CN104302638A - 用于抑制abl1、abl2和bcr-abl1的活性的苯甲酰胺衍生物 - Google Patents

用于抑制abl1、abl2和bcr-abl1的活性的苯甲酰胺衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能抑制BCR-ABL1及其突变体的活性的式(I)的化合物，其中Y、Y1、R1、R2、R3和R4如本发明的概述中所定义。本发明还提供了制备本发明化合物的方法、含所述化合物的药物制剂和在治疗癌症中使用所述化合物的方法。

Description

用于抑制ABL1、ABL2和BCR-ABL1的活性的苯甲酰胺衍生物
本申请要求2012年5月15日提交的美国临时专利申请61/647,174和2013年3月15日提交的美国临时专利申请61/790,967的优先权，据此将其各自全部引入作为参考。
发明领域
本发明涉及能抑制Abelson蛋白(ABL1)、Abelson相关蛋白(ABL2)和相关的嵌合蛋白质、特别是BCR-ABL1的酪氨酸激酶酶活性的化合物。本发明还提供了制备本发明化合物的方法、含所述化合物的药物制剂和在治疗癌症中使用所述化合物的方法。
发明背景
ABL1蛋白的酪氨酸激酶活性通常受到严格调节，SH3域的N-端帽区在此起重要作用。一个调节机制涉及将N-端帽甘氨酸-2残基肉豆蔻酰化，然后与SH1催化结构域中的肉豆蔻酸酯结合部位相互作用。慢性髓性白血病(CML)一个标志是费城染色体(Ph)，由造血干细胞中的t(9,22)染色体相互易位形成。该染色体携带BCR-ABL1癌基因，其编码缺乏N-端帽并具有组成性激活的酪氨酸激酶域的嵌合的BCR-ABL1蛋白。
尽管经由ATP-竞争性机制抑制BCR-ABL1的酪氨酸激酶活性的药物、诸如(伊马替尼)、(尼洛替尼)和(达沙替尼)在治疗CML中有效，但一些患者由于耐药性克隆的出现而复发，其中SH1域中的突变减弱抑制剂结合。尽管和对BCR-ABL1的多种Gleevec-耐药突变型形式保持功效，但其中苏氨酸-315残基被异亮氨酸替代的突变(T315I)对所有三种药物保持不灵敏，且能导致CML患者发展出对治疗法的抗性。因此，对抑制BCR-ABL1突变、诸如T315I仍有未满足的医疗需求。除CML之外，BCR-ABL1融合蛋白是一定比例的急性淋巴细胞白血病的原因，且靶向ABL激酶活性药物在该适应症中也具有功效。
靶向肉豆蔻酰结合部位的活性剂(称为变构抑制剂)对于BCR-ABL1障碍的治疗具有潜力(J.Zhang,F.J.Adrian,W.Jahnke,S.W.Cowan-Jacob,A.G.Li,R.E.Iacob4,T.Sim,J.Powers,C.Dierks,F.Sun,G.-R.Guo,Q.Ding,B.Okram,Y.Choi,A.Wojciechowski,X.Deng,G.Liu,G.Fendrich,A.Strauss,N.Vajpai,S.Grzesiek,T.Tuntland,Y.Liu,B.Bursulaya,M.Azam,P.W.Manley,J.R.Engen,G.Q.Daley,M.Warmuth.,N.S.Gray.Targeting BCR–ABL by combining allosteric with ATP-binding-siteinhibitors.Nature 2010；463:501-6)。为预防ATP抑制剂和/或变构抑制剂应用的抗药性的出现，可以开发使用这两种类型抑制剂的组合治疗来用于治疗BCR-ABL1相关障碍。具体而言，存在经由ATP结合部位、肉豆蔻酰结合部位或这两个部位的组合来抑制BCR-ABL1和BCR-ABL1突变的活性的小分子类或其组合的需要。
此外，ABL1激酶活性抑制剂具有用作治疗转移的浸润性癌和病毒感染、诸如痘(pox)病毒和埃博拉(Ebola)病毒的治疗法的潜力。
来自本发明的化合物还具有治疗或预防与野生型ABL1的异常激活的激酶活性相关的疾病或障碍的潜力，所述疾病或障碍包括非恶性疾病或障碍、诸如CNS疾病、特别是神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森病)、运动神经元病(肌萎缩侧索硬化)、肌营养不良、自身免疫疾病和炎症性疾病(糖尿病和肺纤维化)、病毒感染、朊病毒病。
发明概述
在一个方面中，本发明提供了式(I)的化合物:
其中：
R1是吡唑基；其中所述吡唑基是未被取代的或被1至2个R6基团取代；
R2是吡咯烷基；其中所述吡咯烷基被1个R7基团取代；
R3选自氢和卤素；
R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3；
R6每次出现时独立地选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟-乙基、乙基和环丙基；
R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基(phosphonooxy)、氰基和氨基-羰基；
Y选自CH和N；
Y1选自CH和N；
Y2选自CF2、O和S(O)0-2；且
Y3选自氢、氯、氟、甲基、二氟甲基和三氟甲基。
在第二个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含式(I)的化合物或者其N-氧化物衍生物、单独的异构体及异构体的混合物、或者其可药用盐，以及与之混合的一种或多种适合的赋形剂。
在第三个方面中，本发明提供了在动物中治疗疾病的方法，其中调节BCR-ABL1活性可以预防、抑制或改善所述疾病的病状和/或症候，所述方法包括向动物施用治疗有效量的式(I)的化合物或者其N-氧化物衍生物、单独的异构体及异构体的混合物、或者其可药用盐。
在第四个方面中，本发明提供了式(I)的化合物在制备用于在动物中治疗疾病的药物中的应用，其中BCR-ABL1活性有助于所述疾病的病状和/或症候。
在第五个方面中，本发明提供了用于动物治疗法的式I的化合物，其中BCR-ABL1活性有助于所述疾病的病状和/或症候。
在第六个方面中，本发明提供了制备式(I)的化合物和其N-氧化物衍生物、前药衍生物、受保护的衍生物、单独的异构体及异构体的混合物和其可药用盐的方法。
附图简述
图1:实施例9的无定形固体分散体制剂(参见实施例41)的X射线粉末衍射图(使用铜源(λ＝1.54A)用于测定)，其具有25％的实施例9的载量以及PVP VA64(37.5％)和Pharmacoat 603(37.5％)。
图2:具有皮下KCL-22异种移植物的动物每天用实施例9治疗。证明了剂量依赖性抗肿瘤活性。
图3:KCL-22细胞被培养为皮下异种移植物，并将75mg/kg尼洛替尼BID(每日二次)给予动物。当肿瘤发展出对尼洛替尼治疗的耐药性时，将给药更换为30mg/kg实施例9(每日二次)。用实施例9治疗尼洛替尼耐药的肿瘤导致该肿瘤的消退。每条线代表单独的动物。
图4:将30mg/kg实施例9(每日二次)和75mg/kg尼洛替尼(每日二次)的组合给予具有皮下KCL-22异种移植物的动物。每条线代表单独的动物。在所有动物中观察到肿瘤的完全消退，并且所述消退维持到该研究结束。
定义
除非另外说明，上下文所用的通用术语在本公开内容的上下文内优选具有以下含义，其中无论在何处使用，更上位的术语可以相互独立地被更具体的定义所替换或者保持不变，由此定义了本发明的更详细的实施方案：
“烷基”是指具有1至7个碳原子(C1-7烷基)或1至4个碳原子(C1-4烷基)的支链或直链的烃基。烷基的代表性的实例包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、仲-丁基、异-丁基、叔丁基、正-戊基、异戊基、新戊基、正-己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正-庚基、正-辛基、正-壬基、正-癸基等。被取代的烷基是含一个或多个诸如1、2或3个选自卤素、羟基或烷氧基的取代基的烷基。卤素取代的烷基和卤素取代的烷氧基可以是直链或支链的，并包括甲氧基、乙氧基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、二氟甲氧基、三氟甲氧基等。
“芳基”意指含有6至10个环碳原子的单环或稠合二环的芳族环系。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”意指衍生自芳基的二价基团。
“BCR-ABL1”是指由裂点簇区(BCR)基因的N-端外显子和Abelson(ABL1)基因的主要的C-端部分(外显子2–11)形成的融合蛋白。最常见的融合转录物编码210-kDa蛋白质(p210BCR-ABL1)，虽然更罕见的转录物编码190-kDa蛋白质(p190BCR-ABL1)和230-kDa蛋白质(p230BCR-ABL1)。这些蛋白的ABL1序列包含在野生型蛋白质中严格调节、但在BCR-ABL1融合蛋白中组成性激活的ABL1酪氨酸激酶域。该失调的酪氨酸激酶与多种导致细胞转化和增殖失调的细胞细胞信号传导通路相互作用。
“BCR-ABL1突变体”是指BCR-ABL1中的众多单一位点突变，包括:Glu255→赖氨酸、Glu255→缬氨酸、Thr315→异亮氨酸、Met244→Val、Phe317→Leu、Leu248→Val、Met343→Thr、Gly250→Ala、Met351→Thr、Gly250→Glu、Glu355→Gly、Gln252→His、Phe358→Ala、Gln252→Arg、Phe359→Val、Tyr253→His、Val379→Ile、Tyr253→Phe、Phe382→Leu、Glu255→Lys、Leu387→Met、Glu255→Val、His396→Pro、Phe311→Ile、His396→Arg、Phe311→Leu、Ser417→Tyr、Thr315→Ile、Glu459→Lys和Phe486→Ser。
本发明化合物对R3/R4取代的环上的NHC(O)的连接点邻位的取代敏感。比较例如以下式(I)的化合物。与氯代或甲基取代相比(IC50分别为1.6和1.8μM)，实施例2的IC50为1nM:
“杂芳基”如上文对芳基的定义，其中一个或多个环成员是杂原子。例如，5至8元杂芳基具有最低5个选自碳、氮、氧和硫的环原子。所以5至8元杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1,3]间二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“环烷基”意指含有所示环原子数的饱和的、单环、稠合的二环或桥连的多环环系。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。部分不饱和的环烷基意指具有至少一个为双键的键的如上文定义的环烷基。
“杂环烷基”意指如本申请中定义的环烷基，条件是一个或多个所示的环碳被选自以下基团替代：-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-，其中R是氢、C1-4烷基或氮保护基团(例如，苄酯基、对甲氧基苄基羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基-苄基、对甲氧基-苯基、3,4-二甲氧基苄基等)。例如，3至8元杂环烷基包括吗啉代、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、哌嗪基、哌啶基、哌啶基酮、1,4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基、硫代吗啉代、硫代吗啉代-S-单氧化物(sulfanomorpholino)、硫代吗啉代-S,S-二氧化物(sulfonomorpholino)等。
“卤素”(或卤代)优选表示氯或氟，但还可以是溴或碘。
(甲磺酸伊马替尼)被指示用于治疗KIT(CD117)-阳性的不能切除的和/或转移的恶性胃肠道间质肿瘤(GIST)的患者。其还被指示用于治疗KIT(CD117)-阳性的GIST完全切除后的成年患者。其还被指示用于治疗新诊断的成人和慢性期的患有费城染色体–阳性的慢性髓性白血病(Ph+CML)的儿科患者以及在α-干扰素治疗失败后、处于原始细胞危象(BC)、加速期(AP)中或处于慢性期(CP)中的患有Ph+CML的患者。其还可以用作治疗以下具有有限的治疗选项的罕见病的靶向药物:复发或顽固的费城染色体–阳性的急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)；与血小板衍生生长因子受体(PDGFR)基因重排相关的骨髓发育不良/骨髓增生性疾病(MDS/MPD)；没有D816V c-KIT突变或者c-KIT突变状态未知的侵袭性系统性肥大细胞增生症(ASM)；具有FIP1L1-PDGFRα融合激酶(CHIC2等位基因缺失的突变分析或FISH证明)的嗜酸性细胞增多综合征/慢性嗜酸细胞白血病(HES/CEL)，并用于FIP1L1-PDGFRα融合激酶阴性或未知的HES和/或CEL患者；和不能切除的、复发的和/或转移的隆凸性皮肤纤维肉瘤(DFSP)。
(尼洛替尼)被指示用于治疗患有新诊断的在慢性期的费城染色体-阳性的慢性髓性白血病(Ph+CML)的成年患者。其可以用于治疗不再从包括伊马替尼在内的其他治疗获益或对包括伊马替尼在内的其他治疗不耐受的成人，或接受过包括伊马替尼在内的其他治疗但对它们不耐受的成人。
(达沙替尼)是用于治疗患有新诊断的在慢性期的费城染色体-阳性的(Ph+)慢性髓性白血病(CML)的成人和用于治疗不再从其他治疗获益或对其他治疗不耐受的成人、以及ALL患者的处方药。
(波舒替尼)是用于治疗患有新诊断的在慢性期的费城染色体-阳性的(Ph+)慢性髓性白血病(CML)的成人和用于治疗不再从其他治疗获益或对其他治疗不耐受的成人、以及ALL患者的处方药。
式(I)的化合物可具有不同的异构形式。例如，任何不对称碳原子可以以(R)-、(S)-或(R,S)-构型存在，优选(R)-或(S)-构型。位于双键或者尤其环上的取代基可以以顺式-(＝Z-)或反式(＝E-)形式存在。因此该化合物可以作为异构体的混合物或优选纯的异构体存在、优选作为纯的非对映异构体或纯的对映体存在。以下的式(I)的化合物会存在互变异构形式:
为阐述互变异构现象使用以下具体实例，(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(以下右侧结构)为(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-3-基)烟酰胺(以下左侧结构)的互变异构体，且反之亦然:
当应用复数形式(例如多种化合物、多种盐)时，其包括单数(例如单种化合物、单种盐)。“化合物”不排除(例如在药物制剂中)存在多于一种式(I)的化合物(或其盐)，该术语未限定单复数。因此未限定单复数的术语优选理解为“一种/个或多种/个”，不太优选备选地理解为“一种/个”。
术语“和/或其N-氧化物、其互变异构体和/或其(优选可药用的)盐”尤其意指式(I)的化合物可以照原样存在或与其N-氧化物混合存在、作为互变异构体(例如由于酮-烯醇、内酰胺-内酰亚胺、酰胺-亚胺酸或烯胺-亚胺互变异构现象)或(例如等价反应导致的)与其互变异构体混合存在，或者作为式(I)的化合物的盐存在和/或作为这些形式中的任何一种或者作为两种或更多种所述形式的混合物存在。
本文给出的任何式还预期表示所述化合物的未标记形式以及同位素标记的形式。同位素标记的化合物具有本文给出式的所描述的结构，不同之处在于一个或多个原子被具有所选择的原子质量或质量数的原子所替代。可以掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素、分别诸如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F31P、32P、35S、36Cl、123I、124I、125I。本发明包括各种同位素标记的如本文定义的化合物，例如存在放射性同位素、诸如3H和14C的那些，或存在非-放射性同位素、诸如2H和13C的那些。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(使用14C)、反应动力研究(使用例如2H或3H)、检测或成像技术、诸如正电子发射断层成象术(PET)或单光子发射计算机断层成象术(SPECT)SPECT)，包括药物或底物组织分布测定法，或者可用于患者的放射性治疗中。特别地，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究是特别合乎需要的。同位素标记的本发明化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些类似的方法使用适合的同位素标记的试剂来制备。
此外，被更重的同位素、特别是氘(即2H或D)取代可因更大的代谢稳定性而提供某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求或治疗指数的改善。应当理解的是，在本文的上下文中氘被视为本发明的化合物的取代基。这类更重的同位素、特别是氘的浓度可以用同位素富集因子来定义。本文所用的术语“同位素富集因子”意指给定的同位素的同位素丰度与天然丰度之间的比。如果本发明的化合物上的取代基是所示的氘，则所述化合物对每个指定的氘原子而言具有至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)的同位素富集因子。
例如，本文所示的其中R3是氢且Y是CH的式Ib的化合物可以如下所示在吡咯烷基环上含氘:
与非氘化形式(以上右侧)相比，该氘化形式(以上左侧)较不易于代谢转化。
优选实施方案的描述
本发明涉及能通过变构的、肉豆蔻酰的结合部位来抑制BCR-ABL1或BCR-ABL1的突变体活性的化合物。
就本发明化合物而言，在一个实施方案中，为式(Ib)的化合物:
其中：R3选自氢和卤素；R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3；R6当连接于吡唑基环的氮时选自氢、甲基、羟基-乙基、氟-乙基、乙基和环丙基；和R6当连接于吡唑基环的碳原子时选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟-乙基、乙基和环丙基；R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基、氰基和氨基-羰基；Y1选自CH和N；Y2选自CF2、O和S(O)0-2；Y3选自氢、氟、氯、甲基、二氟甲基和三氟甲基；或其可药用盐。
在一个进一步的实施方案中为式(Ic)的化合物:
其中：R3选自氢和卤素；R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3；R6当连接于吡唑基环的氮时选自氢、甲基、羟基-乙基、氟-乙基、乙基和环丙基；且R6当连接于吡唑基环的碳原子时选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟-乙基、乙基和环丙基；R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基、氰基和氨基-羰基；Y1选自CH和N；Y2选自CF2、O和S(O)0-2；Y3选自氢、氟、氯、甲基、二氟甲基和三氟甲基；或其可药用盐。
在另一个实施方案中是式(I)的化合物或其可药用盐，其中R1是吡唑基；其中所述吡唑基是未被取代的或被1至2个R6基团取代。
在一个进一步的实施方案中，R1是未被取代的吡唑基。
在一个进一步的实施方案中，R1是被1个R6基团取代的吡唑基。
在一个进一步的实施方案中，R1是被两个R6基团取代的吡唑基。
在另一个实施方案中，R2是被1个R7基团取代的吡咯烷-1-基。
在另一个实施方案中，Y选自CH和N。
在一个进一步的实施方案中，Y是N。
在一个进一步的实施方案中，Y是CH。
在另一个实施方案中，Y1选自CH和N。
在一个进一步的实施方案中，Y1是N。
在一个进一步的实施方案中，Y1是CH。
以下进一步的实施方案适用于式(I)、(Ib)或(Ic)中的任何一个的化合物或其可药用盐。
在另一个实施方案中，R3选自氢和卤素。
在另一个实施方案中，R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3。
在一个进一步的实施方案中，R4是氯二氟甲氧基。
在一个进一步的实施方案中，R4是三氟甲氧基。
在另一个实施方案中，R6每次出现时独立地选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟-乙基、乙基和环丙基。
在一个进一步的实施方案中，R6当连接于吡唑基环的氮时选自氢、甲基、羟基-乙基、氟-乙基、乙基和环丙基。
在一个进一步的实施方案中，R6当连接于吡唑基环的碳原子时选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟-乙基、乙基和环丙基。
在另一个实施方案中，R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基、氰基和氨基-羰基。
在另一个实施方案中，Y2选自CF2、O和S(O)0-2。
在一个进一步的实施方案中，Y2是O。
在一个进一步的实施方案中，Y2是CF2。
在一个进一步的实施方案中，Y2是S(O)0-2。
在另一个实施方案中，Y3选自氢、氯、氟、甲基、二氟甲基和三氟甲基。
在一个进一步的实施方案中，Y3是氯。
在一个进一步的实施方案中，Y3是氟。
在一个进一步的实施方案中是选自以下的化合物或其可药用盐:
在另一个实施方案中是选自以下的化合物或其可药用盐:
在另一个实施方案中是选自以下的化合物或其可药用盐:
在另一个实施方案中是选自以下的化合物或其可药用盐，即:
在另一个实施方案中是选自以下的化合物:
药理和功效
基于下文“试验”部分中描述的抑制性研究，本发明的式(I)的化合物尤其对依赖于BCR-ABL1活性的障碍显示治疗功效。特别地，本发明化合物抑制BCR-ABL1的变构的或肉豆蔻酰结合部位(包括野生型BCR-ABL1和/或其突变)。
BCR-ABL1的ATP-竞争性抑制剂与BCR-ABL1的变构抑制剂的组合在体外在BCR-ABL1+KCL-22细胞中延长获得性耐药性。令人惊讶地，每3-4天用本发明化合物处理的BCR-ABL1+KCL-22细胞在约28天后显示获得性耐药性，而每3-4天用尼洛替尼或达沙替尼处理的这些相同的细胞在仅18-21天后显示获得性耐药性。甚至更令人惊讶地，当每3-4天用本发明化合物与尼洛替尼或达沙替尼的组合处理BCR-ABL1+KCL-22细胞时，在至少前60天内没有观察到获得性耐药性。因此，本发明的肉豆蔻酰-结合部位化合物与结合ATP结合部位的BCR-ABL1抑制剂的组合对于治疗涉及ABL1激酶活性的向上调节的增殖性疾病尤其重要，如在CML和其他血液学恶性肿瘤的亚型、诸如ALL和AML中的BCR-ABL1融合蛋白情况中。
癌细胞肿瘤侵袭和转移期间利用侵袭伪足(invapodia)降解细胞外基质。ABL激酶活性是SRC-诱导的侵袭伪足形成所需要的，其调节侵袭伪足装配的不同阶段和功能。因此，作为ABL1抑制剂的本发明化合物具有用作治疗转移的浸润性癌的治疗法的潜力。
ABL1激酶的变构抑制剂可以用于治疗脑癌:包括为最常见和最具侵袭性的恶性原发性脑肿瘤的成胶质细胞瘤，其中在一个亚类的患者中可通过免疫组化技术检测到ABL1的表达(Haberler C,Gelpi E,Marosi C,K,Birner P,Budka H,Hainfellner JA.Immunohistochemicalanalysis of platelet-derived growth factor receptor-alpha,-beta,c-KIT,ABL1,and ABL2proteins in glioblastoma:possible implications forpatient selection for imatinib mesylate therapy.J Neurooncol.2006年1月；76(2):105-9)。然而，的临床试验在成胶质细胞瘤患者中失败了(Reardon DA,Dresemann G,Taillibert S,Campone M,van den Bent M,Clement P,Blomquist E,Gordower L,Schultz H,Raizer J,Hau P,Easaw J,Gil M,Tonn J,Gijtenbeek A,Schlegel U,Bergstrom P,Green S,Weir A,Nikolova Z.Multicentre phase II studies evaluating imatinib plushydroxyurea in patients with progressive glioblastoma.Br J Cancer.2009年12月15日；101(12):1995-2004；Razis E,Selviaridis P,Labropoulos S,Norris JL,Zhu MJ,Song DD,Kalebic T,Torrens M,Kalogera-Fountzila A,Karkavelas G,Karanastasi S,Fletcher JA,Fountzilas G.Phase II study ofneoadjuvant imatinib in glioblastoma:evaluation of clinical and moleculareffects of the treatment.Clin Cancer Res.2009年10月1日；15(19):6258-66；Dresemann G.Imatinib and hydroxyurea in pretreated progressiveglioblastoma multiforme:a patient series.Ann Oncol.2005年10月；16(10):1702-8)，可能是由于脑肿瘤内药物的暴露低和缺乏扰乱的血脑屏障(Holdhoff等,J Neurooncol.2010；97(2):241-5)。事实上在临床前研究中穿过血脑屏障的转移显示受到主动流出转运蛋白、诸如P-糖蛋白的限制。达沙替尼也是该情况(Chen Y,Agarwal S,Shaik NM,Chen C,Yang Z,Elmquist WF.P-glycoprotein and breast cancer resistance proteininfluence brain distribution of dasatinib.J Pharmacol Exp Ther.2009年9月；330(3):956-63)。已知辐照增强血脑屏障开放。在小鼠模型中，当施用与每日辐照联用时，多形性成胶质细胞瘤对的响应与肿瘤生长延迟的增加和存活相关(Geng L,Shinohara ET,Kim D,Tan J,Osusky K,Shyr Y,Hallahan DE.STI571(Gleevec)improves tumor growthdelay and survival in irradiated mouse models of glioblastoma.Int JRadiat Oncol Biol Phys.2006年1月1日；64(1):263-71)。因此，具有高脑暴露的新的ABL1抑制剂代表了对成胶质细胞瘤和其他脑癌的固体治疗方法。
CNS-CML:在一些使用治疗的CML患者中，报道了CNS原始细胞危象和衰竭，且可以通过的差的脑暴露来解释。(Kim HJ,Jung CW,Kim K,Ahn JS,Kim WS,Park K,Ko YH,Kang WK,Park K.Isolated blast crisis in CNS in a patient with chronic myelogenous leukemiamaintaining major cytogenetic response after imatinib.J Clin Oncol.2006年8月20日；24(24):4028-9；Radhika N,Minakshi M,Rajesh M,Manas BR,Deepak Kumar M.Central nervous system blast crisis in chronic myeloidleukemia on imatinib mesylate therapy:report of two cases.Indian JHematol Blood Transfus.2011年3月；27(1):51-4)。实际中，在CML患者中，浓度事实上在CNS中比在血浆中低的多(～100倍)(Leis JF,Stepan DE,Curtin PT,Ford JM,Peng B,Schubach S,Druker BJ,MaziarzRT.Central nervous system failure in patients with chronic myelogenousleukemia lymphoid blast crisis and Philadelphia chromosome positiveacute lymphoblastic leukemia treated with imatinib(STI-571).LeukLymphoma.2004年4月；45(4):695-8)。因此，显示出高脑暴露的本发明的ABL1抑制剂代表了开发针对包括CNS-CML在内的CML的治疗法的有效途径。
本发明化合物可以用于治疗病毒。例如，病毒感染可以由ABL1激酶活性介导，如在痘病毒类和埃博拉病毒的情况中。已显示和在体外停止埃博拉病毒颗粒从受感染细胞的释放(Kalman,Daniel；Bornmann,William Gerard,Methods of use of non-ATPcompetitive tyrosine kinase inhibitors to treat pathogenic infection,PCT国际申请2007,WO 2007002441；Garcia Mayra；Cooper Arik；Shi Wei；Bornmann William；Carrion Ricardo；Kalman Daniel；Nabel Gary J.Productive Replication of Ebola Virus Is Regulated by the ABL1TyrosineKinase.Science translational medicine 2012；4:123ra24)。因此能够预期抑制ABL1激酶的本发明化合物可以用于降低病原体的复制能力。
本发明化合物还可以用于治疗神经变性。虽然在健康的成人脑中天然ABL1酪氨酸激酶保持相对静止，但其在CNS疾病患者的脑中可以被激活，所述CNS疾病包括神经变性疾病、诸如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(AD)、额颞叶痴呆(frontotemporal dementia)(FTD)、皮克病、C型尼曼-皮克病(NPC)和其他退化性疾病、炎性疾病和自身免疫性疾病和老化。
帕金森病是第二普遍的慢性神经变性疾病，其具有最常见的由E3遍在蛋白连接酶(帕金蛋白(parkin))上的突变引起的家族性常染色体隐性形式。最新研究显示在散发性帕金森病患者的纹状体中发现激活的ABL1/ABL2。同时，帕金蛋白是酪氨酸-磷酸化的，引起其遍在蛋白连接酶和细胞保护活性的损失，如帕金蛋白底物的累积所示(Ko HS,Lee Y,Shin JH,Karuppagounder SS,Gadad BS,Koleske AJ,Pletnikova O,Troncoso JC,Dawson VL,Dawson TM.Phosphorylation by the c-Ablprotein tyrosine kinase inhibits parkin's ubiquitination and protectivefunction.Proc Natl Acad Sci U S A.2010年9月21日；107(38):16691-6；Imam SZ,Zhou Q,Yamamoto A,Valente AJ,Ali SF,Bains M,Roberts JL,Kahle PJ,Clark RA,Li S.Novel regulation of parkin function throughc-Abl-mediated tyrosine phosphorylation:implications for Parkinson'sdisease.J Neurosci.2011年1月5日；31(1):157-63)。这两个研究还显示在帕金森病细胞或动物模型中，ABL1激酶的药理抑制或ABL1基因敲除防止帕金蛋白的酪氨酸磷酸化，并恢复其E3连接酶活性和细胞保护功能，在体外和体内均如此。这些结果显示帕金蛋白的ABL1-依赖的酪氨酸磷酸化是导致散发性PD中帕金蛋白功能损失和疾病进展的主要的翻译后修饰。因此，本发明化合物抑制ABL1的肉豆蔻酸酯-结合部位的能力预期能提供阻断帕金森病进展的新的治疗可能性。
阿尔茨海默病的特征在于两个主要的标志:导致淀粉样蛋白斑发展的神经毒性淀粉样蛋白-β的细胞外沉积和有助于神经原纤维缠结(NFTs)发展的超磷酸化的tau的细胞内累积。
在野生型豚鼠的脑中和在细胞模型中用鞘内治疗后，淀粉样蛋白-β水平降低(Netzer WJ,Dou F,Cai D,Veach D,Jean S,Li Y,Bornmann WG,Clarkson B,Xu H,Greengard P.Gleevec inhibitsbeta-amyloid production but not Notch cleavage.Proc Natl Acad Sci U S A.2003年10月14日；100(21):12444-9)。该小组提出通过防止GSAP与γ-分泌酶底物(APP-CTF)相互作用的新的机制达到其淀粉样蛋白-β-降低作用(He G,Luo W,Li P,Remmers C,Netzer WJ,Hendrick J,Bettayeb K,Flajolet M,Gorelick F,Wennogle LP,Greengard P.Γ-secretase activatingprotein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.Nature.2010年9月2日；467(7311):95-8)。在该研究中，仅在微摩尔级浓度观测到抑制GSAP/APP-CTF的作用。另一小组证明在体内APP的胞内结构域(即Tyr682)的酪氨酸磷酸化调节致淀粉样变性的APP加工处理，后者加速淀粉样蛋白-β的形成(Barbagallo AP,Weldon R,Tamayev R,Zhou D,Giliberto L,Foreman O,D'Adamio L.Tyr(682)in the intracellular domainof APP regulates amyloidogenic APP processing in vivo.PLoS One.2010年11月16日；5(11):e15503)。其他研究显示APP在表达ABL1癌基因的组成性激活形式的细胞中是酪氨酸-磷酸化的(Zambrano N,Bruni P,MinopoliG,Mosca R,Molino D,Russo C,Schettini G,Sudol M,Russo T.Thebeta-amyloid precursor protein APP is tyrosine-phosphorylated in cellsexpressing a constitutively active form of the Abl protoncogene.J BiolChem.2001年1月8日；276(23):19787-92)。这些数据一起提示用于形成毒性淀粉样蛋白-β肽和随后的淀粉样蛋白斑的ABL1-依赖的致淀粉样变性的APP加工处理。因此预期ABL1抑制剂在阿尔茨海默病患者中降低淀粉样蛋白斑形成。
已显示在细胞模型中Tau在酪氨酸18、197、310和394被ABL1激酶磷酸化，且已显示在AD患者的脑中tau pY394存在于神经原纤维缠结(NFTs)病变中。
ABL1在散发性阿尔茨海默病患者的脑中激活，如其在Y412(激活指示物，其共定位粒状空泡变性)或者在T735(除GVD之外还共定位典型病变、淀粉样蛋白斑、神经原纤维缠结(NFTs))的磷酸化所示。淀粉样蛋白-β和氧化应激激活神经元培养物中的ABL1激酶，且原纤维淀粉样蛋白肽的脑内注射导致ABL1和下游效应物p73的表达增加。转基因小鼠(AD的APP/Swe小鼠模型)在它们的脑中显示更高的ABL1水平，且当用ABL1抑制剂处理这些小鼠时，在它们的脑中tau磷酸化减少。在前脑神经元中表达组成性激活的ABL1的转基因小鼠模型显示神经元损失、严重的神经炎症和脑中tau的酪氨酸磷酸化(综述参见Schlatterer SD,AckerCM,Davies P.c-Abl in neurodegenerative disease.J Mol Neurosci.2011年11月；45(3):445-52)。
基于所有这些结果，存在ABL1激酶由于发展病变、淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结在阿尔茨海默病发病机制中起作用的证据。
