CN115916997A - 靶核酸的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶核酸的检测方法，其包含：将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼切断的步骤；将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤；通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤；其中，将第一侧翼切断的步骤及将第二侧翼切断的步骤通过用侧翼核酸内切酶将第一侧翼和第二侧翼切断来进行，侧翼核酸内切酶具有与选自由属于热球菌目的细菌和属于甲烷杆菌目的细菌组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性的氨基酸序列。

Description

靶核酸的检测方法
技术领域
本发明涉及靶核酸的检测方法。
背景技术
已知有基于靶核酸的检测的各种诊断方法。作为这样的诊断方法，例如有基于单核苷酸多态性(SNP)分析的体质诊断、基于体细胞突变分析的药剂(例如抗癌剂)的效果和副作用的预测诊断、基于病毒的DNA或RNA的检测的感染症的诊断等。在这些诊断用途中，靶核酸的存在比较低的情况较多，因此需要能够高精度地对靶核酸进行定量分析的方法。作为高精度地对靶核酸进行定量分析的方法，例如已知利用了数字测量的方法。
数字测量是如下的定量方法：将靶核酸等生物分子以概率达到1分子以下的方式稀释，分配给多个微小的反应容器，对各反应容器进行2值化(有/无伴随检测反应的信号)，由此对检测对象是否进入反应容器进行计数。在数字测量中，还能够检测1分子的生物分子，能够进行高精度的定量测定。例如，非专利文献1中公开了将ICA(Invasive CleavageAssay，侵入裂解分析)法与数字测量组合而成的靶核酸的检测方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：日本印刷学会誌，2017年，第54巻第6号，pp.377－382
发明内容
发明所要解决的课题
数字测量是基于对各反应容器进行2值化(有/无伴随检测反应的信号)的步骤，因此为了进行更高精度的定量测定，要求提高信号/噪声比(S/N比)。因此，本发明的目的在于提供一种提高了S/N比的靶核酸的检测方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及一种靶核酸的检测方法，其包含：将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼(flap)切断的步骤；将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤；以及通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤；其中，将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤通过用侧翼核酸内切酶将上述第一侧翼和上述第二侧翼切断来进行，上述侧翼核酸内切酶具有与选自由属于热球菌目(Thermococcales)的细菌和属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性的氨基酸序列。
本发明的检测方法中，第一侧翼的切断及第二侧翼的切断通过特定的侧翼核酸内切酶进行，因此与现有方法相比，S/N比提高。
上述侧翼核酸内切酶优选具有与选自由嗜热古生菌(Thermococcuskodakarensis)KOD1株、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)GE5株、以及热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter Thermautotrophicus)Delta H株组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性的氨基酸序列。由此，S/N比进一步提高。
在上述检测方法中，靶核酸可以是DNA。
在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在pH为7.5以上且9.0以下的条件下进行。pH在该范围内时，S/N比的提高效果变得更显著。
在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在温度为55℃以上且70℃以下的条件下进行。当温度在该范围内时，S/N比的提高效果变得更显著。
在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，上述水性溶剂含有Mg2+。另外，更优选水性溶剂中的Mg2+浓度为2.5mM以上且20mM以下。由此，S/N比的提高效果变得更显著。
在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，上述水性溶剂中的K+浓度为0mM以上且100mM以下。由此，S/N比的提高效果变得更显著。
在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，上述水性溶剂中的三羟甲基氨基甲烷浓度为超过0mM且300mM以下。由此，S/N比的提高效果变得更显著。
在上述检测方法中，可以将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，上述水性溶剂中的上述侧翼核酸内切酶浓度为0.5μM以上且8μM以下。由此，能够实现充分的S/N比的提高效果。
在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，上述水性溶剂的容积为10aL以上且10μL以下。由此，S/N比的提高效果变得更显著。
在上述检测方法中，上述第三核酸与上述第四核酸可以通过连接分子结合。
上述检测方法可以通过检测荧光来检测上述被切断的第二侧翼。
另外，本发明还涉及用于在上述的本发明的检测方法中使用的试剂盒，其包含：上述第三核酸、上述第四核酸、上述侧翼核酸内切酶、以及显示根据上述靶核酸的碱基序列来设计第一核酸和第二核酸的碱基序列的指导的说明书。
