CN111855990A - 一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，该方法的主要步骤包括(1)crRNA的设计、转录和纯化；(2)通用探针在纳米粒子上的标记；(3)Linker探针的制备；(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应；(5)纳米粒子的显色反应与结果读取。本发明还包括基于该方法的一种试剂盒及其应用。本发明可以实现裸眼室温均相检测，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等特点，其成本廉价及较强通用性有利于现场检验与基层医疗系统的推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人类面对的威胁也越来越多。人类渴望能够快速鉴定病原微生物的检验技术和试剂，来区分种类繁多且变异迅速的病原微生物，面对鱼龙混杂的转核酸食品，人类也迫切希望能够快速甄别转核酸食品的含量与危害。然而传统实验室检测方法操作繁琐，周期长，依赖一些高精尖仪器，且对操作人员的技术水平要求比较高，并不能很好满足人类的需求。因此无论从哪种方面均亟需发展通用、简单和经济的生物传感技术来准确进行核酸鉴定，从而采取相应措施，避免造成损失。
随着胶体金诊断技术的发展，相对快速准确的胶体金试纸条在生物检测领域得到了很大的发展应用。尽管其在快速检测应用上有很大的空间，但是，这种检测方法针对每种不同的检测核酸都要重新设计相应的抗体或捕获探针，提高了使用成本，在通用性上也大打折扣。近年来，一种名为CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)的基因编辑技术迅速发展，这项技术不但可以应用于DNA编辑，而且也已被扩展到了RNA编辑领域。在CRIAPR技术中，CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a具有两种不同的催化能力，被用于特定的DNA/RNA靶基因识别。它们可以在识别靶基因的情况下，不仅对靶标基因有剪切作用，同时对反应体系中的其他单链DNA或RNA也进行剪切。但这种方法在基因检测方面的应用往往依赖于电泳技术和荧光定量技术，同样面临着基层一线推广难、检测成本高的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，具体包括以下步骤：
(1)crRNA的设计、转录和纯化：
crRNA探针的设计：如果靶核酸为DNA则根据Cas12a蛋白的识别机理进行设计，如果靶核酸为RNA则根据Cas13a蛋白的识别机理进行设计。
crRNA探针的转录：根据设计好的crRNA序列进行体外转录。
crRNA探针的纯化：将转录产物采用市售的相关纯化试剂盒进行纯化。
(2)通用探针在纳米粒子上的标记：
所述纳米粒子为具有距离效应产生光学性质变化的纳米粒子；所述通用探针至少为一种，且其序列的一端带有修饰基团或一段多聚A或者其他亲和序列，使其能够标记到纳米粒子上从而得到标记有通用探针的纳米粒子溶液。
所述纳米粒子包括但不限于纳米金、磁珠、荧光微球、量子点、上转换纳米粒子等。
所述的修饰基团包括但不限于巯基、生物素等。
所述标记方法包括但不限于冷冻法、盐标法、pH法等。
(3)Linker探针的制备：
所述Linker探针至少为一种，且其与步骤(2)所述通用探针存在部分互补序列，两者通过杂交可使纳米粒子交联变色；如果靶核酸为DNA则所述Linker探针为DNA序列，如果靶核酸为RNA则所述Linker探针为RNA序列。
(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应：
将待测样品的核酸与步骤(3)得到的Linker探针置于CRISPR/Cas系统中进行剪切反应；如果靶核酸为DNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas12a/crRNA复合物；如果靶核酸为RNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas13a/crRNA复合物；所述crRNA为步骤(1)得到的产物。
(5)纳米粒子的显色反应与结果读取：
将步骤(4)所述剪切反应的产物与步骤(2)所述标记有通用探针的纳米粒子溶液进行反应，放置一段时间后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理，如果溶液颜色不发生变化或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色变为无色或透明，则待测样品中不含目的核酸。
显色反应混合液放置一段时间后可进行特殊处理，可以使显色对比结果更快更显著，所述特殊处理方法为离心、过滤、加热和冷冻处理中的任一种，其中离心和过滤是为了除去混合溶液中已经交联聚集的纳米粒子颗粒的影响；加热或冷冻处理是为了加快纳米粒子颗粒的交联聚集速度，使显色更快。
如果溶液的颜色变浅，说明待测核酸的浓度比较低，但此时仍然可以确定待测核酸中含有目的核酸。
优选地，步骤(2)所述的纳米粒子为胶体金。所述胶体金的粒径大小为5nm-50nm，所述胶体金的浓度要求为1nM-50nM。
