WO2019026884A1 - 核酸検出方法および検出用試薬 - Google Patents

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cleaving enzyme
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enzyme
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雅之 荻野
牧野　洋一
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid detection method. More specifically, the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of a nucleic acid to be detected in the presence of a detection nucleic acid capable of complex formation with a nucleic acid sample to be detected and a nucleic acid cleaving enzyme.
  • a detection nucleic acid capable of complex formation with a nucleic acid sample to be detected and a nucleic acid cleaving enzyme.
  • Non-patent Documents 1 and 2 There are many methods for accurately and rapidly detecting and quantifying DNA in gene diagnosis (Patent Document 1-3, Non-patent Documents 1 and 2). Although there are methods for detecting and quantifying RNA, it takes time and effort, such as reverse transcription reaction. In addition, reverse transcription reaction is biased. Therefore, it is conceivable to use an isothermal amplification reaction to enable RNA detection in a short time with few operations. Among them, Invasive Cleavage Assay (ICA) using a nucleic acid cleaving enzyme such as Flapendo nuclease 1 (FEN-1) or 5'-Nuclease can be said to be an effective method in terms of operability and stability of reaction.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • ICA using FEN-1 recognizes the invasion structure on DNA / DNA duplex and causes cleavage at the flap site, but in the case of RNA / DNA duplex, only few cleavage occurs. It does not occur.
  • ICA using the 5'-Nuclease which is a nucleic acid cleaving enzyme, recognizes the entry structure on the RNA / DNA duplex and can cleave the flap site, but in the case of DNA / DNA duplex, the cleavage activity Decreases.
  • the flap cleavage activity at the time of DNA / DNA duplex of 5'-Nuclease is greatly inferior to FEN-1.
  • a method in which two types of cleavage reactions are mixed is used. That is, in the first step, cleavage of the flap occurs, and in the second step, the cleaved nucleic acid for detection which forms the invasion structure and the flap that has been further cleaved is cleaved. This is a method for detecting this cleavage product. After the second stage reaction is completed, the flaps can be used again for the first or second stage reaction, so that signal amplification is faster than detecting the first stage flaps.
  • the detection target is DNA
  • the detection nucleic acid is also DNA
  • detection can be performed by ICA using only FEN-1.
  • the detection target is RNA
  • the overall cleavage activity decreases due to the characteristics of each of the enzymes described above, and the time required for detection increases.
  • 5'-Nuclease has flap cleavage activity with respect to the above-mentioned RNA / DNA, the side reaction by misrecognition of an enzyme exists. Therefore, if the amount of enzyme is increased in an attempt to shorten the detection time, the frequency of occurrence of side reactions will increase, making accurate determination of the detection result difficult.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 5'-Nuclease as a nucleic acid cleaving enzyme, a nucleic acid is a target RNA, and two kinds of oligo DNAs necessary for forming an invasion structure are prepared in a reaction solution in which only the first step proceeds. After progressing to a certain extent in the first step, the detection nucleic acid is added in the second step, and an oligo RNA named as arrester oligo is also simultaneously added to suppress the side reaction due to misrecognition of the enzyme.
  • Patent No. 4016050 gazette Patent No. 4362150 Patent No. 4363988
  • the method of opening the reaction container halfway complicates the operation, and increases the risk of causing false positives due to sample contamination from the outside, which may impair the accuracy of the test. Therefore, when it is required to perform RNA detection quickly and accurately, the procedure is simple, and it is desirable to use a method in which the cleavage activity is maintained and the side reaction is suppressed even in a reaction system in which both structures coexist.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and an object thereof is to provide a method for rapidly detecting RNA.
  • the nucleic acid detection method according to the present invention is a nucleic acid detection method for detecting a target nucleic acid from a fluid containing a target nucleic acid, wherein the detection reagent comprising a first nucleic acid cleaving enzyme and a second nucleic acid cleaving enzyme is used as the fluid.
  • a detection reagent mixing step of mixing wherein the target nucleic acid, and the first nucleic acid having the first flap site and the first nucleic acid having the first flap site, the first flap site associated with the first invasion structure which appears upon complex formation;
  • the second flap site associated with the structure is cleaved with the second nucleic acid cleaving enzyme to generate a cleavage product.
  • a nucleic acid detection method for detecting a target nucleic acid from a fluid containing a target nucleic acid which comprises mixing a detection reagent comprising a first nucleic acid cleaving enzyme and a second nucleic acid cleaving enzyme into the fluid
  • the target nucleic acid and the first nucleic acid having the first flap site, and the first nucleic acid cleaving associated with the first invasion structure that appears upon complex formation with the first nucleic acid and the second nucleic acid.
  • the enzyme is cleaved to generate a third nucleic acid, and the third nucleic acid and the fourth nucleic acid having the second flap site are associated with the second invasion structure which is revealed by complex formation.
  • a method for detecting a nucleic acid, which is cleaved with the second nucleic acid cleaving enzyme to produce a product to be cleaved. [2] The nucleic acid detection method according to [1], wherein the target nucleic acid is RNA, and at least the first flap site of the first nucleic acid, the second nucleic acid, and the fourth nucleic acid comprise DNA.
  • nucleic acid detection method wherein the target nucleic acid and the fourth nucleic acid are DNA, and the first nucleic acid and the second nucleic acid include RNA.
  • the third nucleic acid, the fourth nucleic acid having the second flap site, and the fifth nucleic acid form a complex, the second newly introduced structure appears, and the fifth nucleic acid includes DNA
  • the nucleic acid detection method in any one of [1] to [3].
  • the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the first entry structure is smaller than the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the first entry structure, and the first nucleic acid cleavage to the second entry structure is The nucleic acid detection method according to any one of [1] to [4], wherein the cleavage activity of the enzyme is smaller than the cleavage activity of the second nucleic acid cleavage enzyme for the second entry structure.
  • the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the first invasion structure is 90% or less of the cleavage activity of the first nucleic acid cleaving enzyme for the first invasion structure
  • the second invasion structure [4] the nucleic acid detection method according to [4], wherein the cleavage activity of the first nucleic acid cleaving enzyme is 90% or less of the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the second entry structure.
  • the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid and the cleavage activity of the second nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid are the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the first entry structure and The nucleic acid detection method according to any one of [1] to [7], which is smaller than the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the second invasion structure.
  • the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid and the cleavage activity of the second nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid are the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the first entry structure and The nucleic acid detection method according to [8], which is 80% or less relative to the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the second invasion structure.
  • nucleic acid detection method according to any one of [1] to [10], wherein the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme is 0.27 mg / mL or less.
  • concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme is 0.12 mg / mL or less.
  • At least one of the first nucleic acid and the fourth nucleic acid forming the invasion structure is fluorescently labeled, and the method further comprises a target nucleic acid confirmation step capable of detecting cleavage of the invasion structure by a change in fluorescence intensity.
  • the nucleic acid detection method in any one of [1] to [12].
  • nucleic acid detection method according to any one of [1] to [12], further including a target nucleic acid confirmation step of detecting the object by comparing the mobility before and after the reaction by electrophoresis.
  • the height of the minute space is 10 nm to 100 ⁇ m.
  • nucleic acid detection method according to [15] or [16], wherein the minute space is provided at a density of 100,000 to 10,000,000 cells / cm 2 .
  • nucleic acid detection method for rapidly detecting a target nucleic acid such as RNA from a fluid containing a target nucleic acid, and to provide a detection reagent for carrying out the nucleic acid detection method. it can.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II of FIG. It is a top view which shows the principal part of the microwell array of the said microfluidic device. It is a figure which shows the principal part of the microwell array of the said microfluidic device, and is sectional drawing in the IIIb-IIIb line
  • 7 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity observed in Example 2.
  • 7 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity observed in Example 2.
  • 7 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity observed in Example 2.
  • 15 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity observed in Example 3.
  • 15 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity observed in Example 4.
  • 15 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity observed in Example 4. It is a captured image of the fluorescence visual field (signal) of the microfluidic device observed in the example.
  • the nucleic acid detection method according to the first embodiment of the present invention is a method for detecting a target nucleic acid from a fluid 20 containing the target nucleic acid.
  • the nucleic acid detection method according to the present embodiment includes a detection reagent mixing step of mixing the detection reagent (microdroplet) 23 with the fluid 20.
  • the detection reagent 23 has a first nucleic acid cleaving enzyme and a second nucleic acid cleaving enzyme.
  • the first nucleic acid cleaving enzyme and the second nucleic acid cleaving enzyme are enzymes that cleave a specific flap site associated with the invasion structure of a specific nucleic acid.
  • a buffer, a surfactant and the like may be included.
  • these reagents are provided in suitable containers.
  • a part of the base sequence of the nucleic acid hybridizes by base pairing, but other 3 'end or 5' end Refers to a portion in which one or both do not form a base pair.
  • the portion which does not form a base pair may be composed of a non-natural structure such as a fluorescent substance or an artificial nucleobase in addition to a normal nucleobase.
  • the invasion structure of nucleic acid represents a unique structure shown in Patent Documents 1 to 3 and Non-patent Documents 1 and 2 and the like. That is, the invasion structure of a nucleic acid is a structure having a flap site which is generated when two types of oligonucleotide probes are hybridized to a target nucleic acid to be detected to form a substrate complex.
  • the hybridizing oligonucleotide probe hybridizes with a flap probe (FP) having a base sequence that becomes a flap site from the 5 'end side and a base sequence complementary to the target nucleic acid, and a site adjacent to the hybridizing position of FP.
  • FP flap probe
  • IP intrusion probe
  • At least one base at the 3 'end of IP has a base sequence overlapping with the 5' portion to which FP and target nucleic acid are hybridized.
  • the presence of an enzyme capable of recognizing a special structure such as an invasion structure and cleaving the flap portion cleaves the flap site.
  • a reaction in which the intruding structure is cleaved occurs in at least two steps.
  • the first nucleic acid having the first flap site corresponds to the FP
  • the second nucleic acid corresponds to the IP
  • the first nucleic acid and the second nucleic acid hybridize to the target nucleic acid to form a complex.
  • a first invasion structure is formed, and a first flap site associated with the first invasion structure is cleaved by the first nucleic acid cleaving enzyme to produce a third nucleic acid.