本发明还涉及一种表达载体，其具有编码下述氨基酸序列的核酸序列和可工作地连结于上述核酸序列的1个或多个调节序列，所述氨基酸序列与选自由属于热球菌目(Thermococcales)的细菌和属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性。
上述表达载体可用于制备可适用于上述本发明的检测方法的侧翼核酸内切酶。另外，上述表达载体可以为质粒。
发明效果
根据本发明，能够提供S/N比提高的靶核酸的检测方法。
附图说明
图1是开裂结构的说明图。
图2是表示试验例3的评价体系的概要的说明图。
图3是表示试验例3中的荧光强度的实时测定的结果的一例的曲线图。
图4是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图5是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图6是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图7是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图8是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图9是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图10是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图11是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图12是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图13是表示试验例4中的荧光强度的实时测定的结果的曲线图。
图14是表示试验例5中的数字测量的结果的照片。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
本实施方式的靶核酸的检测方法包含：将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼(flap)切断的步骤(第一侧翼切断步骤)；将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤(第二侧翼切断步骤)；以及通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤(检测步骤)。其中，第一侧翼的切断以及第二侧翼的切断通过特定的侧翼核酸内切酶进行。
在本说明书中，“开裂结构”是指下述结构：由靶核酸、和能够分别与该靶核酸的邻接的第一区域和第二区域杂交的2个核酸形成的结构，一个核酸(例如第一核酸)的3’侧的部分序列与靶核酸的第一区域杂交，另一个核酸(例如第二核酸)与和靶核酸的第一区域的3’侧邻接的第二区域杂交，与第一区域杂交的核酸(例如第一核酸)的5’侧的剩余的序列以单链突出形成侧翼。作为开裂结构的具体例，可举出图1所示的结构。
本实施方式的检测方法中使用的侧翼核酸内切酶(以下，也记载为“FEN”或“FEN蛋白”)只要具有与选自由属于热球菌目(Thermococcales)的细菌和属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌组成的组中的细菌的FEN的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性的氨基酸序列即可。通过使用这样的FEN，能够实现比现有方法提高的S/N比。
本实施方式的检测方法中使用的FEN只要具有识别开裂结构、切断侧翼的根部(三个核酸重叠的部位的3’侧的磷酸二酯键)、使侧翼(核酸)游离的活性即可。
作为属于热球菌目的细菌，例如可举出属于热球菌科(Thermococcaceae)的细菌。作为属于热球菌科的细菌，例如可举出属于热球菌属(Thermococcus)的细菌、属于热球菌属(Pyrococcus)的细菌、属于古老细菌属(Palaeococcus)的细菌。
作为属于热球菌属的细菌，例如可举出属于嗜热古生菌(T.kodakarensis)的细菌、属于T.gammatolerans的细菌、属于T.gorgonarius的细菌、属于速生热球菌(T.zilligii)的细菌。
作为属于火球菌属的细菌，例如可举出属于深海热球菌(P.abyssi)的细菌、属于激烈火球菌(P.furiosus)的细菌、属于掘越氏火球菌(P.horikoshii)的细菌。
作为属于古老细菌属的细菌，例如可举出属于嗜铁古球菌(P.ferrophilus)的细菌、属于P.helgesonii的细菌。
作为属于热球菌目的细菌，优选属于热球菌属的细菌和属于火球菌属的细菌，更优选属于嗜热古生菌的细菌和属于深海热球菌属的细菌，进一步优选嗜热古生菌KOD1株、深海热球菌GE5株。其中，嗜热古生菌KOD1株以及深海热球菌GE5株可以从国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心(RIKEN BRC)获得。
作为属于甲烷杆菌目的细菌，例如可举出属于甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)的细菌、属于甲烷嗜热菌科(Methanothermaceae)的细菌。作为属于甲烷杆菌科的细菌，例如可举出属于甲烷杆菌属(Methanobacterium)的细菌、属于甲烷嗜热杆菌属(Methanothermobacter)的细菌。作为属于甲烷嗜热菌科的细菌，例如可举出属于甲烷嗜热菌属(Methanothermus)的细菌。
作为属于甲烷杆菌属的细菌，例如可举出属于甲酸甲烷杆菌(M.formicicum)的细菌、属于奥尔胡斯甲烷杆菌(M.aarhusense)的细菌、属于嗜碱甲烷杆菌(M.alcaliphilum)的细菌。
作为属于甲烷嗜热杆菌属的细菌，例如可举出属于热自养甲烷嗜热杆菌(M.Thermautotrophicus)的细菌、属于马尔堡甲烷嗜热杆菌(M.marburgensis)、属于沃氏甲烷嗜热杆菌(M.wolfeii)的细菌。
