CN110997938A - Abl1 t315i突变的表达水平的测定方法 - Google Patents
Abl1 t315i突变的表达水平的测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110997938A CN110997938A CN201880042856.1A CN201880042856A CN110997938A CN 110997938 A CN110997938 A CN 110997938A CN 201880042856 A CN201880042856 A CN 201880042856A CN 110997938 A CN110997938 A CN 110997938A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutation
- primer
- abl
- region
- reverse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 139
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 101
- 101000823316 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 claims abstract description 116
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 109
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 64
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 51
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 57
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 42
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 22
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 16
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 10
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 9
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 63
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 61
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 56
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 55
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 101100268646 Homo sapiens ABL1 gene Proteins 0.000 description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 8
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 7
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 7
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 6
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 101100268645 Caenorhabditis elegans abl-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000002137 L01XE24 - Ponatinib Substances 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 210000004214 philadelphia chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 229960001131 ponatinib Drugs 0.000 description 4
- PHXJVRSECIGDHY-UHFFFAOYSA-N ponatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC(C(=C1)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C)C(C#CC=2N3N=CC=CC3=NC=2)=C1 PHXJVRSECIGDHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 101150033421 ABL gene Proteins 0.000 description 3
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 3
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 101150049556 Bcr gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 2
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-ULQXZJNLSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 MXHRCPNRJAMMIM-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 239000005536 L01XE08 - Nilotinib Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- -1 dNTP Substances 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 229960001346 nilotinib Drugs 0.000 description 1
- HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N nilotinib Chemical compound C1=NC(C)=CN1C1=CC(NC(=O)C=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)=CC(C(F)(F)F)=C1 HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
Abstract
本公开提供一种方法及用于该方法的试剂盒,所述方法包括:(1)在具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸存在下,在同一容器中使用(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物、及(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物,对对象的RNA试样进行逆转录的工序;(2)基于利用(a)的引物得到的逆转录产物相对于利用(b)的引物得到的逆转录产物的比例,计算ABL1 T315I突变的表达水平的工序。
Description
技术领域
本专利申请基于日本专利申请第2017-087578号要求优先权,在此通过参照将其整体引入到本说明书中。
本申请涉及测定ABL1 T315I突变的表达水平的方法、或用于该方法的试剂盒。
背景技术
BCR-ABL1融合基因是在慢性髓性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia:CML)及费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病(Philadelphia chromosome positive AcuteLymphocytic Leukemia:Ph阳性ALL)中可见的染色体异常。由于9号染色体与22号染色体之间的易位t(9;22),定位在9号染色体的q34带的ABL1基因与定位在22号染色体的q11带的BCR基因融合而形成该融合基因。BCR-ABL1融合基因所编码的嵌合蛋白BCR-ABL1具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase)活性,通过稳定地刺激细胞增殖信号、抑制细胞凋亡抑制的行为而使造血干细胞无限增殖、引起异常。
综上所述,嵌合蛋白BCR-ABL1是CML及Ph阳性ALL的致病蛋白之一,因此一直在开发以BCR-ABL1为靶分子并作用于该靶分子的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitor:TKI)来作为治疗药。作为代表性的TKI的伊马替尼对CML及Ph阳性ALL的病例发挥了划时代的治疗效果。但是,在BCR-ABL1基因发生突变的病例中,其效果下降,这成为治疗上的课题。此后,作为对伊马替尼具有耐药性的BCR-ABL1基因突变中的多种类型有效的TKI,开发出尼洛替尼及达沙替尼。但是,对于BCR-ABL1基因发生BCR-ABL1的ABL1区域第315位的氨基酸-苏氨酸置换为异亮氨酸的突变(T315I突变)的病例,效果显著下降(非专利文献1~3)。以往,发生T315I突变时TKI治疗的预后不好,同种异体干细胞移植成为第一选择,期望在血液学复发前早期检测T315I突变。
作为对于存在该T315I突变的BCR-ABL1也显示酪氨酸激酶抑制作用的药剂,开发出帕纳替尼。帕纳替尼在对现有的TKI具有耐药性或不耐受的CML及Ph阳性ALL中有用,特别是存在T315I突变时显示出较高的效果(非专利文献4及5)。
由于这样的原因,在患者存在T315I突变的情况下,需要从目前的TKI迅速切换到帕纳替尼治疗。但是,目前用于BCR-ABL1的突变分析的直接测序法、焦磷酸测序法、DHPLC法、高分辨率熔解曲线分析法、利用特异性引物的PCR法等方法灵敏度不充分,难以早期确认T315I突变(非专利文献6~8)。若T315I突变发现得晚、疾病分期发生进展,很可能即使使用对T315I突变有效的帕纳替尼也无法实现缓解。因此认为,在更早的时期检测T315I突变是医疗上的重要课题。
另外,BCR-ABL1为对象的TKI治疗中,可通过测定BCR-ABL1 mRNA表达量来监测治疗效果。T315I突变对多种TKI具有耐药性、预后不良,因此认为,与BCR-ABL1 mRNA量同样地,监测具有T315I突变的BCR-ABL1 mRNA的表达量在临床上有用。另外,认为对于评价帕纳替尼的效果也有用。但是,目前开发出的T315I突变检测法缺乏足够的定量性,对于这些目的而言并不充分。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Druker BJ,Guilhot F,O’Brien SG,Gathmann I,Kantarjian H,Gattermann N,et al.Five-year follow-up of patients receiving imatinib forchronic myeloid leukemia.N Engl J Med.2006;355:2408-17.
非专利文献2:Modugno M.New resistance mechanisms for small moleculekinase inhibitors of Abl kinase.Drug Discov Today Technol.2014;11:5-10.
非专利文献3:Zabriskie MS,Eide CA,Tantravahi SK,Vellore NA,Estrada J,Nicolini FE,et al.BCR-ABL1 Compound Mutations Combining Key Kinase DomainPositions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-PositiveLeukemia.Cancer Cell.2014;26:428-42.
非专利文献4:Goldman JM.Ponatinib for chronic myeloid leukemia.N EnglJ Med.2012;367:2148-2149.
非专利文献5:Cortes JE,Kantarjian H,Shah NP,et al.Ponatinib inrefractory Philadelphia chromosome-positive leukemias.N Engl J Med.2012;367:2075-2088.
非专利文献6:Hofmann WK、Jones LC,Lemp NA,de Vos S,Gschaidmeier H、Hoelzer D,et al.Ph(+)acute lymphoblastic leukemia resistant to the tyrosinekinase inhibitor STI571 has a unique BCR-ABL gene mutation.Blood.2002;99:1860-2.
非专利文献7:Yamamoto M,Kakihana K,Ohashi K,Yamaguchi T,Tadokoro K,Akiyama H,et al.Serial monitoring of T315I BCR-ABL mutation by Invader assaycombined with RT-PCR.Int J Hematol.2009;89:482-8.
非专利文献8:Yin L,Dittman D,Chenn A.Rapid quantitative detection ofthe T315I mutation in patients with chronic myelogenous leukemia.Diagn MolPathol.2012;21:34-39.