此外，激活的ABL1还存在于除散发性阿尔茨海默病之外的其他Tau病变中，包括具有N279K和P301L突变的额颞叶痴呆、皮克病和关岛帕金森-痴呆综合征(Guam Parkinson-dementia)的患者的脑中(SchlattererSD,Acker CM,Davies P.c-Abl in neurodegenerative disease.J MolNeurosci.2011年11月；45(3):445-52)。
因此，本发明化合物，通过抑制CNS中的ABL1，代表了开发针对阿尔茨海默病以及其它β-淀粉样变性、诸如血管性痴呆和其他Tau病变、诸如额颞叶痴呆和皮克病的治疗方法的有效途径。
C型尼曼-皮克病(NPC)是致命的常染色体隐性遗传障碍，特征为核内质溶酶体系统中游离胆固醇和糖鞘酯累积，和进行性神经元死亡、特别是小脑普肯耶神经元。在NPC小鼠模型中，凋亡前ABL1、下游靶点以及p73靶基因在小脑中表达。使用抑制ABL1防止普肯耶神经元损失，改善神经病学症状，并增加存活。的该促存活作用与降低的p73凋亡前靶基因的mRNA水平相关(Alvarez AR,Klein A,Castro J,Cancino GI,Amigo J,Mosqueira M,Vargas LM,Yévenes LF,BronfmanFC,Zanlungo S.Imatinib therapy blocks cerebellar apoptosis andimproves neurological symptoms in a mouse model of Niemann-Pick typeC disease.FASEB J.2008年10月；22(10):3617-27)。因此，本发明化合物，通过抑制ABL1激酶，代表了开发针对由凋亡前ABL1/p73通路、诸如NPC引起的疾病的治疗法的有效方法。
在朊病毒病模型中，显示有益的作用:其通过抑制朊病毒从外周向CNS传播延缓朊病毒神经入侵(neuroinvasion)(Yun SW,Ertmer A,Flechsig E,Gilch S,Riederer P,Gerlach M,HM,Klein MA.Thetyrosine kinase inhibitor imatinib mesylate delays prion neuroinvasion byinhibiting prion propagation in the periphery.J Neurovirol.2007年8月；13(4):328-37)。和ABL1不足在朊病毒-感染细胞中诱导细胞的PrPSc的清除(Ertmer A,Gilch S,Yun SW,Flechsig E,Klebl B,Stein-Gerlach M,Klein MA,HM.The tyrosine kinase inhibitorSTI571induces cellular clearance of PrPSc in prion-infected cells.J BiolChem.2004年10月1日；279(40):41918-27)。因此，本发明的新的ABL1抑制剂还代表了治疗朊病毒病、诸如克-雅病的有效的治疗方法。
X连锁隐性埃-德二氏肌营养不良由伊默菌素(在细胞核结构、基因调节和信号传导中起作用的核膜蛋白质)的突变引起。最新研究已显示在细胞模型中伊默菌素直接由ABL1酪氨酸-磷酸化，且伊默菌素的磷酸化状态改变伊默菌素与其他蛋白质、诸如BAF结合。这从而可解释突变体伊默菌素由细胞核至胞质组分的错位分布，并因此改变下游效应物和用于核被膜上信号传导途径的信号整合分子(Tifft KE,Bradbury KA,Wilson KL.Tyrosine phosphorylation of nuclear-membrane protein emerin by SRC,ABL1and other kinases.J Cell Sci.2009年10月15日；122(Pt20):3780-90)。有丝分裂和分裂间期期间中伊默菌素-核纤层蛋白相互作用的变化与肌营养不良的病变有关。此外，另一项研究的结果证实在mdx小鼠中减轻骨骼肌营养不良(Huang P,Zhao XS,Fields M,Ransohoff RM,Zhou L.Imatinib attenuates skeletal muscle dystrophy inmdx mice.FASEB J.2009年8月；23(8):2539-48)。
因此，本发明的新的ABL1抑制剂还代表了治疗骨骼和肌营养不良的治疗方法。
此外，ABL1激酶在牵涉大量的人类疾病两个机制——炎症和氧化应激中起作用，所述疾病范围包括急性CNS疾病、诸如中风和脑创伤或脊髓损伤、慢性CNS疾病、诸如阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿病和运动神经元病，非-CNS炎性和自身免疫性疾病、诸如糖尿病、肺纤维化。
例如，在系统性硬化病的不同的临床前模型中防止纤维化，并诱导已建立的纤维化退化(Akhmetshina A,Venalis P,Dees C,Busch N,Zwerina J,Schett G,Distler O,Distler JH.Treatment with imatinibprevents fibrosis in different preclinical models of systemic sclerosis andinduces regression of established fibrosis.Arthritis Rheum.2009年1月；60(1):219-24)，且在小鼠中其显示在博来霉素-诱导的肺纤维化中的抗纤维化作用(Aono Y,Nishioka Y,Inayama M,Ugai M,Kishi J,Uehara H,Izumi K,Sone S.Imatinib as a novel antifibrotic agent inbleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.Am J Respir Crit CareMed.2005年1月1日；171(11):1279-85)。另一项研究显示伊马替尼和尼洛替尼均在小鼠中减轻博来霉素-诱导的急性肺损伤和肺纤维化(Rhee CK,Lee SH,Yoon HK,Kim SC,Lee SY,Kwon SS,Kim YK,Kim KH,Kim TJ,Kim JW.Effect of nilotinib on bleomycin-induced acute lung injury andpulmonary fibrosis in mice.Respiration.2011；82(3):273-87)。尽管在这些研究中作者聚焦于推断与PDGFRs相关的机制，但令人感兴趣地，在Rhee等的研究中(Respiration.2011；82(3):273-87)，比伊马替尼更强效的c-ABL抑制剂尼洛替尼显示更强的抗纤维化治疗作用，因此支持c-ABL抑制剂在治疗有肺部炎症的人疾病中的治疗应用。在另一项研究中，小鼠暴露于高氧症增加了ABL1激活和肺气漏，ABL1激活是发动蛋白2磷酸化和活性氧生成所需要的(Singleton PA,Pendyala S,Gorshkova IA,MambetsarievN,Moitra J,Garcia JG,Natarajan V.Dynamin 2and c-Abl are novelregulators of hyperoxia-mediated NADPH oxidase activation and reactiveoxygen species production in caveolin-enriched microdomains of theendothelium.J Biol Chem.2009年12月11日；284(50):34964-75)。
因此，这些数据表明本发明的新的c-ABL抑制剂具有治疗有肺部炎症的人疾病的治疗应用。
通过胰岛素经由FAK应答的改变来激活ABL1，在指导促有丝分裂相对代谢的胰岛素受体信号传导中可能起重要作用(Genua M,Pandini G,Cassarino MF,Messina RL,Frasca F.c-Abl and insulin receptor signalling.Vitam Horm.2009；80:77-105)。c-ABL抑制剂、诸如已显示在非肥胖糖尿病小鼠中逆转1型糖尿病(Louvet C,Szot GL,Lang J,Lee MR,Martinier N,Bollag G,Zhu S,Weiss A,Bluestone JA.Tyrosine kinaseinhibitors reverse type 1diabetes in nonobese diabetic mice.Proc NatlAcad Sci U S A.2008年12月2日；105(48):18895-900)。通过siRNA-介导ABL1mRNA的敲除模拟了对糖尿病的改善(R,Sandler S,Mokhtari D,Welsh N.Amelioration of diabetes by imatinibmesylate(Gleevec):role of beta-cell NF-kappaB activation andanti-apoptotic preconditioning.FASEB J.2007年2月；21(2):618-28)。
因此，本发明的新的ABL1抑制剂具有治疗人糖尿病的治疗应用。
本发明的ABL1抑制剂可以与一种或多种现有的用于以上疾病的治疗法组合使用:例如本发明的ABL1抑制剂可以与治疗帕金森病的左旋多巴或其他含L-DOPA的药物或多巴胺受体激动剂组合使用或与治疗阿尔茨海默病的胆碱酯酶抑制剂、诸如艾斯能胶囊或透皮贴剂组合使用。
在慢性髓性白血病(CML)中，在造血干细胞(HSCs)中相互平衡的染色体易位产生BCR-ABL1杂合基因。后者编码致癌的BCR-ABL1融合蛋白。虽然ABL1编码受严格调节的在调节细胞增殖、粘附和凋亡中起基础作用的蛋白酪氨酸激酶，但BCR-ABL1融合基因编码为组成性激活的激酶。该激活的激酶转化造血干细胞来生成显示失调的克隆样增生、降低的粘附骨髓基质的能力和降低的对突变刺激的细胞凋亡应答的表型，导致逐渐更恶性的转化。生成的粒细胞不能发展为成熟的淋巴细胞，且被释放到循环中，导致缺乏成熟细胞和增加的对感染的易感性。已证实BCR-ABL1的ATP-竞争性抑制剂防止激酶激活促有丝分裂和抗细胞凋亡通路(例如，PI-3激酶和STAT5)，导致BCR-ABL1表型细胞的死亡，并由此提供针对CML的有效的治疗法。KCL-22细胞系(购自DSMZ,Leibniz研究所，德国)在1981年由具有在原始细胞危象的费城染色体-阳性的CML的32-岁的女性的胸腔积液建立，且已描述其包含t(9；22)，导致BCR-ABL1融合基因和p53突变。KCL-22细胞系可以用于异种移植物模型以在体内显示本发明化合物的功效(参见以下实验部分)。因此作为BCR-ABL1抑制剂(包括其突变体)本发明化合物尤其适用于与其过表达有关的疾病、诸如ALL或CML白血病的治疗法。
还已经证实本发明化合物在体外具有抗肿瘤活性:例如使用白血病细胞系诸如Ba/F3-BCR-ABL1、KCL-22、K-562、MEG-01、KYO-1、LAMA-84、KU812、EM-2、CML-T1、BV-173或ALL-SIL测试了体外抗肿瘤活性。
本发明包括治疗癌症的方法，其包括向需要所述治疗的个体施用有效量的本发明化合物或药物组合物。
一个进一步的实施方案包括还向个体施用另外的治疗剂。
在一个进一步的实施方案中，所述另外的治疗剂是不同的选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼(dosutinib)、拉多替尼(radotinib)、普纳替尼(ponatinib)和巴非替尼(bafetinib)的BCR-ABL1的抑制剂。
在另一个实施方案中是治疗由BCR-ABL1介导的病症的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的本发明化合物或药物组合物。
BCR-ABL1可以包含一种或多种突变。这些突变包括V299L、T315I、F317I、F317L、Y253F、Y253H、E255K、E255V、F359C和F359V(UJaneF.Apperley.Part 1:Mechanism of resistance to imatinib in chronicmyeloid leukaemia.Lancet Oncology 2007；8:1018)。
一个进一步的实施方案是治疗由BCR-ABL1介导的病症的方法，其中BCR-ABL1包含一种或多种选自V299L、T315I、F317I、F317L、Y253F、Y253H、E255K、E255V、F359C和F359V的突变。
在一些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中所述化合物经胃肠外施用。
在一些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中所述化合物经肌内、静脉内、皮下地、口服、肺、鞘内、局部或鼻内施用。
在一些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中所述化合物被全身施用。
在一些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中所述患者是哺乳动物。
在一些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中所述患者是灵长类动物。
在一些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中所述患者是人。
在另一个方面，本发明涉及治疗ABL1/BCR-ABL1–介导的障碍的方法，其被包括以下步骤:向有需要的患者施用治疗有效量的化疗剂以及与之组合的治疗有效量的式(I)的化合物。
在另一个方面中是上文描述的式I的化合物或其任何具体的实施方案，其用于治疗癌症。
在进一步的方面，所述癌症是选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病。
在另一个方面中是式I的化合物或其任何具体的实施方案，其用于与另外的化合物组合来治疗癌症，所述另外的化合物选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼。
在进一步的方面，式I的化合物是(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺。
在一个进一步的方面，式I的化合物是(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺的可药用盐。
在进一步的方面，依次施用所述另外的化合物。
在进一步的方面，同时施用所述另外的化合物。
在进一步的方面，所述另外的化合物是尼洛替尼。
在进一步的方面，所述另外的化合物是伊马替尼。
在进一步的方面，所述另外的化合物是达沙替尼。
在进一步的方面，所述另外的化合物是波舒替尼。
在进一步的方面，所述另外的化合物是普纳替尼。
在进一步的方面，所述另外的化合物是巴非替尼。
在另一个方面，本发明涉及治疗ABL1/BCR-ABL1-介导的障碍的方法，其包括以下步骤:向有需要的患者施用治疗有效量的化疗剂以及与之组合的治疗有效量的式(I)的化合物。
药物组合物
另一方面，本发明提供了可药用的组合物，其包含与一种或多种可药用载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量一种或多种上述化合物。如下面详细描述的那样，本发明的药物组合物特别是可以被配制为以固体或液体形式进行施用的制剂，其包括适于下列施用途径的那些制剂：(1)口服施用，例如饮剂(drenches)(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂，例如，目标在于口含、舌下和全身吸收的那些片剂、大药丸、散剂、粒剂、应用于舌的糊剂；(2)胃肠外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射进行施用，作为例如无菌溶液或混悬液或缓释制剂形式；(3)局部应用，例如以应用于皮肤的霜剂、软膏剂、或控释贴剂或喷雾的形式进行施用；(4)阴道内或直肠内施用，例如以阴道栓、霜剂或泡沫剂的形式进行施用；(5)舌下施用；(6)眼部施用；(7)经皮施用；(8)鼻施用；(9)肺施用；或(10)鞘内施用。
本文所用的术语“治疗有效量”是指化合物、材料或含有本发明化合物的组合物的量，所述量以可用于任何医学治疗的合理益处/风险比，可以有效用于在动物的至少一种细胞亚群中产生某些需要的治疗作用。
本文所用的短语“可药用”指的是在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织进行接触而不会产生过量的毒性、刺激、变应性反应或其它问题或并发症(与合理益处/风险比相称的)的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所用的短语“可药用的载体”是指可药用的材料、组合物或介质，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)，或在将目标化合物从一个器官或机体的一部分携带或转运到另一个器官或机体的另一部分时所涉及的溶剂包封材料。各载体在与该制剂的其它成分在可相容的意义上必须是“可接受的”并且不会对患者产生损害。一些可作为可药用载体的材料的实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗的盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类；和(22)用于药物制剂的其它无毒的可相容的物质。
如上所述，本发明化合物的一些实施方案可以包含碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，因此，它们能够与可药用酸形成可药用盐。在这方面，术语“可药用盐”是指本发明化合物相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在施用介质或剂型制造过程中在原位进行制备，或者可以通过独立地将游离碱形式的本发明的纯化的化合物与适宜的有机酸或无机酸进行反应，并在随后的纯化中将由此形成的盐分离出来进行制备。典型的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘二甲酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡糖酸盐、乳糖酸盐和月桂磺酸盐等。(参见例如，Berge等(1977)"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.66:1-19)。
本发明化合物的可药用盐包括所述化合物的常规无毒的盐或季铵盐，例如，得自无毒有机酸或无机酸的盐。例如，此类常规无毒盐包括这些得自下列酸的盐：无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸(isothionic acid)等。
在另一些情况中，本发明的化合物可包含一个或多个酸性官能团，并且因此可以与可药用的碱形成可药用盐。在这些情况中，术语“可药用盐”指的是本发明化合物相对无毒的无机碱和有机碱加成盐。这些盐同样可以在施用介质中或者在剂型制备过程中在原位进行制备，或者可以通过独立地将游离酸形式的纯化的化合物与适宜的碱进行反应而制备，所述碱如可药用金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐、氨、可药用的有机伯、仲或叔胺。典型的碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的典型的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见，例如，Berge等，同上)
湿润剂、乳化剂和润滑剂(如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香味剂、防腐剂和抗氧剂也可存在于所述组合物中。
可药用的抗氧剂的实例包括：(1)水溶性抗氧剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的制剂包括那些适于经口、鼻、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外施用的制剂。所述制剂可以方便地以单位剂型提供，并可以通过制药领域熟知的任何方法制备。可与载体物质混合以制备单一剂型的活性成分的量将依据所治疗的宿主、具体的施用方式而变化。可与载体物质混合以制备单一剂型的活性成分的量一般是产生治疗效果的化合物的量。通常，以百分含量计，该量的范围在约0.1-99％的活性成分，优选在约5-70％，最优选在约10-30％。
在一些实施方案中，本发明的制剂包含选自下列的赋形剂：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂，例如胆汁酸，以及聚合物载体，例如聚酯和聚酐；以及本发明的化合物。在一些实施方案中，上述制剂能提供口服可生物利用的本发明化合物。
制备这些制剂或组合物的方法包括将本发明的化合物与载体以及任选一种或多种助剂相结合的步骤。一般而言，可通过将本发明的化合物与液体载体或细碎的固体载体或者与这两种均匀且紧密地混合，然后如果必要将产品成型，来制备所述制剂。
适于口服施用的本发明的制剂可以是各自包含预定量的作为活性成分的本发明化合物的下列形式：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味的基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者作为在水性或非水性液体中的溶液剂、混悬剂或固态分散体，或者作为水包油或油包水的液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆剂，或者作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为口腔洗剂等。还可以以大丸剂、药糖剂或糊剂施用本发明的化合物。
本发明的固体分散体制剂包含例如，本发明化合物的无定形分散体、赋形剂(共聚物、诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)VA64(VA64或Copovidone)等)。所述固体分散体可以使用低粘度羟丙基甲基纤维素(HPMCs)(诸如Pharmacoat 603、Methocel E3等)进一步增强。更多的制备本发明的固体分散体制剂的特定实例参见以下实施例41。
在本发明的一个实施方案中是药物组合物，其包含(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的无定形分散体和1至2种赋形剂；其中赋形剂选自HPMC AS、Pharmacoat603、Eudragit L100、PVP K30、PVP VA64和Eudragit EPO。
在一个进一步的实施方案中，赋形剂是PVP VA64和Pharmacoat 603。
在一个进一步的实施方案中，Pharmacoat 603的百分比范围为30％至45％，PVP VA64的百分比范围为30％至45％，且(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的百分比范围为20％至30％。
在一个进一步的实施方案中，Pharmacoat 603的百分比是37.5％，PVPVA64的百分比是37.5％且(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的百分比是25％。
在本发明的口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、散剂、颗粒剂、锭剂(trouches)等)中，可将所述活性成分与一种或多种可药用的载体混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或下列任意载体：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某种硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂如石蜡；(6)吸收加速剂，如季铵化合物和表面活性剂，如泊洛沙姆和十二烷基硫酸钠；(7)湿润剂，如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子型表面活性剂；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；和(11)控释剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂情况下，所述药用组合物还可包括缓冲剂。使用诸如乳糖(lactose)或乳的糖(milk sugars)以及高分子量的聚乙二醇等赋形剂，可将类似类型的固体组合物用作软和硬-壳明胶胶囊中的填充剂。
可通过任选与一种或多种助剂压缩或模压而制备片剂。压制片可用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片可通过在适合的机器中将用惰性液体稀释剂湿润的粉末化的化合物的混合物模压成型制备。
可任选将本发明的药用组合物的片剂和其它固体剂型(如锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂)压痕或者用包衣和外壳制备，如肠溶衣和制剂领域熟知的其它包衣。还可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素(以提供所要求释放特性)、其它聚合物基质、脂质体和/或微球体，对其进行配制以提供其中活性成分的缓慢或控制释放。可将它们配制成快速释放制剂，如冷冻干燥。可将它们通过以下方式灭菌，例如通过防菌过滤器过滤或者在无菌固体组合物形式中掺入灭菌剂，可将所述无菌固体组合物在临用前在无菌水或某些其它无菌注射介质中溶解。这些组合物还可任选含遮光剂，并可以是任选能以延迟方式，仅在或优选在消化道的某一部位释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡类。如果适合，所述活性成分还可以是带有一种或多种上述赋形剂的微囊形式。
用于口服施用的本发明化合物的液体剂型包括可药用的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂等。除所述活性成分外，所述液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，如水和其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(尤其是棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括辅助剂，如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性成分外，混悬剂可包含诸如下列助悬剂：乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、皂土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。
供直肠或阴道施用的本发明组合物的制剂可以是栓剂形式，其可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种适合的非刺激性赋形剂或载体混合制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，其在室温下为固体，但在体温下为液体，因此在直肠或阴道内熔化并释放出活性化合物。
适于阴道施用的本发明组合物的制剂还包括包含本领域已知的适合的载体的阴道栓剂、棉塞(tampons)、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
用于局部或经皮施用的本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可在无菌条件下，将活性化合物与可药用的载体以及防腐剂、缓冲剂或可能需要的抛射剂混合。
除本发明的活性化合物外，所述软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可包含赋形剂，如动植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合物。
散剂和喷雾剂除包含本发明化合物外，还可含有诸如以下赋形剂：乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或者这些物质的混合物。喷雾剂还可含有常规抛射剂，如氯氟烃和挥发性的未取代的烃，如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有能向身体提供受控传递本发明化合物的另外的优点。这些剂型可通过将所述化合物溶解或分散于适当介质中制备。还可使用吸收促进剂增加化合物通过皮肤的流量。这种流量的速率可通过提供速率控制膜或在聚合基质或凝胶中分散化合物来控制。
眼用制剂、眼用软膏剂、散剂、溶液剂等也意欲包括在本发明范围之内。
适于胃肠外施用的本发明药用组合物包括一种或多种本发明化合物以及与之组合的一种或多种可药用的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液，或者可在临用前才制成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末，其可包含糖、醇、抗氧剂、缓冲剂、灭菌剂、使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。
本发明药用组合物中可使用的适合的水性或非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油(如橄榄油)以及注射用有机酯(如油酸乙酯)。例如通过使用涂覆物质(如卵磷脂)、通过保持分散剂中所需要的粒径以及通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。
这些组合物还可含有诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂的辅助剂。预防微生物对本发明化合物的作用可通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂来保证，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可能需要在所述组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)，达到可注射药物形式的延迟吸收。
在某些情况下，为延长药物的作用，需要减慢皮下或肌内注射中药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定型物质的液体混悬液来实现。然后，该药物的吸收速率依据其溶出速率而定，而溶出速率依次可依据晶体尺寸和晶形而定。另外，通过将药物溶解或悬浮于油性介质中，可完成胃肠外施用的药物形式的延迟吸收。
储库形式注射剂可通过在生物可降解性聚合物(如聚乳酸-聚乙醇酸交酯)中形成本发明化合物的微囊基质来制备。依据药物和聚合物的比率以及所用的具体聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它生物可降解性聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。储库形式注射剂还可通过将所述药物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳中制备。
当将本发明化合物作为药物施用于人和动物时，可将它们以其原形或以药用组合物形式施用，所述药用组合物包含例如0.1-99％(更优选10-30％)的活性化合物以及与之组合的可药用的载体。
可将本发明制剂经口服、胃肠外、局部或直肠给予。当然，可将它们以适合于每种施用途径的形式给予。例如，可将它们以片剂或胶囊形式、以注射剂、吸入剂、洗眼剂、软膏剂、栓剂等施用，通过注射、输注或吸入施用；通过洗剂或软膏剂局部施用；以及通过栓剂直肠施用。优选口服施用。
本发明所用术语“胃肠外施用”和“经胃肠外施用”指并非肠内和局部施用的给药方式，通常经注射施用，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
本发明所用术语“全身施用”、“全身性施用”、“外周施用”和“外周性施用”指化合物、药物或其它物质的给药，其并非直接进入中枢神经系统，因此其进入患者体内，并因此经受代谢作用和其它类似过程，例如皮下施用。
可将这些化合物通过任何适合的施用途径施用于人和其它动物而用于治疗，所述途径包括口服、鼻内(如通过喷雾)、直肠、阴道内、胃肠外、脑池内和局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)，包括颊内和舌下施用。
不管所选择的施用的途径如何，都可通过本领域技术人员已知的常规方法，可将本发明化合物(可使用其适合的水合物形式)和/或本发明的药用组合物制备成可药用的剂型。
本发明药用组合物中活性成分的准确剂量水平可以变化，目的是为获得活性成分的量，该量可有效实现对于具体患者、所施用的组合物和施用方式而言的所需要的治疗响应，同时对患者不产生毒性。
所选择的剂量水平取决于多种因素，包括所用的本发明的具体化合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用次数、所用的具体化合物的排泄或代谢率、吸收的时间和范围、治疗的持续时间、与所用的具体化合物联合应用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病情、健康状况和之前用药史以及医药领域熟知的类似因素。
本领域具有普通技能的医生或兽医能很容易确定及开具所需的药用组合物的有效量的处方。例如，医生或兽医可能以低于达到理想治疗效果的水平的药用组合物中所用的本发明化合物的剂量开始，然后逐渐增加剂量直至达到理想的效果。
本发明化合物的适合的日剂量一般为所述化合物产生治疗效果的最低有效量。这种有效量一般取决于上述因素。当指明用于镇痛作用时，本发明化合物对于患者的口服、静脉内、脑室内和皮下施用的剂量范围在约每日每kg体重0.0001-100mg。
如果需要，可将所述活性化合物的有效日剂量以在每日适当的间隔内分2、3、4、5、6或更多个分次施用的亚剂量、任选以单位剂型施用。
体内PK参数可以用于估计人PK参数。应用本领域已知的多种预测人PK的方法，可以评估预测的人清除率。例如，(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)被评估为3mL/min/kg和分布容积被评估为1L/kg。因此实施例9的预计的人有效日剂量被评估为90至130mg/天。
虽然可将本发明化合物单独进行施用，但优选将化合物以药用制剂(组合物)的形式施用。
根据类似于其它药物制剂的方法，可将本发明化合物制成以用于人和兽药的任何便利的方式施用的药物制剂。
在另一方面，本发明提供可药用的组合物，其包括与一种或多种可药用的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的如上所述的一种或多种本发明化合物。如在下文中详细描述，本发明的药用组合物特别是可以被配制为以固体或液体形式施用的制剂，其包括适合下列施用途径的那些制剂：(1)口服施用，例如饮剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂、大丸剂、散剂、颗粒剂、应用于舌的糊剂；(2)胃肠外施用，例如通过皮下、肌内或静脉注射，例如无菌溶液或混悬液；(3)局部应用，例如用于皮肤、肺或粘膜的霜剂、软膏剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内施用，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；(5)舌下或颊内施用；(6)眼内施用；(7)经皮施用；或者(8)鼻施用。
术语“治疗”还意欲包括预防、治疗和治愈。
接受该治疗的患者可以是有需要的任何动物，包括灵长类动物，尤其是人，及其它哺乳动物，如马科动物(equine)、牛、猪和羊；以及一般的家禽和宠物。
近来，制药工业引入微乳化技术来改善某些亲脂性(水不溶性)药物的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo，S.K.等，Drug Developmentand IndustrialPharmacy，17(12)，1685-1713，1991)和REV 5901(Sheen，P.C等，J Pharm Sci 80(7)，712-714，1991)。除其他之外，微乳化作用通过优先直接吸收进入淋巴系统代替循环系统，从而绕过肝脏而提供了增强的生物利用度，并且预防在肝胆管内循环中对化合物的破坏。