  • the third nucleic acid generated in the first step corresponds to an IP in the invasion structure of the second step, has a second flap site, and has a base sequence to which the third nucleic acid can be hybridized
  • the four nucleic acids correspond to FP, and these form a complex to form a second invasion structure.
  • the second flap site associated with the second invasion structure is cleaved by the second nucleic acid cleaving enzyme to produce a cut.
  • the fourth nucleic acid has a base sequence to which the third nucleic acid can hybridize, and has the function of combining the target nucleic acid and the FP in the first step, but as the fifth nucleic acid, it is in the second step.
  • the function may be divided by using a target nucleic acid.
  • the object to be cleaved can be detected by comparing the mobility before and after the reaction by means such as electrophoresis.
  • a fluorescent dye and a fluorescent substance having an absorption wavelength corresponding to the fluorescent wavelength of the fluorescent dye and a quenching substance are added to the first nucleic acid or the fourth nucleic acid, and light emission caused by separation of the two by cleavage reaction It is also possible to confirm the object to be cut.
  • target nucleic acid confirmation step By confirming the object to be cut, it is possible to detect that the fluid 20 contains the target nucleic acid (target nucleic acid confirmation step).
  • the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the first invasion structure is smaller than the first nucleic acid cleaving enzyme for the first invasion structure
  • the first nucleic acid cleaving enzyme for the second invasion structure Is characterized in that the cleavage activity of is less than the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme on the second entry structure.
  • cleavage activity refers to the ability of an enzyme to recognize an entry structure and cleave a flap, and can be expressed by detecting the amount of nucleic acid cleaved.
  • the mobility before and after the reaction can be compared by electrophoresis, or can be expressed by measuring the fluorescence intensity caused by the object to be cut.
  • the cleavage activity can be adjusted by the concentration of the enzyme and the reaction conditions.
  • the reaction conditions and the concentration of the enzyme are kept constant, the cleavage activity increases hyperbolically toward the maximum value as the concentration of the substrate increases.
  • the concentration of the substrate and the cleavage activity are in a proportional relationship.
  • the low concentration is, for example, 1 m ⁇ or less, 10 ⁇ or less, 10 n ⁇ or less, or 500 p ⁇ or less. Therefore, the concentration of the enzyme and the cleavage activity can be treated as an approximation.
  • the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the first invasion structure is more than 0% and 90% or less, more than 0% and 80% or less, relative to the first nucleic acid cleaving enzyme for the first invasion structure. More than 0% and 70% or less are more preferable, and more than 0% and 60% or less are particularly preferable.
  • the cleavage activity of the first nucleic acid cleaving enzyme for the second invasion structure is more than 0% and not more than 90% relative to the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the second invasion structure, more than 0% and 80%. % Or less is more preferable, more than 0% and 70% or less is more preferable, and more than 0% and 60% or less is particularly preferable.
  • the first nucleic acid cleaving enzyme is an enzyme capable of recognizing the aforementioned invasion structure and cleaving the flap site.
  • the first nucleic acid cleaving enzyme has a cleavage activity to the flap site associated with the DNA / DNA double-stranded structure formed when the target nucleic acid is DNA and the FP and IP are DNA.
  • the first nucleic acid cleaving enzyme has a cleavage activity to the flap site associated with the RNA / DNA double-stranded structure formed when the target nucleic acid is RNA and FP and IP are DNA.
  • the first nucleic acid cleaving enzyme includes polymerase-like nucleases, but may be other nucleases. It may also be a flap endonuclease that has been modified to recognize an entry structure in the RNA / DNA duplex structure.
  • the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme is preferably 9.0 times or less, more preferably 0.10 times or more and 9.0 times or less, more preferably 0.6 times or more, the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • the value is more preferably twice or less, and more preferably 0.6 times or more and 1.3 times or less.
  • the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme is 9.0 times or less, the signal / noise ratio of detection can be increased to facilitate nucleic acid detection.
  • the background fluorescence intensity is suppressed while maintaining the fluorescence intensity in the second step cleavage reaction.
  • the concentration of the enzyme refers to the concentration represented by mg / mL.
  • the second nucleic acid cleaving enzyme is an enzyme capable of recognizing the aforementioned entry structure and cleaving the flap site.
  • the second nucleic acid cleaving enzyme is compared to the first nucleic acid cleaving enzyme for the flap site associated with the DNA / DNA duplex structure formed when the target nucleic acid is DNA and FP and IP are DNA. Have high cleavage activity.
  • the cleavage activity for the flap site associated with the RNA / DNA double-stranded structure (for example, the first entry structure with RNA as the target nucleic acid) formed when the target nucleic acid is RNA and FP and IP are DNA
  • the second nucleic acid cleaving enzyme is lower compared to the first nucleic acid cleaving enzyme.
  • the rate of activity is preferably less than 100%, more preferably less than 90%, more preferably less than 80%, more preferably less than 70%, more preferably less than 60%, more preferably more than 50% It is characterized by low, more preferably less than 40%, more preferably less than 30%, more preferably less than 20%, more preferably less than 10%.
  • the second nucleic acid cleaving enzyme includes flap endonucleases, but may be other nucleases. It may also be a polymerase nuclease that has been modified to recognize an entry structure in DNA / DNA double-stranded structure.
  • the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme is preferably 0.1 times or more, more preferably 0.1 times to 10 times, and more preferably 0.4 times to 1.7 times the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme. Is more preferable, and 0.75 times or more and 1.7 times or less is more preferable.
  • the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme is preferably 0.12 mg / mL or less, more preferably 0.008 mg / mL or more and 0.12 mg / mL or less, and further preferably 0.03 mg / mL or more and 0.06 mg / mL or less. preferable.
  • the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme is at least 0.1 times the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme, noise can be reduced while shortening the reaction time required for detection. Also, by setting the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme at 0.12 mg / mL or less, noise can be reduced while shortening the reaction time.
  • the nucleic acid detection method according to the present embodiment exhibits a high effect in the method of detecting the presence or absence of a target nucleic acid by recognizing an entry structure and causing a cleavage reaction. For example, by mixing enzymes having different activities with respect to the nucleic acid structure to be cleaved in the same reaction system, the detection signal is enhanced, and the noise is reduced to enhance the signal / noise ratio at the time of detection. Is possible.
  • an undesired side reaction may occur in a nucleic acid cleavage reaction using an enzyme due to misrecognition of any nucleic acid structure.
  • the reaction may occur with the reagent alone to cause fluorescence.
  • the target nucleic acid is RNA
  • a side reaction of cleaving the flap site of the fourth nucleic acid tends to occur.
  • the amount introduced into the reaction system is increased to accelerate the cleavage reaction of the flap site for the purpose of shortening the detection time, the above-mentioned side reaction will increase. If the input amount of the first nucleic acid cleaving enzyme is reduced to avoid that, the time required for detection will increase.
  • the above-mentioned side reaction can occur similarly when using two types of nucleic acid cleaving enzymes.
  • the above-mentioned side effects can be suppressed and the signal / noise ratio at the time of detection can be increased without increasing the time for detection.
  • the amount of the first nucleic acid cleaving enzyme in the detection reagent 23 is reduced to suppress the above-mentioned side reaction.
  • the cleaving activity of the second-step cleavage reaction (cleavage reaction to the second invasion structure composed of the third nucleic acid and the fourth nucleic acid) is enhanced.
  • the side reaction is suppressed by reducing the amount of the first nucleic acid cleaving enzyme, while the increase of the detection time is prevented by mixing the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • the cleavage activity of the first nucleic acid cleaving enzyme for the fourth nucleic acid is smaller than the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the second entry structure.
  • the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid and the cleavage activity of the second nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid are the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the first entry structure and the second Small compared to the cleavage activity of said second nucleic acid cleaving enzyme on the invasion structure
  • the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid and the cleavage activity of the second nucleic acid cleavage enzyme for the fourth nucleic acid are the cleavage activity of the first nucleic acid cleavage enzyme for the first entry structure and the second It is 80% or less, preferably 60% or less, more preferably 50% or less, more preferably 40% or less, still more preferably 30% or less, as compared with the cleavage activity of the second nucleic acid cleaving enzyme for the invasion structure.
  • the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme is not more than 9.0 times, preferably not less than 0.1 times and not more than 9.0 times, and more preferably not less than 0.6 times the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme. .5 is more preferable, and 0.6 times or more and 1.3 times or less is more preferable.
  • the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme is 0.27 mg / mL or less, more preferably 0.18 mg / mL or less, more preferably 0.148 mg / mL or less, more preferably 0.09 mg / mL or less, 0 .074 mg / mL or less is more preferable, 0.045 mg / mL or less is more preferable, and 0.037 mg / mL or less is still more preferable.
  • the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme is 0.003 mg / mL or more, more preferably 0.005 mg / mL or more, more preferably 0.01 mg / mL or more, and still more preferably 0.019 mg / mL or more. .
  • the cleavage activity to the flap site associated with the RNA / DNA double-stranded structure is lower in the second nucleic acid cleaving enzyme compared to the first nucleic acid cleaving enzyme . Therefore, even if the second nucleic acid cleaving enzyme is further mixed in the detection reagent 23, the first step cleaving reaction by the first nucleic acid cleaving enzyme (the first invasion consisting of the target nucleic acid, the first nucleic acid and the second nucleic acid) The effect of the cleavage reaction on the structure on the cleavage activity is small.
  • the amount of the first nucleic acid cleaving enzyme can be reduced, and the first cleaving enzyme can be prevented from cleaving the second invasion structure. Therefore, the signal / noise ratio at the time of detection can be increased, and target nucleic acid can be detected more effectively.
  • the formation of the double-stranded structure can be carried out under conditions of ordinary temperature, pH, salt concentration, buffer solution and the like, but is preferably carried out in the same solution as the solution for nucleic acid cleavage reaction.
  • Hybridization is preferably performed in a reaction solution containing a buffered salt. It is preferable that the pH of the reaction solution is in the range of 6.5 to 10.0, particularly in the range of 7.5 to 9.0.
  • the concentration of the buffering salt is preferably in the range of 5 to 250 mM, particularly preferably in the range of 10 to 100 mM.
  • a buffer salt there may be mentioned cacodylate, phosphate and tris salt, but other salts may be used.
