CN113088517B - 一种纳米探针构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纳米探针构建方法，包括以下步骤：S1：制备纳米粒子和标记探针；所述标记探针为与纳米粒子具有亲和性的分子；所述标记探针由亲和性基团修饰，或，所述标记探针由至少一段多聚T或多聚U修饰；S2：将所述标记探针和纳米粒子加入容器中形成混合溶液，使所述混合溶液中水分蒸发至完全干燥，得到纳米探针；S3：纯化所述纳米探针。本发明的纳米探针构建方法不需要额外的试剂就能在短时间内完成纳米粒子上的核酸探针标记，具有快速，简便的特点，且可标记各种SH修饰核酸链、短链DNA/RNA以及长链DNA/RNA，通用性强。

Description

一种纳米探针构建方法
技术领域
本发明属纳米生物科学技术领域，具体涉及一种纳米探针构建方法。
背景技术
核酸纳米探针，特别是基于纳米金的核酸探针开辟了纳米生物技术新领域。这种独特的纳米材料由纳米金核以及包裹在纳米金表面的核酸组成，能够将核酸分子的识别和可编程性与纳米金的光、电、化学和催化特性结合起来，从而具有新的化学物理特性和生物功能。到目前为止，基于纳米金的核酸探针已经在生物分析、药物传递和基因调控中得到了广泛的应用。
核酸纳米探针的构建对其成功应用于纳米生物科学领域至关重要。目前最常用的方法是利用盐老化法。但是该方法需要逐步添加NaCl并且整个标记过程需要超过2天，这是一个非常耗时的过程。其他一些核酸探针构建策略主要通过加入酸，表面活性剂以及聚合物等方法使DNA标记在纳米金表面。但该方法需要添加额外的试剂，使得标记过程变得更加复杂并且某些试剂可能会影响后续的应用。最近发展的基于冷冻的标记方法可以将巯基修饰和多聚A修饰的核酸标记在纳米金表面，并且不需要额外的试剂。然而，在长链DNA/RNA上进行巯基修饰非常困难且花费高，该方法很难应用于长链核酸的标记。此外，基于冷冻的标记方法在将多聚A修饰的DNA/RNA标记在金纳米颗粒上时，容易受到DNA序列结构的影响，缺乏通用性。目前，还没有一种基于纳米金的核酸探针构建方法可以同时满足简单、快速、低成本和通用的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供一种纳米探针构建方法，不需要额外的试剂就能在短时间内完成纳米粒子上的核酸探针标记，具有快速，简便的特点，且可标记各种SH修饰核酸链、短链DNA/RNA以及长链DNA/RNA，通用性强。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种纳米探针构建方法，包括以下步骤：
S1：制备纳米粒子和制备标记探针；所述标记探针为与纳米粒子具有亲和性的分子；所述标记探针由亲和性基团修饰，或，所述标记探针由至少一段多聚T或多聚U修饰；S2：将所述标记探针和纳米粒子加入容器中形成混合溶液，使所述混合溶液中水分蒸发至完全干燥，得到纳米探针；S3：纯化所述纳米探针。
本发明提供的纳米探针构建方法，在干燥过程中水分蒸发，增大了亲和性基团、多聚T和多聚U修饰的标记探针和纳米粒子的浓度，从而增大了亲和性基团、多聚T和多聚U和纳米粒子的接触概率，此外在脱水环境中，疏水性强的多聚T和多聚U对纳米粒子的亲和性变强，从而能够在短时间内使亲和性基团、多聚T和多聚U修饰的标记探针吸附在纳米粒子表面。
进一步，S2中的干燥方式包括微波加热干燥、鼓风加热干燥、电炉加热干燥、自然晾干中的至少一种。通过微波加热干燥、鼓风加热干燥、电炉加热干燥等热干燥的方式可使所述混合溶液的水分迅速蒸干，在几分钟内达到标记探针吸附到纳米粒子表面的效果；虽然通过自然晾干的方式进行干燥消耗时间较长，但同样可以实现标记探针吸附到纳米粒子表面的效果。
进一步，所述标记探针包括核酸分子、无机分子、有机分子、多肽分子和聚合物分子中的至少一种，选用适当的标记探针以吸附到纳米粒子上。