发明内容
发明要解决的问题
本申请的目的在于,提供测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平的方法、或用于该方法的试剂盒。
用于解决问题的方案
本发明人们发现,使用与ABL1 mRNA的T315I突变部位的上游和下游结合的两种反向引物,并且在与野生型ABL1 mRNA基因特异性结合的修饰核酸存在下对对象的RNA试样进行逆转录并比较利用这两种引物得到的逆转录产物的量,从而可以测定ABL1 T315I突变的表达水平。
因此,在一方式中,本申请提供一种测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平的方法,其包括:
(1)在具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸存在下,在同一容器中使用(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物、及(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物对对象的RNA试样进行逆转录的工序;及,
(2)基于利用(a)的引物得到的逆转录产物相对于利用(b)的引物得到的逆转录产物的比例,计算ABL1 T315I突变的表达水平的工序。
在另一方式中,本申请提供一种试剂盒,其用于测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平,其包含:
(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物;
(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物;及,
(c)具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸。
发明的效果
根据本发明,可以测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平。由此,可期待得到对处置存在T315I突变的患者有用的信息。
附图说明
图1-1示出序列号1的碱基序列。将第947位的胞嘧啶碱基用粗体及下划线示出。
图1-2示出序列号1的碱基序列(续)。
图2-1示出序列号3的碱基序列。将第947位的胸腺嘧啶碱基用粗体及下划线示出。
图2-2示出序列号3的碱基序列(续)。
图3是使用两个反向引物的野生型ABL1 mRNA的逆转录反应的示意图。
图4是使用两个反向引物的T315I突变型ABL1 mRNA的逆转录反应的示意图。
图5是逆转录反应的示意图。
图6是ABL1 mRNA的定量实时PCR的示意图。
图7是T315I突变型ABL1 mRNA的定量实时PCR的示意图。
图8示出来自T315I反向引物的cDNA的扩增的扩增曲线。
图9示出来自ABL反向引物的cDNA的扩增的扩增曲线。
具体实施方式
只要没有特别地具体进行规定,则本说明书中使用的术语具有如有机化学、医学、药学、分子生物学、微生物学等领域的本领域技术人员通常所理解的意思。以下记载本说明书中所使用的几个术语的定义,这些定义在本说明书中优先于常规理解。
本说明书中,在数值伴有“约”这一术语时,表示该值的±10%的范围。例如,“约20”是指包含“18~22”。数值的范围包含两端点间的全部数值及两端点的数值。关于范围的“约”应用于该范围的两端点。因此,例如“约20~30”是指包含“18~33”。
ABL1基因是定位于9号染色体的q34带的基因。由于9号染色体与22号染色体之间的易位t(9;22),BCR基因的外显子1、外显子1~13或1~14与ABL1基因的外显子2~4融合,产生在慢性髓性白血病及费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病中可见的BCR-ABL1基因。
ABL1基因典型情况下具有序列号1的碱基序列,已知有多个突变体。本申请中,ABL1基因包括:与具有序列号1的序列的多核苷酸的互补序列在严谨条件下杂交的多核苷酸。关于“在严谨条件下杂交”,这里所使用的杂交例如可以基于Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)等中记载的常规方法来进行。另外,“严谨条件下”可列举例如:在包含6×SSC(将包含1.5M NaCl、0.15M柠檬酸三钠的溶液设为10×SSC)、50%甲酰胺的溶液中且在45℃下形成杂交体后,用2×SSC在50℃下进行洗涤的条件(Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6);及,带来与其同等的严谨度的条件。
进一步地,ABL1基因包括与具有序列号1的序列的多核苷酸具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的序列同一性的多核苷酸。序列同一性是指:两个寡核苷酸间的序列的类似程度,可通过对待比较的碱基序列区域以最佳状态(序列的一致性达到最大的状态)排列着的两个序列进行比较而确定。序列同一性的数值(%)可如下计算:确定存在于两个序列中的相同的碱基,确定匹配位点的数量,然后将该匹配位点的数量除以待比较的序列区域内的碱基总数,将得到的数值乘以100,从而算出。作为用于得到最佳的比对及序列同一性的算法,可列举本领域技术人员通常可以使用的各种算法(例如BLAST算法、FASTA算法等)。碱基序列的序列同一性例如可使用BLAST、FASTA等序列分析软件来确定。
本说明书中,将ABL1基因中的、T315I突变位置的核苷酸具有胞嘧啶的ABL1基因称为“野生型ABL1基因”,将其mRNA称为“野生型ABL1 mRNA”。野生型ABL1 mRNA典型情况下具有序列号1的核苷酸序列,其编码的蛋白质具有序列号2的氨基酸序列。本申请中,“T315I突变位置”是指:将某一ABL1基因的核苷酸序列与序列号1的核苷酸序列进行最佳比对时相当于序列号1的第947位的位置。
若野生型ABL1基因的上述胞嘧啶被置换为胸腺嘧啶,则其编码的蛋白质中相当于BCR-ABL1蛋白的ABL1区域的第315位的氨基酸的苏氨酸被置换为异亮氨酸。本说明书中将ABL1基因或ABL1蛋白中的该置换称为“T315I突变”。将存在T315I突变的ABL1基因称为“T315I突变型ABL1基因”,将其mRNA称为“T315I突变型ABL1 mRNA”。T315I突变型ABL1 mRNA典型情况下具有序列号3的核苷酸序列,其编码的蛋白质具有序列号4的氨基酸序列。
本申请中,“ABL1 T315I突变的表达水平”是指:存在T315I突变的全部基因、即存在T315I突变的未发生易位的ABL1基因及包含BCR-ABL1基因的发生了易位的ABL1基因的表达水平。
本申请中,典型情况下,对象为人。对象可以是患有慢性髓性白血病(CML)或费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病(Ph+ALL)的对象、或有患病疑似的对象。对象可具有BCR-ABL1基因。
本申请中,“RNA试样”是从来自对象的包含造血干细胞、白细胞或白血病细胞的试样中提取的RNA,例如可以是从血液、骨髓液、淋巴液中提取的RNA。可以使用从分离后的造血干细胞、血细胞、白细胞或白血病细胞中提取的RNA。一实施方式中,RNA试样是从外周血白细胞或骨髓有核细胞中提取的RNA。一实施方式中,RNA试样是从外周血白细胞中提取的RNA。
从试样中提取RNA时,可以使用公知的任一方法。例如,可以利用:在PCI(苯酚·氯仿·异戊醇提取)法中使溶液呈酸性并从水层中提取的方法;使用市售的RNA提取试剂盒的方法;其它公知的方法。RNA可以是总RNA,也可以是纯化后的mRNA。
工序(1)中,使用具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸。本说明书中,将该修饰核酸称为“T315I夹(clamp)”。修饰核酸包含1个以上的人工核苷酸,与具有某种序列的mRNA形成比具有与修饰核酸相同的碱基序列的DNA更牢固的互补链,不会被逆转录酶的核酸外切酶活性降解。若修饰核酸与作为模板的mRNA结合,则逆转录酶将在结合部位停止延伸反应。
T315I夹被设计为与T315I突变位置的核苷酸具有胞嘧啶的野生型ABL1 mRNA结合、并且不与该核苷酸具有胸腺嘧啶的T315I突变型ABL1 mRNA结合,从而抑制野生型ABL1mRNA的逆转录且不抑制T315I突变型ABL1 mRNA的逆转录。具体而言,T315I夹可以是:与包括野生型ABL1 mRNA的T315I突变位置的核苷酸在内的约10~22个、约12~20个、约14~18个或约15~17个、例如约16个核苷酸所构成的区域互补的修饰核酸。一实施方式中,T315I夹包含5’-ATGAACTCAGTGATGA-3’(序列号5)的核苷酸序列。一实施方式中,T315I夹由序列号5的碱基序列构成。