作为属于甲烷嗜热菌属(Methanothermus)的细菌，例如可举出属于火热甲烷菌(M.fervidus)的细菌。
作为属于甲烷杆菌目的细菌，优选属于甲烷嗜热杆菌的细菌，更优选属于热自养甲烷嗜热杆菌的细菌，进一步优选热自养甲烷嗜热杆菌Delta H株。其中，热自养甲烷嗜热杆菌Delta H株可以从国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心(RIKEN BRC)获得。
本实施方式的检测方法中使用的FEN只要其氨基酸序列与上述细菌所具有的FEN的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性即可。另外，该FEN具有识别开裂结构、切断侧翼的根部(三个核酸重叠的部位的3’侧的磷酸二酯键)、使侧翼(核酸)游离的活性。
在本说明书中，“序列同源性”是指在该技术领域中使用公知的数学算法将2个氨基酸序列比对的情况下的最佳比对(优选该算法为了最佳比对而能够考虑向序列中的一方或双方导入间隙)中的、相同的氨基酸残基相对于重叠的全部氨基酸序列的比例(％)。在比对的制作中，例如可以使用NCBI BLAST(National Center for BiotechnologyInformation Basic LocalAlignment Search Tool，美国国家生物技术信息中心基于局部比对算法的搜索工具)。
本实施方式的检测方法中使用的FEN的氨基酸序列与上述细菌所具有的FEN的氨基酸序列的序列同源性可以为65％以上、可以为70％以上、可以为75％以上、可以为80％以上、可以为85％以上、可以为90％以上、可以为91％以上、可以为93％以上、可以为94％以上、可以为95％以上、可以为96％以上、可以为97％以上、可以为98％以上、可以为99％以上、可以为99.1％以上、可以为99.2％以上、可以为99.3％以上、可以为99.4％以上、可以为99.5％以上、可以为99.6％以上、可以为99.7％以上、可以为99.8％以上、可以为99.9％以上、也可以为100％。
本实施方式的检测方法中使用的FEN蛋白可以是从上述细菌中提取或精制并进行分离而得到的，也可以是从上述细菌克隆编码FEN蛋白的基因，提取或精制在异种蛋白表达系统(重组蛋白表达系统)中表达的蛋白并分离而得到的。另外，也可以不使用上述细菌，而基于上述细菌所具有的FEN蛋白的氨基酸序列通过化学合成等制造编码该氨基酸序列的基因，提取或精制在异种蛋白表达系统(重组蛋白表达系统)中表达的蛋白并进行分离而得到的。在异种蛋白表达系统中表达FEN蛋白的情况下，也可以使用按照达到上述序列同源性的范围内的方式使氨基酸序列突变而得到的基因。其中，上述细菌所具有的FEN蛋白的氨基酸序列等信息可以从序列数据库(例如GenBank、NCBI)获得。
第一侧翼切断步骤是将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼切断的步骤。
第一核酸和第二核酸被设计为能够分别与靶核酸的第一区域及与第一区域的3’侧邻接的第二区域杂交。此时，第一核酸被设计为3’侧的部分序列与靶核酸的第一区域杂交，5’侧的剩余序列以单链形成突出侧翼。另外，侧翼的序列被设计为与第四核酸的第二区域杂交。第二核酸被设计为与靶核酸的第二区域杂交。靶核酸的第一区域和第二区域被设计为具有能够特异性地检测靶核酸的碱基序列。例如，在应用于SNP分析的情况下，优选设计为SNP部位位于第一区域与第二区域的结合部分、即三个核酸重叠的部位。
第一开裂结构为如下结构：第一核酸的3’侧的部分序列与靶核酸的第一区域杂交，第二核酸与靶核酸的和第一区域的3’侧邻接的第二区域杂交，第一核酸的5’侧的剩余序列以单链突出，形成第一侧翼。在第一侧翼切断步骤中，FEN识别该第一开裂结构，切断第一侧翼的根部(三个核酸重叠的部位的3’侧的磷酸二酯键)，使第一侧翼(核酸)游离。
优选第一侧翼切断步骤在反应液的pH为7.5以上且9.0以下的条件下进行。pH在该范围内时，S/N比的提高效果变得更显著。除了良好的S/N比以外，从能够在更短时间内进行检测的观点出发，反应液的pH优选在8.0以上且9.0以下的范围内，更优选在8.2以上且8.8以下的范围内，进一步优选在8.4以上且8.6以下的范围内。
优选第一侧翼切断步骤在反应液的温度为55℃以上且75℃以下的条件下进行，更优选在55℃以上且70℃以下的条件下进行。当温度在该范围内时，S/N比的提高效果变得更显著。除了良好的S/N比以外，从即使在靶核酸的浓度低的情况下也能够在更短时间内进行检测的观点出发，反应液的温度例如可以为60℃以上，也可以为65℃以下。反应液的温度为60℃以上且65℃以下时，能够更显著地发挥即使在靶核酸的浓度低的情况下也能够在更短时间内进行检测的效果。
优选第一侧翼切断步骤在含有Mg2+的水性介质中进行。从S/N比的提高效果变得更显著的观点出发，反应液(水性介质)中的Mg2+浓度优选在1mM以上且20mM以下的范围内，更优选在2.5mM以上且20mM以下的范围内。除了良好的S/N比以外，从能够在更短时间内进行检测的观点出发，反应液(水性介质)中的Mg2+浓度进一步优选在5mM以上且10mM以下的范围内。反应液(水性介质)中的Mg2+浓度例如可以通过将氯化镁等镁盐添加到反应液中来进行调整。
优选第一侧翼切断步骤在K+浓度为0mM以上且100mM以下的水性介质中进行。由此，S/N比的提高效果变得更显著。需要说明的是，如果为上述范围内，则即使反应液(水性介质)中的K+浓度为0mM，S/N比和上升的速度也没有大的差异，因此不一定需要添加K+，从能够使反应液更简单的观点出发，更优选K+浓度为0mM。反应液(水性介质)中的K+浓度例如可以通过将氯化钾等钾盐添加到反应液中来进行调整。
第一侧翼切断步骤可以在任意的缓冲液中进行。作为缓冲液，例如可以使用Tris缓冲液、Bis-Tris缓冲液、MOPS缓冲液等。从S/N比的提高效果变得更显著的观点出发，第一侧翼切断步骤优选在三羟甲基氨基甲烷浓度为超过0mM且300mM以下的水性溶剂中进行。除了S/N比的提高效果变得更显著以外，从能够在更短时间内进行检测的观点出发，更优选反应液(水性介质)中的三羟甲基氨基甲烷浓度在5mM以上且300mM以下的范围内。
在第一侧翼切断步骤中，反应液(水性介质)中的侧翼核酸内切酶浓度可以为0.5μM以上且8μM以下。由此，能够实现充分的S/N比的提高效果。