进一步，所述纳米粒子包括金纳米粒子、银纳米粒子、黑磷、氧化石墨烯、荧光微球、量子点、上转换纳米粒子中的至少一种，选用适当的纳米粒子以吸附标记探针。
进一步，所述亲和性基团包括巯基、多聚A、氨基、羧基、溴基和生物素中的至少一种；所述多聚T包括若干T，T为T碱基、叠氮修饰的T碱基以及其他化学修饰的T碱基中的至少一种；所述多聚U包括若干U，U为U碱基、叠氮修饰的U碱基以及其他化学修饰的U碱基中的至少一种。所述亲和性基团、多聚T和多聚U有利于增强与纳米粒子之间的吸引力。
进一步，所述多聚T包括至少5个T，所述多聚U包括至少5个U，若T的数量或U的数量少于5个，则对纳米粒子的亲和性下降。
进一步，所述混合溶液中，标记探针与纳米粒子的浓度比值≥n/1,其中n≤12.5。T或U的数量越多，发生反应的所需最小浓度比越小。当T或U的数量为5个，则标记探针与纳米粒子的浓度比值需≥12.5/1，该比值为T或U的数量为5个时能够发生反应的临界值，若标记探针与纳米粒子的浓度比值＜12.5，则标记探针无法吸附于纳米粒子表面；当T或U的数量＞5个，则浓度比值＜12.5/1时也可发生反应。
进一步，所述纳米粒子在高温下稳定存在，当使用微波加热干燥、鼓风加热干燥、电炉加热干燥等热干燥形式使水分蒸发时，选用的纳米粒子需要在高温稳定才能实现将标记探针吸附于纳米粒子表面。
进一步，S3中，将所述纳米探针在缓冲液中重悬，离心后得到上清液和沉淀，用洗涤液洗涤沉淀，最后用重悬液重悬。此为一种纯化纳米探针的方式，经过纯化可得到高纯度的纳米探针。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明核酸探针构建方法的原理图。
图2是实施例1在纳米金上标记SH修饰的DNA的结果图；图2a是实施例1的操作结果图；图2b是重悬后溶液的紫外光谱吸收图。
图3是实施例2在纳米金上标记多聚T或多聚U修饰的DNA/RNA链的结果图。
图4是实施例3在纳米金上标记长链DNA的结果图；图4a是实施例3的原理图；图4b是长链DNA的电泳图；图4c是重悬后溶液的紫外光谱吸收图。
图5是实施例3中在纳米金上吸附标记探针以检测DNA单碱基突变的应用；图5a是在纳米金上吸附标记探针以检测DNA单碱基突变的原理图；图5b是DNA扩增产物的电泳图；图5c是重悬后溶液的紫外光谱吸收图。
图6是实施例4中在纳米金上标记长链RNA的结果图；图6a是poly(U)-sgRNA标记于纳米金上并重悬得到的溶液的紫外光谱吸收图；图6b是将poly(U)-N-RNA标记于纳米金上并重悬得到的溶液的紫外光谱吸收图。
图7是实施例4中在纳米金上标记长链RNA并应用于基于CRISPR-Cas9的侧向流试纸条核酸分析方法的应用；图7a是在纳米金上标记长链RNA并应用于基于CRISPR-Cas9的侧向流试纸条核酸分析方法的原理图；图7b是在纳米金上标记长链RNA并应用于基于CRISPR-Cas9的侧向流试纸条核酸分析方法的结果图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米探针构建方法，包括以下步骤：
S1：制备纳米粒子和标记探针；所述标记探针为与纳米粒子具有亲和性的分子；所述标记探针由亲和性基团修饰，或，所述标记探针由至少一段多聚T或多聚U修饰；
S2：将所述标记探针和纳米粒子加入容器中形成混合溶液，使所述混合溶液中水分蒸发至完全干燥，得到纳米探针；
S3：纯化所述纳米探针。
本发明提供的纳米探针构建方法，在干燥过程中水分蒸发，增大了亲和性基团、多聚T和多聚U修饰的标记探针和纳米粒子的浓度，从而增大了亲和性基团、多聚T和多聚U和纳米粒子的概率，并且在脱水环境中，疏水性强的多聚T和多聚U对纳米粒子的亲和性变强，从而能够在短时间内使亲和性基团、多聚T和多聚U修饰的标记探针吸附在纳米粒子表面。