T315I夹包含1个或1个以上的人工核苷酸。人工核苷酸是指:核苷(碱基部分或糖部分)被修饰而具有不同于天然核苷酸的结构的核苷酸。作为人工核苷酸,可选择提高了核酸酶耐受性、与靶序列的结合亲和性的人工核苷酸。例如,可使用通过示出出处而成为本说明书的一部分的、Deleavey,G.F.,&Damha,M.J.(2012).Designing chemically modifiedoligonucleotides for targeted gene silencing.Chemistry&biology,19(8),937-954中记载的人工核苷酸。人工核苷酸的例子可列举例如:无碱基(abasic)核苷;阿拉伯糖核苷、2’-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷、具有其它糖修饰的核苷;肽核酸(PNA)、键合有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、桥型人工核酸(LNA)、2’-O,4’-C-亚乙基桥核酸(ENA)、受限的乙基(cEt)、吗啉代核酸等。具有糖修饰的核苷包括2’-O-甲基核糖、2’-O-甲氧基乙基核糖、2’-脱氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖等取代戊糖;1’,2’-脱氧核糖;阿拉伯糖;取代阿拉伯糖;具有己糖及α异头糖修饰的核苷。作为修饰碱基,可列举例如5-羟基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫尿嘧啶等嘧啶;6-甲基腺嘌呤、6-硫鸟嘌呤等嘌呤;及其它杂环碱基等。T315I夹中的人工核苷酸可以全部为同一种,也可以存在两种以上不同的人工核苷酸。
一实施方式中,T315I夹包含1个或1个以上的PNA作为人工核苷酸。PNA通常产生如下结构:通过由N-(2-氨基乙基)甘氨酸形成肽键而以肽键置换DNA的磷酸键的结构(Nielsen et al.1991 Science 254、1457-1500)。PNA对各种核酸分解酶具有耐受性,通过与DNA或RNA同样的分子识别而与DNA或RNA形成互补链。PNA与DNA的亲和性高于DNA与DNA或DNA与RNA的亲和性。一实施方式中,T315I夹中的核苷酸均为PNA。
T315I夹的添加量为可控制野生型ABL1 mRNA的逆转录的量即可,例如以逆转录反应液的最终体积摩尔浓度计,可以设为约0.1μM~10μM或约0.5μM~5μM,例如约2μM。
工序(1)中,为了进行逆转录而使用两种反向引物,即(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物、及(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物。(a)的反向引物对ABL1 mRNA的包含T315I夹所结合的区域的部分进行逆转录。本说明书中,将该反向引物称为“T315I反向引物”。(b)的反向引物对ABL1 mRNA的、T315I夹所结合的区域的上游部分进行逆转录。本说明书中,将(b)的反向引物称为“ABL反向引物”。适合于逆转录的引物的设计方法对于本领域技术人员而言是已知的。
工序(1)中,以一步反应、即在同一容器内同时或连续地进行基于T315I反向引物和ABL反向引物的逆转录。一实施方式中,在同一容器内同时进行基于T315I反向引物和ABL反向引物的逆转录。将使用这些逆转录用引物和T315I夹的野生型ABL1 mRNA及T315I突变型ABL1 mRNA的逆转录反应的示意图分别示于图3及4。
逆转录酶、dNTP、缓冲液等试剂可以使用该领域中通常使用的物质,各种试剂的量、反应时间、温度等条件可根据逆转录酶所附带的说明书的记载、通常使用的规程等公知方法适当地确定。例如,逆转录酶可使用能用于分子生物学实验等中的公知的任意逆转录酶,例如TthDNA聚合酶、rTthDNA聚合酶、AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶等或它们的衍生物。
工序(2)中,基于利用(a)的T315I反向引物得到的逆转录产物相对于利用(b)的ABL反向引物得到的逆转录产物的比例计算ABL1 T315I突变的表达水平。例如。将用利用(a)的T315I反向引物得到的逆转录产物的定量值除以利用(b)的ABL反向引物得到的逆转录产物的定量值而得的值作为ABL1 T315I突变的表达水平的测定值。逆转录产物的定量可以通过该领域中已知的任一方法来实施。可列举例如:定量PCR、扩增后的核酸的电泳、使用结合有可检测的标记的核酸探针的杂交法、用嵌入性荧光染料进行的双链DNA染色、荧光探针法等。
一实施方式中,上述方法的工序(2)还包括:工序(2-1)通过定量PCR对利用(a)的T315I反向引物得到的逆转录产物进行定量的工序、及工序(2-2)通过定量PCR对利用(b)的ABL反向引物得到的逆转录产物进行定量的工序。定量PCR例如可以是定量实时PCR。作为定量实时PCR,可使用各种荧光PCR技术。作为荧光PCR技术,可列举例如:使用SYBR GREEN I等荧光性核酸标记剂的嵌入法(使用例如LightCycler(注册商标)(罗氏公司)、ABI Prizm7700Sequence Detection System(注册商标)(PerkinElmer Applied Biosystems公司))、利用DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性来实时监控扩增的TaqMan探针法、利用RNaseH酶的RNase活性及配套的嵌合RNA探针的循环探针法(cycling probe method)等,但不限于此。
一实施方式中,利用TaqMan探针法来进行定量实时PCR。通常,TaqMan探针法中,向PCR反应体系中添加用荧光物质修饰5’末端、用淬灭剂物质修饰3’末端的寡核苷酸(TaqMan探针)。TaqMan探针在退火阶段与模板DNA特异性地杂交,由于探针上存在淬灭剂,即使照射激发光也抑制荧光的产生。在延伸反应阶段,当杂交于模板的TaqMan探针由于Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性而被分解时,荧光染料远离淬灭剂,从而发出荧光。TaqMan探针可以结合于PCR产物的任意位置,可利用该领域中已知的方法来设计。另外,可使用任意的荧光物质与淬灭剂物质的组合。
定量实时PCR中,可以同时扩增包含已知浓度的cDNA的标准液和未知浓度的cDNA(被检体),制作横轴标绘扩增循环数、纵轴标绘报告染料的荧光强度(对数变换值)的荧光扩增曲线。可在扩增曲线呈直线状的荧光强度的中央值附近引出与横轴平行的线,从而求出该线与各扩增曲线相交时的扩增循环数。另外,制作横轴标绘各标准液的浓度(对数变换值)、纵轴标绘标准液的扩增循环数的标准曲线,将被检体的扩增循环数带入该标准曲线,从而可计算被检体的浓度。
工序(2-1)及(2-2)中使用的引物对分别按照可扩增工序(1)的逆转录产物的方式来设计。适合于PCR的引物的设计方法对于本领域技术人员而言是已知的。可按照扩增后的核酸具有适合于定量的长度、例如约10~1000、约20~500、约50~300、约100~200核苷酸、例如约150核苷酸长的方式来设计引物对。
工序(2-1)中使用的引物对按照可扩增包含逆转录产物的T315I突变位置的区域的方式来设计。即,使用具有ABL基因的包含T315I突变位置的区域或其上游区域的碱基序列的正向引物、和具有与ABL1基因的包含T315I突变位置的区域或其下游的区域的碱基序列互补的碱基序列的反向引物。工序(2-1)中使用的正向引物可以是具有ABL基因的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、且相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸被尿嘧啶核糖核苷酸置换的引物。一实施方式中,工序(2-1)中使用与工序(1)的(a)相同的T315I反向引物。一实施方式中,工序(2-2)中使用与工序(1)的(b)相同的ABL反向引物。
工序(2-1)中,可以利用T315I突变特异性的RNaseH依赖性定量PCR来定量利用T315I反向引物得到的逆转录产物。RNaseH依赖性PCR是利用RNaseH的序列特异性PCR法(Boucard AA,et.al.J Biol Chem,289(1):387-402;Dobosy JR,et al.,BMC Biotechnol,11(80):1-18)。RNaseH识别RNA/DNA杂化双链并切断RNA的5’末端侧的与DNA的磷酸二酯键。在RNaseH依赖性PCR中,通过将引物中的至少1碱基设为RNA而形成模板DNA和RNA/DNA杂化双链,进一步在RNA的3’侧设置DNA聚合酶不能结合的区域(阻断区域),从而使得仅在RNaseH识别RNA/DNA杂化双链并切断时进行PCR。对于RNaseH切断RNA与DNA的磷酸二酯键而言,引物内的RNA与模板DNA互补、而非错配这一点是必要条件。
工序(2-1)中的RNaseH依赖性定量PCR中,使用具有ABL1基因的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、且相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸被置换为尿嘧啶核糖核苷酸、且在3’末端具有阻断区域的正向引物。本说明书中,将该正向引物称为“T315I正向引物”。在野生型ABL cDNA的PCR中,T315I正向引物中的尿嘧啶核糖核苷酸与模板的核苷酸产生错配,因此阻断区域不会被切断,从而PCR不会进行。另一方面,T315I突变型ABL cDNA的PCR中不产生错配,因此阻断区域被切断,从而进行PCR。因此利用使用T315I正向引物的RNaseH依赖性PCR可以特异性扩增T315I突变型ABL cDNA。