  • the salt concentration of the reaction solution is preferably in the range of 1 to 100 mM, particularly preferably in the range of 5 to 50 mM, and particularly preferably in the range of 10 to 30 mM.
  • the temperature in the whole reaction is preferably in the range of 15 to 90 ° C., particularly preferably in the range of 25 to 80 ° C., and particularly preferably in the range of 35 to 70 ° C.
  • the nucleic acid to be a detection target in the nucleic acid detection method according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is DNA or RNA, and may be natural or synthetic.
  • natural nucleic acids include genomic DNA recovered from organisms, mRNA, rRNA, hnRNA, miRNA, tRNA and the like.
  • synthesized nucleic acid DNA synthesized by a known chemical synthesis method such as ⁇ -cyanoethyl phosphoroamidite method, DNA solid phase synthesis method, a nucleic acid synthesized by a known nucleic acid synthesis method such as PCR, There is cDNA etc. synthesized by reverse transcription reaction.
  • the nucleic acid to be a detection target in the nucleic acid detection method according to this embodiment is not particularly limited, and may be a nucleic acid extracted from an organism such as an animal, a plant, a microorganism, a cultured cell, etc. It may be a nucleic acid amplified by When the amplification product is a double stranded nucleic acid, it can be used after being single stranded by heat denaturation treatment, chemical denaturation treatment or the like. As such a nucleic acid amplification reaction, for example, PCR method, LAMP method, SMAP method, NASBA method, RCA method and the like can be mentioned. In addition, extraction of nucleic acid from an animal or the like can be performed by a known method such as phenol / chloroform method.
  • the nucleic acid detection method of the present embodiment in the nucleic acid detection method of the present embodiment, it is possible to increase the signal / noise ratio at the time of detection without increasing the time for detection. In particular, when an RNA is used as a target nucleic acid, a high effect is exhibited. Moreover, according to the nucleic acid detection method according to the present embodiment, the nucleic acid can be easily detected by mixing the detection reagent 23 which is a microdroplet into the fluid 20 only once. A simple and rapid RNA detection makes it possible to conduct an in-hospital examination on the day of examination. This makes it possible to prevent the aggravation of the patient since the policies on treatment and dosage can be determined quickly. In addition, reducing the number of hospital visits is considered to contribute to the shortage of medical personnel and the reduction of medical expenses.
  • the nucleic acid detection method according to the second embodiment is performed using a container in which a tube or a well found in conventional biochemical or molecular biological techniques is disposed on a plate.
  • a container in which a tube or a well found in conventional biochemical or molecular biological techniques is disposed on a plate.
  • microwell arrays having fine flow path structures of various forms, which are formed using etching technology, photolithography technology, etc., which are used in semiconductor circuit manufacturing technology, are being studied. It is also possible to use the wells of these microwell arrays as chemical reaction vessels for performing various biochemical or chemical reactions in a minute volume of fluid. Microwells exist innumerably on one array, and one microwell allows one detection target.
  • the nucleic acid detection method according to the second embodiment uses a microwell array as a chemical reaction container.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a microfluidic device 1.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II of FIG.
  • FIG. 3 is a view showing the main part of the microwell array 4 of the microfluidic device 1.
  • FIG. 3A is a plan view thereof, and
  • FIG. 3B is a cross-sectional view taken along line IIIb-IIIb of FIG. 3A.
  • the microfluidic device 1 can be used not only for liquid biopsy but also for measurement of proteins, DNA, RNA, viral biomolecules, bacteria and the like.
  • the microfluidic device 1 includes a microwell array 4 in which a plurality of wells (microspaces) 3 are formed.
  • the microwell array 4 includes a plate-like bottom layer 11 and a plate-like wall layer 12 formed on the bottom layer 11.
  • the plurality of wells 3 of the microwell array 4 are arrayed as illustrated in FIG. 3A.
  • a plurality of wells 3 are arranged at intervals in the lateral direction (left and right direction in FIG. 3A).
  • a plurality of horizontally arranged well groups 30 composed of a plurality of wells 3 arranged in the lateral direction are arranged in the longitudinal direction (vertical direction in FIG. 3A).
  • the horizontally arranged well groups 30 adjacent to each other in the vertical direction are arranged laterally shifted so that the wells 3 do not overlap in the vertical direction.
  • the surface (opening surface 6) of the microwell array 4 in which the plurality of wells 3 are open is flat.
  • the plurality of wells 3 may be formed, for example, on the entire opening surface 6 of the microwell array 4, but in the present embodiment, a region (well forming region except the peripheral region 7 of the opening surface 6 of the microwell array 4) 8) is formed.
  • the peripheral shape of the well formation region 8 may be arbitrary, it is rectangular in this embodiment.
  • the well 3 is a hole having a bottom.
  • the well 3 is formed in a cylindrical shape and has a bottom surface 9.
  • the shape and size of the wells 3 of the microwell array 4 are not particularly limited.
  • the carrier may be, for example, beads, and a biomolecule 21 as a sample may be bound to the carrier.
  • the shape of the well 3 is not limited to a cylindrical shape, and may be arbitrary, for example, a cylindrical shape, a polyhedron composed of a plurality of faces (for example, a rectangular parallelepiped, a hexagonal prism, an octagonal prism, etc.), an inverted conical shape, or an inverted shape It may be a pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted pentagonal pyramid, inverted hexagonal pyramid, inverted polygonal pyramid having seven or more corners) or the like.
  • the inverted conical shape and the inverted pyramidal shape mean the shape of the well 3 such that the bases of the cone and the pyramid become the opening of the well 3 respectively.
  • the shape of the well 3 is an inverted cone or inverted pyramid, for example, the top of a cone or pyramid may be cut to make the bottom 9 of the well 3 flat.
  • the bottom surface 9 of the well 3 may be formed into a curved surface that is convex or concave toward the opening of the well 3.
  • the shape of the well 3 may be, for example, a shape in which two or more of the above-mentioned shapes are combined.
  • the shape of the well 3 may be partially cylindrical and the rest may be inverted conical.
  • the base of the cone or pyramid is the entrance (opening) of the well 3, but the inverted cone, even if it is partially cut from the apex of the inverted pyramid Good.
  • the bottom of the microwell is flat.
  • the shape of the well 3 is cylindrical, and the bottom of the well 3 is flat, but may be a curved surface (convex surface or concave surface).
  • the bottom of the well 3 can be formed into a curved surface as well as in the case of an inverted conical shape, and a shape obtained by cutting a part of the inverted pyramid from the top.
  • the maximum diameter of the well 3 and the height Wh are, for example, 10 nm to 100 ⁇ m, preferably 100 nm to seal the aqueous liquid containing biomolecules 21. It may be 20 ⁇ m, more preferably 1 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the dimensions of the well 3 are preferably 1 microwell in consideration of the amount of the aqueous liquid to be stored in the well 3 and the preferred ratio of the size of the carrier such as the beads to which the biomolecules 21 are attached to the dimensions of the well 3. It is appropriately determined such that one or several biomolecules 21 are accommodated.
  • the material of the microwell array 4 is preferably one that does not inhibit the enzyme reaction.
  • a surfactant, a phospholipid, another polymer compound, or a mixture thereof may be coated.
  • surfactants include nonionic surfactants.
  • nonionic surfactants include Tween, glycerol, Triton-X100 and the like.
  • PEG pollyethyleneglycol
  • DNA protein
  • BSA can be mentioned.
  • the surface of the material (material) of the microwell array 4 may be coated with a fluorine-based coating agent or a silicon-based coating agent.
  • the surface can be hydrophobically modified by coating these coating agents.
  • the detection target of the nucleic acid detection method using the microwell array 4 may be, for example, a sample collected from a living body such as blood or a PCR product, etc., and is an artificially synthesized compound etc. It is also good.
  • the well 3 may have a shape and a size in which one molecule of DNA is contained.
  • the density of the wells 3 of the microwell array 4 is, for example, 100,000 to 10,000,000 cells / cm 2 , preferably 100,000 to 5,000,000 cells / cm 2 , and more preferably 100,000 to 1,000,000 cells / cm 2. 2
  • the density of the wells 3 is in such a range, the operation of enclosing the aqueous liquid as the sample in the predetermined number of wells 3 is easy. Moreover, observation of the well 3 for analyzing an experimental result is also easy.
  • each well 3 is formed by laminating a hydrophilic material or a hydrophobic material on a substrate to form a hydrophilic layer or a hydrophobic layer, and drilling the hydrophilic layer or the hydrophobic layer to form a plurality of wells. It can be produced from the forming step.
  • the well 3 may be made of the same material as the substrate, and may be formed by molding or cutting under the conditions that can realize the present embodiment.
  • the microwell array 4 may be formed on a substrate.
  • the substrate may or may not have electromagnetic wave transparency.
  • examples of the electromagnetic waves include X-rays, ultraviolet rays, visible rays, infrared rays and the like.
  • electromagnetic waves include X-rays, ultraviolet rays, visible rays, infrared rays and the like.
  • the microwell array is formed on a substrate having electromagnetic wave transparency, it is possible to use electromagnetic waves to analyze the results of experiments conducted on the microwell array. For example, fluorescence, phosphorescence and the like resulting from irradiation of electromagnetic waves can be measured from the substrate side. For detection of fluorescence, phosphorescence and the like, for example, a fluorescence microscope can be used.
  • the electromagnetic waves may be emitted from, for example, the substrate side, or may be emitted from, for example, the inlet side of the well.
  • a substrate having good transparency to at least the light in the visible light region is used. Just do it.
  • the resin substrate examples include ABS resin, polycarbonate resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl acetate, PET (polyethylene resin) Terephthalate), PEN (polyethylene naphthalate) and the like.
  • These resins may contain various additives, and a plurality of resins may be mixed.
  • the above-mentioned substrate has substantially no autofluorescence.
  • substantially no autofluorescence means that the substrate has or does not have any autofluorescence of the wavelength used for detection of the experimental result so that detection of the experimental result is not affected. It means that it is weak. For example, if the intensity of autofluorescence is about 1 ⁇ 2 or less and about 1/10 or less of the fluorescence to be detected, it can be said that the intensity of the autofluorescence is so weak as not to affect the detection of the experimental result.
  • quartz glass As a material which has electromagnetic wave permeability and does not emit autofluorescence at all, for example, quartz glass can be mentioned. Low fluorescence glass, an acrylic resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer) etc. are mentioned as a raw material which has weak self-fluorescence and there is no hindrance to detection of the experimental result using electromagnetic waves.
