100单位MMVL-逆转录酶的反应混合物，开始引物延伸反应。在37℃下反应进行20分钟，100℃加热反应管2分钟终止反应。将1μl反应混合物作薄层层析(TRIM USA，Maryland)分出游离的dCTPα32P。然后用闪烁计数器(Beckman LS 5000)测定标记引物的放射性。表2显示了结果。
上述所有步骤包括化学、操作和流程是自动化的或是能够自动化的。因此，将本发明优选模式纳入适当编程的机器人工作区的操作，将显著节省成本并将增加任何诊断手续(依赖于检测得自生物样品的核酸中特定核苷酸序列或序列差异的手续)的效率。
这里引用的所有参考文献都全部引证包括在说明书中。
表1
MPE方法与Northern分析和RNA酶保护分析的比较
    方法  所耗时间   试验流程 敏感度  原理 成本 生物危险性/放射性废料
Northern分析  2-3天 ●RNA凝胶跑样●RNA转移●制备探针●杂交 5μg  只有杂交 高     高
RNA酶保护分析  2-3天 ●制备模板DNA●制备RNA探针●杂交●酶消化●凝胶跑样 1μg  杂交和酶消化 高     高
MPE  1小时 ●引物延伸 1ng  杂交和特异性延伸 低     低
表2
 RNA量(ng) 标记的引物(cpm)
    20     31552
    10     29756
    5     26066
    2     16779
    1     11156
    0.5     6587
    0     6703
                 序列表<110>王小兵
 森泽  绅胜<120>用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒<130>900315<140><141><150>US 60/209,987<151>2000-06-08<150>US<151>2001-05-23<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>1gtgggaaccg tgtca                                                 15<210>2<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>2tgatcagcag gctgaaatcg tcgtggattg caacgacgcc gacgattctc gtcctttaag 60gcgatagcat                                           70<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>3tcgtcggcgt cgttgc                                    16<210>4<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>4aaaggacgag aa                                        12<210>5<211>70<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>5ugaucagcag gcugaaaucg ucguggauug caacgacgcc gacgauucuc guccuuuaag 60gcgauagcau                                                        70<210>6<211>8<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>6gcctgctg                                              8<210>7<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>7ccacgacga                                             9<210>8<211>8<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>8ttaaagga                                              8<210>9<211>5<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸<400>9gattt                                                 5

Claims (40)

1.一种检测或定量样品中靶核酸的方法，其特征在于，包括：
(a)制备一种或多种引物，该引物特异性配对于靶核酸的预定位置；
(b)在高度严谨的条件下，将(a)中的一种或多种引物与靶核酸退火，在靶核酸预定位置上得到引物-核酸双链体；
(c)使(b)的引物-核酸双链体与以下混合物混合，该混合物包括：
    (1)一种或两种或三种类型的游离的非终止子核苷酸和至少一种类型的的任选地标记有可检测的标记物的非终止子核苷酸，和
    (2)有或无一种类型与(1)的一种或两种或三种类型非终止子核苷酸不同的终止子核苷酸；
(d)在合适的缓冲液中用酶或化学反应进行引物延伸反应；和
(e)检测或定量引物延伸的核苷酸中标记信号的量，或
(f)用质谱检测或定量延伸的引物的量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物是核酸引物、寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸、或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感兴趣的核酸是脱氧核糖核酸、核糖核酸、或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非终止子核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的终止子是双脱氧核糖核苷酸。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非终止子和终止子核苷酸混合液的组合是：
(a)dATP、dCTP、dGTP、ddTTP或ddUTP，
(b)dATP、dCTP、dTTP或dUTP、ddGTP，
(c)dATP、dGTP、dTTP或dUTP、ddCTP，
(d)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP、ddATP，
(e)dATP、dCTP、dGTP
(f)dATP、dCTP、dTTP或dUTP，
(g)dATP、dGTP、dTTP或dUTP或
(h)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的至少一种非终止子核苷酸标记有可检测的标记物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的终止子核苷酸标记有或未标记与非终止子核苷酸的标记物不同的可检测标记物。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物包括酶或蛋白质部分、放射性同位素、荧光部分或化学基团。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非终止子和终止子核苷酸是不带标记物的，通过质谱分析延伸的引物量进行检测或定量步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶是模板依赖性的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的模板依赖性酶是DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的模板依赖性酶是大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、噬热菌DNA聚合酶、逆转录病毒逆转录酶、或它们的组合。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是在体内、体外酶促合成的或非酶促合成的。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是由聚合酶链式反应合成的。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸含有非天然核苷酸类似物。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的非天然核苷酸类似物包括脱氧肌苷或7-脱氮-2’-脱氧鸟苷。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸包括生物体的基因组DNA、它的RNA转录物、或由生物体RNA转录物制备的cDNA。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物体是植物、微生物、细菌、病毒。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物体是脊椎动物或无脊椎动物。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物体是哺乳动物。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物体是人。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增步骤是在靶核酸上进行的。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述的扩增步骤包括克隆、转录、聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增、或环介导的等温扩增。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物包括一种或多种成分，从而可以从未掺入的试剂和/或感兴趣的核酸中亲和分离出引物。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物包括一种或多种成分，使引物固定到固相载体上产生固定的引物序列。
27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述的成分包括特定的化学基团，如生物素或毛地黄皂苷。
28.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述的组成成分包括DNA或RNA序列，可通过碱基配对于固相载体存在的互补序列，将引物连接到固相载体。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，直接在固相载体上合成引物，产生固定的引物序列。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的合成是用酶促或化学或物理方法进行的。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述的引物固定在固相载体上，产生固定的靶核酸序列。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物是可逆地固定到固相载体上的。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述的引物可用化学、酶促或物理方法从固相载体上切割下。
34.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸固定在固相载体上，产生固定的靶核酸序列。
35.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是可逆地固定到固相载体上的。
36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸可用化学、酶促或物理方法从固相载体上切割下。
37.如权利要求31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固定是通过光可切割的键实现的。
38.如权利要求26、29、31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固相载体包括小珠、平面、芯片、毛细管、针头、梳或干糊片。
39.如权利要求31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固定是通过互补的捕捉核酸分子与核酸分子的部分之间杂交完成的，其中捕捉的核酸预先固定在固相载体上，且核酸分子的部分与靶核酸序列不同。
40.如权利要求31、32、34或35任一所述的方法，其特征在于，所述的固定是通过固相载体和核酸分子的部分之间直接结合完成的，且所述的核酸分子的部分与靶核酸序列不同。
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