关于RNaseH依赖性PCR中使用的引物,例如可以参照Integrated DNAtechnologies公司提供的规程由本领域技术人员适当地进行设计。T315I正向引物按照ABL1基因的包含T315I突变位置的上游区域的序列、并且在RNA和阻断区域被切掉后残留的寡核苷酸可作为PCR反应的正向引物起作用的方式来设计。T315I正向引物包含例如ABL1mRNA的T315I突变位置的上游约8~60、10~30、15~25或19~23核苷酸、例如约20、21或22核苷酸的序列。T315I正向引物中的相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸为尿嘧啶核糖核苷酸。3’侧的阻断区域包含错配DNA及C3间隔子等阻断基。例如阻断区域包含:具有与ABL1基因的第945~948位的核苷酸相同的碱基的4个脱氧核糖核苷酸、具有与第949位的核苷酸不同的碱基的1个脱氧核糖核苷酸及1个阻断基。另一例子中,阻断区域包含:具有与ABL1基因的第945位的核苷酸相同的碱基的1个脱氧核糖核苷酸、2个阻断基、具有与第946位的核苷酸相同的碱基的1个脱氧核糖核苷酸、具有与第947位的核苷酸不同的碱基的1个脱氧核糖核苷酸。
一实施方式中,T315I正向引物为5’-GAGCCCCCGTTCTATATCATCArUT/iSpC3//iSpC3/GC-3’(序列号6、在此,rU为尿嘧啶RNA,iSpC3为间隔子C3)。
工序(2-1)及(2-2)可以在T315I夹的存在下进行。因此,可以在工序(1)的产物的全部或一部分中添加工序(2-1)或(2-2)所需的试剂而进行反应。例如,可以以一步反应、即在同一容器内同时或连续地进行工序(1)和(2-1)、或者工序(1)和(2-2)。
在于工序(2-1)中实施RNaseH依赖性PCR、以一步反应来实施工序(1)和(2-1)的情况下,有时T315I夹的一部分与T315I正向引物的一部分可能会互补结合。通常认为,寡核苷酸识别1碱基突变的能力在突变部位位于寡核苷酸中央时达到最大,为了减少该互补结合,可以按照下述方式来设计T315I夹:相较于T315I夹的中央,使相当于T315I突变位置的核苷酸位于3’侧。即,可按照T315I夹与T315I正向引物的互补的区域少于T315I夹的全长的50%的方式来设计T315I夹。例如,由序列号5的碱基序列构成的T315I夹已按照与RNaseH依赖性PCR中使用的正向引物的互补结合少、且具有识别突变的能力进行了优化。需要说明的是,这种修饰核酸序列的制备不限于T315I突变的检测,也可以用于其它突变的检测。即,在通过修饰核酸抑制野生型mRNA的逆转录反应、通过RNaseH依赖性PCR抑制其后的PCR反应的情况下,按照少于修饰核酸的全长的50%的部分与RNaseH依赖性PCR的正向引物互补结合的方式来制备为好。
DNA聚合酶、RNaseH、dNTP、缓冲液等试剂可以使用该领域中通常使用的物质,各种试剂的量、反应时间、温度等条件可根据酶所附带的说明书的记载、通常使用的规程等公知的方法适当地确定。例如,DNA聚合酶可使用能用于分子生物学实验等的公知的任意DNA聚合酶,例如rTthDNA聚合酶、Taq聚合酶及其衍生物。例如RNaseH可使用能用于分子生物学实验等的公知的任意RNaseH,例如RNaseH2。
一实施方式中,使用下表的引物、夹及探针。可以将这些全部组合使用,也可以使用其中至少一种。
[表1]
在一方式中,本申请提供一种试剂盒,其用于实施上述方法。试剂盒至少包含:
(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物;
(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物;及,
(c)具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸。
试剂盒还可以包含:用于通过PCR扩增利用(a)及(b)的反向引物得到的ABL1 mRNA的逆转录产物的正向引物及PCR用的进一步的反向引物中的至少一者。引物可以是RNaseH依赖性PCR用引物。试剂盒可以还包含定量PCR用的探针。试剂盒可以还包含标准品,例如已知量的野生型ABL1 mRNA及T315I突变型ABL1 mRNA中的至少一者。
试剂盒可以还包含实施上述方法所需的试剂,例如逆转录PCR、定量PCR或RNaseH依赖性PCR用的逆转录酶、DNA聚合酶、RNaseH、dNTP、缓冲液等。试剂盒可以还包含从商业角度及使用者角度出发而期望的其它构成要素,例如包含使用说明在内的附加文件(例如书面或存储介质等)等。
试剂盒中所含的各构成要素可以分别单独地、或者在可能的情况下以混合的状态溶解于水或合适的缓冲液中或以冷冻干燥的状态收容在合适的容器中而提供。合适的容器包括瓶、管形瓶、试管、管、板、多孔板等。容器可以由玻璃、塑料、金属等中的至少一种材料形成。容器可以具有标签。
以下,对于本申请的方法及试剂盒的实施方式的一例,使用示意图来说明测定原理,本申请发明不局限于任意理论。
1 测定原理概要
测定提取自外周血白细胞或骨髓有核细胞的RNA中的ABL1 mRNA的第944位的碱基从胞嘧啶突变为胸腺嘧啶的T315I突变型ABL1 mRNA的表达量。测定原理为:以RNA为模板合成互补DNA(cDNA)的逆转录反应(RT)和使用荧光标记探针定量cDNA的实时PCR的、包含两阶段的两步定量RT-PCR法。分别扩增T315I突变型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域和全部ABL1 mRNA的不含T315I突变位置的区域,将用前者的定量值除以后者的定量值而得的比作为报告值。
1.1 逆转录反应
将逆转录反应的概要示于图5。将第944位的碱基为胞嘧啶的ABL1 mRNA定义为野生型ABL1 mRNA,将第944位的碱基为胸腺嘧啶的ABL1 mRNA定义为T315I突变型ABL1 mRNA。为了对用于定量全部ABL1 mRNA的区域及用于定量T315I突变型ABL1 mRNA的区域分别进行逆转录,使用ABL反向引物及T315I反向引物这两种引物。
首先,ABL反向引物及T315I反向引物与测定试样中所含的互补序列结合(图5的(1a)及(1b))。以这些反向引物为起点,通过反应液中所含的TthDNA聚合酶的逆转录活性合成第1链cDNA(图5的(2a)或(2b))。反应液中包含具有与野生型ABL1 mRNA互补的序列的T315I夹,在合成第1链cDNA时,如果模板为野生型ABL1 mRNA则由于T315I夹的特异性结合而使逆转录反应受到抑制(图5的(2a)),来自T315I反向引物的cDNA的合成量减少(图5的(3a))。另一方面,如果模板为T315I突变型ABL1 mRNA则T315I夹不与其结合,逆转录反应不会受到抑制(图5的(2b)及(3b))。另外,来自ABL反向引物的cDNA的合成不受T315I夹的影响,因此对于野生型ABL1 mRNA和T315I突变型ABL1 mRNA同样地合成cDNA。
1.2 ABL1 mRNA的定量实时PCR
将ABL1 mRNA定量实时PCR的概要示于图6。通过实时PCR而扩增由逆转录反应合成的来自ABL1 mRNA的cDNA(图6)。在该扩增过程中,结合于双链cDNA中的一方上的荧光标记探针(ABL探针)由于反应液中的TthDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性而被降解,报告染料游离。通过在每个循环中测定游离的染料的荧光强度,来实时测定来自ABL1 mRNA的cDNA量的增加(图6的(6))。
1.3 T315I突变型ABL1 mRNA的定量实时PCR
在扩增来自T315I突变型ABL1 mRNA的cDNA时,为了提高反应特异性而使用RNaseH依赖性PCR(rhPCR)的原理。作为用于rhPCR的核酸分解酶、即RNaseH2具有识别RNA/DNA杂化双链、并且将RNA的5’末端侧与DNA的磷酸二酯键切断的特性。在rhPCR中,通过将引物的一个脱氧核糖核苷酸变更为核糖核苷酸而形成模板DNA和RNA/DNA杂化双链、进一步在RNA的3’侧设置DNA聚合酶不能结合的区域(阻断区域),仅在RNaseH2识别RNA/DNA杂化双链并切断时进行PCR。利用该原理,仅扩增来自ABL1 mRNA的第944位的碱基为胸腺嘧啶的T315I突变型ABL1mRNA的cDNA。将T315I突变型ABL1 mRNA的定量实时PCR的概要示于图7。
T315I正向引物中,相当于T315I突变型ABL1 mRNA的第944位的碱基的部分被由DNA(胸腺嘧啶)置换为RNA(尿嘧啶)(图7的(1a))。T315I正向引物的RNA置换碱基与来自野生型ABL1 mRNA的cDNA不形成RNA/DNA杂化双链,因此不会发生RNaseH2对阻断区域的切割,不会引起PCR反应(图7的(2a))。