优选第一侧翼切断步骤以反应液(水性溶剂)的容积达到10aL以上且10μL以下的方式实施。由此，S/N比的提高效果变得更显著。
反应液中的第一核酸和第二核酸的浓度例如可以分别在1nM以上且10μM以下的范围内适当设定。
在第一侧翼切断步骤中被切断的第一侧翼与第三核酸和第四核酸形成第二开裂结构。
第二侧翼切断步骤是将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤。
第三核酸被设计成能够与第四核酸的第一区域杂交。此时，第三核酸被设计为3’侧的部分序列与第四核酸的第一区域杂交，5’侧的剩余序列以单链突出形成侧翼。另外，第一侧翼被设计为与第四核酸的和第一区域的3’侧邻接的第二区域杂交。
第二开裂结构是如下结构：第三核酸的3’侧的部分序列与第四核酸的第一区域杂交，第一侧翼与第四核酸的和第一区域的3’侧邻接的第二区域杂交，第三核酸的5’侧的剩余序列以单链突出形成第二侧翼。在第二侧翼切断步骤中，FEN识别该第二开裂结构，切断第二侧翼的根部(三个核酸重叠的部位的3’侧的磷酸二酯键)，使第二侧翼(核酸)游离。
第三核酸和第四核酸可以分别构成为不同的核酸分子，也可以通过连接分子结合。作为连接分子，例如可举出核酸(即通过第三核酸和第四核酸介由作为核酸的连接分子结合，从而构成为一个分子的核酸)、由链状分子构成的间隔基等。
第三核酸可以根据检测步骤中的检测方法附加标记。作为标记，例如可举出荧光色素、放射性核素、发光物质、磷光性物质、氧化还原分子等。标记方法根据本技术领域的常规方法即可。在用荧光色素进行标记的情况下，例如也可以使荧光色素结合在相当于第三核酸的侧翼的部位，使与荧光色素的种类对应的消光分子结合在相当于第三核酸的3’侧的部分序列的部位。由此，在第二开裂结构的状态下，由于通过FRET没有检测到来自荧光色素的荧光，在第二侧翼游离时检测到来自荧光色素的荧光，因此能够更简便地进行检测。
第二侧翼切断步骤中的优选反应条件可举出与在第一侧翼切断步骤中说明过的反应条件同样的条件。
反应液中的第三核酸和第四核酸的浓度例如可以分别在1nM以上且10μM以下的范围内适当设定。
第一侧翼切断步骤与第二侧翼切断步骤可以在不同的反应容器中实施，也可以在同一反应容器中实施。从操作变得更简便的角度出发，优选第一侧翼切断步骤与第二侧翼切断步骤在同一反应容器中实施。在该情况下，使反应液中预先含有第三核酸和第四核酸即可。
检测步骤是通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤。检测步骤例如可以通过如下方法来实施：通过电泳检测与第二侧翼对应的尺寸的条带的方法；在第二侧翼具有标记的情况下，根据该标记通过荧光检测或放射能检测等进行检测的方法等。
本实施方式的靶核酸的检测方法由于S/N比提高，因此能够适用于数字测量。
本实施方式的试剂盒是用于在上述的本发明的检测方法中使用的试剂盒，其包含：上述第三核酸、上述第四核酸、上述侧翼核酸内切酶、以及显示根据上述靶核酸的碱基序列来设计第一核酸和第二核酸的碱基序列的指导的说明书。第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸的具体方式如上所述。
另外，本发明还涉及一种表达载体，其具有编码下述氨基酸序列的核酸序列和可工作地连结于上述核酸序列的1个或多个调节序列，所述氨基酸序列与选自由属于热球菌目(Thermococcales)的细菌和属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性。
根据本实施方式的表达载体，能够生产适用于上述本发明的检测方法的FEN蛋白。
调节序列为控制宿主中的FEN蛋白的表达的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、粘粒载体、福斯质粒载体、人工染色体载体等。
实施例
以下，基于试验例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的试验例。
[试验例1：FEN蛋白的制备]
通过PCR法或化学合成来获得编码表1所示的各种种类的侧翼核酸内切酶(FEN)蛋白的基因，将所获得的基因重组到大肠杆菌用的表达载体(pET21a)中。在通过化学合成获得的基因的情况下，按照向C末端赋予组氨酸6残基的方式合成基因。其中，试验No.1(简称Afu)的FEN蛋白是以往ICA法中使用的酶(参照日本特表2001-518805号公报)。
表1
Figure BDA0003824215010000111
用构建的表达载体转化大肠杆菌(BL21-CodonPlus(DE3))。将转化后的大肠杆菌接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素和35μg/mL的氯霉素的LB培养基中，在37℃培养至OD600达到约0.5为止。接着，以终浓度达到0.5mM的方式添加1M IPTG，在25℃下培养16小时，使FEN蛋白大量表达。
通过离心分离回收培养的大肠杆菌(培养基为1L)，再悬浮于缓冲液(25mL)。对再悬浮的大肠杆菌进行超声波破碎后，离心分离回收上清液。接着，将回收的上清液在60～80℃下加热20分钟后，离心分离回收上清液。接着，在回收的上清液中添加聚乙烯亚胺后，离心分离回收上清液。在回收的上清液中添加硫酸铵，使其达到80％饱和，回收所形成的沉淀。将所得到的沉淀再悬浮于含有硫酸铵的缓冲液中，除去不溶物后，利用疏水性相互作用色谱法进行分级，回收含有目标FEN蛋白的级分。将回收的级分用缓冲液透析后，将FEN蛋白通过肝素亲和层析法进一步精制。在C末端具有组氨酸残基的蛋白的情况下，通过离心分离回收培养的大肠杆菌(培养基为1L)，再悬浮于缓冲液(25mL)。对再悬浮的大肠杆菌进行超声波破碎后，离心分离回收上清液。接着，将回收的上清液在60～80℃下加热20分钟后，离心分离回收上清液。接着，将回收的上清液添加到TALON金属亲和树脂(Clontech公司)中，使用含有咪唑的缓冲液，通过固定化金属亲和层析法进行分级，回收含有目标FEN蛋白的级分。
需要说明的是，试验No.7(简称Sso)及试验No.8(简称Sto)的FEN蛋白在上述精制过程中凝聚沉淀，无法进行精制，因此从以后的研究中排除。
测定精制后的各FEN蛋白的紫外线吸收，根据波长280nm的摩尔吸光系数计算出浓度。另外，用SDS-PAGE对精制后的各FEN蛋白进行分析，结果确认到预想尺寸的单一条带。另外，虽然也存在检测出一部分小条带(日文原文：マイナーバンド)的情况，但确认了不存在非特异性的核酸酶活性。