进一步地，步骤(2)所述的通用探针为至少含有5个碱基A的多聚A序列。多聚A可以吸附在胶体金表面使得探针可以标记到胶体金颗粒上。
进一步地，步骤(2)所述的通用探针为两种不同的探针，分别标记在胶体金上；步骤(3)所述Linker探针为一种，且与两种通用探针都存在部分互补序列，能够通过杂交作用使胶体金交联变色。
更进一步地，步骤(5)所述显色反应具体为：预混，将标记了两种不同探针的胶体金按1:1的比例混匀；显色，将步骤(4)所述的剪切反应产物加入到预混好的胶体金中，所述反应产物与预混好的胶体金比例为1:3，放置5min后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理；如果溶液颜色仍为红色或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色由红色变为无色，则待测样品中不含目的核酸。
进一步地，如果步骤(5)所述显色反应的颜色区分不明显，可通过测量混合溶液在纳米粒子最大吸收峰处的紫外吸收值来进行判断，所述吸收值大于检测限则视为含有目的核酸。
最大吸收值的测量与所选的纳米粒子相关，选取该纳米粒子最大吸收值处波长进行测量。在测量最大吸收值的分析中，只要待测核酸的最大吸收值高于检测限，我们就可以判定，待测样品中含有目的核酸。检测限是待测样品中目的核酸能被检测出的最低量，用以表示测定方法在所述条件下对待测样品中目的核酸的最低检出浓度。
更进一步地，所述检测限为阴性标准品产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。
阴性标准品是将水作为待测样品，不含目的核酸，测量其显色液的吸收值大小，为了避免误差，通常多组实验测量后取平均值，计算得到检测限。
本发明还包括一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒，采用以上所述检测方法进行检测，包含A、B两个分试剂盒：
A分试剂盒包括CRISPR/Cas系统的剪切反应所需的Cas12a蛋白/crRNA复合物和/或Cas13a蛋白/crRNA复合物、对应的Cas12a蛋白反应buffer和/或Cas13a蛋白反应buffer、胶体金Linker DNA和/或Linker RNA及其他相关试剂；
B分试剂盒包括已标记两种不同通用探针的胶体金混合液，所述两种通用探针能够与A分试剂盒中所述胶体金Linker进行杂交从而使胶体金交联变色。
更进一步地，待测样品的核酸先与所述A分试剂盒中的试剂进行剪切反应，然后再与所述B分试剂盒中的试剂进行显色反应，通过离心、过滤、加热、冷冻等处理后观察颜色变化来判断检测结果。
本发明还包括所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒在核酸检测中的应用。
本发明所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及其试剂盒不仅可以直接检测待测样品是否含有目的核酸，还可以通过检测样品中是否含有保守序列等来鉴定物种。
本发明的原理为当目的核酸存在时，CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a在识别目的核酸的同时还会使纳米粒子的Linker DNA/RNA被剪切，从而纳米粒子颗粒不发生交联，本发明通过判断纳米粒子的交联状态来检测核酸。具体如图1所示：
当存在目的核酸时，Cas蛋白/crRNA复合物可以与其结合(DNA靶标可以由Cas12a蛋白/crRNA复合物结合，RNA靶标可以由Cas13a蛋白/crRNA复合物结合)，Cas蛋白的cis切割活性被激发，目的核酸被切割，同时，Cas蛋白的trans切割活性被激发，反应溶液中的单链纳米粒子Linker被切割；当反应液与后续的被标记过探针的纳米粒子溶液混合时，纳米粒子颗粒不会发生交联聚集，溶液颜色仍保持原来的颜色；
反之，当不存在目的核酸的时，Cas蛋白/crRNA复合物不会与其结合，后续的Cas蛋白的cis切割活性与trans切割活性不会被激发，反应溶液中的单链纳米粒子Linker不会被切割，此时，再将反应液与后续的被标记过探针的纳米粒子溶液混合时，纳米粒子颗粒会由于Linker序列的存在发生交联聚集，溶液颜色会逐渐变为无色。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明提供的一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法较传统方法可用于裸眼室温均相检测，检测时间短、特异性高、灵敏度强的特点。
2、本发明提供的一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法不需要依赖高精尖的仪器，对操作人员及操作环境要求低，便携性强。
3、本发明提供的一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法只需针对不同靶标设计相应crRNA即可，显色体系通用性强。
4、本发明提供的一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法所涉及的试剂材料等便宜，检测成本廉价。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法的原理图。
图2是实施例1中核酸检测方法的具体流程示意图。