另一方面,T315I正向引物的RNA置换碱基与来自T315I突变型ABL1 mRNA的cDNA形成RNA/DNA杂化双链,阻断区域在RNaseH2作用下被切割,进行来自T315I突变型ABL1 mRNA的cDNA的特异性的扩增(图7的(1b)、(2b))。来自T315I突变型ABL1 mRNA的cDNA的特异性的扩增通过PCR而反复进行(图7的(3)~(9))。在该扩增过程中,结合于双链cDNA中的一方的荧光标记探针(ABLT315I探针)由于反应液中的TthDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性而被分解,报告染料游离。通过在每个循环中测定游离的染料的荧光强度而实时测定来自T315I突变型ABL1 mRNA的cDNA量的增加(图7的(6))。
在另一实施方式中,本申请提供一种检测对象中的ABL1 T315I突变的方法,其包括:
(1)在具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸存在下,使用与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物,对对象的RNA试样进行逆转录的工序;
(2)使用具有ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸为尿嘧啶核糖核苷酸且在3’末端具有阻断区域的正向引物,利用RNaseH依赖性PCR对(1)的逆转录产物进行扩增的工序;和,
(3)在工序(2)中核酸得到扩增的情况下,判定对象表达ABL1 T315I突变的工序。
在另一方式中,本申请提供一种用于实施上述方法的试剂盒,其包含:
(a)具有ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸被置换为尿嘧啶核糖核苷酸且在3’末端具有阻断区域的正向引物;
(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物;及,
(c)具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸。
该方法及试剂盒的详细沿用上述的测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平的方法及试剂盒的说明。
本申请提供例如下述的实施方式。
[1]一种测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平的方法,其包括:
(1)在具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸存在下,在同一容器中使用(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物、及(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物,对对象的RNA试样进行逆转录的工序;及,
(2)基于利用(a)的引物得到的逆转录产物相对于利用(b)的引物得到的逆转录产物的比例,计算ABL1 T315I突变的表达水平的工序。
[2]根据第1项所述的方法,其中,工序(2)还包括:
工序(2-1)通过定量PCR对利用(a)的引物得到的逆转录产物进行定量的工序;及,
工序(2-2)通过定量PCR对利用(b)的引物得到的逆转录产物进行定量的工序。
[3]根据第2项所述的方法,其中,工序(2-1)的定量PCR使用(X)具有ABL基因的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、且相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸被置换为尿嘧啶核糖核苷酸的正向引物、或
(Y)具有ABL mRNA的T315I突变位置的上游区域的碱基序列的正向引物。
[4]根据第3项所述的方法,其中,正向引物为(X)的正向引物。
[5]根据第4项所述的方法,其中,正向引物在3’末端具有阻断区域。
[6]根据第2项~第5项中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)的定量PCR为T315I突变特异性的RNaseH依赖性定量PCR。
[7]根据第2项~第6项中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)中使用包含序列号6的碱基序列的正向引物。
[8]根据第2项~第7项中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)中使用由序列号6的碱基序列构成的正向引物。
[9]根据第3项~第8项中任一项所述的方法,其中,修饰核酸的一部分与(X)的正向引物的一部分互补,互补的区域少于修饰核酸的全长的50%。
[10]根据第1项~第9项中任一项所述的方法,其中,修饰核酸中的相当于T315I突变位置的核苷酸相较于修饰核酸的中央位于3’侧。
[11]根据第1项~第10项中任一项所述的方法,其中,修饰核酸包含序列号5的碱基序列。
[12]根据第1项~第11项中任一项所述的方法,其中,修饰核酸由序列号5的碱基序列构成。
[13]根据第1项~第12项中任一项所述的方法,其中,修饰核酸包含PNA。
[14]根据第1项~第12项中任一项所述的方法,其中,工序(1)的(a)的反向引物包含序列号7的序列。
[15]根据第1项~第14项中任一项所述的方法,其中,工序(1)的(b)的反向引物包含序列号10的序列。
[16]根据第1项~第15项中任一项所述的方法,其中,工序(1)的(a)的反向引物由序列号7的序列构成。
[17]根据第1项~第16项中任一项所述的方法,其中,工序(1)的(b)的反向引物由序列号10的序列构成。
[18]根据第2项~第17项中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)在工序(1)所使用的修饰核酸的存在下进行。
[19]根据第1项~第18项中任一项所述的方法,其中,对象为人。
[20]根据第1项~第19项中任一项所述的方法,其中,RNA试样为从外周血白细胞或骨髓有核细胞中提取的RNA。
[21]根据第1项~第19项中任一项所述的方法,其中,RNA试样为从外周血白细胞中提取的RNA。
[22]根据第1项~第21项中任一项所述的方法,其中,使用表1中记载的引物、夹及探针中的至少1者。
[23]根据第1项~第22项中任一项所述的方法,其中,使用表1中记载的引物、夹及探针。
[24]一种试剂盒,其用于测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平,其包含:
(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物;
(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物;及,
(c)具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸。
[25]根据第24项所述的试剂盒,其还包含用于通过PCR扩增利用(a)及(b)的反向引物得到的ABL mRNA的逆转录产物的正向引物。
[26]根据第25项所述的试剂盒,其中,正向引物为:
(X)具有ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、且相当于T315I突变的核苷酸的核苷酸被置换为尿嘧啶核糖核苷酸的正向引物、或
(Y)具有ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域的碱基序列的正向引物。
[27]根据第26项所述的试剂盒,其中,正向引物为(X)的正向引物。
[28]根据第27项所述的试剂盒,其中,正向引物在3’末端具有阻断区域。
[29]根据第25项~第28项中任一项所述的试剂盒,其中,正向引物包含序列号6的序列。
[30]根据第25项~第29项中任一项所述的试剂盒,其中,正向引物由序列号6的序列构成。
[31]根据第25项~第30项中任一项所述的试剂盒,其中,修饰核酸的一部分与(X)的正向引物的一部分互补,互补的区域少于修饰核酸的全长的50%。
[32]根据第24项~第31项中任一项所述的试剂盒,其中,修饰核酸中的相当于T315I突变位置的核苷酸相较于修饰核酸的中央位于3’侧。
[33]根据第24项~第32项中任一项所述的试剂盒,其中,修饰核酸包含序列号5的序列。
[34]根据第24项~第33项中任一项所述的试剂盒,其中,修饰核酸由序列号5的序列构成。
[35]根据第24项~第34项中任一项所述的试剂盒,其中,修饰核酸包含PNA。
[35]根据第24项~第35项中任一项所述的试剂盒,其中,(a)的反向引物包含序列号7的序列。
[36]根据第24项~第35项中任一项所述的试剂盒,其中,(b)的反向引物包含序列号10的序列。
[37]根据第24项~第36项中任一项所述的试剂盒,其中,(a)的反向引物由序列号7的序列构成。
[38]根据第24项~第37项中任一项所述的试剂盒,其中,(b)的反向引物由序列号10的序列构成。
[39]根据第24项~第38项中任一项所述的试剂盒,其还包含定量PCR用的探针。
[40]根据第24项~第39项中任一项所述的试剂盒,其还包含野生型ABL1 mRNA及存在T315I突变的ABL1 mRNA中的至少一者。
[41]根据第24项~第40项中任一项所述的试剂盒,其包含表1中记载的引物、夹及探针中的至少一者。