S2中的干燥方式包括微波加热干燥、鼓风加热干燥、电炉加热干燥、自然晾干中的至少一种。通过微波加热干燥、鼓风加热干燥、电炉加热干燥等热干燥的方式可使所述混合溶液的水分迅速蒸干，在几分钟内可达到标记探针吸附到纳米粒子表面的效果；虽然通过自然晾干的方式进行干燥消耗时间较长，但同样可以实现标记探针吸附到纳米粒子表面的效果。
所述标记探针包括核酸分子、无机小分子、有机小分子、多肽分子和聚合物分子中的至少一种，选用适当的标记探针以吸附到纳米粒子上。所述核酸分子包括DNA、RNA、LNA、XNA和PNA中的至少一种。
所述纳米粒子包括金纳米粒子、银纳米粒子、黑磷、氧化石墨烯、荧光微球、量子点、上转换纳米粒子中的至少一种，选用适当的纳米粒子以吸附标记探针。
所述亲和性基团包括巯基、多聚A、氨基、羧基、溴基和生物素中的至少一种；所述多聚T中，T为T碱基、叠氮修饰的T碱基以及其他化学修饰的T碱基中的至少一种；所述多聚U中，U为U碱基、叠氮修饰的U碱基以及其他化学修饰的U碱基中的至少一种。所述亲和性基团、多聚T和多聚U有利于增强与纳米粒子之间的吸引力。
所述多聚T包括至少5个T，所述多聚U包括至少5个U，若T的数量或U的数量少于5个，则对纳米粒子的亲和性下降。
所述混合溶液中，标记探针与纳米粒子的浓度比值≥n/1,其中n≤12.5。T或U的数量越多，发生反应的所需最小浓度比越小。当T或U的数量为5个，则标记探针与纳米粒子的浓度比值需≥12.5/1，该比值为T或U的数量为5个时能够发生反应的临界值，若标记探针与纳米粒子的浓度比值＜12.5，则标记探针无法吸附于纳米粒子表面；当T或U的数量＞5个，则浓度比值＜12.5/1时也可发生反应。
所述纳米粒子在高温下稳定存在，当使用微波加热干燥、鼓风加热干燥、电炉加热干燥等热干燥形式使水分蒸发时，选用的纳米粒子需要在高温稳定才能实现将标记探针吸附于纳米粒子表面。
S3中，将所述纳米探针在缓冲液中重悬，离心后得到上清液和沉淀，用洗涤液洗涤沉淀，最后用重悬液重悬。此为一种纯化纳米探针的方式，经过纯化可得到高纯度的纳米探针。
如图1所示，当标记探针为核酸分子，纳米粒子和核酸分子形成的混合溶液在加热情况下，核酸分子卷曲的核酸链能够打开并暴露其碱基。在加热干燥过程中，水分的蒸发使纳米粒子、核酸分子的浓度都逐渐增加，从而增加了核酸链与纳米粒子的接触概率。在脱水环境中，疏水性越强的T碱基或U碱基对AuNPs的亲和力越强，从而使核酸分子吸附在纳米粒子表面，形成核酸纳米探针。当标记探针为无机小分子、有机小分子、多肽分子和聚合物分子中的至少一种，在加热干燥过程中，水分的蒸发使标记探针和纳米粒子的浓度逐渐增加，从而增加了标记探针与纳米粒子的碰撞概率，有利于形成纳米探针。
实施例1
将SH修饰的DNA标记在纳米金上：
S1：制备纳米金：
将100mL浓度为1nM的HAuCl4置于容器中加热至沸腾，待沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8nM的柠檬酸钠溶液，两分钟内容器中的溶液颜色变化为：金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌10-30分钟，停止加热，继续搅拌冷却至室温，得到10nM纳米金溶液，纳米金粒径为13nm左右。
S2：将20μL浓度为100μM的核酸探针与400μL浓度为10nM的纳米金混合得到混合溶液，混匀后加入玻璃瓶中，其中所述核酸探针为SH修饰的DNA。将玻璃瓶放入微波炉中，调至中高火模式加热3min，此时所述混合溶液中的水分已完全蒸发。
S3：加入400μL三蒸水于加热干燥后的玻璃瓶中，用移液枪轻轻吹打混匀。将玻璃瓶中的溶液转移至EP管中，在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液包括0.3M NaCl和0.01M磷酸缓冲液，pH为7.4。再次在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后用1M NaCl重悬，得到核酸纳米探针溶液。