虽然所有适合的两亲性载体均可使用，但目前优选的载体一般是那些具有公认为安全(GRAS)状态的载体，且其既能溶解本发明化合物，也能在后期当该溶液与复杂水相(如在人体胃肠道中发现的水相)接触时将化合物微乳化。通常满足这些需求的两亲性成分具有2-20的HLB(亲水对亲脂平衡)值，且其结构包含范围为C-6至C-20的直链脂族基团。实例为聚乙二醇化脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。
特别涉及商购可得的两亲性载体，包括Gelucire-系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol(所有均由GattefosseCorporation，SaintPriest，法国生产并提供)、PEG-单油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-单月桂酸酯和双月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(由许多美国及世界多家公司生产并提供)。
适于本发明使用的亲水性聚合物是那些易溶于水的、可与形成小囊泡的脂质共价连接的、并且能耐受体内环境而无毒性作用的聚合物(即为生理上相容的)。适合的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物以及聚乙烯醇。优选的聚合物是那些分子量在约100或120道尔顿至最高约5,000或10,000道尔顿，更优选约300道尔顿至约5,000道尔顿的聚合物。在一个特别优选的实施方案中，聚合物是具有分子量在约100-约5,000道尔顿，更优选分子量在约300-约5,000道尔顿的聚乙二醇。在一个特别优选的实施方案中，聚合物是750道尔顿的聚乙二醇(PEG(750))。聚合物还可以通过其中单体的数量定义；本发明的一个优选实施方案利用具有至少约三种单体的聚合物，如由三个单体组成的PEG聚合物(约150道尔顿)。
适用于本发明的其它亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基唑啉(polymethoxazoline)、聚乙基唑啉、聚羟丙基异丁烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生化的纤维素，如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
在一些实施方案中，本发明的制剂包含选自下列的生物可相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、丙烯酸酯和甲基丙酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交脂、聚硅氧烷、聚氨基己酸酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和羟乙酸的共聚物、聚酐、聚(原)酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯及其掺合物、混合物或共聚物。
环糊精类是环状寡糖类，由6、7或8个葡萄糖单元组成，分别通过希腊字母α、β或γ命名。具有少于6个葡萄糖单元的环糊精类未知是否存在。各葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接。由于糖单元的椅型构象，所有仲醇羟基(C-2、C-3的)位于环的一侧，而所有C-6的伯醇羟基位于另一侧。所以，外部的面是亲水的，使得环糊精类是水溶性的。相反地，环糊精类的内腔是疏水的，因为它们通过原子C-3和C-5的氢和醚样氧(ether-likeoxygens)连接。这些基质可以与各种相对疏水的化合物复合，所述化合物包括例如甾类化合物，诸如17-β-雌二醇(参见，例如，van Uden等Plant CellTiss.Org.Cult.38:1-3-113(1994))。所述复合通过范德华相互作用和氢键形成而发生。环糊精类化学的一般综述参见，Wenz,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:803-822(1994)。
环糊精衍生物的理化性质主要取决于取代的类型和程度。例如，它们在水中的溶解度范围从不溶(例如，三乙酰基-β-环糊精)至147％溶解(w/v)(G-2-β-环糊精)。此外，它们可溶于多种有机溶剂中。环糊精的性能使得其能够通过提高或降低各种制剂组分的溶解度来控制它们的溶解度。
已描述了众多环糊精类和制备它们的方法。例如，Parmeter(I)等(美国专利号3,453,259)和Gramera,等(美国专利号3,459,731)描述了电中性环糊精类。其他衍生物包括具有阳离子性质的环糊精类[Parmeter(II),美国专利号3,453,257]、不溶的交联环糊精类(Solms,美国专利号3,420,788)和具有阴离子性质的环糊精类[Parmeter(III),美国专利号3,426,011]。在具有阴离子性质的环糊精衍生物中，羧酸类、亚磷酸类、三价膦酸类、膦酸类、磷酸类、硫代膦酸类(thiophosphonic acids)、硫代亚磺酸类(thiosulphinicacids)和磺酸类被挂至母体环糊精[参见，Parmeter(III),上述的]。此外，Stella等已描述了硫代烷基醚环糊精衍生物(美国专利号5,134,127)。
脂质体由至少一个密封含水内腔的脂双层膜组成。脂质体可以以膜类型和大小为特征。小单层脂质体(SUVs)具有单一膜，直径典型为0.02～0.05μm；大单层脂质体(LUVS)通常比0.05μm寡层大脂质体大，多层脂质体具有多个通常同心的膜层，并且通常比0.1μm大。具有若干非同心膜的脂质体(即包含在大脂质体之内的若干较小脂质体)称为多泡状脂质体。
本发明的一个方面涉及包含脂质体的制剂，所述脂质体含有本发明化合物，其中将脂质体膜进行配制，以提供具有高负载力的脂质体。作为选择地或此外，本发明的化合物可包含在或吸附至脂质体的脂质体双层。本发明化合物可以用脂质表面活性剂聚集，并且携带于脂质体的内部空间内；在这些情况下，对脂质体膜进行配制，以阻止活性剂-表面活性剂聚集体的破坏作用。
根据本发明的一个实施方案中，脂质体的脂双层含有用聚乙二醇(PEG)衍生的脂质，以使PEG链从脂双层的内表面延伸入被脂质体包封的内部空间，并从脂双层的外部延伸入周围环境。
包含在本发明脂质体内的活性剂是溶解形式。可以将表面活性剂和活性剂的聚集体(例如含有感兴趣的活性剂的乳液或胶束)捕获在本发明的脂质体的内部空间之内。表面活性剂起分散和溶解活性剂的作用，可以选自任何合适的脂族、环脂族或芳族表面活性剂，包括但不限于不同链长(例如从大约C.sub.14至约C.sub.20)的生物相容性溶血磷脂酰胆碱(LPCs)。聚合物衍生的脂质例如PEG-脂质也可以用于胶束形成，因为它们起抑制胶束/膜融合的作用，并且因为向表面活性剂分子中加入聚合物降低了表面活性剂的CMC并帮助胶束形成。优选的是具有微摩尔范围的CMC的表面活性剂；可以使用较高CMC的表面活性剂，以制备胶束(捕获在本发明的脂质体内)，然而，胶束表面活性剂单体可以影响脂质体双层的稳定性，是设计具有所需稳定性的脂质体中的一个因素。
本发明的脂质体可以通过本领域已知的多种技术中的任何一种制备。参见例如，美国专利号4,235,871；公布的PCT申请WO96/14057；NewRRC，Liposomes：A practical approach，IRL Press，Oxford(1990)，第33-104页；Lasic DD，Liposomes from physics to applications，ElsevierScience Publishers BV，Amsterdam，1993。
例如，可以通过如下方式制备本发明的脂质体：将用亲水性聚合物衍生化的脂质扩散到预先形成的脂质体中，例如，在相当于衍生化脂质的最终摩尔百分数的脂质浓度(其在脂质体中是需要的)下，通过将预先形成的脂质体与由脂质接枝的聚合物组成的胶束接触。包含亲水性聚合物的脂质体还可以由本领域已知的均质化、脂质水合(lipid-field hydration)或挤压技术形成。
在本发明的一方面，在所选择的尺寸范围内，脂质体具有基本均匀的尺寸。一种有效的筛分方法涉及将脂质体的水混悬液挤压通过一系列聚碳酸酯膜(具有所选择的均匀孔径)；膜的孔径大致与挤压通过该膜所产生的脂质体的最大尺寸相当。参见例如，美国专利号4,737,323(1988年4月12日)。
本发明制剂的释放特性取决于包囊材料、被包囊的药物的浓度以及存在的释放改进剂。例如，可使释放处理为pH依赖性的，例如，使用仅在低pH(如在胃中)或高pH(如在肠中)释放的pH敏感包衣。可使用肠溶衣阻止出现释放，直至药物通过胃后。可使用包囊在不同材料中的氨基氰的多种包衣或混合物，以获得在胃中的初级释放，接着在肠中进行随后的释放。释放还可通过添加盐和孔隙形成剂进行处理，它们能通过从囊内扩散而增加水吸收或药物的释放。也可用能修饰药物溶解度的赋形剂控制释放速率。还可加入增强基质降解或从基质中释放的试剂。根据化合物不同，可将它们加入药物中、作为单独相态(即作为粒子)加入或者可将其共溶于聚合物相中。在所有情况下，加入量都应在0.1-30％(w/w聚合物)之间。降解增强剂的类型包括无机盐(如硫酸铵和氯化铵)、有机酸(如柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸)、无机碱(如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌)和有机碱(如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)以及表面活性剂(如和)。加入作为微粒的、向基质(即水溶性化合物，如无机盐和糖)中加入微结构的孔隙形成剂。该范围应在1-30％(w/w聚合物)之间。
还可通过改变粒子在消化道中的驻留时间影响吸收。这可例如通过将粒子用粘膜粘连性聚合物包被或者将粘膜粘连性聚合物选作包囊物质来实现。实例包括具有游离羧基的大多数聚合物(如壳聚糖)、纤维素、以及尤其是聚丙烯酸酯(此处所用的聚丙烯酸酯指包括丙烯酸酯基团和修饰的丙烯酸酯基团(如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)的聚合物)。
药物组合产品
本发明尤其涉及式(I)的化合物(或包含式(I)的化合物的药物组合物)在治疗本文提及的一种或多种疾病中的应用；其中对治疗的应答是有益的，如例如通过部分或完全消除疾病的一种或多种症状直至完全治愈或缓解所证实。
费城染色体阳性(Ph+)ALL占15-30％的成人ALL和至多5％的儿科ALL(Faderl S,Garcia-MAnero G,Thomas D等.PhiladelphiaChromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia-Current Conceptsand Future Perspectives.Rev Clin Exp Hematol 2002；6:142-160)。儿科Ph+ALL特征为年龄较大(中位数9-10岁对比约4岁，对所有ALL患者而言)和诊断时较高的WBC计数。在成人和儿童中，Ph+ALL特征为染色体9和22之间的相互易位(t(9；22)(q34；q11))，导致染色体22上的BCR基因与从染色体9易位的ABL基因序列的融合，这导致BCR-ABL1蛋白的表达。BCR-ABL1有两种主要的突变体，p190BCR-ABL1，在约85％的Ph+ALL患者中可检测到，和p210BCR-ABL1，CML特有，在约15％的Ph+ALL患者中可检测到(Dombret H,Galbert J,Boiron J等.Outcome ofTreatment in Adults with Philadelphia chromosome-posititve acutelymphoblastic leukemia-Results of the prospective multicenter LALA-94trial.Blood 2002；100:2357-2366；Faderl S,Garcia-MAnero G,Thomas D等.Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia-Current Concepts and Future Perspectives.Rev Clin Exp Hematol2002；6:142-160)。
ALL的治疗基于每个患者的风险等级，较高复发风险的患者的治疗强度增加；该策略使缓解速度最大化同时限制不必要的毒性。从引入组合化学治疗与症状发生前中枢神经系统白血病的治疗，至对复发风险高的患者的更新的、加强治疗方案，进展是逐渐增长的(C.H.Pui和W.E.Evans.Acute Lymphoblastic Leukemia New Engl J Med 1998；339:605-615；)。在开发伊马替尼之前，Ph+ALL患者用加强的化学疗法进行治疗，随后进行造血干细胞移植(HSCT)，理想地采用匹配的相关供体，因为，与用其他供体进行HSCT或单独进行化学治疗相比，已显示这样会导致改善的无事件生存。总之并且与大部分ALL儿科患者有明显的差异，Ph+ALL患者的预后很差，无事件生存(EFS)率低(Arico M,Valsecchi M G,Camitta B,Schrappe M,Chessells J,Baruchel A,Gaynon P,Silverman L,Janka-Schaub G,Kamps W等New Engl J Med 2000；342:998-1006)。
现有的治疗法(诸如 ICLUSIGTM等)与激酶结构域的ATP结合部位结合。相反地，本发明化合物为强效BCR-ABL1、ABL1和ABL2抑制剂，与激酶结构域上不同于ATP-结合部位的部位结合。
因此，具有新的、变构的作用机制的本发明化合物可以用作独立的治疗法，或者可以与选自和ICLUSIGTM的现存的治疗法依次或组合施用。
作为独立的治疗法，本发明化合物可以用于治疗BCR-ABL1,ABL1和ABL2相关疾病和障碍。BCR-ABL1可以是野生型或选自V299L、T315I、F317I/L、Y253F/H、E255K/V和F359C/V的突变体BCR-ABL1。本发明化合物可以用于治疗由于ATP-结合部位出现突变而对现有治疗法无应答的患者。作为组合治疗法，使用两种强效的、机制不同的BCR-ABL抑制剂的组合，本发明化合物为治疗Ph+白血病患者提供唯一的机会。在临床上组合途径可以为患者提供更深入的和更持久的肿瘤负荷的减少，而复发风险降低。
在本发明的另一个实施方案中是治疗具有选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病的温血动物的方法，其包括向所述动物施用治疗有效量的本发明化合物或其可药用盐。
在一个进一步的实施方案中，温血动物是人(患者)。
在一个进一步的实施方案中，本发明的化合物是(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)或其可药用盐。
在本发明的另一个实施方案中是治疗具有选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病的温血动物的方法，其包括向所述动物依次施用治疗有效量的本发明化合物或其可药用盐与治疗有效量的选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼的化合物。
在一个进一步的实施方案中，温血动物是人(患者)。
在一个进一步的实施方案中，本发明的化合物是(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)或其可药用盐。
在一个进一步的实施方案中，(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的剂量是90-130mg。
在一个进一步的实施方案中，尼洛替尼的剂量是10-50mg/kg，伊马替尼是50-200mg/kg，达沙替尼是5-20mg/kg或普纳替尼是2-10mg/kg。
在一个进一步的实施方案中，波舒替尼的剂量是500mg。
在本发明的另一个实施方案中是治疗具有选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病的温血动物的方法，其包括向所述动物同时施用治疗有效量的本发明化合物或其可药用盐与治疗有效量的选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼的化合物。
在一个进一步的实施方案中，温血动物是人(患者)。
在一个进一步的实施方案中，本发明的化合物是(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)或其可药用盐。
在一个进一步的实施方案中，(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的剂量是90-130mg。
在一个进一步的实施方案中，尼洛替尼的剂量是10-50mg/kg，伊马替尼是50-200mg/kg，达沙替尼是5-20mg/kg或普纳替尼是2-10mg/kg。
在一个进一步的实施方案中，波舒替尼的剂量是500mg。
在本发明的另一个实施方案中是治疗具有选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病的温血动物的方法，其包括向所述动物同时施用治疗有效量的(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)或其可药用盐与治疗有效量的尼洛替尼。
在本发明的另一个实施方案中是治疗具有选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病的温血动物的方法，其包括向所述动物同时施用治疗有效量的(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)或其可药用盐与治疗有效量的尼洛替尼。
式(I)的化合物还可以与其他抗肿瘤化合物组合使用。此类化合物包括但不限于核苷酸还原酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂；JAK抑制剂、诸如ruxolitinib；Smoothened抑制剂、诸如LDE225；干扰素；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性化合物；烷化化合物；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；mTOR抑制剂、诸如RAD001；抗肿瘤抗代谢物；铂化合物；靶向/降低蛋白或脂质激酶活性的化合物、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂；生物反应修饰剂；Ras致癌亚型抑制剂；端粒末端转移酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗恶性血液病的化合物、诸如氟达拉滨；靶向、降低或抑制PKC活性的化合物、诸如米哚妥林；HSP90抑制剂、诸如来自Conforma Therapeutics的17-AAG(17-烯丙基氨基格尔德霉素、NSC330507)、17-DMAG(17-二甲氨基乙氨基-17-脱甲氧基-格尔德霉素、NSC707545)、IPI-504、CNF1010、CNF2024、CNF1010，HSP990和AUY922；替莫唑胺驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂、诸如来自GlaxoSmithKline的SB715992或SB743921或来自CombinatoRx的喷他脒/氯丙嗪；PI3K抑制剂、诸如BEZ235、BKM120或BYL719；MEK抑制剂、诸如来自Array PioPharma的ARRY142886、来自AstraZeneca的AZD6244、来自Pfizer的PD181461、亚叶酸、EDG结合剂、抗白血病化合物、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂、抗增殖的抗体或其他化学治疗化合物。进一步地、作为选择地或此外，它们可与电离辐射组合使用。进一步地、作为选择地或此外，它们可与JAK抑制剂、诸如ruxolitinib组合使用。
进一步地、作为选择地或此外，它们可与Smoothened抑制剂、诸如LDE225组合使用。
进一步地、作为选择地或此外，它们可与干扰素组合使用。
术语“核苷酸还原酶抑制剂”是指嘧啶或嘌呤核苷类似物，其包括但不限于氟达拉滨和/或阿糖胞苷(ara-C)、6-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、6-巯嘌呤(尤其与阿糖胞苷组合治疗ALL)、氯法拉滨、奈拉滨(9-β-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤ara-G的前药)、喷托他丁、羟基脲或2-羟基-1H-异吲哚-1,3-二酮衍生物(Nandy等、Acta Oncologica 1994；33:953-961。
本文所用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不限于拓扑替康、吉马替康、伊立替康、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148(WO 99/17804中的化合物A1)。依立替康可以例如以其市售形式施用，例如商标为CAMPTOSAR。托泊替康例如可以例如以其市售形式施用，例如商标为HYCAMTIN。
本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于蒽环类，如阿霉素(包括脂质体制剂，如CAELYX)；柔红霉素、表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星；蒽醌类的米托蒽醌和洛索蒽醌；和鬼臼毒素类的依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以例如以其市售形式施用，例如商标为ETOPOPHOS。替尼泊苷可以例如以其市售形式施用，例如商标为VM26-BRISTOL。阿霉素可以例如以其市售形式施用，例如商标为ADRIBLASTIN或阿霉素。表柔比星可以以商标为FARMORUBICIN的市售形式施用。伊达比星可以例如以其市售形式施用，例如商标为ZAVEDOS。米托蒽醌可以例如以其市售形式施用，例如商标为NOVANTRON。
术语“微管活性化合物”涉及微管稳定化合物、微管去稳定化合物和微管蛋白聚合抑制剂，非限制性地包括紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛；长春花属生物碱，例如，长春碱，尤其是硫酸长春碱，长春新碱，尤其是硫酸长春新碱和长春瑞滨；淅皮海绵内酯类；秋水仙碱以及埃坡霉素类及其衍生物，例如，埃坡霉素B或D或其衍生物。紫杉醇可以例如以其市售形式施用，例如商标为TAXOL。多西他赛可以例如以其市售形式施用，例如商标为TAXOTERE。硫酸长春碱可以例如以其市售形式施用，例如商标为VINBLASTIN R.P。硫酸长春新碱可以例如以其市售形式施用，例如商标为FARMISTIN。淅皮海绵内酯例如可以如US专利5,010,099中所公开的那样获得。还包括在US专利WO 98/10121、6,194,181、WO 98/25929、WO 98/08849、WO 99/43653、WO 98/22461和WO 00/31247中公开的埃坡霉素衍生物。尤其优选的是埃坡霉素A和/或B。
本文所用的术语“烷化化合物”包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、亚硝基脲(BCNU或Gliadel)。环磷酰胺可以例如以其市售形式施用，例如商标为CYCLOSTIN。异环磷酰胺可以例如以其市售形式施用，例如商标为HOLOXAN。
术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”是指抑制组蛋白脱乙酰酶并具有抗增殖活性的化合物。其包括化合物诸如WO 02/22577中公开的LDH589、尤其是N-羟基-3-[4-[[(2-羟基乙基)[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其可药用盐。其还尤其包括辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。
术语“抗肿瘤抗代谢物”包括但不限于5-氟尿嘧啶或5-FU、卡培他滨、吉西他滨、DNA脱甲基化合物、诸如5-氮胞苷和地西他滨、甲氨蝶呤和依达曲沙和叶酸拮抗剂诸如培美曲塞。卡培他滨可以例如以市售形式施用，例如以商品名XELODA。吉西他滨可以例如以市售形式施用，例如以商品名GEMZAR。
本文所用的术语“铂化合物”包括但不限于卡铂、顺铂、Cisplatinum、奥沙利铂。卡铂可以例如以其市售形式施用，例如商标为CARBOPLAT。奥沙利铂可以例如以其市售形式施用，例如商标为ELOXATIN。
本文所用的术语“靶向/降低蛋白或脂质激酶活性的化合物”；或“蛋白或脂质磷酸酶活性”包括但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂质激酶抑制剂，例如：
a)靶向、降低或抑制ABL1家族成员、它们的基因融合产物(例如BCR-ABL1激酶)和突变体的活性的化合物、诸如靶向、降低或抑制ABL1家族成员和它们的基因融合产物活性的化合物，例如伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼、巴非替尼、PD180970、AG957、NSC 680410和PD173955；
b)靶向、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸-苏氨酸激酶的Raf家族的成员、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK1、PKB/Akt成员以及Ras/MAPK家族成员，和/或周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)成员的活性的化合物，且其尤其是在U.S 5,093,330中所公开的那些星孢素衍生物，例如米哚妥林；另外的化合物的实例包括，例如UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、苔藓抑素1、哌立福辛；伊莫福新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis 3521；LY333531/LY379196；异喹啉类化合物，如在WO 00/09495中公开的那些；FTI；BEZ235(P13K抑制剂)或AT7519(CDK抑制剂)；
术语“mTOR抑制剂”是指抑制哺乳动物的雷帕霉素靶点(mTOR)、且具有抗增殖活性的化合物，诸如西罗莫司依维莫司(CerticanTM)、CCI-779和ABT578。
如本文使用的术语“生物反应修饰剂”是指淋巴因子或干扰素、例如干扰素γ。
本文所用的术语“Ras致癌亚型抑制剂”，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，是指靶向、降低或抑制Ras的致癌活性的化合物，例如“法呢基转移酶抑制剂”，例如L-744832、DK8G557或R115777(Zarnestra)。
本文所用的术语“端粒末端转移酶抑制剂”涉及靶向、降低或抑制端粒末端转移酶活性的化合物。靶向、降低或抑制端粒末端转移酶活性的化合物尤其是抑制端粒末端转移酶受体的化合物，例如端粒抑素。
本文所用的术语“甲硫氨酸氨肽酶抑制剂”涉及靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物。靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物是例如比格麦德或其衍生物。
如本文使用的术语“蛋白酶体抑制剂”是指靶向、降低或抑制蛋白酶体的活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋白酶体的活性的化合物包括例如Bortezomid(VelcadeTM)和MLN 341。
本文所用的术语“HSP90抑制剂”包括但不限于靶向、降低或抑制HSP90的固有ATP酶活性的化合物；以及通过泛素蛋白体通路降解、靶向、降低或抑制HSP90客户蛋白的化合物。靶向、降低或抑制HSP90的固有ATP酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物、蛋白质或抗体，例如格尔德霉素衍生物17-烯丙基氨基,17-去甲氧基格尔德霉素(17AAG)；其他格尔德霉素相关化合物；根赤壳素和HDAC抑制剂。示例性的HSP90抑制剂为HSP990和AUY922。
对于急性髓样白血病(AML)的治疗，式(I)的化合物可以用于与标准白血病治疗法组合，尤其是与用于治疗AML的治疗法组合。特别地，式(I)的化合物可以与例如法尼基转移酶抑制剂和/或其他可用于治疗AML的药物、诸如柔红霉素、阿霉素、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊达比星、碳铂和PKC412组合施用。
靶向、降低或抑制组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性的化合物、诸如丁酸钠和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)抑制称为组蛋白脱乙酰酶的酶的活性。具体的HDAC抑制剂包括MS275、SAHA、FK228(旧称FR901228)、曲古抑菌素A和US 6,552,065中公开的化合物、特别是N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺或其可药用盐和N-羟基-3-[4-[(2-羟基乙基){2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺或其可药用盐、尤其是乳酸盐。
肿瘤细胞损伤方法是指诸如电离辐射的方法。在上下文中提及的术语“电离辐射”是指作为电磁射线(如X射线和γ射线)或粒子(如α和β粒子)而发生的电离辐射。在不限于放射疗法的方法中提供了电离辐射，这是本领域所知晓的。参见Hellman,放射疗法原理(Principles of RadiationTherapy),Cancer,Principles and Practice of Oncology,Devita等人编,第4版,第1卷,第248-275页(1993)。
本文所用的术语“S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂”包括但不限于在U.S5,461,076中所公开的化合物。
“其他化学治疗化合物”包括但不限于植物生物碱、激素化合物和拮抗剂；生物学响应调节剂、优选淋巴因子或干扰素类；反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物；shRNA或siRNA；或各种各样的化合物或者具有其它的或未知的作用机理的化合物。
由代号、通用名或商标名标识的活性化合物的结构可取自当前版的标准手册“The Merck Index”或数据库如Patents International(如IMSWorld Publications)。
本公开物中对参考文献的引用均不应理解为承认所引用的参考文献是将对本发明的专利性有负面影响的现有技术。
制备本发明化合物的方法
本发明还包括本发明化合物的制备方法。在描述的反应中，可能必须保护这些在最终产物中需要的反应性的功能基团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫基或羧基，以避免它们不希望地参与反应。可以根据标准实践使用常规保护基团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective GroupsinOrganic Chemistry”,John Wiley and Sons,1991。
在上下文给出温度之处，必须添加“约”，因为相对于给定的数值的较小偏差(例如±10％的变化)是容许的。所有反应可以在一种或多种稀释剂和/或溶剂的存在下进行。起始原料可以以等摩尔量使用；或者，一种化合物可以过量使用，用于例如充当溶剂或移动平衡或通常加速反应速率。如本领域已知、根据反应需要和与公知的方法一致，可适量加入反应助剂(例如酸、碱或催化剂)。
可以通过进行以下的反应流程I制备式(I)的化合物:
反应流程I:
其中Y、Y1、R1、R2、R3和R4如本发明概述中对式(I)所定义，且X1和X2表示卤素原子，X1可以选自氯、溴或碘，且X2可以选自氯或氟。
步骤a:式(4)的化合物可以通过将来自式(2)的化合物的酰基氯与式(3)的化合物在适合的溶剂(例如四氢呋喃等)和有机碱(例如二异丙基乙胺等)的存在下反应来制备。该反应在约0℃至约室温进行，并可以进行至多约2小时来完成。
式(2)的酰基氯化合物可以使用氯化剂(例如亚硫酰氯或草酰氯等)在催化剂(例如二甲基甲酰胺等)和适合的溶剂(例如甲苯等)的存在下来制备。该反应在约室温或加热至约85℃进行，且可以进行至多约2小时来完成。
步骤b:式(5)的化合物可以通过将式(4)的化合物与R2-H(其中R2如本发明的概述中所定义)在适合的溶剂(例如2-丙醇或二甲亚砜等)和适合的有机碱(例如二异丙基乙胺或三乙胺等)的存在下反应来制备。该反应在约90℃至约140℃进行，并可以进行约30分钟至约72小时来完成。
步骤c:式(6)的化合物可以通过在适合的溶剂(例如二甲氧基乙烷或二甲氧基乙烷和水的混合物等)、适合的无机碱(例如碳酸钠等)和钯催化剂(例如双(三苯基膦)二氯化钯(II)或1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷复合物或四(三苯基膦)钯(0)等)和任选的共溶剂(例如，乙醇等)的存在下将式(4)的化合物(X1优选为溴或碘)与R1-Z1反应来制备，其中R1如本文所定义，Z1优选为烃基硼酸或酯(铃木反应)。该反应在约80℃至约130℃进行，且可以进行约20分钟至约18小时来完成。
或者，步骤c可以通过将式(4)的化合物(X1优选为溴或碘)与R1-Z2反应进行，其中R1如本文所定义，Z2优选为三烷基锡烷基试剂(斯提勒反应)，其在适合的溶剂(例如二甲亚砜等)和钯催化剂(例如四(三苯基膦)钯(0)的存在下进行。该反应在约140℃进行，并可以进行至多约18小时来完成。
步骤d:式(I)的化合物可以通过将式(5)的化合物(X1优选为溴或碘)与R1-Z1在适合的溶剂(例如二甲氧基乙烷或二甲氧基乙烷和水的混合物等)、无机碱(例如碳酸钠等)和钯催化剂(例如双(三苯基膦)二氯化钯(II)或1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷复合物或四(三苯基膦)钯(0)等)和任选的共溶剂(例如，乙醇等)的存在下反应来制备，其中R1如本文所定义，Z1优选为烃基硼酸或酯(铃木反应)。该反应在约80-130℃进行，且可以进行至多约20分钟至2小时来完成。
步骤e:式(I)的化合物可以通过将式(6)的化合物与R2-H在适合的溶剂(例如2-丙醇或二甲亚砜等)、有机碱(例如二异丙基乙胺或三乙胺等)的存在下反应来制备，其中R2如本文所定义。该反应在约90-140℃进行，且可以进行至多约30分钟至72小时来完成。
式(I)的化合物可以通过如以下反应流程II中的方法来制备:
反应流程II:
其中Y、Y1、R1、R2、R3和R4如本发明概述中对式(I)所定义，且X1和X2表示卤素原子，X1特别是氯、溴或碘，X2特别是氯或氟，且Alk是低级烷基链、特别是甲基。
步骤f:式(8)的化合物可以通过类似于步骤b将式(7)的化合物与R2-H反应来制备，其中R2如本文所定义，
步骤g:式(9)的化合物可以通过类似于步骤d将式(8)的化合物(X1优选为溴或碘)与R1-Z1反应来制备，其中R1如本文所定义，Z1优选为烃基硼酸或酯(铃木反应)。
步骤h:式(10)的化合物可以通过在适合的溶剂(例如水等)、无机碱(例如氢氧化钠等)的存在下水解式(9)的酯化合物来制备。该反应在室温进行，且可以进行至多约2小时来完成。
步骤i:式(I)的化合物可以通过将式(10)的化合物与式(3)的化合物在偶联试剂(诸如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基苯并三唑等)、适合的碱(诸如N-甲基吗啉、二异丙基乙胺等)和适合的溶剂(诸如二氯甲烷、二甲基甲酰胺等)的存在下反应来制备。该反应在室温进行，且可以进行至多约12小时来完成。
式(I)的化合物可以如以下的反应流程III中的方法制备:
反应流程III:
其中Y、Y1、R1、R2、R3和R4如本发明概述中对式(I)所定义，且X1和X2表示卤素原子，X1特别是氯、溴或碘，X2特别是氯或氟，Prot表示保护基团，当R1是具有游离NH的吡唑时Prot特别是四氢-2H-吡喃-2-基(THP)或2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基(SEM)。
步骤l:式(12)的化合物可以通过类似于步骤c将式(4)的化合物与Prot-R1-Z1反应来制备，其中R1如本文所定义，Z1优选为烃基硼酸或酯(铃木反应)，Prot特别是THP或SEM。
步骤m:式(13)的化合物可以通过类似于步骤e将式(12)的化合物与R2-H反应来制备，其中R2如本文所定义。
步骤n:式(13)的化合物可以通过类似于步骤d将式(5)的化合物与Prot-R1-Z1反应来制备，其中R1如本文所定义，Z1优选为烃基硼酸或酯(铃木反应)，Prot特别是THP或SEM。
步骤o:式(I)的化合物可以通过将式(13)的化合物与脱保护剂(例如四正丁基氟化铵或三氟乙酸或盐酸等)在适合的溶剂(例如四氢呋喃或二氯甲烷等)的存在下反应来制备。该反应在室温或室温至约80℃进行，且可以进行至多约2至24小时来完成。
式(I)的化合物，其中R1是被R6基团取代的吡唑，可以如以下的反应流程IV中的方法来制备:
反应流程IV:
其中Y、Y1、R2、R3、R4和R6如本发明概述中对式(I)所定义，且X1表示卤素原子、特别是溴或碘，且R6是低级烷基、特别是甲基。
步骤p:式(14)的化合物可以通过将式(5)的化合物与烷基乙烯基酮(例如甲基乙烯基酮等)在适合的溶剂(例如二甲基甲酰胺等)、有机碱(例如三乙胺等)和钯催化剂(例如三-邻甲苯基膦-二醋酸钯等)的存在下反应来制备。该反应在约130℃进行，且可以进行至多16小时来完成。
步骤q:式(Id)的化合物可以通过将式(14)的化合物与被保护的酰肼(例如甲苯-4-磺酸酰肼等)在适合的溶剂(例如乙醇等)的存在下反应来制备，该反应在约80℃进行，可以进行至多2小时来完成。然后用醇盐(例如甲氧基钠等)将保护基团原位除去。脱保护在约80℃进行，且可以进行至多48小时来完成。
式(I)的化合物可以如以下的反应流程V中的方法制备:
反应流程V:
其中Y、Y1、R1、R2、R3和R4如本发明概述中对式(I)所定义，X1和X2表示卤素原子，X1特别是氯、溴或碘，X2特别是氯或氟，且Alk是低级烷基链、特别是甲基，Prot表示保护基团，特别是当R1是无游离NH的吡唑时Prot是四氢-2H-吡喃-2-基(THP)。
步骤r:式(15)的化合物可以通过类似于步骤d将式(8)的化合物(X1优选为溴或碘)与Prot-R1-Z1反应来制备，其中R1如本文所定义，当R1是无游离NH的吡唑时Prot特别是四氢-2H-吡喃-2-基(THP)，Z1优选为烃基硼酸或酯(铃木反应)。
步骤s:式(16)的化合物可以通过在适合的溶剂(例如水和甲醇等)、无机碱(例如氢氧化钠等)的存在下水解式(15)的酯化合物来制备。该反应在室温进行，且可以进行至多约14小时来完成。
步骤t:式(17)的化合物可以通过在偶联试剂(诸如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基苯并三唑等)、适合的碱(诸如N-甲基吗啉等)和适合的溶剂(诸如四氢呋喃等)的存在下将式(16)的化合物与式(3)的化合物反应来制备。该反应在约25°-65℃进行，且可以进行至多约2天来完成。
步骤u:式(I)的化合物可以通过在适合的溶剂(例如四氢呋喃和甲醇等)的存在下将式(17)的化合物与脱保护剂(例如盐酸等)反应来制备。该反应在室温进行约2小时来完成。
式(I)的化合物合成的详细实例可以见以下实施例。
制备本发明化合物的另外的方法
本发明的化合物可以作为可药用酸加成盐通过将化合物的游离碱与可药用的无机或有机酸反应来制备。或者，本发明化合物的可药用碱加成盐可以通过将化合物的游离酸与可药用的无机或有机碱反应来制备。
式(I)的化合物还可以通过附加适当的官能团来修饰，从而提高生物学选择性。此类修饰在本领域中是已知的，包括那些能够增加进入给定生物学系统(例如血液、淋巴系统、中枢神经系统、睾丸)的通透性的修饰，增加生物利用度的修饰，增加溶解度以有助于胃肠外给药(例如注射、输液)的修饰，改变代谢和/或改变分泌速率的修饰。此类修饰的实例包括但不限于酯化(例如采用聚乙二醇的酯化)、采用新戊酰基氧基或脂肪酸取代基的衍生化、转化为氨基甲酸酯、芳族环的羟基化和在芳族环中进行杂原子取代。每当提及式(I)的化合物和/或其N-氧化物、互变异构体和/或(优选可药用)盐时，其包括此类修饰的结构式，但优选指式(I)的分子、它们的N-氧化物、它们的互变异构体和/或它们的盐。
或者，本发明化合物的盐形式可以使用起始材料或中间体的盐来制备。由于游离形式的新的式(I)的化合物与其盐形式的化合物(包括可用作中间体的那些盐，例如用于新化合物的纯化或其鉴别)之间的紧密联系，上下文中任何对式(I)的化合物的任何提及均应理解为是指游离形式的化合物和/或也指一种或多种其盐(如果适当和便利的话)以及一种或多种溶剂化物、例如水合物。
盐可以由具有碱性氮原子的式(I)的化合物优选与有机或无机酸形成，例如形成酸加成盐，尤其是可药用盐。适宜的无机酸例如氢卤酸如盐酸、硫酸或磷酸。适宜的有机酸例如羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、丙二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷甲酸、金刚烷甲酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、酞酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、2-萘磺酸、1,5-萘-二磺酸、2-或3-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-氨基磺酸、N-乙基-氨基磺酸或N-丙基-氨基磺酸，或其它有机质子酸，如抗坏血酸。盐通常可以转化为游离化合物，例如通过用适合的碱性化合物处理，例如用碱金属碳酸盐类、碱金属碳酸氢盐类或碱金属氢氧化物、通常为碳酸钾或氢氧化钠。
为了分离或纯化目的，也有可能使用不可药用的盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗应用，只能使用可药用盐或游离化合物(适用时以药物制剂的形式)，因此，它们是优选的。
本发明化合物的游离酸或游离碱形式可以分别从相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备。例如酸加成盐形式的本发明化合物可以通过用适合的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理被转化为相应的游离碱。碱加成盐形式的本发明化合物可以通过用适合的酸(例如，盐酸等)处理被转化为相应的游离酸。
未氧化形式的本发明化合物可以从本发明化合物的N-氧化物通过在适合的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二烷水溶液等)中、在0至80℃用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化物等)处理制备。
本发明化合物的前药衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(例如，进一步的细节参见Saulnier MG,Langley DR,Kadow JF,Senter PD,Knipe JO,Tun MM,Vyas DM和Doyle TW(1994)Synthesis ofetoposide phosphate,BMY-40481:a watersoluble clinically active prodrugof etoposide.Bioorg Med Chem Lett 4:2567-2572；和Rautio J,Kumpulainen H,Heimbach T,Oliyai R,Oh D,T和Savolainen J(2008)；Prodrugs:design and clinical applications.Nat Rev Drug Discov.7:255-70)。例如，本发明的化合物可以形成羟基的磷酸酯。更具体地，本发明化合物可以形成如下所示的前药:
此外，本发明化合物可以是本发明的另一种化合物的前药。例如，实施例36是实施例37的前药，且实施例37是实施例36的潜在的代谢产物。
本发明化合物的受保护的衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方式制备。如果本文描述的原料或者任何其它前体中一个或多个其它官能团例如羧基、羟基、氨基、巯基等被保护或者需要被保护，因为它们不应当参与反应或者干扰反应，则这些是诸如在肽化合物以及头孢菌素和青霉素以及核酸衍生物和糖的合成中通常使用的基团。保护基是例如一旦除去就不存在于最终化合物中的基团，而留下作为取代基的基团在本文应用的范围内不是保护基，它们是在原料或中间体阶段加入然后除去以获得最终化合物的基团。在将式(I)的化合物转化为不同的式(I)的化合物的情况中，如果可用并且需要，可以引入并且除去保护基。保护基可以已经存在于前体中并且应当保护有关官能团免于不希望的二级反应，例如酰基化、醚化、酯化、氧化、溶剂解和类似的反应。保护基的特征在于它们可以易于除去(即没有不需要的二级反应发生)，典型地通过乙酰解、质子分解、溶剂解、还原、光解或者还通过酶活性例如在类似于生理学条件下除去，并且它们不存在于终产物中。技术人员已知或可以容易地确定哪些保护基适合上下文提及的反应。
通过此类保护基的官能团的保护、保护基本身以及它们的除去反应例如在标准参考文献中描述，诸如J.F.W.McOmie,"Protective Groups inOrganic Chemistry",Plenum Press,伦敦和纽约1973,T.W.Greene,"Protective Groups in Organic Synthesis",第三版,Wiley,纽约1999,"The Peptides"；第3卷(编者:E.Gross和J.Meienhofer),Academic Press,伦敦和纽约1981,"Methoden der organischen Chemie"(有机化学方法),Houben Weyl,第四版,第15/I卷,Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974,H.-D.Jakubke和H.Jescheit,"Peptide,Proteine"(氨基酸、肽、蛋白质),Verlag Chemie,Weinheim,Deerfield Beach，和Basel 1982，以及Jochen Lehmann,"Chemie der Kohlenhydrate:Monosaccharide undDerivate"(碳水化合物化学：单糖及其衍生物),Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974。
本发明化合物可以在本发明的操作期间作为溶剂化物(例如，水合物)方便地制备或形成。本发明化合物的水合物可以方便地通过从含水溶剂/有机溶剂的混合液(使用有机溶剂、诸如二氧芑、四氢呋喃或甲醇)中重结晶来制备。
本发明化合物可以如下作为它们的单独立体异构体制备：将化合物的外消旋混合物与旋光的拆分剂反应，形成一对非对映异构的化合物，将该非对映异构体分离，并回收旋光纯的对映体。虽然对映体的拆分可以使用本发明化合物的共价连接的非对映异构衍生物进行，但优选易解离的复合物(例如，结晶的非对映异构的盐)。非对映异构体具有不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)，且利用这些不同可以容易地分离。非对映异构混合物例如通过分级结晶、色谱法、溶剂分配和相似的方法可分离为它们的单独的非对映异构体。该分离可在起始化合物水平或在式(I)的化合物自身水平进行。对映体可通过形成非对映异构体盐分离，例如通过与对映体-纯的手性酸形成盐，或通过色谱法、例如HPLC(使用具有手性配体的色谱底物)。然后通过任何不会导致外消旋化的实践方法回收旋光纯的对映体以及连同拆分剂。可应用于将化合物的立体异构体从它们的外消旋混合物中拆分的技术的更详细的描述可以见Jean Jacques,AndreCollet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,JohnWiley and Sons,Inc.,1981。
总之，式(I)的化合物可以通过包括以下步骤的方法制备:
(a)反应流程I-V中的那些步骤；和
(b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；
(c)任选地将本发明化合物的盐形式转化为非盐形式；
(d)任选地将本发明化合物的未氧化形式转化为可药用N-氧化物；
(e)任选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化为其未氧化形式；
(f)任选地从异构体的混合物中拆分本发明化合物的单独的异构体；
(g)任选地将本发明的非衍生化的化合物转化为可药用的前药衍生物；且
(h)任选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其非衍生化形式。
在没有特别描述原料的制备的情况下，该化合物是已知的，或者可以类似于本领域已知的方法制备，或者如下文实施例中公开的方法制备。
本领域技术人员将会理解上述转化仅仅是本发明化合物的代表性的制备方法，其他公知的方法可被类似地使用。
实施例
以下实施例阐述本发明而不限制其范围。在提供的实施例中，温度以摄氏度给出。除非另外指出，否者反应在室温发生。此外，如果没有另外指出，则分析型HPLC条件如下:
条件1:UPLC-MS,柱：Acquity BEH C18,1.7μm,2.1x 50mm,恒温器在40℃,洗脱液:A＝水+0.1％甲酸和B＝MeCN+0.1％甲酸,梯度20％至100％B，4.3min,流速0.7mL/min,检测：UV/V(DAD),ESI(+/-)。
条件2:LC-MS,柱：Express C182.7μm 2.1x 30mm,50℃,洗脱液:A＝水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵和B＝MeCN+0.04％甲酸,梯度5％至95％B，3.7min,流速1.2mL/min至1.4mL/min，3.7min,检测：UV/V(DAD),ESI(+/-)。
条件3:UPLC-MS,柱：Acquity HSS T3,1.8μm,2.1x 50mm,恒温器在50℃,洗脱液:A＝水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵和B＝MeCN+0.04％甲酸,梯度2％至98％B，1.40min,然后98％B，0.75min,流速1.2mL/min,检测：UV/V(DAD),ESI(+/-)。
条件4:HPLC,柱：Performance,RP-18e,100x 4.6mm+预柱5x 4.6mm，在室温，洗脱液:A＝水+0.1％甲酸和B＝MeCN+0.1％甲酸,梯度2％至100％B进行8min,然后100％B进行2min,流速2.0mL/min,检测：UV/V(DAD)。
条件5:HPLC,柱：CC125/4100-3C18HD,4.0x 125mm,洗脱液:A＝水+0.1％TFA和B＝MeCN+0.1％TFA,梯度2％至100％B进行7min,然后100％B进行2min，最终100％至2％B进行1min,流速1.0mL/min,检测UV 215nm。
条件6:与条件3类似的条件，恒温器在60℃而不是50℃。
条件7:HPLC,柱：Eclipse XDB C18,5μm,4.6x 150mm,恒温器在25℃,洗脱液:A＝水+0.1％H3PO4和B＝MeCN,梯度10％至95％B，17min,流速1.0mL/min,检测：UV/V(DAD)210nm。
条件8:LC-MS,柱：120SB-C18,3.0x 50mm,2.7μm,洗脱液:A＝水+0.1％TFA和B＝MeCN+0.1％TFA,梯度5％B进行0.5min,5％至95％B进行6.5min,95％B进行3min,95％至5％B进行0.1min,5％B进行2min,流速0.8mL/min,UV/V是(DAD),ESI(+)。
此外，如果没有另外指出，制备型HPLC条件如下:
条件9:制备型HPLC,柱:XBridge C1830x 100mm,5μm；流速30mL/min；流动相:A＝水+0.1％甲酸；B＝MeCN；可变梯度，初始％B至最终％B，且具体运行时间见实施例。
条件10:制备型HPLC Gilson系统,柱：SunFireTMprep C18 OBD,5μm 30x 100mm,洗脱液:A＝水+0.1％TFA和B＝MeCN,梯度5％B进行2min,然后5％至100％B进行20min，最终100％B进行3min,流速30mL/min,检测UV/VIS。
使用以下系统进行制备型非手性SFC:Waters SFC THAR100；流速100mL/min；流动相:A＝超临界CO2；B＝MeOH；可变梯度，初始％B至最终％B，具体运行时间和柱见实施例。柱的细节:
DEAP柱:二乙基氨基柱(250x 30mm,5μm,)，普林斯顿(Princeton)
Diol柱:二醇基柱(250x 30mm,5μm,)，普林斯顿
1H-NMR谱如所示在300MHz或400MHz NMR波谱仪记录。将显著的峰以峰裂数(s,单峰；d,双重峰；t,三重峰；q,四重峰；m,多重峰；br.s,宽单峰)和质子数的顺序进行列表。
在以下实施例中，使用以下给出的缩写:aq.(含水)；DAD(二极管阵列检测器)；DCM(二氯甲烷)；DIPEA(二异丙基-乙胺)；DMF(N,N-二甲基甲酰胺)；DME(二甲氧基乙烷)；DMSO(二甲亚砜)；dppf(1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁)；eq.(当量)；ESI(电喷射离子化)；EtOAc(乙酸乙酯)；EtOH(乙醇)；Et2O(乙醚)；h(小时)；HPLC(高效液相色谱法)；HV(高真空)；iPrOH(异丙醇)；iPr2O(二异丙醚)；LC(液相色谱法)；M(摩尔浓度)；MeCN(乙腈)；MeOH(甲醇)；MeTHF(2-甲基四氢呋喃)；min(分钟)；mL(毫升)；MP(大孔)；MPLC(中压液相色谱法)；MS(质谱法)；MW(微波)；n-BuLi(正丁基锂)；NMM(N-甲基吗啉)；NMP(N-甲基吡咯烷酮)；NMR(核磁共振)；PL(聚苯乙烯)；PPh3(三苯基膦)；PTFE(聚四氟乙烯)；RM(反应混合物)；RT(室温)；sat.(饱和的)；sec(秒)；SFC(超临界流体色谱法)；Si-Thiol(3-巯基丙基改性硅胶)；SPE(固相萃取)；TBAF(四正丁基氯化铵)；TBME(甲基叔丁基醚)；TFA(三氟乙酸)；THF(四氢呋喃)；tR(保留时间)；UPLC(超高效液相色谱法)和UV(紫外)。
实施例1
(R)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-3-(1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基) 苯甲酰胺
将(R)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)苯甲酰胺(阶段1.1,149mg，0.2mmol)加入MW瓶中，将其密封，并用氩气冲洗。然后加入1M TBAF在THF(2.98mL，2.98mmol)中的溶液，并将RM在80℃搅拌3天。将RM用EtOAc(40mL)稀释，用饱和的NaHCO3和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉。将粗制的产物经制备型SFC纯化(DEAP柱，25％至30％，6min)，得到标题化合物，为白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝0.98min,m/z＝433.3[M+H]+,m/z＝431.3[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.75(br.s,1H)1.86(br.s,1H)2.70-2.79(m,1H)3.03-3.19(m,2H)3.19-3.28(m,1H)4.20(br.s,1H)4.73-4.92(m,1H)6.34(d,J＝11.00Hz,1H)6.73-6.94(m,1H)7.32(d,J＝8.80Hz,2H)7.65(d,J＝104.42Hz,1H)7.81-7.96(m,4H)10.10(s,1H)12.88(d,J＝81.67Hz,1H)。
阶段1.1:(R)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)苯甲酰胺
将(R)-3-溴-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)苯甲酰胺(阶段1.2,100mg，0.225mmol)、5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(146mg，0.45mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(17.34mg，0.025mmol)和Na2CO3(119mg，1.123mmol)在水(272μL)、DME(953μL)和EtOH(136μL)的混合液中的混悬液在125℃进行MW辐照20min。将RM用THF(3mL)稀释，用Si-Thiol(Silicycle，1.44mmol/g，94mg，0.135mmol)处理，过滤，并将滤液减压蒸发掉，得到残余物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，4g，环己烷/EtOAc，40％至100％EtOAc)，得到标题化合物，为黄色油状物。UPLC-MS(条件1)tR＝3.28min,m/z＝563.2[M+H]+,m/z＝561.2[M-H]-。
阶段1.2:(R)-3-溴-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)苯甲酰胺
将3-溴-4-氟-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)苯甲酰胺(阶段1.3,100mg，0.264mmol)、(R)-吡咯烷-3-醇(46.1mg，0.529mmol)和TEA(147μL，1.058mmol)在DMSO(199μL)中的混合液在90℃搅拌16h。将RM用TBME/EtOAc(1:1)(30mL)稀释，用0.5M HCl(3x 5mL)和盐水(5mL)洗涤，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，4g，环己烷/EtOAc-EtOH+0.1％NH4OH(8:2)，30％至80％EtOAc-EtOH+0.1％NH4OH(8:2))，得到标题化合物，为类白色固体。UPLC-MS(条件1)tR＝2.83min,m/z＝444.9/446.9[M+H]+,m/z＝443.0/445.0[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.80-1.92(m,1H)1.92-2.04(m,1H)3.24-3.30(m,1H)。3.36-3.46(m,1H)3.60-3.72(m,1H)3.81(dd,J＝10.51,4.65Hz,1H)4.36(d,J＝2.69Hz,1H)4.97(d,J＝3.42Hz,1H)6.93(d,J＝8.80Hz,1H)7.34(d,J＝8.56Hz,2H)7.80-7.90(m,3H)8.14(d,J＝1.96Hz,1H)10.19(s,1H)。
阶段1.3:3-溴-4-氟-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)苯甲酰胺
将SOCl2(2.92mL，40.0mmol)和DMF(0.5mL)滴加至3-溴-4-氟苯甲酸(1.752g，8mmol)在甲苯(20mL)中的混悬液中，并将RM在80℃搅拌1h，将溶剂减压蒸发掉，并将残余物用THF(15mL)稀释。加入DIPEA(2.79mL，16.00mmol)，并将该混合液冷却至0℃，用4-三氟甲氧基苯胺(1.181mL，8.80mmol)在THF(5mL)中的溶液处理，并搅拌1h。将RM处理用1M HCl水溶液(50mL)，并用TBME萃取。将合并的萃取物用1MHCl水溶液、1M NaOH水溶液和盐水洗涤，经MgSO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其从中正庚烷/DCM重结晶，得到标题化合物，为白色固体。UPLC-MS(条件1)tR＝3.18min,m/z＝377.9/379.9[M+H]+,m/z＝375.9/377.9[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.38(d,J＝8.6Hz,2H)7.56(t,J＝8.7Hz,1H)7.87(d,J＝9.0Hz,2H)8.00-8.06(m,1H)8.32(dd,J＝6.6,2.2Hz,1H)10.50(s,1H)。
实施例2
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-3-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基) 烟酰胺
将DME(570μL)、水(163μL)和EtOH(81μL)中的混合液加入(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.2、60mg，0.134mmol)、(1H-吡唑-3-基)硼酸(45.1mg，0.403mmol)Pd(PPh3)2Cl2(9.44mg，0.013mmol)、Na2CO3(42.8mg，0.403mmol)在MW瓶中的混合液中。将小瓶密封，抽真空/用氩气净化3次，并将RM在120℃进行MW辐照10min。加入另外的(1H-吡唑-3-基)硼酸(45.1mg，0.403mmol)，并将RM在120℃进行MW辐照30min，用THF(1mL)稀释，并用Si-Thiol(Silicycle 1.27mmol/g，52.9mg，0.067mmol)处理，过滤，并将滤液减压蒸发掉，得到残余物，将其经制备型HPLC纯化(条件9，15％达0.2min，然后15％至45％达14min)，得到标题化合物，为白色固体。
或者，通过在室温将6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.1,68.3g，132mmol)在DCM(1L)中的混悬液用TFA(305mL，3959mmol)处理达5.5h来制备实施例2。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于EtOAc(2L)中，用饱和的NaHCO3溶液(3x 500mL)和盐水(2x 500mL)洗涤，并经Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物混悬于DCM(300mL)中，并在室温搅拌15min。将结晶物质过滤，用DCM(200mL)洗涤，减压干燥，溶于MeOH(500mL)中，并在30℃用Si-Thiol(Biotage,10.0g，13mmol)处理达15h。将该混合液过滤，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶，2kg，DCM/MeOH 95:5)，并从MeCN中结晶，得到标题化合物，为白色结晶固体。
实施例2的分析数据:HPLC(条件5)tR＝5.37min,手性HPLC(AD-H,250x 4.6mm,洗脱液:EtOH/MeCN(98:2),0.5mL/min,UV 210nm)tR＝9.62min,UPLC-MS(条件1)tR＝1.79min,m/z＝434.1/435.1[M+H]+,m/z＝432.1/433.1[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.65-1.76(m,1H)1.76-1.87(m,1H)2.97(d,J＝11.37Hz,1H)3.19-3.29(m,2H)3.34-3.48(m,1H)4.10-4.23(m,1H)4.89(br.s,1H)6.40(s,1H)7.33(d,J＝8.70Hz,2H)7.58/7.82(br.s,1H)7.89(d,J＝8.70Hz,2H)8.06(s,1H)8.77(s,1H)10.21(s,1H)12.88/13.07(br.s,1H)。
阶段2.1:6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(59.9g，214.4mmol),K3PO4(105.7g，498.1mmol)和Pd(PPh3)4(9.6g，8.30mmol)加入(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.2，74g，165.8mmol)在甲苯(740mL)中的混悬液中，并在110℃在氩气下搅拌2.5h。然后将该混合液用EtOAc(2L)稀释，用水(2x 1L)洗涤，并经Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸发掉，并将粗制的残余物经快速色谱纯化(硅胶，2kg，DCM/MeOH 95:5)。将得到的物质溶于MeOH(500mL)和THF(800mL)的混合液中，并在室温用Si-Thiol(Biotage,15g，19.5mmol)处理达17h。将该混合液过滤，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其从MeOH中重结晶，得到标题化合物，为白色结晶固体。HPLC(条件5)tR＝5.99min,UPLC-MS(条件6)m/z＝518.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.42(br.s,3H)1.63-1.98(m,4H)2.20-2.37(m,1H)2.71-2.94(m,1H)3.21(d,J＝6.65Hz,3H)3.32-3.51(m,1H)3.69-3.92(m,1H)4.08-4.24(m,1H)4.75-4.88(m,1H)4.89-5.17(m,1H)6.29-6.49(m,1H)7.32(d,J＝8.99Hz,2H)7.59(s,1H)7.78-8.10(m,3H)8.80(t,J＝2.54Hz,1H)10.05-10.28(m,1H)。
阶段2.2:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将(R)-吡咯烷-3-醇(17.1ml，211.2mmol)和DIPEA(67.6ml，387.6mmol)加入5-溴-6-氯-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.3,69.6g，175.9mmol)在iPrOH(120mL)中的混悬液中，并在140℃搅拌1h。将该混合液用EtOAc(1L)稀释，用1N HCl(2x 200mL)、饱和的NaHCO3溶液(200mL)和盐水(2x 200mL)洗涤，并经Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸发掉，并将产物从EtOAc/iPr2O中重结晶，得到标题化合物，为白色结晶固体。HPLC(条件5)tR＝6.58min,UPLC-MS(条件6)m/z＝446.0/448.0[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.78-2.01(m,2H)3.55(d,J＝11.34Hz,1H)3.64-3.76(m,1H)3.79-3.91(m,2H)4.33(br.s,1H)4.97(d,J＝3.13Hz,1H)7.33(d,J＝9.38Hz,2H)7.83(d,J＝8.99Hz,2H)8.30-8.36(m,1H)8.66(d,J＝2.35Hz,1H)10.20(s,1H)。
阶段2.3:5-溴-6-氯-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
在室温滴加SOCl2(347mL，4.758mol)处理5-溴-6-氯-烟酸(375g，1.586mol)和DMF(37mL)在甲苯(3.1L)中的搅拌的溶液，然后在85℃搅拌2.5h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于THF(3.1L)中，冷却至-25℃，首先用DIPEA(543mL，3.172mol)处理，然后通过滴加4-(三氟甲氧基)苯胺(295g，1.665mol)在THF(3.1L)中的溶液处理。在10℃30min后将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于TBME(4L)中，用1N HCl(2x 1L)、饱和的NaHCO3溶液(1L)和盐水(2x 200mL)洗涤，并经Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸发掉，并将产物从EtOAc/正庚烷中重结晶，得到标题化合物，为浅褐色结晶固体。UPLC-MS(条件3)tR＝1.25min,m/z＝393/395/397[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.40(d,J＝8.60Hz,2H)7.86(d,J＝8.60Hz,2H)8.73(d,J＝2.20Hz,1H)8.92(d,J＝2.20Hz,1H)10.69(s,1H)。
实施例3
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基) 苯基)烟酰胺
将(R,E)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(3-氧代丁-1-烯-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段3.1,50mg，0.091mmol)和甲苯-4-磺酸酰肼(34.5mg，0.181mmol)和EtOH(302μL)加入MW瓶中，将其密封，并在80℃搅拌1.5h。将该混合液冷却至室温，加入NaOMe(17.15mg，0.318mmol)，并将RM在80℃搅拌48h.Aq。将该RM用甲酸水溶液酸化，经由0.2μMPTFE膜过滤器过滤，并经制备型HPLC纯化(条件9，20％至50％，18min)，得到标题化合物，为白色固体。UPLC-MS(条件1)tR＝2.08min,m/z＝448.0[M+H]+,m/z＝446.0[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.68-1.79(m,1H)1.78-1.90(m,1H)2.29(br.s,3H)2.98(d,J＝11.74Hz,1H)3.25-3.37(m,2H)3.40-3.53(m,1H)4.21(br.s,1H)4.83(br.s,1H)6.13(s,1H)7.33(d,J＝8.31Hz,2H)7.86(d,2H)8.01(br.s,1H)8.71(br.s,1H)10.15(s,1H)12.57(br.s,1H)。
阶段3.1:(R,E)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(3-氧代丁-1-烯-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.2，250mg，0.560mmol)、Pd(OAc)2(3.77mg，0.017mmol)、三-邻甲苯基膦(20.46mg，0.067mmol)、丁-3-烯-2-酮(55.1μL、0.672mmol)和TEA(102μL、0.728mmol)加入MW瓶中，将其密封，并用氩气净化。加入DMF(1.87mL)，并将RM在130℃搅拌6h。然后加入另外的丁-3-烯-2-酮(22.96μL，0.280mmol)，并将该混合液在130℃搅拌16h。将该RM倾入水(25mL)中，并用DCM萃取(3x 20mL)。将合并的萃取物经MgSO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12g，环己烷/EtOAc-EtOH+0.1％NH4OH(9:1)，40％至75％EtOAc-EtOH+0.1％NH4OH(9:1))。将含纯产物的级分合并，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其与二甲苯共沸，并在环己烷中研磨，得到标题化合物，为黄色固体。UPLC-MS(条件1)tR＝2.39min,m/z＝436.0[M+H]+,m/z＝434.0[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.82-1.91(m,1H)1.91-2.00(m,1H)2.35(s,3H)3.43(d,J＝11.25Hz,1H)3.59-3.67(m,1H)3.78-3.88(m,2H)4.34(br.s,1H)4.99(d,J＝3.18Hz,1H)6.61(d,J＝15.89Hz,1H)7.36(d,J＝8.31Hz,2H)7.81-7.93(m,J＝16.14,9.29Hz,3H)8.29(d,J＝2.20Hz,1H)8.71(d,J＝2.45Hz,1H)10.21(s,1H)。