[42]根据第24项~第41项中任一项所述的试剂盒,其包含表1中记载的引物、夹及探针。
本说明书中引用的全部文献通过示出出处而成为本说明书的一部分。
上述说明均为非限定性说明,可以在不脱离所附的权利要求书所定义的本发明的范围的条件下进行变更。进一步地,下述实施例均为非限定性的实施例,仅为了说明本发明而提供。
实施例
引物和探针的设计
设计、合成了以下的引物组及探针。
荧光标记探针中,将探针的5’末端用HEX(6-羧基荧光素)标记,将探针的3’末端用作为淬灭染料的Iowa Black FQ(Integrated DNA technologies公司)标记。
将本实施例中的引物及探针的详细情况示于表2。
[表2]
[试验1]
(1)标准品(ABL1 T315I突变RNA)的制备
作为标准品,使用包含存在T315I突变的ABL1 mRNA的序列的合成RNA。为了制作成为合成RNA的模板的DNA片段,制作包含野生型ABL1mRNA中的利用上述引物的PCR的扩增区域、和成为RNA合成的起点的T7启动子序列的质粒载体。对于该质粒载体中所含的、来自ABL1 mRNA的序列的相当于T315I突变的部分,利用定点诱变法导入单碱基突变。用该导入了突变的质粒载体转化大肠杆菌。培养大肠杆菌而制备大量的质粒载体,通过利用限制酶进行单位点切断,从而制作具有编码存在T315I突变的ABL1 mRNA的序列的直链状的DNA片段。
使用T7 RNA聚合酶,以上述DNA片段为模板合成包含存在T315I突变的ABL1 mRNA的序列的RNA(ABL1 T315I突变RNA)。将合成的RNA用包含100ng/μL的大肠杆菌转运RNA的TE缓冲液稀释,从而制备RNA标准品。将由此制备的ABL1 T315I突变RNA标准品调整为1×102、1×103、1×104、1×105、1.0×106、1×107拷贝/试验的浓度。另外,作为阴性对照品,使用包含100ng/μL的大肠杆菌转运RNA的TE缓冲液。
(2)逆转录反应
(2-1)反应液的制备
将反应液的体积设为50μL,按照T315I反向引物及ABL反向引物(Integrated DNAtechnologies公司)分别为终浓度0.2μM、dNTPs(东洋纺公司)为终浓度0.1mM、MnOAc(东洋纺公司)为终浓度2.4mM、PNA夹(Panagene公司)为终浓度2μM、rTth DNA聚合酶(东洋纺公司)为每个反应2.5U、受试RNA为每个反应1μg的方式来制备。对于各浓度,在反应中使用1样品的标准品。PNA夹是具有ATGAACTCAGTGATGA(序列号5)的碱基序列、且全部核苷酸均形成肽键的形态。
(2-2)反应条件:
在60℃下进行60分钟的逆转录反应。
(3)PCR
关于PCR反应,在不同的管中进行来自T315I反向引物的cDNA和来自ABL反向引物的cDNA(对照)的扩增。
(3-1)来自T315I反向引物的cDNA的测定
(a)反应液的制备
将反应液的体积设为30μL,按照T315I正向引物及T315I反向引物(IntegratedDNA technologies公司)分别为终浓度0.3μM、T315I荧光标记探针(Integrated DNAtechnologies公司)为终浓度0.15μM、dNTPs(东洋纺公司)为终浓度0.2mM、MnOAc(东洋纺公司)为终浓度2.4mM、RNaseH2(Integrated DNA technologies公司)为每个反应100mU、rTthDNA聚合酶(东洋纺公司)为每个反应1.25U、逆转录反应产物为25μL的方式来制备。对(2)的逆转录反应产物不进行纯化而直接使用。对各浓度的逆转录反应产物单独进行测定。
(b)PCR反应
使用Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system(LifeTechnologies公司)在95℃反应10秒后,将95℃下10秒→60℃下60秒的反应重复进行40次。
(3-2)来自ABL反向引物的cDNA的测定
(a)反应液的制备
将反应液的体积设为30μL,按照ABL正向引物及ABL反向引物(Integrated DNAtechnologies公司)分别为终浓度0.3μM、ABL荧光标记探针(Integrated DNAtechnologies公司)为终浓度0.2μM、dNTPs(东洋纺公司)为终浓度0.4mM、MnOAc(东洋纺公司)为终浓度2.0mM、Tth DNA聚合酶为每个反应1.125U、逆转录反应产物为每个反应5μL的方式来制备。对各浓度的逆转录反应产物单独进行测定。
(b)PCR反应
使用Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system(LifeTechnologies公司),在95℃下反应10秒后,将95℃下10秒→60℃下60秒的反应重复进行40次。
(4)结果
在(a)进行来自T315I反向引物的cDNA的扩增、(b)进行来自ABL反向引物的cDNA的扩增的情况下,分别确认标准品和阴性对照品的荧光扩增曲线和扩增循环数。
图8示出(a)进行来自T315I反向引物的cDNA的扩增时的扩增曲线,图9示出(b)进行来自ABL反向引物的cDNA的扩增时的扩增曲线。表3示出扩增来自T315I反向引物的cDNA及来自ABL反向引物的cDNA时的扩增循环。均能够在1×102至1×107拷贝/试验的较宽范围内测定来自T315I反向引物的cDNA、来自ABL反向引物的cDNA。
[表3]
[试验2]检测限的研究
本试验中,为了求出ABL1 T315I突变测定体系的检测下限,使用试样测定来自T315I反向引物的cDNA及来自ABL反向引物的cDNA,求出用前者的测定值除以后者的测定值而得的比,所述试样向从人白血病来源的细胞HL60中提取的RNA中以各种浓度添加作为试验1的标准品而使用的ABL1 T315I突变RNA而成的。
(1)标准品(ABL1 T315I突变RNA)的制备
标准品通过与试验1相同的方法来制备。
(2)受试试样
作为受试试样,使用向从BCR-ABL1阴性的人白血病细胞株HL60中提取的RNA中以各种浓度添加作为标准品而使用的ABL1 T315I突变RNA而得的试样。具体而言,向从HL60中提取的总RNA中,以25、50、100拷贝/试验的浓度添加作为标准品使用的ABL1 T315I突变RNA,用TE缓冲液将RNA的终浓度调整为100ng/μL。另外,作为对照品,使用从HL60中提取的用TE缓冲液调整为100ng/μL的总RNA。
(3)逆转录反应
逆转录反应通过与试验1相同的方法来进行。对于标准品,在反应中对各浓度使用1样品。对于受试试样,在反应中对各浓度使用12个样品。
(4)PCR
PCR通过与试验1相同的方法来进行。对于标准品,对逆转录反应产物单独进行测定。对于受试试样,分别对各浓度的12个样品的逆转录产物单独进行测定。
(5)结果
将来自T315I反向引物的cDNA的测定值示于表4,将来自ABL反向引物的cDNA的测定值示于表5,将来自T315I反向引物的cDNA的测定值除以来自反向引物的cDNA的测定值而得的比(ABL1 T315I突变/ABL1比)示于表6。添加了100、50及25拷贝/试验的ABL1 T315I突变RNA的试样的、来自T315I反向引物的cDNA的测定值以平均值计分别为109.4、47.4及27.3,与理论值一致。另一方面,不含ABL1 T315I突变RNA的HL60(对照)的来自T315I反向引物的cDNA的测定中,均未检测到荧光扩增。
由于稀释中使用的HL60表达恒定量的ABL1 mRNA,因此来自ABL反向引物的cDNA的测定值达到平均2.08×105,在全部测定试样中均显示大致同等的值。从而,在测定从表达105拷贝以上的野生型ABL的HL60细胞中提取的RNA时未检测到不含ABL1 T315I突变RNA的HL60的来自T315I反向引物的cDNA,基于此我们认为该测定体系对ABL1 T315I突变RNA具有非常高的特异性。
添加了100、50及25拷贝/试验的ABL1 T315I突变RNA的试样的ABL1 T315I突变/ABL1比以平均值计分别为0.052%、0.023%及0.013%。因此,该测定体系的突变检测率为0.01%左右,灵敏度非常高。
[表4]
[表5]
[表6]
[试验3]PNA夹的反应抑制效果
本试验是为了确认PNA夹在逆转录反应中的效果而进行的。
(1)标准品(ABL1 T315I突变RNA)的制备
标准品通过与试验1相同的方法来制备。
(2)受试试样
受试试样通过与试验2相同的方法来制备。
(3)逆转录反应
逆转录反应通过与试验2相同的方法、但是不添加PNA夹而进行。
(4)PCR
PCR通过与试验2相同的方法来进行。
(5)结果
将来自T315I反向引物的cDNA的测定值示于表7,将来自ABL反向引物的cDNA的测定值示于表8,将用来自T315I反向引物的cDNA的测定值除以来自反向引物的cDNA的测定值而得的比(ABL1 T315I突变/ABL1比)示于表9。添加了100、50及25拷贝/试验的ABL1 T315I突变RNA的试样的来自T315I反向引物的cDNA的测定值以平均值计分别为333.7、235.3、202.3拷贝/试验。从HL60中提取的RNA(对照)的来自T315I反向引物的cDNA的测定值为186.9拷贝/试验。