[试验例2：侧翼切断活性的评价]
对试验例1中精制的FEN蛋白的侧翼切断活性进行评价。开裂结构由靶核酸(5’-GGTGATCGTTCGCTACATGTCGTCAGGATTCCAGGCAG-3’：序列号1)、第一核酸(5’-FITC-AGACACATGGTATGTAGCGAACGATCACC-3’：序列号2)和第二核酸(5’-CTGCCTGGAATCCTGACGAC-3’：序列号3)形成。在该开裂结构中，第一核酸的5’侧的部分序列(从5’端起到带下划线的T为止的11个碱基)作为侧翼以单链突出。
切断反应通过如下方式进行：以50mM Tris-HCl(pH为7.6)、2.5mM MgCl2、10nM底物DNA(上述靶核酸、第一核酸和第二核酸的等摩尔混合物)、0.5μM FEN蛋白的组成制备反应溶液，将该反应溶液在55℃下孵育10分钟。
反应结束后，用含有8M尿素的12％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。接着，使用图像分析仪(Typhoon Trio+，GE Healthcare公司制)，测定未切断的开裂结构(38个碱基的位置的条带)及切断后的侧翼(11个碱基的位置的条带)的荧光强度。根据所测定的荧光强度，按照下述式计算出侧翼切断活性。将结果示于表2。
侧翼切断活性＝(11个碱基的位置的条带的荧光强度)/{(11个碱基的位置的条带的荧光强度)+(38个碱基的位置的条带的荧光强度)}×100(％)
表2
试验No. FEN蛋白的来源 侧翼切断活性(％)
1 Afu 94
2 Ape 94
3 Mth 97
4 Pab 97
5 Tac 96
6 Tko 96
7 Sso -
8 Sto -
9 Pfuma 90
10 Pdela 93
11 Pisla 83
12 Pferr 84
13 Pogun 11
14 Shell 95
15 Clagu 54
16 Mjann 90
17 Mvulc 94
18 Migne 94
19 Gacet 82
20 Gahan 83
21 Aprof 89
如表2所示，除试验No.13(简称Pogun)和试验No.15(简称为Clagu)以外的FEN蛋白确认到充分的侧翼切断活性。
[试验例3：2阶段侧翼切断活性的评价]
对于在试验例2中确认到侧翼切断活性的FEN蛋白，评价了在ICA法中通常采用的2阶段的侧翼切断反应中的侧翼切断活性。评价体系的概要如图2所示。图2所示的评价体系中，除了通过对等位基因探针进行荧光标记而能够检测出基于FEN蛋白的第一阶段的侧翼切断反应(将第一开裂结构的第一侧翼切断的反应)这一点以外，与ICA法中通常使用的反应体系相同。
在图2所示的评价体系中，由靶核酸(碱基序列：5’-GGTGATCGTTCGCTACATGTCGTCAGGATTCCAGGCAG-3’：序列号4)、分别与第一核酸和第二核酸相当的等位基因探针(碱基序列：5’-FAM-AGACACATGGTATGTAGCGAACGATCACC-BHQ1-3’：序列号5)及侵入寡核苷酸(碱基序列：5’-CTGCCTGGAATCCTGACGAC-3’：序列号6)形成第一开裂结构。在等位基因探针的5’端和3’端分别结合有荧光分子(FAM)和消光分子(BHQ1：在胸腺嘧啶残基上修饰有黑洞猝灭剂的分子)，当通过FEN蛋白切断第一侧翼时(第一阶段的侧翼切断反应)，能够检测出FAM的绿色荧光。被切断的第一侧翼和与通过连接分子(在此为检测用核酸的碱基序列的一部分)结合的第三核酸和第四核酸相当的检测用核酸(碱基序列：5’-RedmondRed-TCT-EclipseQuencher-TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACTCCGCGTCCGT-3’：序列号7)形成第二开裂结构。在检测用核酸的5’端结合有荧光分子(Redmond RED，雷蒙德红)，在从检测用核酸的5’末端起的第3个残基与第4个残基之间插入有消光分子(Eclipse Quencher)，当通过FEN蛋白切断了第二侧翼时(第二阶段的侧翼切断反应)，能够检测出RedmondRED的红色荧光。
对于试验No.1(简称Afu)、试验No.3(简称Mth)、试验No.4(简称Pab)和试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白，评价了2阶段的侧翼切断反应。2阶段的侧翼切断反应通过如下方式进行：以1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、4μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、0.05v/v％、Tween 20、20mMMgCl2、0.086mg/mL或0.1mg/mL FEN蛋白、0M、1.5pM、100nM或1μM靶核酸的组成制备反应溶液，使用LightCycler480(注册商标)(RocheDiagnostics制)实时测定荧光强度，同时在65℃下孵育60分钟。
图3表示荧光强度的实时测定的结果的一例。图3是使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白时的测定结果。图3(A)是表示绿色荧光(游离的第一侧翼来源的荧光)的测定结果的曲线图。图3(B)是表示红色荧光(游离的第二侧翼来源的荧光)的测定结果的曲线图。
如图3所示，能够确认绿色荧光和红色荧光均与靶核酸的浓度相应地增加的倾向。另外，在靶核酸的浓度为100nM和1μM的情况下，由于靶核酸浓度高，因此认为荧光强度饱和。另外，在靶核酸的浓度为1.5pM的情况下，与绿色荧光相比，红色荧光与背景(靶核酸的浓度为0M的情况)之差变大，这是因为游离的第一侧翼反复与检测用核酸形成第二开裂结构，由此发生信号(游离的第二侧翼)的放大。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为1.5pM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表3。
表3
试验No. FEN蛋白的来源 S/N比
1 Afu 3.2
3 Mth 3.3
4 Pab 4.8