实施例4
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(4-甲基-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基) 苯基)烟酰胺
将DIPEA(43.9μL，0.252mmol)加入在小瓶中的6-氯-5-(4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段4.1,55mg，0114mmol)和(R)-吡咯烷-3-醇(11.96mg，0.137mmol)在iPrOH(114μL)中的溶液中，将其密封，并在140℃加热18h。冷却至室温后，将该RM溶于EtOAc中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，并将粗制的产物经快速色谱纯化(硅胶柱，EtOAc/MeOH 98:2)，得到6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺，为类白色泡沫。将该中间体(39mg，0.073mmol)溶于DCM(0.8mL)中，用TFA(0.262mL，3.4mmol)处理，并在室温搅拌3h。将该RM倾入25mL Na2CO310％中，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，并将粗制的产物经快速色谱纯化(硅胶柱，DCM/MeOH，2％至10％MeOH)，得到标题化合物，为类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.46min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.92min,m/z＝448.4[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.64-1.81(m,2H)1.86(s,3H)2.78-2.97(m,1H)3.07-3.41(m,3H)4.18(br.s,1H)4.81(br.s,1H)7.32(d,J＝8.60Hz,2H)7.58(br.s,1H)7.85(d,J＝9.38Hz,2H)7.93(br.s,1H)8.73(br.s,1H)10.14(s,1H)12.63(br.s,1H)。
阶段4.1:6-氯-5-(4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将K3PO4(127mg，0.6mmol)加入在小瓶中的6-氯-5-碘-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段4.2,89mg，0.2mmol)和4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(58.4mg，0.2mmol)在二烷(1mL)中的溶液中，将其用氩气净化，加热至110℃，然后加入PdCl2(dppf)(7.32mg，0.01mmol)。将该小瓶密封，并将RM在氩气下在110℃搅拌18h。将该RM冷却至室温，溶于EtOAc中，并洗涤用盐水。将有机相经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，并将残余物经快速色谱纯化(硅胶柱，正庚烷/EtOAc form 50％至100％EtOAc)，得到标题化合物，为白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.24min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.22min,m/z＝481.2[M+H]+。
阶段4.2:6-氯-5-碘-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将DMF(0.13mL)和SOCl2(0.734mL，10.05mmol)加入6-氯-5-碘烟酸(1.00g，3.35mmol)和4-(三氟甲氧基)苯胺(0.623mg，3.52mmol)在甲苯(7mL)中的混合液中，并将RM在80℃搅拌1h。将溶剂减压蒸发掉，并在氩气下将残余物溶于THF(7.00mL)和DIPEA(1.17mL，6.7mmol)中，冷却至-15℃，滴加4-(三氟甲氧基)苯胺(0.476mL，3.52mmol)在THF(7.00mL)中的溶液进行处理，并在室温搅拌1h。将溶剂减压蒸发掉，将残余物用1N HCl水溶液(30mL)处理，并用TBME萃取(100mL)。将合并的萃取物用饱和的Na2CO3水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉直至开始结晶。将产物用正庚烷研磨，过滤，并干燥，得到标题化合物，为类白色固体。HPLC(条件4)tR＝6.36min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.23min,m/z＝441.1[M-H]-。
实施例5
(R)-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基) 苯基)烟酰胺
将DIPEA(71.9μL，0.412mmol)加入在小瓶中的6-氯-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段5.1，75mg，0.187mmol)和(R)-吡咯烷-3-醇(19.97mg，0.225mmol)在iPrOH(187μL)中的溶液中，将小瓶密封，并在140℃加热1h。在室温冷却后，将该RM溶于EtOAc中，并用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，DCM/MeOH，2％至10％MeOH)，得到标题化合物，为白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.73min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.93min,m/z＝452.4[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.64-1.95(m,2H)3.00(d,J＝11.34Hz,1H)3.18-3.51(m,3H)4.22(br.s,1H)4.86(br.s,1H)7.32(d,J＝8.60Hz,2H)7.77-8.11(m,4H)8.76(br.s,1H)10.17(s,1H)12.90(br.s,1H)。
阶段5.1:6-氯-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
在氩气气氛下将Pd(Ph3P)4(17.33mg，0.015mmol)加入在小瓶中的6-氯-5-碘-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段4.2,133mg，0.3mmol)和4-氟-5-(三丁基锡烷基)-1H-吡唑(101mg，0.270mmol)在DMSO(1mL)中的溶液中。将该小瓶密封，并将该RM混合液在100℃加热18h。冷却至室温后，将该RM溶于EtOAc中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，正庚烷/EtOAc，10％至50％EtOAc)，得到标题化合物，为类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.5min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.05min,m/z＝399.2[M-H]-。
实施例6
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(4-(三氟甲氧基) 苯基)烟酰胺
将(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.2，60mg，0.134mmol)、1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(42mg，0.202mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(9.44mg，0.013mmol)、Na2CO3(42.8mg，0.403mmol)、DME(570μL)、水(163μL)和EtOH(81μL)中的混合液在MW瓶中密封，抽真空/用氩气净化，并在120℃进行WM辐照10min。将RM用THF(1mL)稀释，处理用Si-Thiol(Silicycle，1.44mmol/g，46.7mg，0.067mmol)，过滤，并将滤液减压蒸发掉，得到残余物，将其经制备型HPLC纯化(条件9，25％进行0.2min然后15％至45％进行14min)，得到标题化合物，为白色固体。LC-MS(条件2)tR＝1.61min,m/z＝448.2/449.2[M+H]+,m/z＝446.1[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.71-1.80(m,1H)1.81-1.91(m,1H)2.98(d,J＝11.25Hz,1H)3.25-3.39(m,.2H)3.44-3.53(m,1H)3.89(s,3H)4.22(s,1H)4.84(s,1H)7.34(d,J＝8.56Hz,2H)7.53(s,1H)7.84(d,J＝5.38Hz,2H)7.86-7.88(m,1H)7.94(d,J＝2.45Hz,1H)8.67(d,J＝2.45Hz,1H)10.14(s,1H)。
实施例7
(S)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基) 苯基)烟酰胺
以与实施例2类似的方式使用(S)-5-溴-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段7.1)和(1H-吡唑-3-基)硼酸制备标题化合物，得到白色固体。UPLC-MS(条件1)tR＝1.89min,m/z＝448.0[M+H]+,m/z＝446.1[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.48-1.64(m,1H)1.77-1.90(m,1H)2.15-2.28(m,1H)3.03(dd,J＝11.25,6.85Hz,1H)3.22(br.s,2H)3.25-3.31(m,2H)3.34-3.39(m,1H)4.62(br.s,1H)6.39(br.s,1H)7.34(d,J＝8.56Hz,2H)7.51-7.84(m,1H)7.83-7.90(m,2H)8.03(s,1H)8.68-8.79(m,1H)10.19(s,1H)12.87-13.12(m,1H)。
阶段7.1:(S)-5-溴-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将5-溴-6-氯-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.3,500mg，1.264mmol)、(S)-β-脯氨醇盐酸盐(226mg，1.643mmol)、DIPEA(662μL，3.79mmol)和iPrOH(1.945mL)在密封小瓶中的混合液在140℃进行MW辐照60min。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物用0.5M HCl水溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用0.5M HCl(10ml)和水洗涤，经MgSO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到产物，将其用环己烷研磨，过滤，并干燥，得到标题化合物，为白色固体。UPLC-MS(条件1)tR＝2.76min,m/z＝460.0/462.0[M+H]+,m/z＝458.0/460.0[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.59-1.76(m,1H)1.92-2.04(m,1H)2.26-2.44(m,1H)3.37-3.50(m,2H)3.56(dd,J＝11.00,7.34Hz,1H)3.67-3.85(m,3H)4.71(br.s,1H)7.35(d,J＝8.56Hz,2H)7.85(d,1H)8.34(d,J＝1.96Hz,1H)8.68(d,J＝1.96Hz,1H)10.21(s,1H)。
实施例8
(S)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基) 烟酰胺
将K3PO4(41.3mg，0.195mmol)加入在小瓶中的(S)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段8.1、30mg，0.067mmol)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(36.2mg，0.13mmol)在甲苯(0.32mL)中的溶液中，将其用氩气净化。加入Pd(PPh3)4(3.75mg，0.032mmol)。将该小瓶密封，并在110℃加热18h。在室温冷却后，将该RM溶于EtOAc中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，将得到粗制的产物经快速色谱纯化(硅胶柱，DCM/MeOH，2％至5％MeOH)，得到N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺，将其一部分(21mg，0.039mmol)溶于DCM(0.5mL)中，用TFA(0.141mL，1.82mmol)处理，并在室温搅拌3h。将该RM倾入10％Na2CO3水溶液(10mL)中，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，DCM/MeOH，2％至5％MeOH)，得到标题化合物。HPLC(条件4)tR＝4.49min,手性HPLC(OD-H,250x 4.6mm,洗脱液:正庚烷/EtOH/MeOH(85:10:5),1mL/min,UV DAD,tR＝13.32min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.92min,m/z＝450.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.65-1.76(m,1H)1.77-1.92(m,1H)2.86-2.97(m,1H)3.18-3.35(m,2H)3.34-3.47(m,1H)4.10-4.24(m,1H)4.66-4.93(m,1H)6.28-6.42(m,1H)7.31(d,J＝8.99Hz,2H)7.85(d,J＝8.99Hz,3H)7.96-8.05(m,1H)8.64-8.81(m,1H)10.17(s,1H)12.80-13.14(m,1H)。
阶段8.1:(S)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
将DIPEA(190μL，1.1mmol)加入在小瓶中的5-溴-6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段9.3，206mg，0.5mmol)和(S)-吡咯烷-3-醇(52.3mg，0.6mmol)在iPrOH(500μL)中的溶液中，将其密封，并在140℃加热1h。在室温冷却后，将该RM溶于EtOAc中，用0.5MHCl水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，正庚烷/EtOAc，20至100％EtOAc)，得到标题化合物，为白色结晶泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.59min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.17min,m/z＝462.0/464.1[M+H]+。
实施例9
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基) 烟酰胺
将(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2,100mg，0.216mmol)和5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(215mg，0.663mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(17mg，0.024mmol)、Na2CO3(115mg，1.081mmol)、DME(917μL)、水(262μL)和EtOH(131μL)的混合液在MW瓶中密封，抽真空/用氩气净化3次，并在125℃进行WM辐照20min。将RM用2mLDME稀释，用Si-Thiol(Silicycle 1.44mmol/g，90mg，0.130mmol)搅拌3h。将该混合液离心，并将上清液经由0.45μm PTFE过滤器过滤，并将溶剂减压蒸发掉。将粗制的产物经快速色谱纯化(硅胶柱，12g，环己烷/EtOAc，40％至100％EtOAc)，得到受保护的中间体，为无色油状物。然后加入乙二胺(96μL，1.428mmol)和1M在THF(1.428mL，1.428mmol)中的TBAF，并将RM在80-85℃搅拌5天。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于EtOAc(40mL)中，用饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤3次，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经制备型SFC纯化(DEAP柱，25％至30％，6min)，得到标题化合物，为白色固体。
或者，通过将TFA(168mL，2182mmol)加入N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段9.1，31.3g，54.6mmol)在DCM(600mL)中的溶液中制备实施例9。将该混合液在室温搅拌2.5h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于EtOAc(1.5L)中用饱和的NaHCO3溶液(3x 500mL)和盐水(500mL)，洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其混悬于DCM(300mL)中，在室温搅拌15min，过滤，用DCM(200mL)洗涤，干燥，并经色谱法纯化(硅胶，1kg，DCM/MeOH 95:5)。将残余物溶于MeOH(500mL)中，并在25℃用Si-Thiol(Biotage,5.0g,6.5mmol)处理16h。将树脂过滤掉，将溶剂减压蒸发掉，并将残余物从MeCN中结晶，得到标题化合物，为白色结晶固体。
或者，通过在冷却下(低于35℃)将HCl水溶液(7.7mL of 6M)滴加至N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段9.1，3.8g，7.12mmol)在MeOH(20mL)和THF(10mL)中的溶液中制备实施例9。将该混合液在22℃搅拌2h，然后加入冷却的(10℃)1.2M NaOH(22mL)中。在整个添加期间保持温度低于30℃，并将pH保持在9-10的范围。然后将该RM在30℃搅拌30min。将溶剂减压蒸发掉，直至所需化合物沉淀。将沉淀过滤，并干燥，得到标题化合物，为黄色固体。
实施例9的分析数据:HPLC(条件5)tR＝5.54min,手性HPLC(OD-H,250x 4.6mm,洗脱液:正庚烷/EtOH/MeOH(85:10:5),1mL/min,UV 210nm)tR＝10.17min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.93min,m/z＝450.3[M+H]+,m/z＝494.1[M+甲酸-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.65-1.76(m,1H)1.76-1.87(m,1H)2.93(d,J＝11.73Hz,1H)3.19-3.29(m,2H)3.35-3.51(m,1H)4.10-4.25(m,1H)4.89(br.s,1H)6.41(br.s,1H)7.33(d,J＝8.50Hz,2H)7.57/7.83(br.s,1H)7.90(d,J＝8.50Hz,2H)8.07(br.s,1H)8.77(br.s,1H)10.23(s,1H)12.97/13.15(br.s,1H)。
阶段9.1:N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
在氩气气氛下将1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(29.6g，102mmol)、K3PO4(51.6g，236mmol)和Pd(PPh3)4(4.55g，3.93mmol)加入(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2,36.4g，79mmol)在甲苯(360mL)中的混悬液中，并将该混合液在110℃搅拌4h。将该RM倾入盐水(500mL)中，并用EtOAc萃取(2x 1L)。将合并的萃取物用盐水(500mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经色谱法纯化(硅胶柱，1.5kg，DCM/MeOH 95:5)，得到暗黄色泡沫，将其溶于MeOH/DCM(1L，3:1)中，并在30℃用Si-Thiol(Biotage，35g，45.5mmol)处理17h。将树脂过滤掉，并将溶剂减压蒸发掉，直至所需化合物结晶。将产物过滤，用MeOH洗涤，并干燥，得到标题化合物。
或者，通过将4-(氯二氟甲氧基)苯胺(16.6g，84.9mmol)、NMM(21.7g，212.1mmol)、羟基苯并三唑水合物(HOBt·H2O、11.9g，77.77mmol)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl、20.9g，109.0mmol)加入6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酸(阶段9.4，29.83g，70.7mmol)在THF(271mL)中的溶液中制备阶段9.1。将该混合液在25℃搅拌1.5h，然后在65℃搅拌16h。将RM冷却至35℃后，加入另外EDCI·HCl(13.3g，69.4mmol)，并将RM在35℃搅拌1.5h，然后在65℃再次搅拌16h。将RM冷却至后35℃，加入水(150mL)，将THF减压除去，加入EtOAc(180mL)，并将该混合液在35℃搅拌1h。将两层分离，然后将水相用EtOAc萃取(60mL)。将合并的有机层用水(90mL)、盐水(90mL)洗涤。将溶剂减压蒸发掉，得到棕色固体，将其经柱色谱纯化(硅胶，DCM/MeOH 40:1至20:1)，得到标题化合物，为黄色固体。
阶段9.1的分析数据:HPLC(条件5)tR＝6.12min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.06min,m/z＝533.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.36-2.02(m,7H)2.23-2.38(m,1H)3.08-3.29(m,2H)3.32-3.52(m,2H)3.73-3.93(m,1H)4.13-4.25(m,1H)4.80-4.90(m,1H)4.95-5.17(m,1H)6.33-6.50(m,1H)7.33(d,J＝8.99Hz,2H)7.61(d,J＝1.56Hz,1H)7.86(d,J＝8.99Hz,2H)7.97-8.11(m,1H)8.82(s,1H)10.13-10.25(m,1H)。
阶段9.2:(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
将(R)-吡咯烷-3-醇(9.55g，109.6mmol)和DIPEA(35.1ml，201.3mmol)加入5-溴-6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段9.3，37.7g，91.5mmol)在iPrOH(65mL)中的混悬液中，并在140℃搅拌1h。加入EtOAc(700mL)，并将该溶液用1N HCl(2x 200mL)、饱和的NaHCO3(200mL)和盐水(2x 200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将该溶液减压浓缩直至开始结晶。加入正庚烷(1L)，并将该混合液在室温搅拌30min，过滤，并用iPr2O(500mL)洗涤，得到标题化合物，为白色结晶固体。HPLC(条件5)tR＝6.68min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.10min,m/z＝462.2/464.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.78-2.01(m,2H)3.55(d,J＝11.34Hz,1H)3.66-3.75(m,1H)3.79-3.93(m,2H)4.34(br.s,1H)4.98(d,＝3.13Hz,1H)7.32(d,J＝8.99Hz,2H)7.84(d,J＝8.99Hz,2H)8.33(d,J＝1.96Hz,1H)8.66(d,J＝1.96Hz,1H)10.21(s,1H)。
阶段9.3:5-溴-6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)烟酰胺
将DMF(2.55mL，33.0mmol)和SOCl2(24.08ml，330mmol)加入5-溴-6-氯-烟酸(26g，110mmol)在甲苯(220mL)中的混悬液中，并将RM在80℃搅拌1h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于THF(220mL)中，并冷却至-16℃。加入DIPEA(38.4mL，220mmol)，随后历经15min滴加4-(氯二氟甲氧基)苯胺(22.35g，115mmol)在THF(220mL)中的溶液。将该混悬液在室温搅拌1h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于TBME(700mL)中，用1N HCl(2x 200mL)、饱和的NaHCO3(200mL)和盐水(2x 200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到产物，将其从EtOAc-正庚烷中重结晶，得到标题化合物，为白色结晶固体。HPLC(条件5)tR＝7.77min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.24min,m/z＝409.1/411.1/413.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.38(d,＝8.99Hz,2H)7.85(d,＝8.99Hz,2H)8.72(br.s,1H)8.92(br.s,1H)10.68(s,1H)。
阶段9.4:6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酸
将NaOH水溶液(180mL of 2.6M)加入6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酸甲酯(阶段9.5,111g,299mmol)在MeOH(270mL)中的溶液中，并将RM在室温搅拌14h。将MeOH减压蒸发掉，并将残余物的水溶液用盐水(90mL)处理，用MeTHF萃取两次(540mL+360mL)，并将合并的有机层用水(90mL)洗涤。将MeTHF加入合并的各水层中，将该两相混合物冷却至0℃，并用HCl水溶液溶液(18％)酸化(pH＝4-4.5)，并用MeTHF萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其从EtOAc/TBME(1:1)中重结晶，得到标题化合物，为白色固体。HPLC(条件7)tR＝4.74min,LC-MS(条件8)tR＝3.37min,m/z＝359.0[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.44(br.s,2H),1.51(d,J＝11.54Hz,2H),1.64-1.86(m,4H),1.90(br.s,1H),2.31(d,J＝9.29Hz,1H),2.77(br.s,1H),3.10(br.s,1H),3.21(d,J＝8.78Hz,2H),3.27-3.51(m,4H),3.87(d,J＝11.54Hz,1H),4.16(br.s,1H),4.75-4.93(m,1H),5.04(br.s,1H),6.35(d,J＝17.32Hz,1H),7.51-7.64(m,1H),7.64-7.82(m,1H),8.67(d,J＝2.26Hz,1H),12.58(br.s,1H)。
阶段9.5:6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酸甲酯
将(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酸甲酯(阶段9.6、90g，299mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(103.9g，373.6mmol)、K3PO4(126.9g，597.7mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(6.29g，8.97mmol)在甲苯(900mL)中的混合液在92℃搅拌16h。将该混合液来自至室温后，将该溶液用水(450mL)、5％NaHCO3溶液(430mL)洗涤，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。HPLC(条件7)tR＝6.929min,LC-MS(条件8)tR＝4.30min,m/z＝373.0[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.19-1.28(m,1H),1.35-1.63(m,4H),1.63-1.86(m,3H),1.89(br.s,1H),2.12-2.39(m,1H),3.11(br.s,1H),3.18-3.48(m,4H),3.78(s,4H),3.88(d,J＝11.54Hz,1H),4.08-4.24(m,1H),4.86(dd,J＝18.20,2.89Hz,1H),5.02(d,J＝8.28Hz,1H),6.39(br.s,1H),7.58(d,J＝1.25Hz,1H),7.78(br.s,1H),8.69(t,J＝2.01Hz,1H)。
阶段9.6:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酸甲酯
将DIPEA(105.3g，142.2mL，814.4mmol)加入5-溴-6-氯烟酸甲酯(85g，339.5mmol)和(R)-吡咯烷-3-醇(54.2g，441.2mmol)在乙酸异丙基酯中的溶液中，并将RM在70℃搅拌14h。将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其溶于甲苯(850mL)中，用水(127mL)和盐水(127mL)洗涤，并减压浓缩直至开始沉淀。在22℃将正庚烷(340mL)缓慢加入该搅拌的混合液中，然后将其冷却至0℃，并将产物过滤，用甲苯/正庚烷混合液(1:1.5)洗涤，并干燥，得到标题化合物，为黄色固体。HPLC(条件7)tR＝8.54min,LC-MS(条件8)tR＝4.62min,m/z＝300.9/302.9[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.77-1.99(m,2H),3.57(d,J＝11.54Hz,1H),3.72(ddd,J＝11.11,7.97,3.26Hz,1H),3.78(s,3H),3.81-3.90(m,2H),4.26-4.39(m,1H),4.99(br.s,1H),8.11(d,J＝2.01Hz,1H),8.56(d,J＝1.76Hz,1H)。
实施例10
(S)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
将(S)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段10.1、119mg，0.25mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(139mg，0.5mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(0.018g，0.025mmol)、Na2CO3(0.106g，1.000mmol)、DME(1.061mL)、水(0.303mL)和EtOH(0.152mL)的混合液加入MW瓶中，将其密封，抽真空/用氩气净化3次，然后在125℃进行MW辐照20min。将RM用DME(2mL)稀释，并与Si-Thiol(Silicycle 1.43mmol/g，0.105g，0.150mmol)一起搅拌过夜。将该混合液离心，并将上清液经由0.45μmPTFE过滤器过滤，并将溶剂减压蒸发掉。将粗制的产物经快速色谱纯化(硅胶柱，12g，环己烷/EtOAc，20％至90％EtOAc)，得到受保护的中间体，将其用DCM(2.5mL)和TFA(0.963mL，12.50mmol)的混合液处理，并在室温搅拌2h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物用7N NH3在MeOH(2mL，14mmol)中的溶液处理。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物经制备型SFC纯化(DEAP柱，28％等度洗脱9min)，得到标题化合物，为黄色油状物。UPLC-MS(条件1)tR＝1.87min,m/z＝464.1[M+H]+,m/z＝462.1[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.49-1.65(m,1H)1.75-1.97(m,1H)2.14-2.30(m,1H)3.04(dd,J＝11.37,6.97Hz,1H)3.14-3.26(m,2H)3.26-3.29(m,1H)3.35-3.46(m,2H)4.60(t,J＝5.14Hz,1H)6.39(d,J＝1.96Hz,1H)7.33(d,J＝9.05Hz,2H)7.76(br.s,1H)7.84-7.94(m,2H)8.04(d,J＝2.45Hz,1H)8.74(s,1H)10.18(s,1H)12.87(br.s,1H)。
阶段10.1:(S)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段9.3)和(S)-1-吡咯烷-3-基-甲醇制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝5.82min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.14min,m/z＝476.2/478.3[M+H]+。
实施例11
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯 基)烟酰胺