图3是实施例2中针对转基因水稻的检测结果图。
图4是实施例3中针对miR-17的检测结果图。
具体实施方式
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1
一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法
1、crRNA的设计、转录和纯化：
如果靶核酸为DNA则根据Cas12a蛋白的识别机理进行设计，如果靶核酸为RNA则根据Cas13a蛋白的识别机理进行设计。
本实施例的crRNA的转录方法为：T7RNA聚合酶体外转录法。反应条件为37℃恒温4小时，具体反应体系如下：
crRNA转录体系(20μL)
| 反应物 | 加入量 | 终浓度 |
| 双蒸水 | 11μL | - |
| 模板DNA | 0.5μL | 400ng |
| 10×RNA聚合酶buffer | 2μL | 1× |
| NTP混合物(10mM) | 4μL | 2mM |
| RNA酶抑制剂 | 0.5μL | 20U |
| T7RNA聚合酶 | 2μL | 20U |
本实施例中转录得到的的crRNA序列为：
Cas12a蛋白的crRNA：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(划线部分为目的基因识别区域)(SEQ ID NO:1)(N为碱基A、T、G或C)
Cas13a蛋白的crRNA：
NGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(划线部分为目的基因识别区域)(SEQ ID NO:2)(N为碱基A、U、G或C)
将转录产物用相应的纯化试剂盒进行纯化后冻存在-80℃以备使用。
2、胶体金的制备与通用探针的标记：
本实施例采用柠檬酸钠还原法制备胶体金：将100mL浓度为1mM的HAuCl4加热沸腾，带沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，两分钟内溶液颜色由金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌15-30分钟，停止加热后继续搅拌冷却至室温，即可得到胶体金溶液，胶体金粒径为13nm左右。
本实施例中的采用两种不同的通用探针，对应的序列分别为：
Poly A10-P1：AAAAAAAAAATTTTTATGATGTTCGTTGTG(SEQ ID NO:3)
Poly A10-P2：AAAAAAAAAATTTTTCGTTTAGGATTTGTG(SEQ ID NO:4)
本实施例中的探针的标记方法为冷冻法，具体步骤为：按照每3μL浓度为100μM与100μL的胶体金进行混合，混匀后放于-20℃冰箱中冷冻，冷冻标记时间不低于2小时；解冻后将溶液于4℃、12000rpm/min下离心30分钟；吸去上清后使用清洗buffer(0.1M NaCl，0.01M磷酸缓冲液，pH 7.4)重悬，再于4℃、12000rpm/min下离心30分钟，此步骤重复三次；最后使用重悬buffer(0.3M氯化钠，0.01M磷酸缓冲液，pH 7.4)重悬，即得到标记了探针的胶体金溶液。
3、Linker探针的制备：
本实施例中的胶体金linker DNA/RNA的序列为：
Linker DNA：TCCTAAACACCACAACGAAC(SEQ ID NO:5)
Linker RNA：UCCUAAACACCACAACGAAC(SEQ ID NO:6)
其中，Linker DNA/RNA序列双划线部分与通用探针Poly A10-P2序列的划线部分互补配对；Linker DNA/RNA序列单划线部分与通用探针Poly A10-P1序列的划线部分互补配对。通过Linker DNA/RNA与通用探针的杂交可使胶体金交联聚集变色。
4、CRISPR/Cas系统的剪切反应：
将待测样品的核酸序列与步骤3得到的Linker探针置于CRISPR/Cas系统中进行剪切反应；如果靶核酸为DNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas12a/crRNA复合物；如果靶核酸为RNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas13a/crRNA复合物；其中的crRNA为由步骤1制备得到。
本实施例中剪切反应的条件为37℃恒温20分钟，具体反应体系如下：
剪切反应体系(20μL)
| 反应物 | 加入量 | 终浓度 |
| 双蒸水 | 12μL | - |
| 10×Cas蛋白反应buffer | 2μL | 1× |
| Cas蛋白/crRNA复合物 | 2μL | 100nM |
| LinkerDNA/RNA | 2μL | 200nM |
| 靶标 | 2μL | 10nM |
5、胶体金的显色反应与结果读取：
胶体金的预混：将标记了两种探针的胶体金各取30μL混匀；
显色反应实验：将CRISPR/Cas系统的反应产物加入到预混好的胶体金中，加入比例为20μL反应液与60μL预混好的胶体金混匀，室温放置5分钟后在5000r/min的转速下离心30s。
结果读取：当样品中不含目的核酸时，胶体金的Linker DNA/RNA未被剪切，胶体金颗粒发生聚集，溶液颜色发生变化，由红色最终变为无色；当样品中含有目的核酸时，胶体金的Linker DNA/RNA被剪切，胶体金颗粒不聚集，溶液的颜色仍保持红色。