由于稀释中使用的HL60表达恒定量的ABL1 mRNA,因此来自ABL反向引物的cDNA的测定值达到平均2.29×105,在全部测定试样中均显示大致同等的值。添加了100、50及25拷贝/试验的ABL1 T315I突变RNA的试样的ABL1 T315I突变/ABL1比以平均值计分别为0.147%、0.107%及0.090%。不含ABL1 T315I突变RNA的HL60(对照)的ABL1 T315I突变/ABL1比以平均值计为0.077%。
与试验2不同的是,在不存在PNA夹的状态下,检测到未添加ABL1 T315I突变RNA的试样的来自T315I反向引物的cDNA为186.9拷贝/试验,另外与添加了ABL1 T315I突变RNA的试样的差异也未达到充分。因此,我们认为在逆转录反应中使用PNA夹对于高灵敏度地检测ABL1 T315I突变而言很重要。
[表7]
[表8]
[表9]
产业上的可利用性
本申请可以提供灵敏度高于以往方法的ABL1 T315I突变的检测或定量方法。即,通过使用上述的方法或试剂盒,能够灵敏度良好地定量ABL1 T315I突变的表达水平。如此定量出的ABL1 T315I突变的表达水平可以期待在白血病的发病及复发的诊断、预后判断、以及骨髓移植时期的确定等中成为有用的指标。
Claims (21)
1.一种测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平的方法,其包括:
(1)在具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸存在下,在同一容器中使用(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物、及(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物,对对象的RNA试样进行逆转录的工序;及,
(2)基于利用(a)的引物得到的逆转录产物相对于利用(b)的引物得到的逆转录产物的比例,计算ABL1 T315I突变的表达水平的工序。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,工序(2)还包括:
工序(2-1)通过定量PCR对利用(a)的引物得到的逆转录产物进行定量的工序;及,
工序(2-2)通过定量PCR对利用(b)的引物得到的逆转录产物进行定量的工序。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,工序(2-1)的定量PCR使用:
(X)具有ABL mRNA的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、且相当于T315I突变位置的核苷酸的核苷酸被置换为尿嘧啶核糖核苷酸、或
(Y)具有ABL mRNA的T315I突变位置的上游区域的碱基序列
的正向引物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,正向引物为在3’末端具有阻断区域的(X)的正向引物。
5.根据权利要求2~4中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)的定量PCR为T315I突变特异性的RNaseH依赖性定量PCR。
6.根据权利要求2~5中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)中使用包含序列号6的碱基序列的正向引物。
7.根据权利要求2~6中任一项所述的方法,其中,工序(2-1)中使用由序列号6的碱基序列构成的正向引物。
8.根据权利要求3~7中任一项所述的方法,其中,修饰核酸的一部分与(X)的正向引物的一部分互补,互补的区域少于修饰核酸的全长的50%。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的方法,其中,修饰核酸中的相当于T315I突变位置的核苷酸相较于修饰核酸的中央位于3’侧。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,修饰核酸包含序列号5的碱基序列。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的方法,其中,修饰核酸由序列号5的碱基序列构成。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的方法,其中,修饰核酸包含PNA。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的方法,其中,工序(1)的(a)的反向引物包含序列号7的序列,(b)的反向引物包含序列号10的序列。
14.一种试剂盒,其用于测定对象中的ABL1 T315I突变的表达水平,其包含:
(a)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的下游区域结合的反向引物;
(b)与ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域结合的反向引物;及,
(c)具有与野生型ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域互补的碱基序列的修饰核酸。
15.根据权利要求14所述的试剂盒,其还包含用于通过PCR扩增利用(a)及(b)的反向引物得到的ABL mRNA的逆转录产物的正向引物。
16.根据权利要求15所述的试剂盒,其中,正向引物包含:
(X)具有ABL1 mRNA的包含T315I突变位置的区域的碱基序列、且相当于T315I突变的核苷酸的核苷酸被置换为尿嘧啶核糖核苷酸、或
(Y)具有ABL1 mRNA的T315I突变位置的上游区域的碱基序列
的正向引物。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,其中,正向引物为在3’末端具有阻断区域的(X)的正向引物。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒,其中,修饰核酸的一部分与(X)的正向引物的一部分互补,互补的区域少于修饰核酸的全长的50%。
19.根据权利要求14~18中任一项所述的试剂盒,其中,修饰核酸中的相当于T315I突变位置的核苷酸相较于修饰核酸的中央位于3’侧。
20.根据权利要求14~19中任一项所述的试剂盒,其还包含定量PCR用的探针。
21.根据权利要求14~20中任一项所述的试剂盒,其还包含野生型ABL mRNA及存在T315I突变的ABL mRNA中的至少一者。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017-087578 | 2017-04-26 | ||
JP2017087578 | 2017-04-26 | ||
PCT/JP2018/016748 WO2018199136A1 (ja) | 2017-04-26 | 2018-04-25 | Abl1 t315i変異の発現レベルの測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110997938A true CN110997938A (zh) | 2020-04-10 |
Family
ID=63919184
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880042856.1A Pending CN110997938A (zh) | 2017-04-26 | 2018-04-25 | Abl1 t315i突变的表达水平的测定方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2018199136A1 (zh) |
KR (1) | KR20200002933A (zh) |
CN (1) | CN110997938A (zh) |
PH (1) | PH12019502417A1 (zh) |
SG (2) | SG10201912849TA (zh) |
WO (1) | WO2018199136A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111321200A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-23 | 广州安镝声生物医药科技有限公司 | 一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030211483A1 (en) * | 2002-05-09 | 2003-11-13 | Schroeder Benjamin G. | Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides |
WO2012064035A2 (ko) * | 2010-11-11 | 2012-05-18 | 주식회사 파나진 | Pna 기반의 실시간 pcr 클램핑을 이용한 bcr-abl 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법 및 키트 |