  • COC cycloolefin copolymer
  • COP cycloolefin polymer
  • the microwell array 4 may have a plurality of wells 3 formed only by resin molding by injection molding or imprinting.
  • the fluorescence used for detection of the biomolecule 21 includes a fluorescent molecule that can be labeled to a nucleic acid, for example, a fluorescent bead containing a fluorescent molecule, and an intercalator such as SYBR Green that specifically enters the double helix of DNA and emits fluorescence. And those derived from etc.
  • the observation of the fluorescence emitted from the biological molecule 21 accommodated in the well 3 can be performed from the substrate side of the microwell array 4 using, for example, a fluorescence microscope.
  • the number of target molecules can be identified by counting the number of wells 3 emitting a predetermined fluorescence.
  • the biological molecule 21 may be treated with a fluorescent label that specifically labels a target molecule before being accommodated in the well 3 in addition to the method of accommodating the biological molecule 21 as it is.
  • the bead is accommodated in the well 3 and contacted with a fluorescent label that can specifically label the target molecule, and the target molecule is then well It may be fluorescently labeled within 3.
  • the thickness of the substrate can be appropriately determined, but for example, when observing fluorescence from the substrate side using a fluorescence microscope, it is, for example, more than 0 mm and 5 mm or less, 0 mm or more 2 mm or less, or 0 mm or more 0.6 mm or less Is preferred.
  • turbidity or the like can be used besides fluorescence.
  • the turbidity can be measured, for example, by the transparency of light having a wavelength of about 400 to 1000 nm.
  • hydrophilic resin The resin forming the hydrophilic portion (hereinafter sometimes referred to as "hydrophilic resin") is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited, but the molecule of the constituent component of the resin is hydrophilic to exhibit hydrophilicity Those having a group are mentioned.
  • a hydrophilic group a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfone group, a sulfonyl group, an amino group, an amide group, an ether group, an ester group etc. are mentioned, for example.
  • siloxane polymers epoxy resins, polyethylene resins, polyester resins, polyurethane resins, polyacryl amide resins, polyvinyl pyrrolidone resins, acrylic resins such as polyacrylic acid copolymers, cationized polyvinyl alcohols, silanolated polyvinyl alcohols, Polyvinyl alcohol resin such as sulfonated polyvinyl alcohol; polyvinyl acetal resin; polyvinyl butyral resin; polyethylene polyamide resin; polyamide polyamine resin; cellulose derivative such as hydroxymethyl cellulose and methyl cellulose; polyalkylene such as polyethylene oxide, polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymer Oxide derivatives; maleic anhydride copolymer; ethylene-vinyl acetate copolymer; Len - butadiene copolymer; from the combination of the resin can be appropriately selected and used.
  • the hydrophilic resin may be a thermoplastic resin, may be a thermosetting resin, may be
  • the hydrophilic part (the material of the hydrophilic part) may have a contact angle of less than 70 degrees measured according to the static drop method defined in JIS R 3257-1999.
  • a hydrophilic layer may be formed by applying a thermosetting silane coupling agent or the like to a substrate and thermally curing it to form a siloxane polymer.
  • the resin forming the hydrophobic portion (hereinafter sometimes referred to as "hydrophobic resin") is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited, but for example, novolac resin; acrylic resin; methacrylic resin; styrene resin; Vinyl resin; Vinylidene chloride resin; Polyolefin resin; Polyamide resin; Polyacetal resin; Polycarbonate resin; Polyphenylene sulfide resin; Polysulfone resin; Fluorine resin; Silicone resin; Urea resin; Melamine resin; Guanamine resin; Phenolic resin; From among the combinations of the above-mentioned resins and the like, those having a contact measured according to the static droplet method defined in JIS R 3257-1999 of 70 degrees or more can be appropriately selected and used.
  • the hydrophobic resin may be a thermoplastic resin, may be a thermosetting resin, may be a resin that is cured by active energy rays such as electron beam or UV light, or may be an elastomer.
  • the hydrophobic portion may be formed of, for example, a resist.
  • the resist may be a photoresist from the viewpoint of easily forming a fine structure.
  • the photoresist may be, for example, a photosensitive novolac resin.
  • the microwell array 4 is provided with a lid member 5 which constitutes the flow path 2 of the microfluidic device 1 together with the microwell array 4.
  • the lid member 5 is a member formed in a plate shape or a sheet shape, and is disposed to face the opening surface 6 of the microwell array 4. Between the microwell array 4 and the lid member 5, a gap functioning as the flow path 2 is present.
  • the lid member 5 has a plurality of through holes 15 penetrating in the thickness direction.
  • Each through hole 15 is in communication with the flow path 2 of the microfluidic device 1 and functions as an inlet for supplying a fluid into the flow path 2 or an outlet for discharging a fluid.
  • the lid member 5 has two through holes 15A and 15B (a first through hole 15A and a second through hole 15B).
  • the two through holes 15A and 15B are disposed at positions corresponding to two corners facing each other in the rectangular well formation region 8.
  • Each through hole 15 has a small hole portion 16 and a large hole portion 17 larger in size than the small hole portion 16 when viewed in the penetration direction.
  • the signal / noise ratio at the time of detection can be increased by mixing the detection reagent 23 only once with the fluid 20 without increasing the time for detection. It can be enhanced. Furthermore, the well (minute space) 3 can be used to effectively visualize the detection result.
  • FIGS. 4 to 5 are diagrams for explaining an example of use of the microfluidic device 1.
  • a fluid 20 containing a biomolecule 21 which is a target nucleic acid, and a sealing solution are prepared.
  • the fluid 20 is composed of a biomolecule 21 and a solvent fluid 22, and a detection reagent 23 is further mixed.
  • the sealing liquid is, for example, oil.
  • the microfluidic device 1 is disposed such that the flow of the fluid 20 and the sealing liquid in the flow channel 2 is in the horizontal direction, and the opening of the well 3 is directed upward in the vertical direction.
  • the fluid 20 is injected into the flow path 2 from the first through hole 15A of the microfluidic device 1 using a pipette.
  • FIG. 4 shows where the fluid 20 has been injected.
  • the sealing liquid is injected from the first through holes 15A of the microfluidic device 1 into the flow path 2 to fill the flow path 2 with the sealing liquid. That is, the fluid 20 in the flow path 2 is replaced with the sealing liquid. Thereby, the fluid 20 in each well 3 is sealed by the sealing liquid.
  • the biochemical reaction takes place internally by heating the microfluidic device 1.
  • a cleavage reaction of the two-step invasion structure produces an analyte. By detecting the object to be cut, it is detected that the biomolecule 21 is stored in the well 3.
  • Examples of the signal to be measured in the wells 3 of the microwell array 4 after the reaction include fluorescence, luminescence, phosphorescence and the like. These wavelength ranges can be those that can be observed as electromagnetic waves such as visible light, ultraviolet light, and infrared light. Therefore, a detection device having a measurement device capable of measuring such a wavelength range can be used as a detector according to the present embodiment. Specifically, in the present embodiment, a fluorescence microscope is used as a detector for detecting a reaction.
  • the microfluidic device 1 When the microwell array 4 is configured to transmit light, the microfluidic device 1 is arranged so that it can be observed from the side of the microwell array 4 with a fluorescence microscope.
  • An image observed with a fluorescence microscope is shown, for example, as shown in FIG. In the example of FIG. 5, fluorescence is observed by a fluorescence microscope.
  • RNA detection by the Invasive Cleavage Assay was performed using the sequences shown in Table 1 under the following reagent amounts and conditions.
  • the underlined portion of the first nucleic acid of Table 1 represents the first flap site.
  • the underlined portion of the fourth nucleic acid represents the second flap site.
  • F of the fourth nucleic acid represents a fluorescent dye, and Q represents a quencher.
  • the first nucleic acid and the second nucleic acid are hybridized on the target RNA, and the first nucleic acid cleaving enzyme cleaves the first flap site to generate the third nucleic acid.
  • the third nucleic acid is released upon cleavage of the second flap site by the second nucleic acid cleaving enzyme in a hybridized state on the fourth nucleic acid.
  • the fluorescent substance is separated from the quenching substance, and fluorescence emission can be observed.
  • Example 1 detection of nucleic acid was performed using a detection reagent containing a first nucleic acid cleaving enzyme and a second nucleic acid cleaving enzyme.
  • Target RNA (30 pM, 0 pM) and first nucleic acid (1 ⁇ M), second nucleic acid (1 ⁇ M), fourth nucleic acid (2 ⁇ M), 3-morpholinopropanesulfonic acid (pH 7.9) so that the total amount per reaction is 10 ⁇ L.
  • reaction solution comprising Flapendo Nuclease 1 (molecular weight: 36,960) (0.03 mg / mL) as an enzyme and distilled water. Two kinds of reaction solutions having different concentrations of target RNA were prepared.
  • reaction solution was placed in a microtest tube, and fluorescence intensity change (excitation: 490 nm, emission: 520 nm) was measured when heated at 65 ° C. for 60 minutes in a real-time PCR apparatus.
  • Comparative Example 1 In this example, detection of nucleic acid was performed using a detection reagent that contains the second nucleic acid cleaving enzyme and does not contain the first nucleic acid cleaving enzyme.
  • condition The conditions are the same as in Example 1 except that the first nucleic acid cleaving enzyme is not contained and Flapendo Nuclease 1 (0.03 mg / mL) is mixed as the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • Comparative Example 2 In this example, detection of nucleic acid was performed using a detection reagent that contains the first nucleic acid cleaving enzyme and does not contain the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • condition The conditions are the same as in Example 1 except that the second nucleic acid cleaving enzyme is not contained, and 5'-Nuclease (0.09 mg / mL) is mixed as the first nucleic acid cleaving enzyme.
  • Example 1 the rise of the fluorescence intensity is quicker under the same condition of the target RNA concentration as compared with the case where there is one type of nucleic acid cleaving enzyme (Comparative Example 1 and Comparative Example 2).
  • the signal / noise ratio of detection can be enhanced by using the detection reagent 23 containing the first nucleic acid cleaving enzyme and the second nucleic acid cleaving enzyme It is shown to be. Further, it is shown that the use of the detection reagent 23 containing the first nucleic acid cleaving enzyme and the second nucleic acid cleaving enzyme makes the rising of the fluorescence intensity faster, and can prevent the increase of the detection time.