如图2a所示，当单独对纳米金进行微波加热至完全干燥，出现黑色沉淀，加盐重悬后形成无色溶液A1和位于无色溶液A1底部的黑色沉淀，纳米金发生聚集；
当无SH修饰的DNA与纳米金混合形成混合溶液后进行微波加热至完全干燥，出现黑色沉淀，纳米金在微波加热至干燥后发生聚集，加盐重悬后形成无色溶液A2和位于无色溶液A2底部的黑色沉淀，无SH修饰的核酸探针无法标记于纳米金上；
当SH修饰的核酸探针与纳米金混合形成混合溶液后进行微波加热，出现红色沉淀，加盐重悬后得到红色溶液，核酸纳米探针均匀分散于溶液中形成核酸纳米探针溶液，核酸纳米探针溶液呈现出纳米金的颜色。
如图2b所示，对重悬后的溶液进行紫外-可见吸收光谱测试，溶液中纳米金的浓度越大则吸收值越大。SH修饰的核酸纳米探针均匀分布在溶液中，而由于纳米金上未吸附核酸探针，纳米金会聚集形成沉淀，因此无色溶液A1和无色溶液A2中纳米金浓度极低，核酸纳米探针溶液的吸收值高于无色溶液A1和无色溶液A2。
由本实施例1可得，SH修饰的DNA可作为标记探针吸附于纳米金上。
实施例2
将多聚T或多聚U修饰的DNA/RNA链标记到纳米金上：
(1)制备纳米金：
将100mL浓度为1nM的HAuCl4置于容器中加热至沸腾，待沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，两分钟内容器中的溶液颜色变化为：金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌15-30分钟，停止加热后继续搅拌冷却至室温，得到纳米金溶液，纳米金粒径为13nm左右。
(2)将20μL浓度为100μM的标记探针与400μL的纳米金混合得到混合溶液，混匀后加入玻璃瓶中，其中所述标记探针为多聚T或多聚U修饰的DNA或RNA。将玻璃瓶放入微波炉中，调至中高火模式加热3min，此时所述混合溶液中的水分已完全蒸发。
S3：加入400μL三蒸水于加热干燥后的玻璃瓶中，用移液枪轻轻吹打混匀。将玻璃瓶中的溶液转移至EP管中，在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液包括0.3M NaCl和0.01M磷酸缓冲液，pH为7.4。再次在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用1M NaCl重悬，得到核酸纳米探针溶液。
如图3所示，当单独对纳米金进行微博加热至完全干燥，出现黑色沉淀，加盐重悬后形成无色溶液B1和位于无色溶液B1底部的黑色沉淀，纳米金发生聚集；
当无多聚T或多聚U修饰的DNA或RNA与纳米金混合形成混合溶液后，进行微波加热至完全干燥，出现黑色沉淀，纳米金在微波加热至干燥后发生聚集，加盐重悬后形成无色溶液B2和位于无色溶液B2底部的黑色沉淀，无多聚T或多聚U修饰的DNA或RNA未标记到纳米金上；
当多聚T或多聚U修饰的核酸探针与纳米金混合形成混合溶液后，进行微波加热，出现红色沉淀，加盐重悬后得到红色溶液，核酸纳米探针均匀分散于溶液中形成核酸纳米探针溶液，核酸纳米探针溶液呈现出纳米金的颜色。
由实施例2可得，多聚T或多聚U修饰的DNA/RNA链可作为标记探针吸附于纳米金上。
实施例3
(1)制备纳米金：
将100mL浓度为1nM的HAuCl4置于容器中加热至沸腾，待沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，两分钟内容器中的溶液颜色变化为：金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌15-30分钟，停止加热后继续搅拌冷却至室温，得到纳米金溶液，纳米金粒径为13nm左右。