本实施例的核酸检测方法的具体流程示意图如图2所示，其中步骤(A)为CRISPR/Cas系统的剪切反应；步骤(B)为标记有不同通用探针的两种胶体金溶液的混合；步骤(C)为显色反应及结果读取。
6、如果上述显色反应的颜色区分不明显，可通过测量混合溶液在纳米粒子最大吸收峰处的紫外吸收值来进行判断，所述吸收值大于检测限则视为含有目的核酸。
所述检测限为阴性标准品产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。其中的阴性标准品是将水作为待测样品，不含目的核酸，测量其显色液的吸收值大小，为了避免误差，通常多组实验测量后取平均值，计算得到检测限。
实施例2
基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法检测转基因水稻
1、转基因水稻的基因组DNA提取
采用天根植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)对不同含量转基因的水稻(转基因水稻和普通水稻混合)(转基因水稻由华南师范大学生命科学学院阳成伟教授馈赠)抽提基因组DNA。
2、靶基因的引物设计及扩增
转基因水稻的特异性核酸为CaMV 35S启动子序列，针对该序列设计相应的RPA扩增引物；所涉及的引物序列如下：
CaMV35S-RPA-F：TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGC(SEQ ID NO:7)
CaMV35S-RPA-R：GTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTG(SEQ ID NO:8)
CaMV 35S启动子扩增序列如下：
TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCAC(SEQ ID NO:9)
所述的RPA扩增反应体系如下，RPA扩增反应为恒温37℃，反应30分钟。
RPA扩增体系为(50μL)
| 反应物 | 加入量 | 终浓度 |
| 引物1(10μM) | 2.4μL | 800nM |
| 引物2(10μM) | 2.4μL | 800nM |
| 重溶buffer | 29.5μL | 1× |
| 模板DNA和双蒸水 | 13.2μL | - |
| 醋酸镁溶液 | 2.5μL | 14mM |
3、crRNA探针的设计、转录和纯化
转基因水稻的RPA扩增长度为266bp，在扩增序列中寻找Cas12a可以识别的PAM(TTTN)位点序列，根据PAM位点信息设计针对CaMV 35S启动子的crRNA；根据设计好的crRNA序列进行体外转录并纯化；所涉及的序列如下：
CaMV 35S crDNA 1：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTCTTGTAGATTCGCAATGATGGCATTTGTA(划线部分为T7启动子区)(SEQ ID NO:10)
CaMV 35S crDNA 2：
TACAAATGCCATCATTGCGAATCTACAAGAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQID NO:11)
CaMV 35S crRNA：UAAUUUCUACUCUUGUAGAUTCGCAATGATGGCATTTGTA(划线部分为靶向CaMV 35S启动子区域)(SEQ ID NO:12)
CaMV 35S crDNA 1与CaMV 35S crDNA 2经过退火处理之后，可以作为后续转录CaMV 35S crRNA的模板。
4、胶体金的制备与通用探针的标记
使用柠檬酸钠还原法制备胶体金，将100mL浓度为1mM的HAuCl4加热沸腾，带沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，两分钟内溶液颜色由金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌15-30分钟，停止加热后继续搅拌冷却至室温，即可得到胶体金溶液，测紫外吸收光谱最大吸收峰位于520nm处，胶体金粒径为13nm左右，胶体金粒径大小与加入的柠檬酸钠体积有关。
探针的标记采用冷冻法，按照按照每3μL浓度为100μM与100μL的胶体金进行混合，混匀后放于-20℃冰箱中冷冻，冷冻标记时间不低于2小时；解冻后将溶液于4℃、12000rpm/min下离心30分钟；吸去上清后使用清洗buffer(0.1M氯化钠，0.01M磷酸缓冲液，pH7.4)重悬，再于4℃、12000rpm/min下离心30分钟，此步骤重复三次；最后使用重悬buffer(0.3M氯化钠，0.01M磷酸缓冲液，pH 7.4)重悬，即得到胶体金；所涉及的探针序列如下：
Poly A10-P1：AAAAAAAAAATTTTTATGATGTTCGTTGTG(SEQ ID NO:3)
Poly A10-P2：AAAAAAAAAATTTTTCGTTTAGGATTTGTG(SEQ ID NO:4)
5、胶体金Linker探针的设计，具体的Linker DNA序列为：
TCCTAAACACCACAACGAAC(SEQ ID NO:5)