6 Tko 5.3
如表3所示，试验No.3(简称Mth)、试验No.4(简称Pab)和试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白显示比以往使用的试验No.1(简称Afu)的FEN蛋白更高的S/N比。
对于除上述以外的FEN蛋白及试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白，在以下的条件下评价了2阶段的侧翼切断反应。2阶段的侧翼切断反应通过如下方式进行：以1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、2μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、50mMTris-HCl(pH为8.5)、0.05v/v％Tween 20、2.5mM MgCl2、1.16μM(仅试验No.10)或7.74μMFEN蛋白、0M、1.5pM、30pM或100pM靶核酸的组成制备反应溶液，使用LightCycler480(注册商标)(Roche Diagnostics制)实时测定荧光强度，同时在65℃下孵育60分钟。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为1.5pM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表4。
表4
Figure BDA0003824215010000171
试验No.9～试验No.21的FEN蛋白没有显示出高的S/N比。
[试验例4：侧翼切断反应的反应条件的研究]
使用试验No.3(简称Mth)及试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白，在与试验例3同样的评价体系中，进行侧翼切断反应的反应条件的研究。
<pH>
使反应液组成为下述组成：以将pH调整为pH7.5、pH8.0、pH8.5或pH9.0的50mMTris-HCl为基础，含有1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、2μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、0.05v/v％Tween 20、2.5mM MgCl2、0.5μM FEN蛋白、0M、100pM或1nM靶核酸。使反应液量为10μL。在制备反应溶液后，使用LightCycler480(注册商标)(Roche Diagnostics制)实时测定荧光强度，同时在67℃下孵育60分钟，进行侧翼切断反应。需要说明的是，在pH的研究中，仅使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为100pM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表5。另外，图4中表示荧光强度的实时测定的结果(曲线图)。曲线图的纵轴表示荧光强度，横轴表示从反应开始起的时间(分钟)，图4(A)～(D)表示使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白在pH7.5、pH8.0、pH8.5或pH9.0下进行测定的结果。
表5
Figure BDA0003824215010000181
如图4和表5所示，在反应液的pH为7.5以上且9.0以下的范围内可见良好的S/N比。另外，在pH8.5附近，除了良好的S/N比以外，还可见红色荧光强度的上升变得更快的效果。红色荧光强度的上升越快，越能够以更短的时间进行检测。
<温度>
使反应液组成为：1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、2μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、0.05v/v％Tween 20、2.5mM MgCl2、0.5μM FEN蛋白、0M、30pM或1nM靶核酸。使反应液量为10μL。在制备反应溶液后，使用LightCycler480(注册商标)(Roche Diagnostics制)实时测定荧光强度，同时在55℃、60℃、65℃、67℃或70℃下孵育60分钟，进行侧翼切断反应。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为30pM或1nM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表6。另外，图5～图8表示荧光强度的实时测定的结果(曲线图)。曲线图的纵轴表示荧光强度，横轴表示从反应开始起的时间(分钟)，图5(A)～(E)表示使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白，以30pM的靶核酸的浓度在55℃、60℃、65℃、67℃或70℃下进行测定的结果。图6(A)～(E)表示使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白，以1nM的靶核酸的浓度在55℃、60℃、65℃、67℃或70℃下进行测定的结果。图7(A)～(E)表示使用试验No.3(简称Mth)的FEN蛋白，以30pM的靶核酸的浓度在55℃、60℃、65℃、67℃或70℃下进行测定的结果。图8(A)～(E)表示使用试验No.3(简称Mth)的FEN蛋白，以1nM的靶核酸的浓度在55℃、60℃、65℃、67℃或70℃下进行测定的结果。
表6
Figure BDA0003824215010000191
如图5～8和表6所示，在反应液的温度为55℃以上且70℃以下的范围内可见良好的S/N比。另外，在试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白中，在温度为60℃以上且70℃以下的范围内，除了良好的S/N比以外，还可见即使靶核酸的浓度低，红色荧光强度的上升也变得更快的效果。同样的效果在试验No.3(简称Mth)的FEN蛋白中，在温度为55℃以上且65℃以下的范围内也可见。
<Mg2+离子浓度＞