  • Example 2 In this example, the effect ratio of the activity of the first nucleic acid cleaving enzyme to the activity of the second nucleic acid cleaving enzyme on the signal / noise ratio in the detection of the target RNA was confirmed.
  • Example 1 (0.18 mg / mL), 9.0 eq. (0.27 mg / mL), 12.0 eq. (0.36 mg / mL), 15.0 eq.
  • the conditions are the same as in Example 1 except that 13 types of reaction solutions were changed (0.45 mg / mL) and the concentration of target RNA was 30 pM and / or 300 pM.
  • the second nucleic acid cleaving enzyme is Flapendo Nuclease 1 (0.03 mg / mL) as in Example 1.
  • the detection reaction is maintained by mixing the second nucleic acid cleaving enzyme whose activity against the first entry structure is not high, and the signal / noise ratio (fluorescence when the concentration of target RNA is 30 pM or 300 pM and 0 pM) Difference in strength).
  • the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease is 0.10 times, 0.17 times, 0.33 times, 0.63 times, 1.23 times, 1.5 times, 2.46 times, In the case of 3.0 times, 4.93 times, 6.0 times and 9.0 times, the signal / noise ratio becomes 0.10 times, 0.17 times, 0.33 times and 0.63 times. In the case of 1.23, 1.5, 2.46, 3.0, 4.93 and 6.0, it is shown that a more preferable signal / noise ratio is obtained.
  • Example 3 In this example, regardless of the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme, the influence ratio of the activity of the first nucleic acid cleaving enzyme to the second nucleic acid cleaving enzyme on the signal / noise ratio in the detection of the target RNA was confirmed.
  • the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease contained in the reaction solution was 0.63 eq. (0.037 mg / mL), 1.23 eq. (0.074 mg / mL), 2.46 eq.
  • Three kinds of reaction solution (0.148 mg / mL) were required, and the concentration of target RNA was 30 pM and / or 300 pM, and the second nucleic acid cleaving enzyme Flapendo Nuclease 1 was 0.06 mg / mL.
  • the conditions are the same as Example 1 except for the above.
  • the detection reaction is maintained by mixing the second nucleic acid cleaving enzyme whose activity against the first entry structure is not high, and the signal / noise ratio (fluorescence when the concentration of target RNA is 30 pM or 300 pM and 0 pM) Difference in strength).
  • the signal / noise ratio fluorescence when the concentration of target RNA is 30 pM or 300 pM and 0 pM
  • a good signal / noise ratio can be obtained regardless of the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • a suitable signal / noise ratio is obtained when the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease is 0.63, 1.23, and 2.46.
  • the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease was 0.63 times and 1.23 times, it was shown that a suitable signal / noise ratio was obtained regardless of the concentration of the target RNA. .
  • the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease is 0.6 or more and 1.3 or less, target nucleic acids of various concentrations can be detected at a suitable signal / noise ratio, It is more preferable that the concentration of the dinucleolytic enzyme is 0.03 mg / mL or more and 0.06 mg / mL or less.
  • Example 4 the effect ratio of the activity of the first nucleic acid cleaving enzyme to the activity of the second nucleic acid cleaving enzyme on the signal / noise ratio in the detection of the target RNA was confirmed.
  • the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme was 0.63 eq.
  • the experiment was carried out by changing the type of concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease contained in the reaction solution is 0.63 eq.
  • the second nucleic acid cleaving enzyme Flapendo Nuclease 1 is 0.008 mg / mL, 0.015 mg / mL, 0.06 mg / mL, 0.12 mg / mL, 0.24 mg / mL, and the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme Of the first nucleic acid cleaving enzyme 5'-Nuclease at 0.005 mg / mL, 0.01 mg / mL, 0.037 mg / mL, 0.074 mg / mL, and 0.148 mg / mL.
  • the conditions are the same as in Example 1 except that the concentration of target RNA was 30 pM and / or 300 pM.
  • the increase in the detection time was prevented by mixing the second nucleic acid cleaving enzyme.
  • the detection reaction is maintained by mixing the second nucleic acid cleaving enzyme whose activity against the first entry structure is not high, and the signal / noise ratio (fluorescence when the concentration of target RNA is 30 pM or 300 pM and 0 pM) Difference in strength). From these and the results of Example 2, regardless of the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme, if the concentration ratio of the first nucleic acid cleaving enzyme to the second nucleic acid cleaving enzyme is within a certain range, a good signal / noise ratio is obtained.
  • the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme is 0.008 mg / mL, 0.015 mg / mL, 0.03 mg / mL, 0.06 mg / mL, 0.12 mg / mL, a suitable signal / noise ratio It is shown that the signal / noise ratio is more suitable when 0.03 mg / mL and 0.06 mg / mL.
  • the concentration ratio of the second nucleic acid cleaving enzyme and the first nucleic acid cleaving enzyme is the same, the signal / noise ratio is not good if the concentration of the first nucleic acid cleaving enzyme and the second nucleic acid cleaving enzyme is increased too much.
  • the concentration of the second nucleic acid cleaving enzyme was 0.24 mg / mL, a sufficient signal / noise ratio was not obtained.
  • Example 5 In this example, the effect of the improvement of the signal / noise ratio in the confirmation of the fluorescence signal by the well 3 was confirmed.
  • Target RNA (0 pM, 30 pM), first nucleic acid (1 ⁇ M), second nucleic acid (1 ⁇ M), fourth nucleic acid (2 ⁇ M), trishydroxymethylaminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 9) so that the total amount per reaction is 20 ⁇ L.
  • reaction solution is sent to the first through hole 15A of the microfluidic device 1, and thereafter, 80 ⁇ l of FC-40 (Sigma) immiscible with the detection reaction reagent as the sealing solution is sent through the first through hole 15A.
  • FC-40 Sigma
  • the reagent was divided and enclosed in each well 3.
  • the mixture was heated on a 66 ° C. hot plate for 15 minutes to carry out an invader reaction.
  • fluorescence of each micropore was detected using a fluorescence filter of NIBA.
  • FIG. 10A shows the case where the concentration of target RNA is 30 pM, and it was possible to confirm a fluorescence signal of an intensity different from the noise in well 3.
  • FIG. 10B shows the results when the target RNA is 0 pM, and it can be seen that the fluorescence intensity of noise in the well 3 is low.
  • a reaction solution consisting of 05% v / v), 5'-Nuclease (0.09 mg / mL) as the first nucleic acid cleaving enzyme, and distilled water was prepared.
  • reaction solution was placed in a microtest tube, and fluorescence intensity change (excitation: 490 nm, emission: 520 nm) was measured when heated at 65 ° C. for 60 minutes in a real-time PCR apparatus.
  • reaction solution was placed in a microtest tube, and fluorescence intensity change (excitation: 490 nm, emission: 520 nm) was measured when heated at 65 ° C. for 60 minutes in a real-time PCR apparatus.
  • the signal / noise ratio at the time of detection is The target nucleic acid can be detected more effectively.
  • mixing of the second nucleic acid cleaving enzyme can also prevent an increase in detection time.
  • nucleic acid detection method for rapidly detecting a target nucleic acid from a fluid containing a target nucleic acid, and it is possible to provide a detection reagent for carrying out the nucleic acid detection method.