以类似于实施例9中所述的方式使用(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺(阶段11.1)和5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝0.97min,m/z＝450.2[M+H]+,m/z＝448.1[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.67-1.78(m,1H)1.78-1.88(m,1H)2.94(d,J＝11.92Hz,1H)3.19-3.34(m,2H)3.38-3.50(m,1H)4.20(br.s,1H)4.81-4.93(m,1H)6.33-6.45(m,1H)7.83(m,J＝113.40,8.20Hz,3H)7.93(d,J＝8.66Hz,2H)7.99-8.08(m,1H)8.70-8.81(m,1H)10.30(s,1H)12.90-13.16(m,1H)。
阶段11.1:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺
将DIPEA(73μL，0.42mmol)加入在小瓶中的5-溴-6-氯-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺(阶段11.2,123mg，0.3mmol)和(R)-吡咯烷-3-醇(31.4mg，0.36mmol)在iPrOH(300μL)中的溶液中，将其密封，并在140℃加热1h。在室温冷却后，将RM用EtOAc稀释，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并减压蒸发掉溶剂，得到残余物，将其用iPr2O研磨，过滤，并干燥，得到标题化合物，为白色结晶泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.9min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.21min,m/z＝464.1[M+H]+。
阶段11.2:5-溴-6-氯-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺
加入DMF(0.12mL)，随后将SOCl2(0.73mL，10mmol)缓慢滴加中至5-溴-6-氯-烟酸(473mg，2mmol)在甲苯(5mL)中的混合液中，然后将该RM在80℃搅拌1h。在室温冷却后，将甲苯减压蒸发掉，并将残余物溶于THF(0.4mL)中。加入DIPEA(0.7mL，4mmol)，并将该溶液在氮气下冷却至0℃。然后滴加在THF(1mL)中的4-三氟甲基硫烷基-苯胺(438mg，2.2mmol)，并将RM在0℃搅拌2h。将RM用TBME(50mL)稀释，用1M HCl处理，并用TBME萃取。将合并的萃取物用1M NaOH水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，并将产物从TBME/正己烷中重结晶，得到标题化合物，为类白色结晶泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.63min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.33min,m/z＝411.1[M+H]+。
实施例12
(S)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)-N-(4-((三氟甲基)硫 基)苯基)烟酰胺
以类似于实施例10中所述的方式使用(S)-5-溴-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺(阶段12.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到浅黄色泡沫。UPLC-MS(条件3)tR＝0.99min,m/z＝464.2[M+H]+,m/z＝462.2[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)d ppm 1.48-1.64(m,1H)1.76-1.93(m,1H)2.15-2.27(m,1H)3.04(dd,J＝11.49,7.09Hz,1H)3.18-3.26(m,2H)3.27-3.29(m,1H)3.32-3.41(m,2H)4.60(br.s,1H)6.39(d,J＝1.71Hz,1H)7.67(d,J＝8.56Hz,2H)7.80(br.s,1H)7.87-7.99(m,2H)8.04(d,J＝2.45Hz,1H)8.74(br.s,1H)10.28(s,1H)12.76-13.20(m,1H)。
阶段12.1:(S)-5-溴-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺
将DIPEA(4.89mL，28.0mmol)加入在小瓶中的5-溴-6-氯-N-(4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺(阶段11.2,2.88g，7.0mmol)和(S)-1-吡咯烷-3-基-甲醇(1.156,8.40mmol)在iPrOH(7.0mL)中的溶液中，将其密封，然后在140℃加热1h。在室温冷却后，将该RM溶于EtOAc中，用0.5M HCl水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其用iPr2O研磨，过滤，并干燥，得到标题化合物，为浅褐色结晶泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.17min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.20min,m/z＝476.2/478.2[M+H]+。
实施例13
(R)-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑 -5-基)烟酰胺
将(R)-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段13.1，64mg，0.11mmol)、乙二胺(37.2μL，0.55mmol)和1M TBAF在THF(1.651mL，1.651mmol)中的混合液在MW瓶中密封，并在80-85℃搅拌20h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于EtOAc(40mL)中，用饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤3次，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经制备型SFC纯化(二醇基柱，27％等度洗脱)，得到标题化合物，为白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝0.95min,m/z＝452.3[M+H]+,m/z＝450.3[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.64-1.78(m,1H)1.78-1.89(m,1H)2.95(d,J＝11.74Hz,1H)3.29(br.s,2H)3.37-3.49(m,1H)4.20(br.s,1H)4.83(br.s,1H)6.35-6.42(m,1H)7.52(t,J＝9.05Hz,1H)7.62(d,J＝9.29Hz,1H)7.74(br.s,1H)7.98(dd,J＝13.20,2.20Hz,1H)8.02(d,J＝2.20Hz,1H)8.74(d,J＝1.71Hz,1H)10.31(br.s,1H)12.95(br.s,1H)。
阶段13.1:(R)-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
将(R)-5-溴-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段13.2，100mg，0.215mmol)、5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(104mg，0.321mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(15.2mg，0.022mmol)、Na2CO3(91mg，0.862mmol)、DME(914μL)、水(261μL)和EtOH(131μL)的混合液在MW瓶中密封，抽真空/用氩气净化3次，并在125℃进行WM辐照20min。将RM用DME(3mL)稀释，然后与Si-Thiol(Silicycle 1.44mmol/g，90mg，0.129mmol)一起搅拌过夜。将该混合液离心，并将上清液经由0.45μm PTFE过滤器过滤，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经制备型SFC纯化(DEAP柱，15％至20％，6min)，得到标题化合物，为黄色透明油状物。UPLC-MS(条件3)tR＝1.28min,m/z＝581.2[M+H]+,m/z＝580.4[M-H]-。
阶段13.2:(R)-5-溴-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段13.3)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝5.82min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.17min,m/z＝464.1[M+H]+。
阶段13.3:5-溴-6-氯-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段11.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-烟酸和3-氟-4-三氟甲氧基-苯胺制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.43min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.29min,m/z＝413[M-H]-。
实施例14
(S)-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-5-(1H- 吡唑-5-基)烟酰胺
以类似于实施例10中所述的方式使用(S)-5-溴-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段14.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到浅黄色泡沫。UPLC-MS(条件3)tR＝0.96min,m/z＝466.2[M+H]+,m/z＝464.2[M-H]-.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)d ppm 2.77(s,3H)3.38-3.61(m,4H)4.61(br.s,1H)6.47(s,1H)7.68(d,J＝8.56Hz,2H)7.83(br.s,1H)7.93(d,J＝8.80Hz,2H)8.15(br.s,1H)8.71(br.s,1H)10.36(s,1H)12.83-13.15(m,1H)。
阶段14.1:(S)-5-溴-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-6-(3-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段13.3)和(S)-1-吡咯烷-3-基-甲醇制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝5.99min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.18min,m/z＝478.1/480.1[M+H]+。
实施例15
(R)-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
以类似于实施例13中所述的方式使用(R)-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段15.1)制备标题化合物，得到类白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝1.00min,m/z＝468.3[M+H]+,m/z＝466.1[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.68-1.78(m,1H)1.79-1.89(m,1H)2.96(d,J＝11.74Hz,1H)3.24-3.30(m,2H)3.40-3.49(m,1H)4.20(d,J＝2.20Hz,1H)4.84(br.s,1H)6.38(d,J＝1.96Hz,1H)7.66-7.78(m,3H)7.98(dd,J＝11.98,1.96Hz,1H)8.03(d,J＝2.45Hz,1H)8.75(d,J＝2.45Hz,1H)10.24-10.72(m,1H)12.59-13.22(m,1H)。
阶段15.1:(R)-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
以类似于阶段13.1中所述的方式使用(R)-5-溴-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段15.2)和5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到黄色树脂状物。UPLC-MS(条件3)tR＝1.33min,m/z＝598.4[M+H]+,m/z＝596.5[M-H]-。
阶段15.2:(R)-5-溴-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺(阶段15.3)和(R)-吡咯烷-3-醇，得到类白色结晶固体制备标题化合物。HPLC(条件4)tR＝6.11min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.23min,m/z＝480.1[M+H]+。
阶段15.3:5-溴-6-氯-N-(3-氟-4-((三氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段11.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-烟酸和3-氟-4-三氟甲基硫烷基-苯胺制备标题化合物，得到白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.71min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.34min,m/z＝429[M-H]-。
实施例16
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙基)苯基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟 酰胺
将(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙基)苯基)-5-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段16.1,68mg，0.114mmol)和乙二胺(38.4μL，0.569mmol)在MW瓶中的混合液在氩气气氛下密封，并加入1M在THF中的TBAF(1.707mL，1.707mmol)，并将RM在80℃搅拌20h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于EtOAc(40mL)中，用饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤3次，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经制备型SFC纯化(二醇基柱,27％等度洗脱9min)，得到标题化合物，为类白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝0.98min,m/z＝468.2[M+H]+,m/z＝466.2[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.68-1.78(m,1H)1.83(dd,J＝8.80,4.40Hz,1H)2.96(d,J＝11.74Hz,1H)3.19-3.29(m,2H)3.40-3.50(m,1H)4.20(br.s,1H)4.83(br.s,1H)6.39(d,J＝1.96Hz,1H)7.65(d,J＝8.80Hz,2H)7.77(br.s,1H)8.02(d,J＝9.05Hz,2H)8.05(d,J＝2.45Hz,1H)8.76(d,J＝2.20Hz,1H)10.33(s,1H)12.91(br.s,1H)。
阶段16.1:(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙基)苯基)-5-(1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
将(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙基)苯基)烟酰胺(阶段16.2，100mg，0.208mmol)、5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(135mg，0.416mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(14.62mg，0.021mmol)、Na2CO3(88mg，0.833mmol)、DME(883μL)、水(252μL)和EtOH(126μL)在MW瓶中的混合液密封，抽真空/用氩气净化3次，并在125℃进行WM辐照20min。将RM用3mL DME稀释，然后与Si-Thiol(Silicycle 1.44mmol/g，87mg，0.125mmol)一起搅拌过夜。将该混合液离心，并将上清液经由0.45μm PTFE过滤器过滤，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经制备型SFC纯化(二醇基柱，15％至20％，6min)，得到标题化合物，为无色透明树脂状物。UPLC-MS(条件3)tR＝1.31min,m/z＝598.4[M+H]+,m/z＝596.3[M-H]-。
阶段16.2:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(全氟乙基)苯基)烟酰胺(阶段16.3)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝5.96min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.20min,m/z＝480.2[M+H]+。
阶段16.3:5-溴-6-氯-N-(4-(全氟乙基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段11.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-烟酸和4-五氟乙基-苯胺制备标题化合物，得到白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.61min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.32min,m/z＝429[M-H]-。
实施例17
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(五氟硫烷基)苯基)-5-(1H-吡唑-5-基) 烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(五氟硫烷基)苯基)烟酰胺(阶段17.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到浅褐色固体。HPLC(条件4)tR＝4.68min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.92min,m/z＝476.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.64-1.91(m,2H)2.93(d,J＝11.73Hz,1H)3.19-3.34(m,2H)3.36-3.49(m,1H)4.12-4.24(m,1H)4.81(d,J＝3.13Hz,1H)6.38(s,1H)7.73-7.89(m,3H)7.92-8.09(m,3H)8.73(d,J＝1.96Hz,1H)10.37(s,1H)12.82-13.17(m,1H)。
阶段17.1:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(五氟硫烷基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(五氟硫烷基)苯基)烟酰胺(阶段17.2)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到固体。UPLC-MS(条件3)tR＝1.16min,m/z＝490.1[M+H]+。
阶段17.2:5-溴-6-氯-N-(4-(五氟硫烷基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段11.2中所述的方式制备使用5-溴-6-氯-烟酸和4-氨基苯基五氟化硫标题化合物，得到橙色固体。HPLC(条件4),tR＝6.43min,UPLC-MS(条件3),tR＝1.27min,m/z＝435.3/437.2[M+H]+。
实施例18
(R)-N-(4-((氯二氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑 -5-基)烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(R)-5-溴-N-(4-((氯二氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段18.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到类白色固体。HPLC(条件4)tR＝4.94min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.99min,m/z＝466.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.65-1.88(m,2H)2.86-2.99(m,1H)3.19-3.33(m,2H)3.36-3.51(m,1H)4.13-4.23(m,1H)4.76-4.90(m,1H)6.31-6.42(m,1H)7.65(d,J＝8.21Hz,2H)7.76-7.84(m,1H)7.92(d,J＝8.60Hz,2H)7.98-8.08(m,1H)8.66-8.82(m,1H)10.28(s,1H)12.82-13.14(m,1H)。
阶段18.1:(R)-5-溴-N-(4-((氯二氟甲基)硫基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-((氯二氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺(阶段18.2)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝5.97min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.19min,m/z＝478.2/480.1[M+H]+。
阶段18.2:5-溴-6-氯-N-(4-((氯二氟甲基)硫基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段11.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-烟酸和4-((氯二氟甲基)硫基)苯胺(阶段18.3)制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.78min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.32min,m/z＝425[M-H]-。
阶段18.3:4-((氯二氟甲基)硫基)苯胺
向4-硝基苯基氯二氟甲基硫化物(如DE2845997,627中所述制备，67.5g，0.28mol)在乙醇(270mL)和水(68mL)中的在72℃搅拌的溶液中分三批历经10min加入浓HCl(3.4mL，41.5mmol)和铁粉(203g，3.63mol)。将RM在82℃搅拌30min，经由(EtOH)过滤，将溶剂减压蒸发掉，得到黄色油状物，将其溶于DCM中，并用饱和的NaHCO3和盐水洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤，并将滤液减压蒸发掉，得到粗制的产物，为黄色油状物，将其蒸馏(沸点88-92℃,0.9mmHg)，并经由过滤，得到标题化合物，为浅黄色油状物。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δppm 3.98(br.s,2H)6.67(dd,2H)7.43(dd,2H)。
实施例19
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙氧基)苯基)-5-(1H-吡唑-5-基) 烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙氧基)苯基)烟酰胺(阶段19.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到类白色固体。HPLC(条件4)tR＝4.86min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.97min,m/z＝484.4[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.62-1.92(m,2H)2.94(d,J＝1.00Hz,1H)3.18-3.34(m,2H)3.37-3.51(m,1H)4.13-4.22(m,1H)4.70-4.91(m,1H)6.37(br.s,1H)7.31(d,J＝8.99Hz,2H)7.86(m,J＝9.00Hz,3H)8.01(br.s,1H)8.65-8.83(m,1H)10.17(s,1H)12.84-13.11(m,1H)。
阶段19.1:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(全氟乙氧基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段9.2中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(全氟乙氧基)苯基)烟酰胺(阶段19.2)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.01min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.17min,m/z＝496.2[M+H]+。
阶段19.2:5-溴-6-氯-N-(4-(全氟乙氧基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段9.3中所述的方式使用5-溴-6-氯-烟酸和4-(全氟乙氧基)苯胺制备标题化合物，得到类白色结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.73min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.30min,m/z＝443.1[M-H]-。
实施例20
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-3-(1H-吡唑-5-基) 苯甲酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(R)-3-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)苯甲酰胺(阶段20.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-硼酸频那醇酯制备标题化合物，得到类白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝0.99min,m/z＝449.0[M+H]+,m/z＝493.0[M+甲酸-H]-；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.67-1.79(m,1H)1.80-1.92(m,1H)2.72(d,J＝10.88Hz,1H)3.03-3.18(m,2H)3.19-3.30(m,1H)4.19(br.s,1H)4.77-4.92(m,1H)6.22-6.42(m,1H)6.76-6.93(m,1H)7.31(d,J＝8.56Hz,2H)7.45-7.81(m,1H)7.83-7.95(m,4H)10.12(s,1H)12.71-13.12(m,1H)。
阶段20.1:(R)-3-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)苯甲酰胺
将3-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-氟苯甲酰胺(1g，2.53mmol)、(R)-吡咯烷-3-醇(0.331g，3.80mmol)、TEA(0.706mL，5.07mmol)和DMSO(2.53mL)的混合液在90℃搅拌20h。将RM用0.5M HCl(50mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用0.5M HCl、饱和的NaHCO3水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，40g，环己烷/EtOAc，1％至4.5％EtOAc)。合并含纯产物的级分，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其在环己烷中研磨，得到标题产物，为白色非晶形固体。UPLC-MS(条件3)tR＝1.15min,m/z＝462.9[M+H]+,m/z＝460.9[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.81-1.90(m,1H)1.92-2.03(m,1H)3.27(dd,J＝10.39,1.10Hz,1H)3.36-3.44(m,1H)3.62-3.71(m,1H)3.81(dd,J＝10.45,4.71Hz,1H)4.32-4.40(m,1H)4.99(d,J＝3.42Hz,1H)6.93(d,J＝8.80Hz,1H)7.33(d,J＝9.05Hz,2H)7.82-7.91(m,3H)8.14(d,J＝2.20Hz,1H)10.21(s,1H)。
阶段20.2:3-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-氟苯甲酰胺
以类似于阶段1.3中所述的方式使用3-溴-4-氟苯甲酸和4-(氯二氟甲氧基)苯胺制备标题化合物，得到类白色固体。UPLC-MS(条件3)tR＝1.25min,m/z＝394.0[M+H]+,m/z＝391.9[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.37(d,J＝9.17Hz,2H)7.57(t,J＝8.68Hz,1H)7.84-7.91(m,2H)8.03(ddd,J＝8.62,4.83,2.32Hz,1H)8.32(dd,J＝6.60,2.20Hz,1H)10.52(s,1H)。
实施例21
(S)-6-(3-(氨基甲基)吡咯烷-1-基)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(S)-((1-(3-溴-5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)氨基甲酰基)-吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(阶段21.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.15min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.78min,m/z＝463.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.50-1.62(m,1H)1.91(d,J＝6.26Hz,1H)2.27(s,1H)2.72(d,J＝7.04Hz,2H)3.04-3.16(m,3H)3.30(br.s,2H)3.47(dd,J＝11.34,7.04Hz,1H)6.38(d,J＝1.96Hz,2H)7.31(d,J＝8.60Hz,2H)7.64-7.91(m,2H)8.05(d,J＝2.35Hz,1H)8.72(d,J＝1.95Hz,1H)10.19(s,1H)12.86-13.01(m,1H)。
阶段21.1:(S)-(1-(3-溴-5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)-氨基甲酰基)吡啶-2-基)吡咯烷-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯
以类似于阶段8.1中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段9.3)和(R)-1-吡咯烷-3-基甲基-氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物，得到结晶固体。HPLC(条件4)tR＝6.09min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.36min,m/z＝577.2[M+H]+。
实施例22
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)-3-(3-甲基-1H-吡 唑-5-基)苯甲酰胺
在氩气气氛下将3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(阶段23.1、128mg，0.329mmol)、K3PO4(140mg，0.658mmol)和Pd(PPh3)4(15.22mg，0.013mmol)加入(R)-3-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-(3-羟基吡咯烷-1-基)苯甲酰胺(阶段20.1,80mg，0.165mmol)在甲苯(1.5mL)中的溶液中，并将RM在110℃加热2h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于DCM(4mL)中，用TFA(0.507mL，6.58mmol)处理，并在室温搅拌2h。将RM用饱和的Na2CO3水溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经制备型HPLC纯化(条件10–20％至80％B，20min)。将含纯产物的级分合并，用饱和的Na2CO3水溶液处理，并将MeCN减压蒸发掉。将残余物水溶液用DCM萃取，并将合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压蒸发掉，得到残余物，将其从DCM/正己烷中重结晶，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝6.41min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.03min,m/z＝463[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.67-1.78(m,1H)1.84(s,1H)2.16-2.30(m,3H)2.74(d,J＝10.56Hz,1H)3.04-3.33(m,3H)4.14-4.23(m,1H)4.76-4.87(m,1H)6.07(s,1H)6.73-6.86(m,1H)7.29(d,J＝8.21Hz,2H)7.78-7.90(m,J＝8.99Hz,4H)10.07(s,1H)12.34-12.56(m,1H)。