6、CRISPR/Cas系统的剪切反应
将样品的RPA扩增产物与胶体金的Linker探针置于CRISPR/Cas12a系统中进行切割反应，37℃下恒温反应20分钟；反应体系如下：
CRISPR/Cas12a剪切反应体系(20μL)
所涉及的10×Cas12a蛋白反应buffer成分包括100mM氯化钠、10mM氯化镁、50mMTris-盐酸、100μg/mL BSA蛋白；
7、胶体金的显色反应
在室温下，将实现标记好的两种胶体金各取30μL等体积混合，然后将步骤6中的20μL反应液加入到预混好的胶体金中，静置5分钟后在5000r/min的转速下离心30s，然后根据颜色变化判断样品中有无转基因水稻。
本实施例根据转基因水稻与普通水稻的百分比不同的样品进行实验，所采取的百分比为100％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0。通过梯度实验，可以检测本实施例所述检测方法的灵敏度。
8、结果读取
根据胶体金的显色情况进行转核酸水稻的定性分析。若胶体金发生聚集，溶液颜色由红色变为无色，则样品中不含转基因水稻；反之，若胶体金没有聚集，溶液颜色没有发生改变或颜色变浅，那么样品中含有转基因水稻。本实施例的结果同样可以根据溶液在520nm处的紫外吸收值来定性分析。
本实施例中的检测结果如图3所示。图中的上部为不同含量转基因水稻的显色结果，下部为520nm处不同含量转基因大米检测的的紫外吸收值情况。由图可知，采用本实施例的检测方法不仅可以检测到转基因水稻，而且在转基因水稻含量为0.01％的情况下同样可以检测到目的基因，说明该检测方法的灵敏度很高。
实施例3
基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法检测miR-17基因
1、样品RNA的提取
采用日本TAKARA公司生产的RNA提取试剂TRIzol对动物癌组织或癌细胞等其他样品中的RNA进行提取，取一定量的细胞加入适量的试剂进行匀浆处理，室温静置5分钟后，12000rpm/min，4℃，离心5分钟，上清吸取到一个新的离心管中；加入管中液体量五分之一的氯仿，震荡混匀；室温静置5分钟后，1200rpm/min，4℃，离心15分钟，上清吸取到新管中；加入等体积异丙醇，上下反转混匀，静置10分钟，12000rpm/min，4℃，离心10分钟，弃去上清；向沉淀中加入1mL预冷的75％乙醇，混匀，12000rpm/min，4℃，离心5分钟，弃上清。室温放置5分钟后，待乙醇完全挥发，用30μLDEPC水重新溶解。
2、在本实施例中，RNA样品不做扩增处理，直接用来检测。
miR-17的序列为：CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG(SEQ ID NO:13)
另外，本实施例还对与miR-17序列类似的miR-10b、miR21和miR155序列分别进行检测，判断本发明所述检测方法的准确性。
3、crRNA的设计、转录和纯化
靶核酸为miR-17，根据cas13a蛋白的识别规则，在序列中寻找Cas13a蛋白可以识别的位点，根据位点信息设计针对miR-17的crRNA；根据设计好的crRNA序列进行体外转录并纯化；所涉及的探针序列如下：
miR-17crDNA 1：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCTACCTGCACTGTAAGCACTTTG(划线部分为T7启动子区)(SEQ ID NO:14)
miR-17crDNA2：
CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID NO:15)
miR-17crRNA：
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUG(划线部分为靶向miR-17区域)(SEQ ID NO:16)
miR-17crDNA 1与miR-17crDNA 2经过退火处理之后，可以作为后续转录miR-17crDNA的模板。
4、胶体金的制备与探针标记
使用柠檬酸钠还原法制备胶体金，将100mL浓度为1mM的HAuCl4加热沸腾，带沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，两分钟内溶液颜色由金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌15-30分钟，停止加热后继续搅拌冷却至室温，即可得到胶体金溶液，测紫外吸收光谱最大吸收峰位于520nm处，胶体金粒径为13nm左右，胶体金粒径大小与加入的柠檬酸钠体积有关。
探针的标记采用冷冻法，按照按照每3μL浓度为100μM与100μL的胶体金进行混合，混匀后放于-20℃冰箱中冷冻，冷冻标记时间不低于2小时；解冻后将溶液于4℃、12000rpm/min下离心30分钟；吸去上清后使用清洗buffer(0.1M氯化钠，0.01M磷酸缓冲液，pH 7.4)重悬，再于4℃、12000rpm/min下离心30分钟，此步骤重复三次；最后使用重悬buffer(0.3M氯化钠，0.01M磷酸缓冲液，pH 7.4)重悬，即得到胶体金；所涉及的探针序列如下：
Poly A10-P1：AAAAAAAAAATTTTTATGATGTTCGTTGTG(SEQ ID NO:3)