(2)长链DNA探针的制备
本实施例3采用连接反应和滚环扩增反应制备长链DNA，其中长链DNA为含有多聚T的ssDNA和无多聚T的ssDNA。连接反应体系为10μL反应体系，所述连接反应包含500nMpadlock探针、500nM连接DNA、连接反应缓冲液和T4 DNA连接酶，其中所述连接反应缓冲液包括终浓度为10mM Tris-HCl(PH8.9)、50mM KCl和1.5mM MgCl2。为通过滚环扩增反应得到含有多聚T的ssDNA或无多聚T的ssDNA，分别设计含有多聚A的padlock(A40)和不含有多聚A的padlock(random)。其中padlock(A40)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，padlock(random)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接DNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
连接反应体系在37℃反应30分钟，得到连接反应产物。
滚环扩增反应体系为20μL反应体系，所述滚环扩增反应体系包括10μL连接反应产物、1.25mM dNTP mix、3.2U Bst 2.0WarmStrat DNA聚合酶以及扩增反应缓冲液(终浓度为10mM Tris-HCl(PH8.9),50mM KCl,1.5mM MgCl2)。滚环扩增反应体系在60℃反应60分钟，通过不同的padlock探针分别得到两种滚环扩增反应产物，为含有多聚T的ssDNA的扩增产物和无多聚T的ssDNA的扩增产物。
所述的连接反应体系如表1所示，连接反应为恒温37℃反应30分钟：
表1连接反应体系成分表
所述的滚环扩增反应体系如表2所示，反应为恒温60℃反应60分钟：
表2滚环扩增反应体系成分表
所述10×反应缓冲液成分包括100mM Tris-HCl(PH8.9)，500mM KCl，15mM MgCl2。
(3)将20μL滚环扩增反应产物与400μL纳米金进行混合得到混合溶液，混匀后加入玻璃瓶中。将玻璃瓶放入微波炉中，调至中高火模式加热3min，此时所述混合溶液中的水分已完全蒸发。
(4)加入400μL三蒸水于加热干燥后的玻璃瓶中，用移液枪轻轻吹打混匀。将玻璃瓶中的溶液转移至EP管中，在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液包括0.3M NaCl和0.01M磷酸缓冲液，pH为7.4。再次在25℃、12000rpm/min下离心20分钟。吸去上清液后用1M NaCl重悬。
当单独对纳米金进行微波加热至完全干燥，出现黑色沉淀，加盐重悬后形成无色溶液C1和位于无色溶液C1底部的黑色沉淀，纳米金发生聚集；
当无多聚T修饰的ssDNA与纳米金混合形成混合溶液后进行微波加热至完全干燥，出现黑色沉淀，纳米金在微波加热至干燥后发生聚集，加盐重悬后形成无色溶液C2和位于无色溶液C2底部的黑色沉淀，无多聚T修饰的ssDNA无法标记于纳米金上；
如图4a所示，当多聚T修饰的ssDNA与纳米金混合形成混合溶液后进行微波加热，出现红色沉淀，多聚T修饰的ssDNA标记于纳米金上得到核酸纳米探针，加盐重悬后得到红色溶液，核酸纳米探针均匀分散于溶液中形成核酸纳米探针溶液，核酸纳米探针溶液呈现出纳米金的颜色。
如图4b所示，多聚T修饰的长链DNA的长度与无多聚T修饰的长链DNA的长度相近，如图4c所示，对重悬后的溶液进行紫外光谱测试，溶液中纳米金的浓度越大则吸收值越大。多聚T修饰的ssDNA均匀分布在溶液中，而由于纳米金上未吸附核酸探针，纳米金会聚集形成沉淀，因此无色溶液D1和无色溶液D2中纳米金浓度极低，核酸纳米探针的吸收值高于无色溶液D1和无色溶液D2。