实施例23
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(3-甲基-1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
在氩气气氛下将3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(阶段23.1，150mg，0.359mmol)、K3PO4(147mg，0.692mmol)和Pd(PPh3)4(15.98mg，0.014mmol)加入(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2,80mg，0.173mmol)在甲苯(1.5mL)中的溶液中，并将RM在110℃搅拌2h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于DCM(1.5mL)中，用TFA(0.533mL，6.92mmol)处理，并在室温搅拌2h。将RM用饱和的Na2CO3水溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12g，DCM/MeOH，99:1至92:8)，并从DCM/正己烷中结晶，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝5.92min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.94min,m/z＝464.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.67-1.89(m,2H)2.19-2.31(m,3H)2.98(d,J＝10.95Hz,1H)3.24-3.35(m,2H)3.39-3.52(m,1H)4.16-4.25(m,1H)4.80-4.90(m,1H)6.11-6.17(m,1H)7.32(d,J＝8.60Hz,2H)7.87(d,J＝8.99Hz,2H)7.97-8.06(m,1H)8.66-8.78(m,1H)10.16(s,1H)12.51-12.70(m,1H)。
阶段23.1:3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑
在氩气气氛下将3-甲基吡唑(3.0g，35.4mmol)、3,4-二氢-2H-吡喃(4.97mL，53.2mmol)和TFA(0.02mL，0.260mmol)的混合液在85℃搅拌6h。将该RM冷却至室温，并加入60％在矿物油中的NaH(0.061g，1.524mmol)，并将RM搅拌10min。将RM经逐泡(bulb-to-bulb)蒸馏纯化，得到3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑(沸点150-170℃/12毫巴)。历经10min在-70℃将n-BuLi在正己烷中的溶液(3.38mL，1.6M，5.41mmol)在氮气气氛下滴加至3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑(1.0g，5.41mmol)在THF(12mL)中的溶液中，并将RM搅拌10min，然后滴加2-甲氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(0.898g，5.69mmol)进行处理，并在-70℃搅拌1h。将该RM温至RT，用正己烷处理，并将产物过滤，溶于水(10mL)中，并用柠檬酸水溶液(10％)酸化至pH 6。将水减压蒸发掉，并将残余物水溶液用EtOAc萃取，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到标题产物，为黄色树脂状物。UPLC-MS(条件3)tR＝0.56min,m/z＝211.2[M+H]+。
实施例24
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-5-基)-4-(3-羟基吡咯烷 -1-基)苯甲酰胺
将N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-氟-3-(4-氟-1H-吡唑-5-基)苯甲酰胺(阶段24.1，62mg，0.147mmol)、R-3-羟基吡咯烷(0.031mL，0.206mmol)和TEA(0.062mL，0.442mmol)在DMSO(0.5mL)中的混合液在100℃搅拌16h。将RM用EtOAc(30mL)稀释，用饱和的Na2CO3水溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经制备型HPLC纯化(条件10)。将含纯产物的级分合并，用饱和的Na2CO3水溶液处理，并将MeCN减压除去。将残余物水溶液用DCM萃取，将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉。将残余物溶于DCM中，并用正己烷处理，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝6.61min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.01min,m/z＝467.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.69-1.95(m,2H)2.79(d,J＝10.56Hz,1H)3.06-3.20(m,2H)3.22-3.35(m,1H)4.13-4.30(m,1H)4.79-4.96(m,1H)6.75-6.92(m,1H)7.31(d,J＝8.60Hz,2H)7.86(m,J＝9.38Hz,5H)10.11(s,1H)12.67-13.12(m,1H)。
阶段24.1:N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-氟-3-(4-氟-1H-吡唑-5-基)苯甲酰胺
在氩气气氛下将在密封小瓶中的3-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-4-氟苯甲酰胺(阶段20.2，200mg，0.497mmol)、4-氟-5-(三丁基锡烷基)-1H-吡唑(211mg，0.472mmol)和Pd(PPh3)4(28,7mg，0.025mmol)在DMSO(1.5mL)中的混合液在100℃搅拌20h。将RM用EtOAc(30mL)稀释，用饱和的Na2CO3水溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12g，正己烷/EtOAc 95:5至6:4)，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝7.20min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.12min,m/z＝400.1[M+H]+。
实施例25
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)-6-(3-羟基吡咯烷 -1-基)烟酰胺
以类似于实施例5中所述的方式使用6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段25.1)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.89min,手性HPLC(OD-H,250x 4.6mm,洗脱液:正庚烷/EtOH/MeOH(85:10:5),1mL/min,UV 210nm)tR＝9.34min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.96min,m/z＝468.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.67-1.92(m,2H)3.00(d,J＝11.73Hz,1H)3.19-3.33(m,2H)3.43(m,J＝7.00Hz,1H)4.22(br.s,1H)4.87(br.s,1H)7.31(d,J＝8.60Hz,2H)7.85(d,J＝8.99Hz,2H)7.90-8.10(m,2H)8.77(br.s,1H)10.18(s,1H)12.83-13.19(m,1H)。
阶段25.1:6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
以类似于阶段13.1中所述的方式使用6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-碘烟酰胺(阶段25.2)和4-氟-5-(三丁基锡烷基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.69min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.09min,m/z＝415[M-H]-；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm。
阶段25.2:6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-碘烟酰胺
以类似于阶段11.2中所述的方式使用6-氯-5-碘烟酸和4-(氯二氟甲氧基)苯胺制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.47min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.26min,m/z＝456.8[M-H]-。
实施例26
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(3-(三氟甲 基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
将K3PO4(135mg，0.635mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基硼酸(112mg，0.424mmol)和Pd(PPh3)4(12.24mg，10.59μmol)加入(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2，100mg，0.212mmol)在甲苯(2mL)中的溶液中，并在氩气气氛下将RM在110℃搅拌2h。将RM经由过滤，用水洗涤，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12g，DCM/EtOH，99:1至94:6)。将得到的中间体溶于DCM(2mL)中，用TFA(0.462mL，5.99mmol)处理，并在室温搅拌1h。将RM用EtOAc(20mL)稀释，用饱和的Na2CO3水溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，4g，DCM/EtOH，99:1至9:1)。将含纯产物的级分合并，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其在DCM/正己烷中研磨，过滤，并干燥，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝6.545min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.10min,m/z＝518.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.71-1.95(m,2H)2.94(d,J＝11.34Hz,1H)3.24(m,2H)3.44(m,1H)4.17-4.32(m,1H)4.91(br.s,1H)6.88(s,1H)7.34(d,J＝8.21Hz,2H)7.86(d,J＝9.38Hz,2H)8.12(s,1H)8.81(s,1H)10.17(s,1H)13.94(s,1H)。
实施例27
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-甲基-1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
以类似于阶段2.1中所述的方式使用(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2)和1-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.25min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.98min,m/z＝464.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.65-1.89(m,2H)2.87-3.00(m,1H)3.09-3.29(m,3H)3.59(s,3H)4.19(br.s,1H)4.87(d,J＝3.13Hz,1H)6.39(s,1H)7.27-7.36(m,2H)7.50(dd,J＝1.76,0.98Hz,1H)7.78-7.88(m,2H)8.00(d,J＝2.35Hz,1H)8.78(dd,J＝2.35,1.17Hz,1H)10.15(s,1H)。
实施例28
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-甲基-1H-吡 唑-3-基)烟酰胺
以类似于阶段2.1中所述的方式使用(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2)和1-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.16min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.98min,m/z＝464[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.64-1.90(m,2H)2.85-3.00(m,1H)3.06-3.26(m,3H)3.59(s,3H)4.19(br.s,1H)4.87(d,J＝2.74Hz,1H)6.39(s,1H)7.31(d,J＝8.60Hz,2H)7.50(dd,J＝1.76,0.98Hz,1H)7.84(d,J＝8.60Hz,2H)8.01(d,J＝2.74Hz,1H)8.78(dd,J＝2.54,0.98Hz,1H)10.15(s,1H)。
实施例29
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(1-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-4-基)-6-(3- 羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
在氩气气氛下将2M Na2CO3(0.375mL，0.75mmol)加入(R)-5-溴-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段9.2，116mg，0.25mmol)和1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(161mg，0.5mmol)在DME(1.0mL)中的溶液中。然后加入PdCl2(dppf)(9.15mg，0.013mmol)，并将该RM混合液在100℃搅拌2h。在室温冷却后，将该RM溶于EtOAc中，并用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉。将粗制的产物溶于冷却至0℃的DCM(1.4mL)中，然后用TFA(0.77mL，10mmol)处理，并在室温搅拌3h。将该RM倾入10％Na2CO3水溶液(15mL)中，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，DCM/MeOH,，2％至10％MeOH)，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.33min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.88min,m/z＝494[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.67-1.88(m,2H)2.96(d,J＝11.73Hz,0H)3.24-3.37(m,2H)3.41-3.53(m,1H)3.75(q,J＝5.73Hz,2H)4.04-4.25(m,4H)4.81(d,J＝3.52Hz,1H)4.86-4.94(m,1H)7.31(d,J＝8.21Hz,2H)7.53-7.59(m,1H)7.79-7.89(m,3H)7.93(d,J＝2.35Hz,1H)8.65(dd,J＝2.35,0.78Hz,1H)10.15(s,1H)。
实施例30
(R)-N-(4-(1,1-二氟乙氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5- 基)烟酰胺
在氩气气氛下将K3PO4(113mg，0.532mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(99mg，0.355mmol)和Pd(PPh3)4(10.24mg，8.86μmol)加入(R)-5-溴-N-(4-(1,1-二氟乙氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段30.1,80mg，0.177mmol)在甲苯(1.5mL)中的溶液中，并将RM在110℃搅拌1h。将RM用EtOAc(20mL)稀释，用饱和的NaHCO3溶液(20mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12g DCM/EtOH，97:3至95:5)，得到N-(4-(1,1-二氟乙氧基)苯基)-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(66mg，0.129mmol)，将其溶于DCM(1.5mL)中，用TFA(0.546mL，7.09mmol)处理，并在室温搅拌2h。将RM用EtOAc(20mL)稀释，用饱和的NaHCO3溶液(25mL)处理，并用EtOAc萃取(20mL)。将合并的萃取物用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经制备型HPLC纯化(条件10)。将含纯产物的级分合并，用0.5g NaHCO3处理，并将MeCN减压蒸发掉。将残余物水溶液用DCM萃取，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝5.42min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.82min,m/z＝430.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.68-1.87(m,2H)1.93(t,J＝13.67Hz,3H)2.94(d,J＝11.71Hz,1H)3.15-3.33(m,2H)3.38-3.48(m,1H)4.19(br.s,1H)6.37(s,1H)7.15(d,J＝9.37Hz,2H)7.65-7.83(m,J＝9.37Hz,3H)8.03(d,J＝2.34Hz,1H)8.73(d,J＝2.34Hz,1H)。
阶段30.1:(R)-5-溴-N-(4-(1,1-二氟乙氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
将在密封小瓶中的5-溴-6-氯-N-(4-(1,1-二氟乙氧基)苯基)烟酰胺(阶段30.2，700mg，1.752mmol)、(R)-吡咯烷-3-醇(0.170mL，2.102mmol)和DIPEA(0.673mL，3.85mmol)和iPrOH(2mL)的混合液加热至120℃达1h。将RM用EtOAc(80mL)稀释，用柠檬酸10％(40mL；～pH4)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用盐水(2x 40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其用Et2O和正己烷洗涤，并将结晶干燥，得到标题产物，为浅褐色固体。HPLC(条件5)tR＝6.4min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.02min,m/z＝442.1/444.0[M+H]+。
阶段30.2:5-溴-6-氯-N-(4-(1,1-二氟乙氧基)苯基)烟酰胺
在氮气气氛下将草酰氯(653μL，7.46mmol)加入5-溴-6-氯烟酸(1.2g，4.97mmol)和DMF(20μL，0.258mmol)在DCM(40mL)中的混合液中，并将RM在室温搅拌2h。将溶剂蒸发，将残余物溶于DCM(10mL)中，并再次蒸发至干燥。将残余物溶于THF(30mL)中，加入DIPEA(1.737mL，9.95mmol)，并将该RM冷却至-15℃。在15min的时间内滴加在THF(10mL)中的4-(1,1-二氟乙氧基)苯胺(阶段30.3,0.932g，5.22mmol)，并将RM在室温搅拌1h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物用EtOAc(100mL)稀释，用柠檬酸10％(60mL)处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用饱和的Na2CO3水溶液(50mL)和盐水(2x 50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其混悬于正己烷中，过滤，并干燥，得到标题产物，为浅褐色固体。HPLC(条件5)tR＝7.3min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.16min,m/z＝391/393[M+H]+。
阶段30.3:4-(1,1-二氟乙氧基)苯胺
将1-(1,1-二氟乙氧基)-4-硝基苯(阶段30.4，2.95g，13.94mmol)在EtOH(100mL)中的溶液氢化(兰尼镍1.0g；在室温26.5h)。将RM经由过滤，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的标题产物，为棕色油状物。HPLC(条件5)tR＝4.5min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.74min,m/z＝174.1[M+H]+。
阶段30.4:1-(1,1-二氟乙氧基)-4-硝基苯
将4-硝基苯乙酮(2.45g，14.54mmol)和HF-吡啶(10.11mL，116mmol)加入XeF2(4.92g，29.1mmol)和DCM(50mL)在塑料小瓶中的混合液中，并将RM在室温搅拌20h。将RM小心地加入EtOAc(150mL)和饱和的NaHCO3(250mL)的搅拌的混合液中，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用盐水(2x 100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，40g，正己烷/EtOAc(95:5))，得到标题产物，为黄色油状物。HPLC(条件5)tR＝6.9min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.05min。
实施例31
(R)-N-(4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(R)-5-溴-N-(4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺(阶段31.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.89min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.98min,m/z＝484.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.65-1.89(m,2H)2.83-2.98(m,1H)3.18-3.33(m,2H)3.36-3.49(m,1H)4.13-4.24(m,1H)4.77-4.93(m,1H)6.31-6.43(m,1H)7.62(d,J＝8.59Hz,2H)7.77-7.84(m,1H)7.91-8.09(m,3H)8.64-8.81(m,1H)10.31(s,1H)12.83-12.96(m,1H)。
阶段31.1:(R)-5-溴-N-(4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)烟酰胺
以类似于阶段8.1中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯基)烟酰胺(阶段31.2)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到白色粉末。HPLC(条件4)tR＝6.05min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.18min,m/z＝498[M+H]+。
阶段31.2:5-溴-6-氯-N-(4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段9.3中所述的方式使用5-溴-6-氯烟酸和4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯胺(阶段31.3)制备标题化合物，得到浅褐色结晶泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.77min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.31min,m/z＝444.8[M+H]+。
阶段31.3:4-(2-氯-1,1,2,2-四氟乙基)苯胺
在氩气气氛下将Ni(PPh3)4(222mg，0.2mmol)加入在MW瓶中的苯胺(745mg，8mmol)和1-氯-1,1,2,2-四氟-2-碘乙烷(1049mg，4mmol)在DMF(10mL)中的混合液中。将该小瓶密封，并将RM在80℃搅拌两天。在室温冷却后，将该RM溶于Et2O中，用NaHCO310％和盐水洗涤，经MgSO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，正庚烷/EtOAc,，0至25％EtOAc)并进一步经反相色谱法纯化(MPLC，15-25μm柱，洗脱液:水+0.1％甲酸/MeCN+0.1％甲酸，梯度10至50％MeCN+0.1％甲酸)。将含纯产物的级分合并，并将MeCN减压蒸发掉，得到水相，将其用NaHCO3中和，并用Et2O萃取。将合并的萃取物经MgSO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到标题化合物，为红色油状物。HPLC(条件4)tR＝5.48min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.04min,m/z＝269[M+H]+。
实施例32
(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)-N-(6-((三氟甲基)硫基)吡 啶-3-基)烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(6-((三氟甲基)硫基)吡啶-3-基)烟酰胺(阶段32.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.18min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.82min,m/z＝451.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.64-1.89(m,2H)2.94(d,J＝11.73Hz,1H)3.18-3.33(m,2H)3.36-3.49(m,1H)4.18(br.s,1H)4.81(d,J＝3.13Hz,1H)6.38(s,1H)7.68-7.85(m,2H)8.02(d,J＝1.95Hz,1H)8.32(dd,J＝8.60,2.35Hz,1H)8.73(d,J＝2.35Hz,1H)8.98(d,J＝2.35Hz,1H)10.42(s,1H)12.89-13.12(m,1H)。
阶段32.1:(R)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(6-((三氟甲基)硫基)吡啶-3-基)烟酰胺
以类似于阶段8.1中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(6-((三氟甲基)硫基)吡啶-3-基)烟酰胺(阶段32.2)和(R)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.53min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.01min,m/z＝463.1[M+H]+。
阶段32.2:5-溴-6-氯-N-(6-((三氟甲基)硫基)吡啶-3-基)烟酰胺
以类似于阶段9.3中所述的方式使用5-溴-6-氯烟酸和6-(三氟甲基硫基)吡啶-3-胺制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.43min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.15min,m/z＝411.9[M-H]-。
实施例33
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(4-甲基-1H-吡 唑-5-基)烟酰胺
将DIPEA(77μL，0.44mmol)加入在小瓶中的6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段33.1,99mg，0.2mmol)和(R)-吡咯烷-3-醇，20.9mg，0.24mmol)在iPrOH(200μL)中的溶液中，将其密封，并将该RM混合液在140℃搅拌1.5h。在室温冷却后，将该RM溶于EtOAc中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉。将残余物溶于中DCM(1.1mL)，冷却至0℃，处理用TFA(0.616mL，8mmol)，并在室温搅拌3h。将该RM倾入10％Na2CO3水溶液(10mL)，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，DCM/MeOH，2％至10％MeOH)，得到标题化合物，为浅褐色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.79min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.95min,m/z＝464[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.63-1.92(m,5H)2.81-2.96(m,1H)3.05-3.41(m,3H)4.17(br.s,1H)4.81(br.s,1H)7.30(d,J＝8.60Hz,2H)7.58(s,1H)7.79-8.02(m,3H)8.73(s,1H)10.15(s,1H)12.58-12.85(m,1H)。
阶段33.1:6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
在氩气气氛下将K3PO4(191mg，0.9mmol)和Pd(PPh3)4(17.33mg，0.015mmol)加入在小瓶中的6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-碘烟酰胺(阶段25.2,138mg，0.3mmol)和4-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(131mg，0.45mmol)在甲苯(1.5mL)中的溶液中，将其密封，并在110℃加热18h。将该RM倾入20mL水中，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，正庚烷/EtOAc，5至50％EtOAc)，并从正庚烷中结晶，得到标题化合物，为类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝6.8min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.26min,m/z＝495[M-H]-。
实施例34
(S)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基) 烟酰胺
以类似于实施例8中所述的方式使用(S)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段34.1)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑制备标题化合物，得到类白色泡沫。HPLC(条件4)tR＝4.42min,手性HPLC(AD-H,250x 4.6mm,洗脱液:EtOH/MeCN(98:2),0.5mL/min,UV 210nm)tR＝28.27min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.91min,m/z＝434.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.63-1.88(m,2H)2.92(d,J＝11.73Hz,1H)3.19-3.29(m,2H)3.34-3.47(m,1H)4.18(br.s,1H)4.80(d,J＝3.13Hz,1H)6.37(s,1H)7.31(d,J＝8.99Hz,2H)7.75-7.89(m,3H)8.00(d,J＝2.35Hz,1H)8.71(d,J＝2.35Hz,1H)10.16(s,1H)12.85-13.12(m,1H)。
阶段34.1:(S)-5-溴-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺
以类似于阶段8.1中所述的方式使用5-溴-6-氯-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.3)和(S)-吡咯烷-3-醇制备标题化合物，得到类白色结晶泡沫。HPLC(条件4)tR＝5.83min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.06min,m/z＝446.1[M+H]+。
实施例35
(S)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)-6-(3-羟基吡咯烷 -1-基)烟酰胺
以类似于实施例5中所述的方式使用6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(4-氟-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段25.1)和(S)-3-吡咯烷醇制备标题化合物，得到白色固体。HPLC(条件5)tR＝5.69min,手性HPLC(OD-H,250x 4.6mm,洗脱液:正庚烷/EtOH/MeOH(85:10:5),1mL/min,UV 210nm)tR＝12.62min,UPLC-MS(条件6)tR＝0.97min,m/z＝468.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.71-1.81(m,1H)1.81-1.92(m,1H)3.02(d,J＝11.34Hz,1H)3.24-3.37(m,2H)3.40-3.49(m,1H)4.23(br.s,1H)4.89(br.s,1H)7.32(d,J＝9.4Hz,2H)7.76-7.98(m,J＝9.00Hz,3H)8.03(d,J＝2.35Hz,1H)8.79(d,J＝2.35Hz,1H)10.20(br.s,1H)12.99(br.s,1H)。