Poly A10-P2：AAAAAAAAAATTTTTCGTTTAGGATTTGTG(SEQ ID NO:4)
5、胶体金Linker探针的设计，具体的Linker RNA序列为：
UCCUAAACACCACAACGAAC(SEQ ID NO:6)
6、CRISPR/Cas系统的剪切反应
将步骤2中的扩增产物与胶体金的Linker探针置于CRISPR/Cas13a系统中进行切割反应，37℃下恒温反应20分钟；所述反应体系如下：
CRISPR/Cas13a剪切反应体系(20μL)
所涉及的10×Cas13a蛋白反应buffer成分包括100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、200mM Tris-盐酸、100μg/mL BSA蛋白。
7、胶体金的显色反应
在室温下，将实现标记好的两种胶体金各取30μL等体积混合，然后将步骤6所述的20μL剪切反应产物加入到预混好的胶体金中，静置5分钟后进行简单的过滤，然后根据颜色变化判断样品中有无miR-17。
本实施例还通过测量溶液在520nm处的紫外吸收值来判断本实施例所述检测方法的灵敏度。
8、结果读取
根据胶体金的显色情况进行靶核酸的定性分析：若胶体金发生聚集，溶液颜色由红色变为无色，则样品中不含miR-17；反之，若胶体金没有聚集，溶液颜色没有发生改变，那么样品中含有miR-17。根据紫外吸收值来定性分析：如果紫外吸收值明显高于其他样品，则可以判断样品中含有miR-17。
本实施例中的核酸检测结果如图4所示。其中A部分为检测特异性展示：可以根据颜色变化来检测miR-17，如果颜色没有发生变化的则说明检测到目的RNA，颜色变为无色的则不是目的RNA；同样也可以根据紫外吸收值来检测miR-17，miR-17的紫外吸收值明显比其他对比样品大。B部分为该方法对miR-17检测灵敏度情况的说明，由图可知，本实施例中的检测限可达500fM，说明其检测灵敏度很高。
实施例4
一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒，包含A、B两个分试剂盒。
A分试剂盒包括CRISPR/Cas系统的剪切反应所需的Cas12a蛋白/crRNA复合物、Cas13a蛋白/crRNA复合物、10×Cas12a蛋白反应buffer、10×Cas13a蛋白反应buffer、胶体金Linker DNA和Linker RNA及其他相关试剂。
其中，Cas12a蛋白/crRNA复合物和Cas13a蛋白/crRNA复合物浓度为1μM。Cas12a蛋白反应buffer成分包括100mM氯化钠、10mM氯化镁、50mM Tris-盐酸、100μg/mL BSA蛋白。Cas13a蛋白反应buffer成分包括100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、200mM Tris-盐酸、100μg/mL BSA蛋白。
A分试剂盒中的胶体金Linker序列为:
Linker DNA：TCCTAAACACCACAACGAAC(SEQ ID NO:5)
Linker RNA：UCCUAAACACCACAACGAAC(SEQ ID NO:6)
B分试剂盒包括已标记探针的胶体金混合液。其中的标记探针为两种，具体序列如下：
Poly A10-P1：AAAAAAAAAATTTTTATGATGTTCGTTGTG(SEQ ID NO:3)
Poly A10-P2：AAAAAAAAAATTTTTCGTTTAGGATTTGTG(SEQ ID NO:4)
本实施例的试剂盒原则上可以用来检测所有目的核酸，只需先将待测样品的核酸与A分试剂盒中的试剂进行剪切反应，再将反应物与B分试剂盒中的试剂进行显色反应，通过离心、过滤、加热或冷冻等处理后观察颜色变化来判断检测结果。
当样品中不含目的核酸时，胶体金的Linker DNA/RNA未被剪切，胶体金颗粒发生聚集，溶液颜色发生变化，由红色最终变为无色；当样品中含有目的核酸时，胶体金的Linker DNA/RNA被剪切，胶体金颗粒不聚集，溶液的颜色仍保持红色。
该试剂盒相较于传统方法，可用于裸眼室温均相检测，检测时间短、特异性高、灵敏度强；不需要依赖高精尖的仪器，对操作人员及操作环境要求低，便携性强；只需针对不同靶标设计相应crRNA即可，显色体系通用性强；所涉及的试剂材料等便宜，检测成本廉价。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>华南师范大学
<120>一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用
<160> 13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>41
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>Cas12a蛋白的crRNA序列
<400>1
uaauuucuac ucuuguagau nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 41
<210>2
<211>58
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>Cas13a蛋白的crRNA序列
<400>2
