CN111321200A - 一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种细胞外abl1激酶活性检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。本发明ABL1激酶活性检测试剂盒操作简便、有效，可以在细胞外高通量地检测ABL1激酶的活性，从而用于大规模地筛选ABL1激酶活性的抑制剂。

Description

一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及酶活性检测技术领域，尤其是一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒。
背景技术
非受体酪氨酸激酶ABL1广泛存在于哺乳动物各种组织细胞中，通过介导底物蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰，参与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、炎症反应、肿瘤发生形成等生命过程的调控。在正常生理条件下，ABL1的激酶活性受到严谨调控，被多种细胞因子、氧化应激或DNA损伤应激激活后的ABL1激酶活性大大提高，通过定位于不同的细胞亚结构发挥不同的生理功能。BCR-ABL融合蛋白在细胞信号转导以及转化过程中通过不断磷酸化和活化下游底物，促使各阶段粒细胞无限增殖和迁移，最终导致细胞生长失控，引发白血病。以它作为靶点来进行研究，使靶向治疗CML(慢性髓性白血病)显得非常有意义。
ABL蛋白是由几个结构域共同组成的一个非受体型酪氨酸激酶，它包括N端结构域(NCap)、SH2结构域、SH3结构域、一段连接序列和C末端的激酶结构域(PTK)，正是其中这段激酶结构域使得ABL蛋白具有酪氨酸激酶的活性。完整的ABL1蛋白较大，表达较为困难。
患者体内ABL1蛋白发生的一些突变使得CML的治疗变得有些困难。目前已开发出一些基于ABL1蛋白的抑制剂，包括伊马替尼(imatinib)，尼洛替尼(nilotinib)，博舒替尼(bosutinib)等，均对ABL1蛋白有很好的抑制作用，但由于蛋白一些位点的突变，使得部分患者产生耐受现象。另一方面，在体内的研究中往往周期长，而且体内生物环境的复杂性也为ABL1抑制剂的研发设置了巨大的阻碍。
发明内容
基于上述问题，本发明提供了一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，其可以用于高通量、大规模地筛选ABL1激酶的活性抑制剂。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。
作为上述方案的进一步优化，所述ABL1底物多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为上述方案的进一步优化，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段为PTK的全部或部分。需要说明的是，ABL蛋白是由几个结构域共同组成的一个非受体型酪氨酸激酶，它包括N端结构域(NCap)、SH2结构域、SH3结构域、一段连接序列和C末端的激酶结构域(PTK)，其中正是这段激酶结构域(PTK)使得ABL蛋白具有酪氨酸激酶的活性，由于ABL1整个蛋白较大，表达较为困难，因此，本发明的检测试剂盒可以选择PTK结构域相应的多肽，但是不限于PTK结构域相应的多肽，还可以选择包括PTK结构域以及其相邻的结构域的多肽片段，或者是整个ABL1蛋白。
作为上述方案的进一步优化，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。需要说明的是，本发明经多次实验证实，采用如SEQ ID NO.2或3所示的多肽用于筛选ABL1激酶的活性抑制剂都是有效的。
作为上述方案的进一步优化，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。需要说明的是，本发明的试剂盒可以选择SEQ ID NO.2所示的多肽，或SEQ ID NO.3所示的多肽，还可以同时选择SEQ ID NO.2和3所示的多肽。
作为上述方案的进一步优化，所述反应缓冲液包括HEPES、MgCl2、DTT和BSA。
作为上述方案的进一步优化，所述HEPES的浓度为50mmol/L，所述的浓度为10mmol/L，所述DTT的浓度为2mmol/L，所述BSA的浓度为0.1％(W/W)。
作为上述方案的进一步优化，所述HEPES的pH为7.3。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒在筛选ABL1的活性抑制剂中应用。
作为本发明的又一个方面，本发明还提供了一种ABL1激酶的活性抑制剂，所述抑制剂为小檗碱。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明ABL1激酶活性检测试剂盒操作简便、有效，可以在细胞外高通量地检测ABL1激酶的活性，从而用于大规模地筛选ABL1激酶活性的抑制剂。
附图说明
图1是ABL1激酶反应原理示意图；
图2是本发明的ABL1激酶活性检测试剂盒的检测原理示意图；
图3是SDS-PAGE实验结果图；
图4是小檗碱抑制ABL1激酶活性的标准曲线；
图5是采用ABL1蛋白片段序列1检测小檗碱抑制ABL1激酶活性的结果图；
图6是采用ABL1蛋白片段序列2检测小檗碱抑制ABL1激酶活性的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种体外的ABL1激酶活性检测方法和试剂盒，其可以用于高通量，大规模的筛选ABL1活性的抑制剂。
本发明的ABL1激酶活性检测试剂盒涉及以下反应原理：
如图1所示，ABL1能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活底物，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。激酶反应发生时，可以使ATP转变为ADP，这样就可以根据ATP的减少量来定量ABL1激酶的活性。如图2所示，Luciferin和ATP反应后，在氧气的催化下和底物(luciferase)反应，产生荧光，通过检测荧光就可以检测ATP的含量。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度；如无特别说明，本发明中的试剂、材料、细胞等均可从市场上或其它公开渠道获得。
实施例1
本发明的细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒的一种实施例，包括以下组分：
(1)ATP；
(2)ABL1底物多肽，其氨基酸序列为：EAIYAAPFAKKK(SEQ ID NO.1)；
(3)ABL1蛋白片段序列1，其氨基酸序列如下：
EYLLSSGINGSFLVERSESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVDDFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRMTGDTYTAHAGAKFPIKWTAPESLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDLSQVYELLEKDYRMERRPEGCPEKVYELMRACWQWNPSDRPSFAEIHQAFETMFQESSISDEVEKELGKQGVRGAVSTLLQAPELPTKTRSRRAAEHRDTTDVPEMPHSK(SEQ ID NO.2)；
(4)ABL1蛋白片段序列2，其氨基酸序列如下：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGPSENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITPVNSLEKHSWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAPKRNERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAGAKFPIKWTAPESLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDLSQVYELLEKDYRMERPEGCPEKVYELMRACWQWNPSDRPSFAEIHQAFETMFQESS(SEQ ID NO.3)；