实施例36
1-(5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)氨基甲酰基)-3-(1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基) 吡咯烷-3-甲酸甲酯
将DIPEA(181μL，1.035mmol)加入6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段36.1，100mg，0.207mmol)、3-吡咯烷甲酸甲酯盐酸盐(44.5mg，0.269mmol)和iPrOH(414μL)在MW小瓶中的混合液中，将小瓶用氩气净化，密封，并在130℃搅拌24h。将RM用EtOAc稀释，用盐水处理，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，正庚烷/EtOAc，40％至100％EtOAc)，随后经制备型TLC纯化(硅胶，洗脱液EtOAc)。再从1,4-二烷进行冻干，得到标题化合物，为白色的轻质固体。UPLC-MS(条件6)tR＝1.09min,m/z＝492.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.90-2.02(m,1H)2.02-2.14(m,1H)3.06-3.20(m,1H)3.23-3.48(m,4H)3.61(s,3H)6.35-6.48(m,1H)7.34(d,J＝8.78Hz,2H)7.79-7.90(m,1H)7.89(d,J＝8.80Hz,2H)8.03-8.13(m,1H)8.70-8.83(m,1H)10.26(s,1H)。
阶段36.1:6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
将1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(9.45g，34.0mmol),Na2CO3(39.2mL，78mmol)和PdCl2(dppf)(0.956g，1.307mmol)加入在DME(160mL)中的6-氯-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-5-碘烟酰胺(阶段25.2,12g，26.1mmol)。将该混合液抽真空/用氩气净化3次，并在80℃搅拌22h。将RM用EtOAc(350mL)稀释，用水(4x 150mL)洗涤，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，850g，EtOAc/正己烷(1:2))，并从iPr2O/EtOAc中结晶，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝7.52min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.22min,m/z＝483/485[M+H]+。
实施例37
1-(5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)氨基甲酰基)-3-(1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基)吡咯 烷-3-甲酸
将1 M LiOH水溶液(0.199mL，0.199mmol)加入1-(5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)氨基甲酰基)-3-(1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基)吡咯烷-3-甲酸甲酯(实施例36,24.5mg，0.05mmol)在MeOH(0.5mL)/THF(1mL)中的溶液中，并将RM在室温搅拌1小时20分。将RM用1M HCl(4当量)处理，并将有机溶剂减压蒸发掉。将水相用EtOAc萃取两次，并将合并的萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压浓缩至0.5mL的体积。加入正庚烷，并将产物过滤，用正庚烷洗涤，并干燥，得到标题化合物，为浅褐色固体。UPLC-MS(条件6)tR＝0.96min,m/z＝478.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.86-2.12(m,2H)2.90-3.09(m,1H)3.17-3.54(m,4H)6.41(d,J＝2.08Hz,1H)7.34(d,J＝9.05Hz,2H)7.66-7.83(m,1H)7.88(d,J＝9.17Hz,2H)8.06(d,J＝2.44Hz,1H)8.70-8.84(m,1H)10.23(s,1H)12.90(br.s,1H)。
实施例38
(S)-(R)-2-氨基-3-甲基丁酸1-(5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)氨基甲酰 基)-3-(1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基)吡咯烷-3-基酯
将Boc-L-缬氨酸(726mg，3.34mmol)和DMAP(102mg，0.836mmol)加入(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9,800mg，1.672mmol)在DCM(20mL)中的混合液中，并将该混悬液在室温搅拌30min。然后加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(0.521mL，3.34mmol)，并将得到的溶液在室温搅拌19h。将RM用EtOAc(150mL)稀释，用饱和的NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(2x 50mL)洗涤，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其混悬于EtOAc(5mL)中，在室温搅拌，过滤，并用10mLEtOAc洗涤。将滤液减压蒸发至干燥，并将得到的中间体溶于DCM(15mL)中，用TFA(4.09mL，53.0mmol)处理，并在室温搅拌92h。将溶剂减压蒸发掉，并将残余物溶于EtOAc(150mL)中，用饱和的NaHCO3水溶液(50mL)和水(2x 50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其溶于MeOH(20mL)中，并用Si-Thiol(Biotage 1.3mmol/g，1g)处理。将硅胶(5g)加入该混合液中，将溶剂减压蒸发掉，并将残余物经快速色谱纯化(硅胶柱，120g，DCM/MeOH 95:5)，随后经制备型SFC纯化(DEAP柱；25％等度洗脱15min)。将含纯产物的级分合并，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其溶于热的MeOH(4mL)中，并经由PTFE 0.45μm过滤器过滤。将滤液超声处理5min，并将得到的白色混悬液在室温搅拌2h，过滤，用MeOH(1mL)洗涤，并干燥，得到标题产物，为白色固体。HPLC(条件5)tR＝5.41min,UPLC-MS(条件3)tR＝0.86min,m/z＝549.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.77(d,J＝6.65Hz,3H)0.81(d,J＝6.65Hz,3H)1.51-1.64(m,2H)1.69-1.81(m,1H)1.84-1.94(m,1H)1.98-2.12(m,1H)3.02(d,J＝5.08Hz,1H)3.15(d,J＝12.90Hz,1H)3.30-3.43(m,2H)3.46-3.57(m,1H)5.13-5.25(m,1H)6.39(br.s,1H)7.31(d,J＝8.21Hz,2H)7.76-7.91(m,3H)8.05(s,1H)8.73(br.s,1H)10.21(s,1H)12.94(br.s,1H)。
实施例39
磷酸二氢(R)-1-(5-((4-(氯二氟甲氧基)苯基)氨基甲酰基)-3-(1H-吡唑-5-基) 吡啶-2-基)吡咯烷-3-基酯
将TFA(1.227mL，15.93mmol)加入N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((R)-3-((3-氧化-1,5-二氢苯并[e][1,3,2]二氧杂磷杂-3-基)氧基)吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段39.1,620mg，0.797mmol)在DCM(10mL)中的溶液中，并将RM在室温搅拌20h。加入另外的TFA(500μL)，并将RM在室温再搅拌4h。将RM用EtOAc(100mL)稀释，用饱和的Na2CO3水溶液(70mL)处理，并用EtOAc萃取(50mL)。将合并的萃取物用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到残余物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12g DCM/EtOH，9:1至4:6)。将中间体溶于MeOH/THF(10mL，1:1)中，并氢化(60mg Pd/C5％，0.1巴，22-25℃，6.5h)。将RM经由过滤，并将溶剂减压蒸发掉。将残余物溶于MeOH/THF中，并用PL-Thiol MP SPE柱筒(StratoSpheresTM)处理。将树脂过滤掉，并将溶剂减压蒸发掉，得到标题产物。HPLC(条件5)tR＝5.50min,UPLC-MS(条件6)tR＝0.76min,m/z＝530.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.88-2.08(m,2H)3.12-3.48(m,4H)4.73(br.s,1H)6.37-6.44(m,1H)7.33(d,J＝8.99Hz,2H)7.76(s,1H)7.87(d,J＝8.99Hz,2H)8.04-8.08(m,1H)8.73-8.78(m,1H)10.21(s,1H)。
阶段39.1:N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((R)-3-((3-氧化-1,5-二氢苯并[e][1,3,2]二氧杂磷杂-3-基)氧基)吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺
将N,N-二乙基-1,5-二氢苯并[e][1,3,2]二氧杂磷杂-3-胺(355mg，1.483mmol)加入在小瓶中的N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)烟酰胺(阶段9.1，200mg，0.371mmol)和四唑在MeCN(8.240mL，3.71mmol)中的混合液中，并将RM在室温搅拌3h。将该RM冷却至5℃，用TEA(0.775mL，5.56mmol)和H2O2水溶液(0.379mL，3.71mmol)处理，并在0℃搅拌30min，随后在室温搅拌3h。将RM用10％Na2S2O3溶液(20mL)淬灭，并用EtOAc萃取。将合并的萃取物用水(20mL)和盐水(15mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发掉，得到粗制的产物，将其经快速色谱纯化(硅胶柱，12gDCM/MeOH，98:2至9:1)，得到标题产物，为白色泡沫。HPLC(条件5)tR＝7.3min,UPLC-MS(条件3)tR＝1.18min,m/z＝716.3[M+H]+。
实施例40
磷酸二氢(R)-1-(3-(1H-吡唑-5-基)-5-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基甲酰基) 吡啶-2-基)吡咯烷-3-基酯
以类似于实施例39中所述的方式使用(R)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-3-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)烟酰胺(阶段2.1)和N,N-二乙基-1,5-二氢苯并[e][1,3,2]二氧杂磷杂-3-胺制备标题化合物，得到浅褐色固体。HPLC(条件5)tR＝5.3min,UPLC-MS(条件6)tR＝0.75min-m/z＝514.4[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.88-2.07(m,2H)3.21-3.49(m,4H)4.66-4.76(m,1H)6.41(d,J＝1.96Hz,1H)7.02-7.15(m,1H)7.34(d,J＝8.68Hz,2H)7.77(s,1H)7.87(d,J＝9.05Hz,2H)8.06(d,J＝2.32Hz,1H)8.75(d,J＝2.32Hz,1H)10.21(s,1H)。
实施例41
固体分散体制剂
可以制备本发明化合物的固体分散体制剂，其中增强它们的溶解度对生物利用度和/或渗透性有益。
使用(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9，参见图1)无定形分散体与选自PVP VA64和Pharmacoat 603的赋形剂制备固体分散体制剂。首先，通过将(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9,2.5克)与PVP VA 64(3.75克)和Pharmacoat 603(3.75克)混合制备用于喷雾干燥的溶液。加入50/50二氯甲烷/乙醇的混合液直至所有组分溶解，如无颗粒和无浑浊的澄清溶液(～200mL)所示。或者，可以用丙酮/乙醇/水(5:4:1)的混合液代替50/50二氯甲烷/乙醇的混合液。在Büchi B290Mini-喷雾干燥器上进行喷雾干燥，入口温度70℃，在85％抽吸，氮气流为50mmHg，泵在15％，且喷嘴清洁器为0，得到5.5克(55％)。得到的喷雾-干燥固体分散体包含23.6％的(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的载药量、37.5％PVP VA64和37.5％Pharmacoat 603。该分散体为无定形的，具有117℃的玻璃化转变温度(Tg)值，且包含约1.4％水，如通过热重分析(TGA)测定。该固体分散体在pH 1、30分钟后转换为pH 6.8的溶出显示其在酸性pH下完全溶出。该分散体在中性pH的pH挑战后仍然保持完全溶解。
将该分散体在室温以3mg/mL的浓度(作为药物)混悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中达12小时。没有发现结晶，粒径D(0.9；当90％的颗粒在所示数值以下时的颗粒直径)是14.134，具有非常均匀和狭窄的粒径分布。该药物没有从混悬液中结晶出来，并且没有发现化学降解(如UPLC所评价)。该混悬液具有99.4％的化学纯度，其匹配该混悬液和药物本身的T0纯度。
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的固体分散体制剂在犬中的提高的性质可以通过以下药物动力学参数表证明。
制剂类型 固体分散体 混悬剂
剂量[mg/kg] 60 60
AUC[mM*h](SD) 671.9 102.9
C最大[nM](SD) 47127 7314
BAV*[％](SD) 179.1 27.4
T最大[h](SD) 2.00 3.3
施用体积[ml/kg] 5 5
等级暴露(Rank exposure)/C最大 14.2 14.1
(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)的固体分散体制剂在60mg/kg的剂量给出比结晶混悬剂高6.5倍的暴露(671.9μM对比102.9μm)。
试验
本文所述的本发明化合物效用可以通过以下试验中的测试证实。评价了本发明化合物在生物化学试验中抑制ABL1活性和在细胞试验中抑制BCR-ABL1活性的能力。进一步测试了本发明化合物，并使用KCL-22异种移植物模型证明了其在体内是有效的。
生物化学试验
蛋白激酶的表达和纯化-使用标准的表达纯化方法进行人ABL表达和纯化。制备ABL64-515蛋白质并用于在体外的激酶测定。使用双重表达载体pCDF Duet-1(Novagen)，通过携带ABL1的DNA片段(1a同工型，具有PreScission蛋白酶切割位点之后的N-端His6-标记)和人蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(残基1-283，未标记)的共表达载体产生该蛋白质。在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中表达His-ABL，并在Ni-NTA柱(Qiagen)上通过Ni-亲和性分离ABL蛋白质。通过PreScission蛋白酶(GE Healthcare)除去His-标记并将该非磷酸化的ABL进一步在Mono Q HR 10/10(GE Healthcare,单磷酸化ABL是总ABL蛋白至的约10-20％)和HiLoad 16/60Superdex200尺寸排阻色谱柱(GE Healthcare)纯化。将非磷酸化的ABL64-515蛋白质通过质谱分析进行分析，以等分试样快速冷动(flash-frozen)并在–80℃储存。如(S.W.Cowan-Jacob,G.Fendrich,P.W.Manley,W.Jahnke,D.Fabbro,J.Liebetanz,T.Meyer,c-Src crystal structure provides insightsinto c-Src activation.结构13(2005)861-871)所述表达并纯化SRC(氨基酸83-535或Src83-535)。
放射ABL1(64-515)(Radio ABL1(64-515))试验
为测定ABL激酶活性，使用放射滤膜结合试验。该试验通过将用10μLATP(20μM ATP，具有0.1μCi[γ-33P]-ATP)预稀释的10μL化合物与磷酸受体肽聚[Ala6Glu2LysHBr5Tyr1]＝聚AEKY)在20mM Tris/HCl pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、0.01mM Na3VO4、50mM NaCl中混合来进行。加入10μL酶(5nM至20nM)以开始反应。酶与化合物的预孵育(当述及时)是通过在加入底物混合物(ATP和/或肽底物)前使所述酶暴露于化合物进行的。在室温15分钟后，通过加入50μL 125mM EDTA停止反应，并在根据制造商的说明制备的滤板(PVDF或MAIP；Millipore,Volketswil,瑞士)上分离结合33P的所述肽。将滤板用0.5％H3PO4洗涤3x，随后每孔加入30μL闪烁合剂(Microscint,Perkin Elmer)，然后在TopCount NXT闪烁计数器(Perkin Elmer)中进行分析。将结果表示为IC50值。对ATP的Km值通过通过以下测定：使用增加浓度的ATP并保持外源受体蛋白质底物(聚-AEKY)在一个恒定的浓度(在约其Km的2-倍)测试ABL激酶，反之亦然。Km和Vmax如所述根据Eadie-Hofstee计算(D.Fabbro,G.Fendrich,V.Guez,T.Meyer,P.Furet,J.Mestan,J.D.Griffin,P.W.Manley,S.W.Cowan-Jacob,Targeted therapy with imatinib:An exceptionor a rule？Handbook of Experimental Pharmacology 167,Inhibitors ofProtein Kinases and Protein Phosphates(2005)361-389)。将数据绘制为V对比V/S，其中V是在给定底物(S)浓度时的反应速率，并使用线性回归分析将其拟合为直线，其中该线的斜率相应于-Km且Y轴截距表示V最大。
Caliper ABL1(64-515)试验
所有试验在384-孔微量滴定板中进行。每个实验板包含40个测试化合物的8-点系列稀释物，以及作为参比的星孢素的四个8-点系列稀释物，加上16个高和16个低对照。液体操作和孵育的步骤在配备InnovadyneNanodrop Express的Thermo CatX工作站进行。在移液步骤间期，在洗涤循环中使用洗涤缓冲液清洗尖端。
通过加入每孔50nL在90％DMSO中的化合物溶液准备试验板。通过逐步加入每孔4.5μL肽/ATP-溶液(50mM HEPES pH 7.5、1mM DTT、0.02％BSA、0.6％DMSO、10mMβ-甘油磷酸盐和10μM原钒酸钠、20mM MgCl2、2mM MnCl2、4μM ATP、4μM肽(FITC-Ahx-EAIYAAPFAKKK-NH2))和每孔4.5μL酶溶液(50mMHEPES pH 7.5、1mM DTT、0.02％BSA、0.6％DMSO、10mMβ-甘油磷酸盐和10μM原钒酸钠、20mM MgCl2、2mM MnCl2、3.5nM ABL(ABL(64-515)，内部制造，从大肠杆菌制备))来起始反应。将激酶反应物在30℃孵育60分钟，随后通过加入每孔16μL停止溶液(100mM HEPES pH7.5、5％DMSO、0.1％Caliper包被试剂、10mM EDTA和0.015％Brij35)终止反应。将具有终止了的激酶反应物的板转移至Caliper LC3000工作站进行读数。使用Caliper微流体泳动率变动技术将磷酸化和未磷酸化的肽分离。简言之，将来自终止的激酶反应的样品应用于该芯片。通过恒定的缓冲液流将分析物运输通过该芯片，并通过其标签的荧光信号监控底物肽的迁移。磷酸化的肽(产物)和未磷酸化的肽(底物)在电场中通过它们的电荷/质量比分离。激酶活性从形成的磷酸肽的量来计算。IC50值通过非线性回归分析从在化合物的不同浓度的抑制百分比来计算。
化合物稀释物的制备：将测试化合物溶于DMSO(10mM)中，并转移至1.4mL平底或V-型Matrix管，所述管带有独特2D矩阵编码。如果不立即使用，则将该储备溶液存储于+2℃。最佳的操作是，将管解冻并通过扫描器识别，由此生成了工作表，其指导随后的工作步骤。
将化合物稀释物在96-孔板中制备。该模式能够进行包括4个参比化合物的最多40个单独的测试化合物(8个浓度(单点))的试验。稀释方案包括制备“预稀释板”、“主板”和“试验板”。
预稀释板：将聚丙烯96-孔板用作预稀释板。制备了总计4个预稀释板，每个包括位于板的A1-A10位置的10个化合物、位于A11的一个标准化合物和位于A12的一个DMSO对照。所有稀释步骤都在HamiltonSTAR机器人进行。
主板：将4个“预稀释板”的30μL单独化合物的稀释物(包括标准化合物和对照)转移至384“主板”，其包括以下浓度1’810、362、72.5、54.6、14.5、2.9、0.58和0.12μM，分别在90％的DMSO中。
试验板：然后通过用HummingBird 384-通道分液器吸取50nL“主板”的每个化合物的稀释物至384-孔“试验板”中来制备相同的“试验板”。这些板直接用于该试验，其在9.05μL总体积中进行。这导致在该试验中化合物终浓度为10、2.0、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064和0.000128μM且最终DMSO浓度为0.5％。
细胞试验
为评价本发明化合物在细胞试验中抑制BCR-ABL1活性的能力，相对于不依赖于BCR-ABL1表达的细胞，评价了化合物对于依赖于BCR-ABL1表达的细胞增殖的选择性抑制能力。
使用鼠骨髓衍生的细胞系Ba/F3来生成适合的细胞系模型。Ba/F3细胞从德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)(DSMZ,Braunschweig和DSMZ号ACC 300)获得。亲本Ba/F3细胞的生长和存活依赖于IL3，将所述细胞用作参比细胞系，其生长和存活不依赖于BCR-ABL1活性。这些细胞称为Ba/F3-WT。
为了产生生长和存活依赖于BCR-ABL1表达的Ba/F3细胞，采用含p210BCR-ABL1表达盒的基于MSCV的逆转录病毒载体使用逆转录病毒转导将Ba/F3细胞进行设计以表达BCR-ABL1。当生长缺乏IL-3时，所述细胞的增殖依赖于BCR-ABL1的表达。(Daley,G.Q.和Baltimore,D.Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line bythe chronic myeloid leukemia-specific p210BCR-ABL1protein.PNAS1988；85:9312-9316)。这些细胞被称为Ba/F3-BCR-ABL-WT。类似的方法被用于产生依赖于BCR-ABL1变体的Ba/F3细胞，其中苏氨酸315被异亮氨酸替代。这些细胞被称为Ba/F3-BCR-ABL-T315I。
将Ba/F3-WT细胞保持在RPMI1640培养基中，其中有L-谷氨酰胺、HEPES(Lonza)、10％FBS(Gibco)和5ng/ml IL-3(Calbiochem)。将Ba/F3-BCR-ABL1-WT细胞和Ba/F3-BCR-ABL1-T315I细胞保持在RPMI1640培养基中，其中有L-谷氨酰胺、HEPES(Lonza)和10％FBS(Gibco)。
增殖试验
对于各细胞系，将细胞密度调节至50000细胞/mL，并向384-孔试验板的每个孔中加入50μL(2500细胞)。
将测试化合物以10mM的密度混悬于DMSO中。使用Janus液体分配器(PerkinElmer)在384-孔板中将各化合物用DMSO进行三倍系列稀释。通过ATS-100(EDC)的声波转移将化合物递送至含2500细胞(50μL体积)的试验板。对于Ba/F3-BCR-ABL1-WT细胞试验，将2nL的各化合物稀释物转移至试验板，最终试验浓度0.4μM、0.13μM、0.044μM、0.015μM、0.005μM、0.001μM、0.00033μM、0.00011μM、0.000037μM、0.000012μM。对于Ba/F3-WT和Ba/F3-BCR-ABL1-T315I细胞试验，将50nL的各化合物稀释物转移至试验板，最终试验浓度10μM、3.33μM、1.11μM、0.37μM、0.12μM、0.041μM、0.014μM、0.0046μM、0.0015μM、0.00051μM。
在37℃将细胞在具有5％二氧化碳的潮湿环境中孵育48小时。根据制造商说明制备Britelite plus溶液(Perkin Elmer)，并将25μL加入试验板的各孔中。将各板孵育3-5分钟，并在EnVision Multimode读板仪(PerkinElmer)上检测发光。发光度与各孔中的细胞数量相关。因此可以计算各抑制剂浓度的作用，并得到IC50值。
在放射过滤结合(Radio)试验中，本发明化合物对于抑制Abl激酶活性显示范围为0.1nM至12nM的IC50值。对于微流体迁移位移试验(Caliper)，IC50值可以在0.1nM至10nM的范围。对于Ba/F3-BCR-ABL-WT和T315I细胞增殖试验，GI50值分别可以在0.8nM至110nM和13nM至4.2μM的范围。
生物化学数据表
Ba/F3-BCR-ABL1-WT和T315I细胞增殖数据的表
在KCL-22异种移植物模型中的体内功效–单活性剂治疗
在小鼠KCL-22异种移植物模型中将本发明化合物口服给药7天。将购自Harlan(Indianapolis IN)的6-8周大的雌性裸鼠在右背腋区皮下植入在50％基质胶(BD Biosciences,#354234)中的5x106KCL-22细胞。当肿瘤体积达到平均238mm3(肿瘤植入10天后)时，开始药物治疗。每周制备在磷酸盐缓冲液中的本发明化合物，并每天两次以3-30mg/kg通过口腔管饲法给药(n＝6只小鼠/剂量水平)。每周两次用数字测径规测量肿瘤体积，并计算为长度x宽度2/2。
本发明化合物显示了统计学上显著的消退。例如，与介质-治疗的小鼠相比，每天两次3mg/kg剂量的(R)-N-(4-(氯二氟甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺(实施例9)产生45％的肿瘤生长抑制，而每天两次施用7.5、15和30mg/kg的剂量分别观测到56％、88％和92％的消退。作为阳性对照，每天两次以75mg/kg施用尼洛替尼导致82％的肿瘤消退(图2)。
在KCL-22异种移植物模型中的体内功效–双活性剂治疗
将购自Harlan(Indianapolis IN)的6-8周大的雌性裸鼠在右背腋区皮下植入在50％基质胶(BD Biosciences,#354234)中的2x106KCL-22细胞。当肿瘤体积达到平均189mm3(肿瘤植入9天后)时，开始药物治疗。每周制备在磷酸盐缓冲液中的本发明化合物，将其每天两次以30mg/kg通过口腔管饲法施用，并每天两次以75mg/kg施用尼洛替尼溶液。动物单独接受单一活性剂或同时接受这两种活性剂的组合。每周两次用数字测径规测量肿瘤体积，并计算为长度x宽度2/2。
在每天治疗4周后，使用尼洛替尼单独治疗的动物达到>84％的肿瘤消退，但其后大多数肿瘤回复至>500mm3。具有尼洛替尼-耐药的肿瘤的动物然后每天接受实施例9的治疗，持续监测了肿瘤响应(图3)。
用尼洛替尼和实施例9同时治疗的动物证实了至研究结束在所有动物中肿瘤完全消退(图4)。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅为举例说明的目的，并且根据这些实施例和实施方案的多种的修改或变化将被提示给本领域技术人员，并且被包括于本申请的主旨和范围及所附的权利要求的范围之内。

Claims (26)

1.式(I)的权利要求1的化合物:
其中：
R1是吡唑基；其中所述吡唑基是未被取代的或被1至2个R6基团取代；
R2是吡咯烷基；其中所述吡咯烷基被1个R7基团取代；
R3选自氢和卤素；
R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3；
R6每次出现时独立地选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟代乙基、乙基和环丙基；
R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基、氰基和氨基-羰基；
Y选自CH和N；
Y1选自CH和N；
Y2选自CF2、O和S(O)0-2；且
Y3选自氢、氯、氟、甲基、二氟甲基和三氟甲基；或其可药用盐。
2.式(Ib)的权利要求1的化合物:
其中：
R3选自氢和卤素；
R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3；
R6当连接于吡唑基环的氮时选自氢、甲基、羟基-乙基、氟代乙基、乙基和环丙基；且R6当连接于吡唑基环的碳原子时选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟代乙基、乙基和环丙基；
R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基、氰基和氨基-羰基；
Y1选自CH和N；
Y2选自CF2、O和S(O)0-2；
Y3选自氢、氟、氯、甲基、二氟甲基和三氟甲基；或其可药用盐。
3.式(Ic)的权利要求2的化合物:
其中：
R3选自氢和卤素；
R4选自–SF5和–Y2–CF2–Y3；
R6当连接于吡唑基环的氮时选自氢、甲基、羟基-乙基、氟代乙基、乙基和环丙基；且R6当连接于吡唑基环的碳原子时选自氢、羟基、甲基、甲氧基、氰基、三氟甲基、羟基-甲基、卤素、氨基、氟代乙基、乙基和环丙基；
R7选自羟基、甲基、卤素、甲氧基、羟基-甲基、氨基、甲基-氨基、氨基-甲基、三氟甲基、2-羟基丙-2-基、甲基-羰基-氨基、二甲基-氨基、2-氨基-3-甲基丁酰基)氧基、羧基、甲氧基-羰基、膦酰基氧基、氰基和氨基-羰基；
Y1选自CH和N；
Y2选自CF2、O和S(O)0-2；
Y3选自氢、氟、氯、甲基、二氟甲基和三氟甲基；或其可药用盐。
4.权利要求3的化合物或其可药用盐，所述化合物选自:
5.权利要求3的化合物或其可药用盐，所述化合物选自:
6.权利要求3的化合物或其可药用盐，所述化合物选自:
7.权利要求1的化合物或其可药用盐，所述化合物是:
8.选自以下的化合物:
9.权利要求1的化合物，其是(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺或其可药用盐。
10.药物组合物，其包含(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺无定形分散体和1至2种选自PVPVA64和Pharmacoat 603的赋形剂。
11.权利要求10的组合物，其中Pharmacoat 603的百分比范围为30％至45％，PVP VA64的百分比范围为30％至45％，且(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺的百分比范围为20％至30％。
12.权利要求11的组合物，其中Pharmacoat 603的百分比是37.5％、PVP VA64的百分比是37.5％，且(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺的百分比是25％。
13.治疗具有选自慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的白血病的患者方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺或其可药用盐、并任选地依次或同时施用治疗有效量的选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼的化合物。
14.权利要求13的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺或其可药用盐。
15.权利要求13的方法，其包括依次施用治疗有效量的化合物(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺或其可药用盐，并依次施用治疗有效量的选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼的化合物。
16.权利要求13的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺或其可药用盐，并同时施用治疗有效量的选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼的化合物。
17.权利要求16的方法，其中将(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺以90-130mg/kg的范围给药。
18.权利要求17的方法，其中尼洛替尼以10-50mg/kg给药。
19.权利要求18的方法，其中伊马替尼以50-200mg/kg给药。
20.用于治疗癌症的根据权利要求1至9中的任意一项的式(I)的化合物或其可药用盐。
21.用于根据权利要求20所述的应用的式(I)的化合物或其可药用盐，其中所述癌症是选自慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病的白血病。
22.用于根据权利要求20或权利要求21所述的应用的式(I)的化合物或其可药用盐，以及选自伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、波舒替尼、普纳替尼和巴非替尼的另外的化合物。
23.与所述另外的化合物依次或同时施用的用于根据权利要求22所述的应用的式(I)的化合物或其可药用盐，其中所述另外的化合物是尼洛替尼。
24.用于根据权利要求20至23中的任意一项所述的应用的式(I)的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是(R)-N-(4-(氯代二氟代甲氧基)苯基)-6-(3-羟基吡咯烷-1-基)-5-(1H-吡唑-5-基)烟酰胺或其可药用盐。
25.式(I)的化合物或其可药用盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
26.根据权利要求25的应用，其中所述癌症是选自慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病的白血病。
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