ngauuuagac uaccccaaaa acgaagggga cuaaaacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 58
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记胶体金的探针序列Poly A10-P1
<400>3
aaaaaaaaaa tttttatgat gttcgttgtg 30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记胶体金的探针序列Poly A10-P2
<400>4
aaaaaaaaaa tttttcgttt aggatttgtg 30
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>linker DNA序列
<400>5
tcctaaacac cacaacgaac 20
<210>6
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>linker RNA序列
<400>6
uccuaaacac cacaacgaac 20
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物CaMV35S-RPA-F
<400>7
tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagc 34
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物CaMV35S-RPA-R
<400>8
gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt g 31
<210>9
<211>266
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> CaMV 35S 启动子扩增序列
<400>9
tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag 60
tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg 120
aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg 180
aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg 240
acgtaaggga tgacgcacaa tcccac 266
<210>10
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CaMV 35S启动子crRNA体外转录所需序列CaMV 35S crDNA 1
<400>10
gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactcttg tagattcgca atgatggcat 60
ttgta 65
<210>11
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CaMV 35S启动子crRNA体外转录所需序列CaMV 35S crDNA 2
<400>11
tacaaatgcc atcattgcga atctacaaga gtagaaatta ccctatagtg agtcgtatta 60
atttc 65
<210>12
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>CaMV 35S crRNA序列
<400>12
uaauuucuac ucuuguagau tcgcaatgat ggcatttgta 40
<210>13
<211>23
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17序列
<400>13
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210>14
<211>83
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17 crRNA体外转录所需序列miR-17 crDNA 1
<400>14
gaaattaata cgactcacta tagggattta gactacccca aaaacgaagg ggactaaaac 60
ctacctgcac tgtaagcact ttg 83
<210>15
<211>83
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17 crRNA体外转录所需序列miR-17 crDNA 2
<400>15
caaagtgctt acagtgcagg taggttttag tccccttcgt ttttggggta gtctaaatcc 60
ctatagtgag tcgtattaat ttc 83
<210>16
<211>59
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17crRNA序列
<400>16