(5)反应buffer：50mmol/L HEPES(pH 7.3)，10mmol/L MgCl2，0.1％BSA，2mmol/LDTT。
实施例2实施例1中ABL1蛋白片段序列1和2的制备
1)质粒的转化和摇瓶培养
1：将表达PTK结构域的pET-28a(+)，Kan质粒1μg加入100μl Arctic Expression(DE3)感受态细菌中，置于冰上20min；
2：42℃热激90sec，迅速置冰中3min；加入600μl LB培养液；
3：37℃，220rpm振摇培养1h，取200μl菌液涂布于含50μg/ml Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜；
4：次日早晨挑取平板上的单克隆接种于含50μg/ml Kan的4ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇培养至下午1点左右，OD约0.6；
5：按1：250比例，接种于100μg/ml Kan的1L LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.5-0.6(约3h)；
6：1L发酵培养基中加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，220rpm 37℃培养3小时；
7：5000rpm，5min离心去上清收集发酵菌体，-20℃保存待破碎纯化。
2)菌体破碎和蛋白复性纯化
1.超声破碎菌体，试剂和条件如下：
破菌缓冲液：20mM Tris，500mM NaCl，pH8.0；
破碎条件：350W功率，破碎4s，间隔6s，共120循环；6000rpm，15min离心收集沉淀；
2.检测到蛋白表达后形成包涵体，因此需要进行包涵体(在蛋白纯化过程中产生)的洗涤，采用如下试剂和条件：
包涵体洗涤液：50mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton-X-100，pH8.5；
洗涤条件：350W功率，破碎4s，间隔6s，共60循环；6000rpm，15min离心收集沉淀。
3.包涵体增容，采用如下试剂和条件：
包涵体增容液：0.1M Tris，6M Gua-HCl，25mM DTT，1mM EDTA，pH8.0(10ml)。室温温和搅拌2小时，然后用HCl调pH至3.0-4.0，然后12000rpm,20min离心收集上清；
4.将增容上清透析至6M Urea，10mM HCl pH3.0-4.0中，透析过夜；然后12000rpm，20min离心收集上清；
5.将离心收集到的上清按照体积比1:50逐滴加入复性液：20mM乙醇胺，1mM EDTA，1mM半胱氨酸，2mM胱氨酸，pH11.0中。每隔32小时再逐滴加入跟第一次一样体积的复性液，一共再加3次，复性液4℃放置；
6.将复性好的蛋白透析至20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0中，中途换液2次；
7.Ni-IMAC纯化，采用如下试剂和条件：
透析好的蛋白进行镍柱纯化平衡液：20mM Tris，500mM NaCl，pH8.0，洗脱液：20mMTris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH8.0。按20mM/200mM imidazole的梯度进行洗脱，根据吸收峰值收集洗脱液。
对上述纯化所得蛋白进行SDS-PAGE实验，实验结果如图3所示，图3左边65KD大小的片段为实施例1中ABL1蛋白片段序列1，图4右边52KD大小的片段为实施例1中ABL1蛋白片段序列2，结果显示，ABL1蛋白片段序列1和ABL1蛋白片段序列2的纯度都很高，达到90％以上。
实施例3采用实施例1的试剂盒检测小檗碱抑制ABL1激酶的效果
小檗碱抑制ABL1激酶活性的检测方法，包括如下反应步骤：
1、药物处理组每孔中依次加入1μL小檗碱，小檗碱浓度依次为(0.2，4，8，10μmol/L，1uL ABL1激酶底物多肽(30ng EAIYAAPFAKKK)以及5uL ATP(2μmol/L),1uL ABL蛋白片段(30ng，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3相应的多肽)；
2、每组设3个复孔。30℃孵育20min后，每孔加入10μL荧光素酶及底物的混合物，在酶标仪上测化学发光数值。
根据检测得到的发光数值，绘制了相应的标准曲线，标准曲线如图4所示；采用ABL1蛋白片段序列1检测得到的药物抑制活性结果如图5所示，采用ABL1蛋白片段序列2检测得到的药物抑制活性结果如图6所示。
上述实验结果表明：小檗碱可以浓度依赖性的抑制ABL1蛋白激酶的活性，ABL1蛋白片段序列1和ABL1蛋白片段序列2检测得到的结果相似，说明两个序列(SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3)的蛋白都可以有效地进行蛋白激酶的活性检测。本发明的ABL1激酶活性检测试剂盒可以在细胞外高通量的检测ABL1激酶的活性，ABL1蛋白片段序列1和ABL1蛋白片段序列2都具有很强的蛋白酪氨酸激酶活性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州安镝声生物医药科技有限公司
<120> 一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒及其应用
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Pro Phe Ala Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Glu Tyr Leu Leu Ser Ser Gly Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Glu Arg
1 5 10 15
Ser Glu Ser Ser Pro Gly Gln Arg Ser Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Gly
20 25 30
Arg Val Tyr His Tyr Arg Ile Asn Thr Ala Ser Asp Gly Lys Leu Val
35 40 45
Ser Ser Glu Ser Arg Phe Asn Thr Leu Ala Glu Leu Val His His His
50 55 60
Ser Thr Val Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro
65 70 75 80
Lys Arg Asn Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys
85 90 95
Trp Glu Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gln Tyr Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu
115 120 125
Thr Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Asp Asp
130 135 140
Phe Leu Lys Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu
145 150 155 160
Val Gln Leu Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile
165 170 175
Thr Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys
180 185 190
Asn Arg Gln Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln
195 200 205
Ile Ser Ser Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg
210 215 220
Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys
225 230 235 240
Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala
245 250 255
His Ala Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu
260 265 270
Ala Tyr Asn Lys Phe Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val
275 280 285
Leu Leu Trp Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile
290 295 300
Asp Leu Ser Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu
305 310 315 320
Arg Arg Pro Glu Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala
325 330 335
Cys Trp Gln Trp Asn Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His
340 345 350
Gln Ala Phe Glu Thr Met Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val
355 360 365
Glu Lys Glu Leu Gly Lys Gln Gly Val Arg Gly Ala Val Ser Thr Leu
370 375 380
Leu Gln Ala Pro Glu Leu Pro Thr Lys Thr Arg Ser Arg Arg Ala Ala
385 390 395 400
Glu His Arg Asp Thr Thr Asp Val Pro Glu Met Pro His Ser Lys
405 410 415
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gly Pro Ser Glu Asn Asp Pro Asn Leu Phe Val
20 25 30
Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp Asn Thr Leu Ser Ile Thr
35 40 45
Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr Asn His Asn Gly Glu Trp
50 55 60
Cys Glu Ala Gln Thr Lys Asn Gly Gln Gly Trp Val Pro Ser Asn Tyr
65 70 75 80
Ile Thr Pro Val Asn Ser Leu Glu Lys His Ser Trp Tyr His Gly Pro
85 90 95
Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr Leu Leu Ser Ser Gly Ile Asn Gly
100 105 110
Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Ser Ser Pro Gly Gln Arg Ser Ile
115 120 125
Ser Leu Arg Tyr Glu Gly Arg Val Tyr His Tyr Arg Ile Asn Thr Ala
130 135 140
Ser Asp Gly Lys Leu Tyr Val Ser Ser Glu Ser Arg Phe Asn Thr Leu
145 150 155 160
Ala Glu Leu Val His His His Ser Thr Val Ala Asp Gly Leu Ile Thr
165 170 175
Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg Asn Glu Arg Thr Asp Ile Thr
180 185 190
Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Glu Val Tyr Glu Gly
195 200 205
Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu
210 215 220
Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ala Ala Val Met Lys
225 230 235 240
Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val Cys Thr Arg
245 250 255
Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu
260 265 270
Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu Val Asn Ala Val Val
275 280 285
Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala Met Glu Tyr Leu Glu
290 295 300
Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val
305 310 315 320
Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala Gly Ala Lys Phe Pro Ile
340 345 350
Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr Asn Lys Phe Ser Ile Lys
355 360 365
Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Ala Thr Tyr
370 375 380
Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu Ser Gln Val Tyr Glu Leu
385 390 395 400
Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro Glu Gly Cys Pro Glu Lys
405 410 415
Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln Trp Asn Pro Ser Asp Arg
420 425 430
Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe Glu Thr Met Phe Gln Glu
435 440 445
Ser Ser
450

Claims (10)

1.一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1底物多肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段为PTK的全部或部分。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括HEPES、MgCl2、DTT和BSA。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述HEPES的浓度为50mmol/L，所述的浓度为10mmol/L，所述DTT的浓度为2mmol/L，所述BSA的浓度为0.1％(W/W)。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述HEPES的pH为7.3。
9.权利要求1～8任一项所述的试剂盒在筛选ABL1的活性抑制剂中应用。
10.一种ABL1激酶的活性抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为小檗碱。
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