  • microfluidic device 3 wells (microspace) 4 microwell array 5 lid member 6 opening surface 7 peripheral region 8 well formation region 9 bottom surface 15 through hole 15A first through hole 15B second through hole 16 small hole 17 large hole 20 fluid 23 detection reagent (microdroplet )

Abstract

核酸を迅速に検出する方法を提供する。核酸検出方法は、標的核酸を含有する流体から標的核酸を検出する核酸検出方法であって、第一核酸切断酵素と、第二核酸切断酵素とを備える検出用試薬を前記流体に混合する検出用試薬混合工程を備え、前記標的核酸と、第一フラップ部位を有する第一核酸および第二核酸とが、複合体形成することで現れる第一侵入構造に付随する前記第一フラップ部位を前記第一核酸切断酵素で切断し、第三核酸を生成し、前記第三核酸と、第二フラップ部位を有する第四核酸とが、複合体形成することで現れる第二侵入構造に付随する前記第二フラップ部位を前記第二核酸切断酵素で切断し、被切断物を生成する。

Description

核酸検出方法および検出用試薬
　本発明は、核酸検出方法に関する。より詳細には検出対象となる核酸試料に対して複合体形成可能な検出核酸および核酸切断酵素存在下で、検出対象となる核酸の有無を検出する方法に関する。
　本願は、２０１７年７月３１日に、日本に出願された特願２０１７－１４８４０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　遺伝子診断においてＤＮＡを正確かつ迅速に検出・定量する手法は多く存在する（特許文献１－３、非特許文献１，２）。ＲＮＡを検出・定量する手法はあるが、逆転写反応など手間と時間を要する。また、逆転写反応のバイアスが掛かってしまう。そこで、少ない操作で短時間にＲＮＡ検出を可能にするために等温増幅反応の利用が考えられる。中でも、Ｆｌａｐｅｎｄｏ　ｎｕｃｌｅａｓｅ　１（ＦＥＮ－１）や５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅといった核酸切断酵素を用いるＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）は操作性や反応の安定性から有効な手法といえる。
　しかし、ＦＥＮ－１を用いたＩＣＡだとＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖上の侵入構造を認識して、フラップ部位の切断反応が生じるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の場合は切断反応が極僅かしか生じない。一方、同じく核酸切断酵素である５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅを用いたＩＣＡではＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖上の侵入構造を認識してフラップ部位の切断はできるが、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の場合は切断活性が低下する。加えて、５’－ＮｕｃｌｅａｓｅのＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖時のフラップ切断活性はＦＥＮ－１に大きく劣る。
　そのため、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖が混在するような反応系に対して、どちらのフラップ部位も切断したい場合はＦＥＮ－１のみ、あるいは５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅのみを用いると全体として切断活性が低下してしまう。
　例えば、ある核酸を標的とした検出反応において検出シグナルを高効率で増幅したいとき、二種類の切断反応が混在する手法を用いる。すなわち、第一段階としてフラップの切断を生じ、第二段階として切断されたフラップと更に侵入構造を形成する検出用核酸が切断されるものであり、この切断産物を検出する手法である。第二段階目の反応が終了した後、フラップは再び第一段階あるいは第二段階の反応に使用できるため、第一段階のフラップを検出するよりも信号増幅は速くなる。
　このとき検出対象がＤＮＡ、検出用核酸もＤＮＡであればＦＥＮ－１のみを用いたＩＣＡで検出できる。しかし、検出対象がＲＮＡの場合は検出用核酸がＤＮＡであってもＲＮＡであっても、先に記述した各々の酵素の特性により全体の切断活性は低下して検出に要する時間が増大する。また、前述のＲＮＡ／ＤＮＡに対して５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅはフラップ切断活性を有するものの、酵素の誤認識による副反応が存在する。そこで、検出時間短縮を企図して酵素量を増量すると副反応の発生頻度が上がってしまい、検出結果の正確な判定を困難なものにしてしまう。
　そのような状況を改善すべく、従来は同一の反応溶液内で実施される前述の第一段階と第二段階を分離する手法が報告されている（非特許文献３，４）。具体的には核酸切断酵素として５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅ、核酸は標的ＲＮＡ、侵入構造を形成するのに必要な二種類のオリゴＤＮＡという構成で第一段階のみが進行する反応溶液を調整する。第一段階をある程度進行させた後に、第二段階として検出用核酸を添加し、且つアレスターオリゴと名づけたオリゴＲＮＡも同時に添加することで酵素の誤認識による副反応を抑制する仕組みである。
特許第４０１６０５０号公報 特許第４３６２１５０号公報 特許第４３６３９８８号公報
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９９９，　２７４，　２１３８７－２１３９４ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０００，　２７５，　２４６９３－２４７００ ＲＮＡ，　２００３，　９，　１５５２－１５６１ ＲＮＡ，　２００４，　１０，　１１５３－１１６１
　しかしながら、反応容器を途中で開放する手法は操作が煩雑になることに加え、外部からの試料混入などによる擬陽性を引き起こすリスクが高まり、試験の正確性を損なう恐れがある。そのため、ＲＮＡ検出を迅速かつ正確に行うことが要求される場合には、操作が簡便であり、両構造が混在する反応系においても切断活性が維持され、副反応が抑制される手法が望ましい。
　本発明は、上述した事情に鑑みたものであって、ＲＮＡを迅速に検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る核酸検出方法は標的核酸を含有する流体から標的核酸を検出する核酸検出方法であって、第一核酸切断酵素と、第二核酸切断酵素と、と備える検出用試薬を前記流体に混合する検出試薬混合工程を備え、前記標的核酸と、第一フラップ部位を有する第一核酸および第二核酸とが、複合体形成することで現れる第一侵入構造に付随する前記第一フラップ部位を前記第一核酸切断酵素で切断し、第三核酸を生成し、前記第三核酸と、第二フラップ部位を有する第四核酸とが、第五核酸上で複合体形成することで現れる第二侵入構造に付随する前記第二フラップ部位を前記第二核酸切断酵素で切断し、被切断物を生成する。
　前記課題は、以下の本発明［１］～［２０］のいずれかによって解決される。
　［１］　標的核酸を含有する流体から標的核酸を検出する核酸検出方法であって、第一核酸切断酵素と、第二核酸切断酵素とを備える検出用試薬を前記流体に混合する検出用試薬混合工程を備え、前記標的核酸と、第一フラップ部位を有する第一核酸および第二核酸とが、複合体形成することで現れる第一侵入構造に付随する前記第一フラップ部位を前記第一核酸切断酵素で切断し、第三核酸を生成し、前記第三核酸と、第二フラップ部位を有する第四核酸とが、複合体形成することで現れる第二侵入構造に付随する前記第二フラップ部位を前記第二核酸切断酵素で切断し、被切断物を生成する、核酸検出方法。
　［２］　前記標的核酸がＲＮＡであり、前記第一核酸の少なくとも前記第一フラップ部位、前記第二核酸、前記第四核酸がＤＮＡを含む、［１］に記載の核酸検出方法。
　［３］　前記標的核酸および前記第四核酸がＤＮＡであり、前記第一核酸および前記第二核酸がＲＮＡを含む、［１］に記載の核酸検出方法。
　［４］　前記第三核酸と、第二フラップ部位を有する第四核酸と、第五核酸とが複合体形成することで、前記第二新入構造が現れ、前記第五核酸がＤＮＡを含む、［１］から［３］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［５］　前記第一侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性は、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性よりも小さく、前記第二侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性は前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性よりも小さい、［１］から［４］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［６］　前記第一侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性は、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性に比して９０％以下であり、前記第二侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性は前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して９０％以下である、［４］に記載の核酸検出方法。
　［７］　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性が、前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して小さい、［１］から［６］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［８］　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第四核酸に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性が、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して小さい、［１］から［７］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［９］　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第四核酸に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性が、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して８０％以下である、［８］に記載の核酸検出方法。
　［１０］　前記第一核酸切断酵素の濃度が、前記第二核酸切断酵素の濃度に比して９倍以下である、［１］から［９］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［１１］　前記第一核酸切断酵素の濃度が、０．２７ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］から［１０］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［１２］　前記第二核酸切断酵素の濃度が、０．１２ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］から［１１］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［１３］　侵入構造を形成する前記第一核酸および前記第四核酸の少なくとも一方は蛍光標識されており、蛍光強度の変化で、前記侵入構造の切断を検出できる標的核酸確認工程をさらに有する、［１］から［１２］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［１４］　電気泳動により反応前後の移動度を比較することで前記被切断物を検出する標的核酸確認工程をさらに有する、［１］から［１２］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［１５］　前記検出試薬混合工程による、前記第一核酸切断酵素と前記第二核酸切断酵素とによる前記被切断物の生成は、微小空間において行われる、［１３］に記載の核酸検出方法。
　［１６］　前記微小空間の高さが１０ｎｍ～１００μｍである、［１５］に記載の核酸検出方法。
　［１７］　前記微小空間が、１０万～１０００万個/ｃｍ２の密度で設けられる、［１５］または［１６］に記載の核酸検出方法。
　［１８］　前記標的核酸確認工程は、前記微小空間において生成された前記被切断物を検出することで、前記標的核酸の検出が行われる、［１５］から［１７］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［１９］　前記第一核酸切断酵素が５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅであり、前記第二核酸切断酵素がＦＥＮ－１である、［１］から［１８］のいずれかに記載の核酸検出方法。
　［２０］　前記第一核酸切断酵素と、前記第二核酸切断酵素とを含む、［１］から［１９］のいずれかに記載の核酸検出方法を実施するための検出用試薬。
　本発明によれば、標的核酸を含有する流体から標的核酸、例えばＲＮＡを迅速に検出する核酸検出方法を提供することができ、前記核酸検出方法を実施するための検出用試薬を提供することができる。
本実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 図１のＩＩ－ＩＩ線における断面図である。 前記マイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイの要部を示す平面図である。 前記マイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイの要部を示す図であり、図３ＡのＩＩＩｂ－ＩＩＩｂ線における断面図である。 前記マイクロ流体デバイスの使用例を説明するための図である。 前記マイクロ流体デバイスの蛍光視野の撮影画像である。 実施例において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 比較例において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 比較例において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例２において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例２において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例２において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例３おいて観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例４おいて観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例４おいて観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例において観測された前記マイクロ流体デバイスの蛍光視野（シグナル）の撮影画像である。 実施例において観測された前記マイクロ流体デバイスの蛍光視野（ノイズ）の撮影画像である。 実施例において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。 実施例において観測された蛍光強度の時間的変化を示すグラフである。