检测DNA的单碱基突变为当前检测DNA碱基突变的难点，本实施例4提供通过在纳米粒子上吸附标记探针检测DNA单碱基突变的应用，具体步骤如下：
根据靶标DNA，设计与靶标DNA互补的padlock探针，再利用padlock探针识别是否存在DNA靶标，其中padlock探针带有多聚A。如图5a所示，当DNA与padlock探针完全互补时，padlock可以连接成环，进行滚环扩增，产生具有多聚T的单链DNA；当DNA发生单碱基突变，无法与padlock探针完全互补，padlock探针不能被连接酶连接成环状，无法发生扩增反应产生具有多聚T的单链DNA。因此，与padlock探针互补的DNA的扩增产物能够标记在纳米金上，纳米金不发生聚集，加入NaCl重悬后溶液呈红色；发生单碱基突变的DNA无法通过padlock滚环扩增得到具有多聚T的单链DNA，则发生单碱基突变的DNA的扩增产物无法标记在纳米金上，纳米金发生聚集。通过观察DNA与纳米金混合形成的混合溶液完全干燥并重悬后的溶液颜色，可判断DNA是否发生单碱基突变。若重悬后的溶液颜色为无色，则证明该DNA发生单碱基突变，若重悬后的溶液为红色，则该DNA未发生单碱基突变。
如图5b所示，样品1为未发生突变的DNA的扩增产物，样品2为发生单碱基突变的DNA的扩增产物，由于不能完全与padlock探针互补，扩增得到的DNA长度较短。
如图5c所示，对重悬后的溶液进行紫外-可见吸收光谱测试，溶液中纳米金的浓度越大则吸收值越大。样品1的DNA扩增产物修饰于纳米金上得到核酸纳米探针，核酸纳米探针均匀分布在溶液中，吸收值最大。
实施例4
(1)制备纳米金：
将100mL浓度为1nM的HAuCl4置于容器中加热至沸腾，待沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，两分钟内容器中的溶液颜色变化为：金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌15-30分钟，停止加热后继续搅拌冷却至室温，得到纳米金溶液，纳米金粒径为13nm左右。
(2)长链RNA探针的制备：
本实施例4制备了两种长度的多聚U修饰的长链RNA：poly(U)-sgRNA(长度为133bp)和poly(U)-N-RNA(长度为1277bp)。制备方法为T7 RNA聚合酶体外转录法，反应条件为37℃恒温12小时，得到转录产物。T7 RNA聚合酶体外转录反应体系如表3所示：
表3 T7 RNA聚合酶体外转录反应体系
反应物 加入量 终浓度
双蒸水 55μL -
模板DNA 2.5μL 400ng
10×RNA聚合酶buffer 10μL 1×
NTP混合物(10mM) 20μL 2mM
RNA酶抑制剂 2.5μL 20U
T7 RNA聚合酶 10μL 20U
向所述转录产物加入10U DNA酶进行消化，目的是除去用于转录的DNA模板，得到纯化的RNA。消化反应条件为37℃恒温1小时，后75℃恒温10分钟。随后，将消化之后的产物进行纯化和浓缩，并测定其浓度。
(3)将20μL浓度为100μM的poly(U)-sgRNA或320μg的poly(U)-N-RNA与400μL纳米金混合得到混合溶液，混匀后加入玻璃瓶中。将玻璃瓶放入微波炉中，调到中高火模式加热3min，此时所述混合溶液中的水分已完全蒸发。
S3：加入400μL三蒸水于加热干燥后的玻璃瓶中，用移液枪轻轻吹打混匀。将玻璃瓶中的溶液转移至EP管中，在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液包括0.3M NaCl和0.01M磷酸缓冲液，pH为7.4。再次在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用1M NaCl重悬，得到核酸纳米探针溶液。