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccuac cugcacugua agcacuuug 59
Claims (10)
1.一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，具体包括以下步骤：
(1)crRNA的设计、转录和纯化；如果靶核酸为DNA则根据Cas12a蛋白的识别机理进行设计，如果靶核酸为RNA则根据Cas13a蛋白的识别机理进行设计；
(2)通用探针在纳米粒子上的标记；所述纳米粒子为具有距离效应产生光学性质变化的纳米粒子；所述通用探针序列的一端带有修饰基团或一段多聚纳米粒子亲和序列，使其能够标记到纳米粒子上从而得到标记有通用探针的纳米粒子溶液；
(3)Linker探针的制备；所述Linker探针与步骤(2)所述通用探针存在部分互补序列，两者通过杂交可使纳米粒子交联；
(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应；将待测样品的核酸与步骤(3)得到的Linker探针置于CRISPR/Cas系统中进行剪切反应，如果靶核酸为DNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas12a/crRNA复合物，如果靶核酸为RNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas13a/crRNA复合物，所述crRNA为步骤(1)得到的产物；
(5)纳米粒子的显色反应与结果读取；将步骤(4)所述剪切反应的产物与步骤(2)所述标记有通用探针的纳米粒子溶液进行反应，放置一段时间后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理，如果溶液颜色不发生变化或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色变为透明或无色，则待测样品中不含目的核酸。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的纳米粒子为胶体金。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的通用探针为至少含有5个碱基A的多聚A序列。
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的通用探针为两种不同的探针，分别标记在胶体金上；步骤(3)所述Linker探针为一种，且与两种通用探针都存在部分互补序列，能够通过杂交作用使胶体金交联变色。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(5)所述显色反应具体为：预混，将标记了两种不同探针的胶体金按1:1的比例混匀；显色，将步骤(4)所述的剪切反应产物加入到预混好的胶体金中，所述反应产物与预混好的胶体金比例为1:3，放置5min后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理；如果溶液颜色仍为红色或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色由红色变为无色或透明，则待测样品中不含目的核酸。
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，如果步骤(5)所述显色反应的颜色区分不明显，可通过测量混合溶液在纳米粒子最大吸收峰处的紫外吸收值来进行判断，所述吸收值大于检测限则视为含有目的核酸。
7.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，所述检测限为阴性标准品产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。
8.一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒，其特征在于，包含A、B两个分试剂盒：
A分试剂盒包括CRISPR/Cas系统的剪切反应所需的Cas12a蛋白/crRNA复合物和/或Cas13a蛋白/crRNA复合物、对应的Cas12a蛋白反应buffer和/或Cas13a蛋白反应buffer、胶体金Linker DNA和/或Linker RNA及其他相关试剂；
B分试剂盒包括已标记两种不同通用探针的胶体金混合液，所述两种通用探针能够与A分试剂盒中所述胶体金Linker进行杂交从而使胶体金交联变色。
9.根据权利要求8所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒，其特征在于，待测样品的核酸先于所述A分试剂盒中的试剂进行剪切反应，然后将剪切反应的反应物与所述B分试剂盒中的试剂进行显色反应，通过离心、过滤、加热或冷冻等处理后观察颜色变化来判断检测结果。
10.权利要求8所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒在核酸检测中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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