[第一実施形態]
　本発明の第一実施形態に係る核酸検出方法について説明する。
　本実施形態に係る核酸検出方法は、標的核酸を含有する流体２０から標的核酸を検出する方法である。
　本実施形態に係る核酸検出方法は流体２０に検出用試薬（微小液滴）２３を混合する、検出試薬混合工程を備えている。
　本実施形態に係る検出用試薬２３は、第一核酸切断酵素と、第二核酸切断酵素と、を有する。第一核酸切断酵素および第二核酸切断酵素は、特定の核酸の侵入構造に付随する特定のフラップ部位を切断する酵素である。本願実施形態の核酸検出方法を簡便にするために、例えばバッファー、および界面活性剤などを含んでもよい。通常、これらの試薬は適切な容器に入れて提供される。
　本実施形態において、フラップ部位とは分子内、あるいは分子間で核酸が会合した際、当該核酸の塩基配列の一部は塩基対形成によりハイブリダイゼーションするが、それ以外の３’末端もしくは５’末端のいずれか一方あるいは両方が塩基対形成しない部分のことをいう。このとき、塩基対形成しない部分は通常の核酸塩基の他に、蛍光物質や人工核酸塩基などの非天然の構造からなっていても良い。
　本実施形態において、核酸の侵入構造とは、特許文献１～３や非特許文献１、２などに示される特異な構造を表すものである。すなわち、核酸の侵入構造とは、検出対象となる標的核酸に対して二種類のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズして、基質複合体を形成した際に生じるフラップ部位を有する構造である。
　ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、５’末端側からフラップ部位となる塩基配列と標的核酸と相補的な塩基配列を有するフラッププローブ（ＦＰ）と、ＦＰのハイブリダイズする位置に隣接する部位にハイブリダイズする侵入プローブ（ＩＰ）と、からなる。ＩＰの３’末端の少なくとも一塩基はＦＰと標的核酸がハイブリダイズしている５’部分と重複する塩基配列を有するものである。侵入構造のような特殊な構造を認識しフラップ部分を切断可能な酵素が存在すると、フラップ部位が切断される。
　本実施形態に係る核酸検出方法において、流体２０に検出用試薬２３を混合する検出試薬混合工程後、侵入構造が切断される反応が少なくとも二段階で発生する。
　第一段階では、第一フラップ部位を有する第一核酸が上記ＦＰに相当し、第二核酸が上記ＩＰに相当し、第一核酸と第二核酸が標的核酸にハイブリダイズして複合体形成することで第一侵入構造が形成されており、第一侵入構造に付随する第一フラップ部位が第一核酸切断酵素によって切断され、第三核酸が生成される。
　第二段階では、第一段階で生じた第三核酸が第二段階目の侵入構造におけるＩＰに相当し、第二フラップ部位を有し、且つ第三核酸がハイブリダイズ可能な塩基配列を有する第四核酸がＦＰに相当し、これらが複合体形成することで第二侵入構造が形成される。第二侵入構造に付随する第二フラップ部位が第二核酸切断酵素によって切断され、被切断物が生成される。このとき、第四核酸は第三核酸がハイブリダイズ可能な塩基配列を有しており、第一段階における標的核酸とＦＰを併せた機能を有するものであるが、第五核酸として第二段階における標的核酸を用いることで機能が分割されていてもよい。
　被切断物は、例えば電気泳動などの手段により反応前後の移動度を比較することで検出が可能なものである。また、第一核酸または第四核酸には、蛍光色素および当該蛍光色素の蛍光波長に対応した吸収波長を有する蛍光物質および消光物質が付加されており、切断反応により両者が離れることで起こる発光から、被切断物を確認することも可能である。
　被切断物を確認することで、流体２０に標的核酸が含有されていることを検出することができる（標的核酸確認工程）。
　本実施形態に係る核酸検出方法において、第一侵入構造に対する第二核酸切断酵素の切断活性は、前記第一侵入構造に対する第一核酸切断酵素よりも小さく、第二侵入構造に対する第一核酸切断酵素の切断活性は前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性よりも小さいことを特徴とする。以下、この特徴について詳しく説明する。
　ここで、「切断活性」とは、酵素が侵入構造を認識してフラップ部を切断する切断性能のことであり、切断された核酸の量を検出することによって表すことができる。本実施形態においては、電気泳動により反応前後の移動度を比較するか、被切断物に起因する蛍光強度を測定することにより表すことができる。切断活性は、酵素の濃度や反応条件により調整可能である。また、反応条件および酵素の濃度を一定にした場合には、基質の濃度の増大に伴い、切断活性は最大値に向かって双曲線的に増加する。基質が低濃度である場合には、基質の濃度と切断活性は比例関係にある。低濃度とは、例えば、１ｍМ以下であり、１０μМ以下であってもよく、１０ｎМ以下であってもよく、５００ｐМ以下であってもよい。そのため、酵素の濃度と切断活性とを近似するものとして扱うことができる。
　前記第一侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性は、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素に比して０％超９０％以下であり、０％超８０％以下がより好ましく、０％超７０％以下が更に好ましく、０％超６０％以下が特に好ましい。
　一方、前記第二侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性は前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して０％超９０％以下であり、０％超８０％以下がより好ましく、０％超７０％以下が更に好ましく、０％超６０％以下が特に好ましい。
　第一核酸切断酵素は、前述の侵入構造を認識してフラップ部位を切断することが可能な酵素である。標的核酸がＤＮＡであり、ＦＰおよびＩＰがＤＮＡである場合に形成されるＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造に付随するフラップ部位に対して、第一核酸切断酵素は切断活性を有する。
　また、標的核酸がＲＮＡであり、ＦＰおよびＩＰがＤＮＡである場合に形成されるＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造に付随するフラップ部位に対して、第一核酸切断酵素は切断活性を有する。
　例えば、第一核酸切断酵素は、ポリメラーゼ様のヌクレアーゼが挙げられるが、その他のヌクレアーゼであってもよい。また、ＲＮＡ／ＤＮＡの二本鎖構造における侵入構造を認識するように改変されたフラップエンドヌクレアーゼでも良い。
　第一核酸切断酵素の濃度は、第二核酸切断酵素の濃度に対して、９．０倍以下が好ましく、０．１０倍以上９．０倍以下がより好ましく、０．６倍以上２．５倍以下がより好ましく、０．６倍以上１．３倍以下が更に好ましい。
　第一核酸切断酵素の濃度が、９．０倍以下であると、検出のシグナル／ノイズ比を高められ、核酸検出が容易になる。特に、二段階目の切断反応における蛍光強度を維持しつつ、バックグラウンドの蛍光強度が抑制される。
　ここで、酵素の濃度とは、ｍｇ／ｍＬにより表される濃度のことを指す。
　第二核酸切断酵素は、前述の侵入構造を認識してフラップ部位を切断することが可能な酵素である。標的核酸がＤＮＡであり、ＦＰおよびＩＰがＤＮＡである場合に形成されるＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造に付随するフラップ部位に対しては、第二核酸切断酵素は第一核酸切断酵素と比較して高い切断活性を有する。
　一方、標的核酸がＲＮＡであり、ＦＰおよびＩＰがＤＮＡである場合に形成されるＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造（例えば、ＲＮＡを標的核酸とした第一侵入構造）に付随するフラップ部位に対する切断活性は、第二核酸切断酵素は第一核酸切断酵素と比較して低い。活性の割合は、好ましくは１００％より低く、より好ましくは９０％より低く、より好ましくは８０％より低く、より好ましくは７０％より低く、より好ましくは６０％より低く、より好ましくは５０％より低く、より好ましくは４０％より低く、より好ましくは３０％より低く、より好ましくは２０％より低く、より好ましくは１０％より低いことが特徴である。
　例えば、第二核酸切断酵素は、フラップエンドヌクレアーゼが挙げられるが、その他のヌクレアーゼであってもよい。また、ＤＮＡ／ＤＮＡの二本鎖構造における侵入構造を認識するように改変されたポリメラーゼヌクレアーゼでも良い。
　第二核酸切断酵素の濃度は、第二核酸切断酵素の濃度に対して、０．１倍以上が好ましく、０．１倍以上１０倍以下がより好ましく、０．４倍以上１．７倍以下がより好ましく、０．７５倍以上１．７倍以下が更に好ましい。また、第二核酸切断酵素の濃度は、０．１２ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．００８ｍｇ／ｍＬ以上０．１２ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．０６ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましい。
　第二核酸切断酵素の濃度が、第一核酸切断酵素の濃度に対して０．１倍以上であると、検出に要する反応時間を短縮しつつ、ノイズを低減することができる。また、第二核酸切断酵素の濃度が、０．１２ｍｇ／ｍＬ以下であることによっても、反応時間を短縮しつつ、ノイズを低減することができる。
　本実施形態に係る核酸検出方法は、侵入構造を認識し、切断反応が生じることで標的核酸の有無を検知する手法において高い効果を発揮する。例えば、切断対象となる核酸構造に対してそれぞれ活性が異なる酵素を同一の反応系に混合することで、検出シグナルが増強され、かつノイズが低減して検出時におけるシグナル／ノイズ比を高められることが可能となる。
　従来の核酸の検出方法では、酵素を用いた核酸切断反応では何らかの核酸構造に対する誤認識による望まない副反応が生じる場合がある。例えば、上記の標的核酸確認工程において、標的核酸が含有されていないにも関わらず、試薬のみで反応が起こり蛍光発光が起こってしまう場合がある。具体的には標的核酸がＲＮＡのとき、一種類の核酸切断酵素、特には第一核酸切断酵素を用いた検出系において、第四核酸のフラップ部位を切断するという副反応が起こりやすい。そのため、検出時間の短縮を目的としてフラップ部位の切断反応を促進すべく反応系中への投入量を増してゆくと、前述の副反応が増大してしまう。それを回避するために第一核酸切断酵素の投入量を減じてしまうと検出に掛かる時間は増加してしまう。
　前述の副反応は、二種類の核酸切断酵素を用いた場合においても、同様に起こり得る。本実施形態に係る核酸検出方法においては、検出に係る時間を増大させることなく、前述の副作用を抑制し、かつ、検出時におけるシグナル／ノイズ比を高められることが可能となる。検出用試薬２３中の第一核酸切断酵素の量を減じて、前述の副反応を抑制する。
　さらに、検出用試薬２３に第二核酸切断酵素を混合することで、前記二段階目の切断反応（第三核酸と第四核酸とからなる第二侵入構造に対する切断反応）の切断活性を高める。
　第一核酸切断酵素の量を減じることで副反応を抑制し、一方、第二核酸切断酵素を混合することで検出時間の増大を阻止する。
　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性が、前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して小さい。
　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第四核酸に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性が、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して小さい。
　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第四核酸に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性が、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して８０％以下であり、６０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましく、４０％以下がより好ましく、３０％以下が更に好ましい。
　前記第一核酸切断酵素の濃度が、前記第二核酸切断酵素の濃度に比して９．０倍以下であり、０．１倍以上９．０倍以下がより好ましく、０．６倍以上２．５がより好ましく、０．６倍以上１．３倍以下が更に好ましい。
　前記第一核酸切断酵素の濃度が、０．２７ｍｇ／ｍＬ以下であり、０．１８ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．１４８ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０９ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０７４ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０４５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０３７ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましい。また、前記第一核酸切断酵素の濃度が、０．００３ｍｇ／ｍＬ以上であり、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０１９ｍｇ／ｍＬ以上が更に好ましい。
　ここで、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造（例えば、ＲＮＡを標的核酸とした第一侵入構造）に付随するフラップ部位に対する切断活性は、第二核酸切断酵素は第一核酸切断酵素と比較して低い。そのため、検出用試薬２３中に第二核酸切断酵素をさらに混合したとしても、第一核酸切断酵素による前記一段階目の切断反応（標的核酸と第一核酸と第二核酸とからなる第一侵入構造に対する切断反応）の切断活性に対する影響は少ない。
　さらに、本実施形態に係る核酸検出方法によれば、第一核酸切断酵素の量を減じることができ、第一切断酵素が第二侵入構造を切断してしまうことを抑制できる。そのため、検出時におけるシグナル／ノイズ比を高めて、より効果的に標的核酸を検出可能となる。