单独对纳米金进行微波加热至完全干燥，出现黑色沉淀，加盐重悬后形成无色溶液D1和位于无色溶液D1底部的黑色沉淀，纳米金发生聚集；
当加入到纳米金溶液中的sgRNA不包含多聚U时，所述混合溶液微波加热至完全干燥后得到黑色沉淀，加盐重悬后形成无色溶液D2和位于无色溶液D2底部的黑色沉淀，纳米金发生聚集，无多聚U修饰的sgRNA无法标记到纳米金上；
当多聚U修饰的长链RNA与纳米金混合形成混合溶液后进行微波加热，出现红色沉淀，加盐重悬后得到红色溶液，核酸纳米探针均匀分散于溶液中形成核酸纳米探针溶液，核酸纳米探针溶液呈现出纳米金的颜色。
如图6所示，对重悬后的溶液进行紫外-可见吸收光谱测试，溶液中纳米金的浓度越大则吸收值越大。多聚U修饰的poly(U)-sgRNA(133bp)和多聚U修饰的poly(U)-N-RNA(1277bp)均可标记到纳米金上。
本实施例4将多聚U修饰的poly(U)-sgRNA(133bp)标记在纳米金表面，并应用于基于CRISPR-Cas9的侧向流试纸条核酸分析方法中，具体方案如下：
poly(U)-sgRNA作为探针可与Cas9结合形成Cas9-poly(U)-sgRNA复合物，当poly(U)-sgRNA标记于纳米金上，则形成Cas9-poly(U)-sgRNA-AuNP复合物，该复合物可发挥其识别功能并结合在靶标DNA上。当有生物素修饰的靶标DNA存在时，Cas9-poly(U)-sgRNA-AuNP复合物能够结合在靶标DNA上，形成DNA-Cas9-poly(U)-sgRNA-AuNP复合物。当DNA-Cas9-poly(U)-sgRNA-AuNP复合物流过侧向流试纸条上时，由于靶标DNA上有生物素，能够被侧向流试纸条上的测试线上的链霉亲和素捕获，由于DNA-Cas9-poly(U)-sgRNA-AuNP复合物中含有纳米金，被捕获后出现条带，条带呈现出纳米金的红色。
以非洲猪瘟VP72基因作为靶标DNA为例，如图7所示，当存在靶标DNA，结果为阳性，在测试线出现条带呈现出纳米金的红色；当不存在靶标DNA、只有Cas9-poly(U)-sgRNA-AuNP复合物时，在控制线出现纳米金的红色，但在测试线处没有捕获到靶标DNA，则无法在测试线处观察到条带。
实施例5
将多聚U修饰的RNA标记在纳米金上：
S1：制备纳米金：
将100mL浓度为1nM的HAuCl4置于容器中加热至沸腾，待沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8nM的柠檬酸钠溶液，两分钟内容器中的溶液颜色变化为：金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌10-30分钟，停止加热，继续搅拌冷却至室温，得到10nM纳米金溶液，纳米金粒径为13nm左右。
S2：将5μL浓度为100μM的核酸探针与400μL浓度为10nM的纳米金混合得到混合溶液，混匀后加入玻璃瓶中，其中所述核酸探针为多聚U修饰的RNA，所述多聚U包括5个U碱基。将玻璃瓶放入微波炉中，调至中高火模式加热3min，此时所述混合溶液中的水分已完全蒸发。
S3：加入400μL三蒸水于加热干燥后的玻璃瓶中，用移液枪轻轻吹打混匀。将玻璃瓶中的溶液转移至EP管中，在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液包括0.3M NaCl和0.01M磷酸缓冲液，pH为7.4。再次在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后用1M NaCl重悬，得到核酸纳米探针溶液。
实施例6
将多聚T修饰的DNA标记在纳米金上：
S1：制备纳米金：