使反应液组成为：1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、2μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、0.05v/v％Tween 20、1mM、2.5mM、5mM、10mM或20mM MgCl2、0.5μM FEN蛋白、0M、100pM或1nM靶核酸。使反应液量为10μL。在制备反应溶液后，使用LightCycler480(注册商标)(Roche Diagnostics制)实时测定荧光强度，同时在67℃下孵育60分钟，进行侧翼切断反应。需要说明的是，在Mg2+离子浓度的研究中，仅使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为100pM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表7。另外，图9表示荧光强度的实时测定的结果(曲线图)。曲线图的纵轴表示荧光强度，横轴表示从反应开始起的时间(分钟)，图9(A)～(E)表示使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白以1mM、2.5mM、5mM、10mM或20mM的Mg2+浓度进行测定的结果。
表7
Figure BDA0003824215010000201
如图9及表7所示，在反应液中的Mg2+浓度为1mM以上且20mM以下的范围内(优选为2.5mM以上且20mM以下的范围内)可见良好的S/N比。另外，在Mg2+浓度为5mM以上且10mM以下的范围内，除了良好的S/N比以外，还可见红色荧光强度的上升变得更快的效果。
<K+离子浓度＞
使反应液组成为：1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、2μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、0.05v/v％Tween 20、2.5mM MgCl2、0mM、25mM、50mM、100mM或200mM KCl、0.5μM FEN蛋白、0M、1nM或10nM靶核酸。使反应液量为10μL。在制备反应溶液后，使用LightCycler480(注册商标)(RocheDiagnostics制)实时测定荧光强度，同时在67℃下孵育60分钟，进行侧翼切断反应。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为1nM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表8。另外，图10～11表示荧光强度的实时测定的结果(曲线图)。曲线图的纵轴表示荧光强度，横轴表示从反应开始起的时间(分钟)，图10(A)～(E)表示使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白以0mM、25mM、50mM、100mM或200mM的K+浓度进行测定的结果。图11(A)～(E)表示使用试验No.3(简称Mth)的FEN蛋白以0mM、25mM、50mM、100mM或200mM的K+浓度进行测定的结果。
表8
Figure BDA0003824215010000211
如图10～11及表8所示，在反应液中的K+浓度为100mM以下的范围内可见良好的S/N比。另外，在该范围内，S/N比及上升的速度没有大的差异，因此可知K+不一定需要(可以为0mM)。
<Tris(三羟甲基氨基甲烷)浓度>
使反应液组成为：1μM等位基因探针(第一核酸)、1μM侵入寡核苷酸(第二核酸)、2μM检测用核酸(第三核酸和第四核酸)、5mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM或500mMTris-HCl(pH为8.5)、0.05v/v％Tween 20、5mM MgCl2、0.5μM FEN蛋白、0M、100pM或1nM靶核酸。使反应液量为10μL。在制备反应溶液后，使用LightCycler480(注册商标)(RocheDiagnostics制)实时测定荧光强度，同时在67℃下孵育60分钟，进行侧翼切断反应。
根据从反应开始起30分钟后的时间点的靶核酸的浓度为100pM时的红色荧光强度(信号)与靶核酸的浓度为0M时的红色荧光强度(噪声)之比计算出S/N比。将结果示于表9。另外，图12～13表示荧光强度的实时测定的结果(曲线图)。曲线图的纵轴表示荧光强度，横轴表示从反应开始起的时间(分钟)，图12(A)～(H)表示使用试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白以5mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM或500mM的Tris浓度进行测定的结果。图13(A)～(H)表示使用试验No.3(简称Mth)的FEN蛋白以5mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM或500mM的Tris浓度进行测定的结果。
表9
Figure BDA0003824215010000221
如图12～13及表9所示，在反应液中的Tris浓度为300mM以下的范围内(优选为5mM以上且300mM以下的范围内)可见良好的S/N比。另外，红色荧光强度的上升也更快。
[试验例5：在数字测量中的应用]
使用试验No.1(简称Afu)和试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白，评价了基于数字测量的靶核酸的检测效率。
将具有多个微孔的平板状的透明的环烯烃聚合物(COP)制的基板与COP制的盖部件贴合，制作微流体设备。盖部件使用以夹着在贴合时形成有微孔的区域的方式具有注入口和排出口，在周缘部具有隆起的50μm的台阶的部件。微流体设备的各孔形成为圆筒形。各孔的直径(开口直径)设计为10μm，孔的深度设计为15μm。基板及盖部件使用热塑性树脂通过注塑成型来制作。使台阶的端部与基板接触，对接触部分进行激光熔融粘合。