CN102676638A (zh) * | 2011-03-08 | 2012-09-19 | 苏州大学附属第一医院 | 检测bcr/abl融合基因abl激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒 |
CN105349681A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-02-24 | 湖南圣维基因科技有限公司 | 一种bcr-abl融合基因t315i突变荧光pcr检测试剂盒 |
CN105441568A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-03-30 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类bcr-abl融合基因t315i突变的引物、探针及试剂盒 |
RU2609641C1 (ru) * | 2015-12-07 | 2017-02-02 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ анализа соматических мутаций в химерном гене BCR/ABL с использованием ОТ-ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5221248B2 (ja) * | 2008-08-26 | 2013-06-26 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 高発現遺伝子由来のcDNAクローンの含有率を低減させたcDNAライブラリーの作製方法 |
TWI541507B (zh) * | 2009-09-11 | 2016-07-11 | 香港中文大學 | 評估肝臟病變之方法 |
JP6531312B2 (ja) * | 2014-10-17 | 2019-06-19 | 東洋鋼鈑株式会社 | Bcr−abl阻害剤耐性関連変異の検出方法及びこれを用いたbcr−abl阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法 |
-
2018
- 2018-04-25 JP JP2019514562A patent/JPWO2018199136A1/ja active Pending
- 2018-04-25 KR KR1020197034072A patent/KR20200002933A/ko unknown
- 2018-04-25 SG SG10201912849TA patent/SG10201912849TA/en unknown
- 2018-04-25 CN CN201880042856.1A patent/CN110997938A/zh active Pending
- 2018-04-25 SG SG11201909983Q patent/SG11201909983QA/en unknown
- 2018-04-25 WO PCT/JP2018/016748 patent/WO2018199136A1/ja active Application Filing
-
2019
- 2019-10-25 PH PH12019502417A patent/PH12019502417A1/en unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030211483A1 (en) * | 2002-05-09 | 2003-11-13 | Schroeder Benjamin G. | Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides |
WO2012064035A2 (ko) * | 2010-11-11 | 2012-05-18 | 주식회사 파나진 | Pna 기반의 실시간 pcr 클램핑을 이용한 bcr-abl 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법 및 키트 |
CN102676638A (zh) * | 2011-03-08 | 2012-09-19 | 苏州大学附属第一医院 | 检测bcr/abl融合基因abl激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒 |
CN105349681A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-02-24 | 湖南圣维基因科技有限公司 | 一种bcr-abl融合基因t315i突变荧光pcr检测试剂盒 |
RU2609641C1 (ru) * | 2015-12-07 | 2017-02-02 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ анализа соматических мутаций в химерном гене BCR/ABL с использованием ОТ-ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) |
CN105441568A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-03-30 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类bcr-abl融合基因t315i突变的引物、探针及试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200002933A (ko) | 2020-01-08 |
PH12019502417A1 (en) | 2020-10-19 |
SG10201912849TA (en) | 2020-02-27 |
WO2018199136A1 (ja) | 2018-11-01 |
JPWO2018199136A1 (ja) | 2020-05-14 |
SG11201909983QA (en) | 2019-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210388430A1 (en) | Compositions of toehold primer duplexes and methods of use | |
JP5674696B2 (ja) | 遠隔サンプル由来のdna断片を提供する方法 | |
EP3455375B1 (en) | Detection of met exon 14 deletions | |
CN110719957B (zh) | 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒 | |
EP4365305A2 (en) | Method of detecting an analyte | |
CN111670254A (zh) | 微卫星不稳定性的改进检测 | |
KR20130094342A (ko) | 인간 표피 성장 인자 수용체 유전자 내의 돌연변이를 탐지하기 위한 방법 및 조성물 | |
JP2022189882A (ja) | minor BCR-ABL1遺伝子を検出する方法 | |
CN110997938A (zh) | Abl1 t315i突变的表达水平的测定方法 | |
AU2013204483B2 (en) | Probe, and polymorphism detection method using the same | |
JP7335871B2 (ja) | 短い核酸の多重検出 | |
MX2015003386A (es) | Metodo para la deteccion de mutaciones de braf y pi3k. | |
JP6205216B2 (ja) | 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット | |
EP4317455A1 (en) | Target nucleic acid amplification method using guide probe and clamping probe and composition for amplifying target nucleic acid comprising same | |
WO2020169666A1 (en) | Improved nucleic acid target enrichment and related methods | |
CN115175985A (zh) | 从未经处理的生物样本中提取单链dna和rna并测序的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40022852 Country of ref document: HK |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200410 |