将100mL浓度为1nM的HAuCl4置于容器中加热至沸腾，待沸腾稳定后，在快速搅拌下加入10mL浓度为38.8nM的柠檬酸钠溶液，两分钟内容器中的溶液颜色变化为：金黄色→无色→黑色→深紫色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌10-30分钟，停止加热，继续搅拌冷却至室温，得到10nM纳米金溶液，纳米金粒径为13nm左右。
S2：将5μL浓度为100μM的核酸探针与400μL浓度为10nM的纳米金混合得到混合溶液，混匀后加入玻璃瓶中，其中所述核酸探针为多聚T修饰的DNA，所述多聚T包括5个T碱基。将玻璃瓶放入微波炉中，调至中高火模式加热3min，此时所述混合溶液中的水分已完全蒸发。
S3：加入400μL三蒸水于加热干燥后的玻璃瓶中，用移液枪轻轻吹打混匀。将玻璃瓶中的溶液转移至EP管中，在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后使用洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液包括0.3M NaCl和0.01M磷酸缓冲液，pH为7.4。再次在25℃、12000rpm/min下离心20分钟，吸去上清液后用1M NaCl重悬，得到核酸纳米探针溶液。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
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SEQUENCE LISTING
<110> 华南师范大学
<120> 一种纳米探针构建方法
<130> 20210310
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aagaactata ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacaccttc 60
tca 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aagaactata ttgagcttac agtgcagctg gatcgtagtg gcaagcgttg tcacaccttc 60
tca 63
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gacaatatag ttctttgaga aggtg 25

Claims (3)

1.一种纳米探针构建方法，其特征在于：
包括以下步骤：
S1：制备纳米粒子和标记探针；所述纳米粒子为金纳米粒子；所述标记探针为与纳米粒子具有亲和性的核酸分子；所述标记探针由亲和性基团修饰，或，所述标记探针由至少一段多聚T或多聚U修饰；其中，所述亲和性基团包括巯基，所述多聚T包括至少5个T，所述多聚U包括至少5个U；
S2：将所述标记探针和纳米粒子加入容器中形成混合溶液，使所述混合溶液中水分蒸发至完全干燥，得到纳米探针；其中，干燥方式为微波加热干燥，所述混合溶液中，标记探针与纳米粒子的浓度比值≥n/1,其中n≤12.5；
S3：纯化所述纳米探针。
2.根据权利要求1所述的纳米探针构建方法，其特征在于：
所述纳米粒子在高温下稳定存在。
3.根据权利要求1所述的纳米探针构建方法，其特征在于：
S3中，将所述纳米探针在缓冲液中重悬，离心后得到上清液和沉淀，用洗涤液洗涤沉淀，最后用重悬液重悬。
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蒸发过程对碳纳米管复合结构拉曼增强特性的影响;张晓蕾等;《中国激光》;20160410(第04期);全文 *

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