作为试剂1，制备了含有150aM靶DNA寡聚物(Fasmac公司制：靶核酸：5’-CCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAG-3’：序列号8)、0.5μM等位基因探针(Fasmac公司制：第一核酸：5’-ACGGACGCGGAGTGCAGCTCATGCCC-3’：序列号9)、1μM侵入寡聚物(Fasmac公司制：第二核酸：5’-CCACCGTGCARCTCATCAA-3’：序列号10)、4μM FRETCassette(Redmond RED-Eclipse Quanrure)(Tsukuba Oligo Service公司制：第三核酸和第四核酸：5’-Redmond Red-TCT-Eclipse Quencher-TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACTCCGCGTCCGT-3’：序列号11)、FEN蛋白(简称Tko或简称Afu)、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、20mM MgCl2、0.05v/v％Tween 20的水溶液。另外，作为密封液，使用了氟系油(FC40、SIGMA公司制)。
首先，使用移液器将上述制备的试剂1(20μL)送液至微流体设备的注入口，用试剂1填满微孔及流路。然后，将氟系油(150μL)送液至微流体设备的注入口，替换流路内的试剂1，将试剂1密封在微孔内。剩余的试剂1和氟系油从排出口排出。
将微流体设备载置于热板上，将热板温度加热至67℃，进行25分钟反应。然后，用荧光显微镜(BZ-X700，KEYENCE公司制)进行微流体设备的观察。将结果示于图14。
根据事先的预备实验，由投入的靶核酸量(150aM)预测的亮点数量为(1孔/13513孔)。如图14所示，试验No.6(简称Tko)的FEN蛋白的结果与预想值大致一致。另一方面，试验No.1(简称Afu)的FEN蛋白的结果是大幅超过预测值，其中的大半为模糊的亮度的结果(副反应)。
Figure IDA0004069637640000011
Figure IDA0004069637640000021
Figure IDA0004069637640000031
Figure IDA0004069637640000041

Claims (16)

1.一种靶核酸的检测方法，其包含：
将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼切断的步骤；
将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤；以及
通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤；
其中，将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤通过用侧翼核酸内切酶将所述第一侧翼和所述第二侧翼切断来进行，
所述侧翼核酸内切酶具有与选自由属于热球菌目(Thermococcales)的细菌和属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述侧翼核酸内切酶具有与选自由嗜热古生菌(Thermococcus kodakar ensis)KOD1株、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)GE5株、以及热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter Thermautotrophicus)Delta H株组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述靶核酸是DNA。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤在pH为7.5以上且9.0以下的条件下进行。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤在温度为55℃以上且70℃以下的条件下进行。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，所述水性溶剂含有Mg2+。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，
所述水性溶剂中的Mg2+浓度为2.5mM以上且20mM以下。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，所述水性溶剂中的K+浓度为0mM以上且100mM以下。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，所述水性溶剂中的三羟甲基氨基甲烷浓度为超过0mM且300mM以下。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤可以在水性溶剂中进行，所述水性溶剂中的所述侧翼核酸内切酶浓度为0.5μM以上且8μM以下。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
将所述第一侧翼切断的步骤及将所述第二侧翼切断的步骤在水性溶剂中进行，所述水性溶剂的容积为10aL以上且10μL以下。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
所述第三核酸与所述第四核酸通过连接分子结合。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，
通过检测荧光来检测所述被切断的第二侧翼。
14.一种用于在权利要求1～13中任一项所述的方法中使用的试剂盒，其包含：
所述第三核酸、所述第四核酸、所述侧翼核酸内切酶、以及显示根据所述靶核酸的碱基序列来设计第一核酸和第二核酸的碱基序列的指导的说明书。
15.一种表达载体，其具有编码下述氨基酸序列的核酸序列和可工作地连结于所述核酸序列的1个或多个调节序列，
所述氨基酸序列与选自由属于热球菌目(Thermococcales)的细菌和属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有65％以上的序列同源性。
16.根据权利要求15所述的表达载体，其为质粒。
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