　二本鎖構造の形成は、通常の温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うことができるが、核酸切断反応を行う溶液と同一の溶液で行うことが好ましい。ハイブリッド形成は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われることが好ましい。反応溶液のｐＨが６．５～１０．０の範囲、特にｐＨ７．５～９．０の範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度が５～２５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に１０～１００ｍＭの範囲に有ることが好ましい。緩衝作用のある塩としては、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができるが、それら以外のものでも良い。
　アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましく、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩として、例えば塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含むことが好ましい。反応溶液の塩濃度としては１～１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に５～５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に１０～３０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
　反応全体における温度は１５～９０℃の範囲が好ましく、特に２５～８０℃の範囲が好ましく、特に３５～７０℃の範囲が好ましい。
　本実施形態に係る核酸検出方法における検出の標的となる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであれば特に限定されず、天然のものであっても合成されたものであってもよい。天然の核酸としては、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡなどである。また、合成された核酸として、β－シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸合成法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
　本実施形態に係る核酸検出方法における検出の標的となる核酸は、特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物、培養細胞等の生物から抽出された核酸であってもよく、核酸増幅反応により増幅された核酸であってもよい。増幅産物が２本鎖核酸である場合には、熱変性処理や化学変性処理等により１本鎖化した後に用いることができる。このような核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。また、動物等からの核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。
（第一実施形態の効果）
　本実施形態に係る核酸検出方法によれば、本実施形態に係る核酸検出方法においては、検出に係る時間を増大させることなく、検出時におけるシグナル／ノイズ比を高められることが可能となる。特に、ＲＮＡを標的核酸とした場合に、高い効果を発揮する。
　また、本実施形態に係る核酸検出方法によれば、微小液滴である検出用試薬２３を流体２０に一度だけ混合するだけで、容易に核酸の検出を行うことができる。
　ＲＮＡ検出が簡便、迅速に行えるようになることで、診察実施日に病院内での検査が可能となる。これにより治療や投薬量についての方針が素早く決定できるため患者の重症化を未然に防ぐことができる。また、通院回数を減らすことで医療側の人手不足や医療費削減に貢献するものと考えられる。
[第二実施形態]
　本発明の第二実施形態に係る核酸検出方法について、図１から図３を参照して説明する。なお、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法等は適宜調整されている。以降の説明において、既に説明したものと共通する構成については、同一の符号を付して重複する説明を省略する。
　第二実施形態に係る核酸検出方法は、従来の生化学的あるいは分子生物学的な手法に見られるチューブやウェルがプレート上に配された容器を用いて行う。この他に、近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術等を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されており、これらのマイクロウェルアレイのウェルを微小体積の流体中で種々の生化学的又は化学的反応をさせるための化学反応容器として用いることも可能である。マイクロウェルは一つのアレイ上に無数に存在し、一つのマイクロウェルに一つの検出対象が入るようにする。検出対象の有無を蛍光発光などで確認できるようにすると、発光が観察されたウェルの数を数え上げることで検出対象を定量できる仕組みである。
　第二実施形態に係る核酸検出方法は、マイクロウェルアレイを化学反応容器として用いる。
　まず、本実施形態に係る核酸検出方法において用いる解析デバイスとして、リキッドバイオプシーを用いたデジタルカウント法に用いられるマイクロ流体デバイス１について説明する。
　図１は、マイクロ流体デバイス１を示す斜視図である。
　図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線における断面図である。
　図３は、マイクロ流体デバイス１のマイクロウェルアレイ４の要部を示す図である。
　また、図３Ａはその平面図であり、図３Ｂは図３ＡのＩＩＩｂ－ＩＩＩｂ線における断面図である。なお、マイクロ流体デバイス１は、リキッドバイオプシーに限らず、タンパク質や、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス生体分子、細菌などの測定にも使用可能である。
　図１から図３に示すように、マイクロ流体デバイス１は、複数のウェル（微小空間）３が形成されたマイクロウェルアレイ４を備えている。
　図１および図２に示すように、マイクロウェルアレイ４は、板状の底部層１１と、底部層１１の上に重ねて形成された板状の壁部層１２と、を備えている。マイクロウェルアレイ４の複数のウェル３は、図３Ａに例示するように、アレイ状に配列されている。図３Ａでは、ウェル３は、横方向（図３Ａにおいて左右方向）に間隔をあけて複数並んでいる。また、横方向に並んだ複数のウェル３からなる横配列ウェル群３０は、縦方向（図３Ａにおいて上下方向）に複数並んでいる。縦方向に隣り合う横配列ウェル群３０は、互いに縦方向にウェル３が重ならないように横方向にずれて配置されている。
　複数のウェル３が開口するマイクロウェルアレイ４の面（開口面６）は平坦となっている。複数のウェル３は、例えばマイクロウェルアレイ４の開口面６の全体に形成されてもよいが、本実施形態では、マイクロウェルアレイ４の開口面６のうち周縁領域７を除く領域（ウェル形成領域８）に形成されている。ウェル形成領域８の周縁形状は任意であってよいが、本実施形態では長方形となっている。
　図２及び図３に示すように、ウェル３は、底を有する穴である。本実施形態では、ウェル３は円筒状に形成され、底面９を有している。マイクロウェルアレイ４のウェル３の形状や大きさに特に制限はないが、例えば、微小液滴中で種々の生化学的な反応を行う場合には、１個～数個の生体分子２１又は担体を収容可能な形状と大きさを有していることが好ましい。担体は例えばビーズであってもよく、担体には試料である生体分子２１が結合されていてもよい。
　なお、ウェル３の形状は、円筒形に限られず、任意であってよく、例えば円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよい。ここで、逆円錐形及び逆角錐形とは、それぞれ円錐及び角錐の底面がウェル３の開口部となるようなウェル３の形状を意味する。ウェル３の形状が逆円錐形や逆角錐形である場合には、例えば円錐や角錐の頂部を切り取り、ウェル３の底面９を平坦にしてもよい。他の例として、ウェル３の底面９を、ウェル３の開口部に向けて凸又は凹となる曲面状に形成してもよい。また、ウェル３の形状は、例えば上述の形状を二つ以上組み合わせたような形状であってもよい。
　例えば、ウェル３の形状は、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、円錐や角錐の底面がウェル３の入り口（開口部）となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状であってもよい。この場合、マイクロウェルの底部は平坦になる。
　　図３Ｂに示すように、本実施形態では、ウェル３の形状が円筒形であり、ウェル３の底部は、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）としてもよい。ウェル３の底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
　図３Ｂに示すように、ウェル３が円筒形の場合、生体分子２１を含む水性液体を封入する目的のためには、ウェル３の最大径、高さＷｈは例えば１０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは１００ｎｍ～２０μｍ、さらに好ましくは１μｍ～２０μｍであってもよい。ウェル３の寸法は、ウェル３に収容する水性液体の量や、生体分子２１を付着させたビーズ等の担体の大きさとウェル３の寸法の好適な比等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子２１が収容されるように、適宜決定する。
　マイクロウェルアレイ４の材質は、酵素反応を阻害しないものであることが好ましい。
　あるいは、マイクロウェルアレイ４の材質（材料）表面に、酵素反応を阻害しない物質をコーティングすることも可能である。例えば、界面活性剤、リン酸脂質、その他の高分子化合物、またはこれらの混合物をコーティングしてよい。界面活性剤の例としては、非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎやｇｌｙｃｅｒоｌ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００等が挙げられる。また、高分子化合物の例としては、Ｐоｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃоｌ（ＰＥＧ）やＤＮＡ、蛋白質、ＢＳＡが挙げられる。
　また、マイクロウェルアレイ４の材質（材料）表面には、フッ素系のコート剤、シリコン系のコート剤をコーティングしてもよい。これらのコート剤をコーティングすることにより、表面を疎水的に改変することができる。上記のようにコーティングする結果、水溶液、バッファー、試薬、酵素、核酸、その他の反応系に含有される物質が表面に付着するのを抑制し、誤検出を防止することができる。
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイ４を用いた核酸検出方法の検出対象は、例えば血液等の生体から採取した試料やＰＣＲ産物等であってもよく、人工的に合成された化合物等であってもよい。例えば、生体分子２１であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェル３は、ＤＮＡが１分子入るような形状と大きさであってもよい。
　マイクロウェルアレイ４は、ウェル３の密度が、例えば１０万～１０００万個／ｃｍ２であり、好ましくは１０万～５００万個／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１０万～１００万個／ｃｍ２である。ウェル３の密度がこのような範囲であると、所定数のウェル３に試料である水性液体を封入させる操作が容易である。また、実験結果を解析するためのウェル３の観察も容易である。
　例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個のウェルを使用することが好適である。
　マイクロウェルアレイ４において、各ウェル３は、基板上に親水性材料または疎水性材料を積層して親水層または疎水層を形成する工程と、前記親水層または疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程から作製することができる。ただし、本実施形態を実現できる条件であれば、ウェル３は基板と同一材料とされて、成型加工や切削加工によって形成されてもよい。
　マイクロウェルアレイ４は、基板上に形成されていてもよい。基板は、電磁波透過性を有するものであってもよく、有さないものであってもよい。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。マイクロウェルアレイが電磁波透過性を有する基板上に形成されていた場合には、マイクロウェルアレイ上で行った実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光、燐光等を基板側から計測することができる。蛍光、燐光等の検出には、例えば蛍光顕微鏡等を利用することができる。この場合、電磁波は、例えば基板側から照射してもよいし、例えばウェルの入り口側から照射してもよい。
　例えば、マイクロウェルアレイ４において、可視光領域である４００～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板を用いればよい。
　電磁波透過性を有する基板としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。
　樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されていてもよい。
　実験結果の検出に蛍光や燐光を利用する観点から、上記の基板は、自家蛍光を実質的に有さないものであることが好ましい。ここで、自家蛍光を実質的に有さないとは、基板が実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有さないか、有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光の強さであれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
　電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた実験結果の検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。
　マイクロウェルアレイ４は、射出成形やインプリントによる樹脂成形のみでウェル３を複数構成したものであってもよい。
　生体分子２１の検出に用いる蛍光としては、核酸に標識可能な蛍光分子や、例えば蛍光分子を内包した蛍光ビーズや、ＤＮＡの二重らせんに特異的に入り込み、蛍光を発するＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーター等に由来するものが挙げられる。
　ウェル３に収容された生体分子２１から発せられる蛍光の観察は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて、マイクロウェルアレイ４の基板側から行うことができる。この蛍光観察により、所定の蛍光を発するウェル３の個数を数えることで、目的分子の数を特定することができる。
　生体分子２１は、例えば、そのままウェル３に収容する方法の他、ウェル３に収容する前に、目的分子を特異的に標識する蛍光標識で処理しておくとよい。あるいは、対象分子を特異的に認識するビーズを用いて、対象分子を補足した後に、ビーズをウェル３に収容し、対象分子を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的分子をウェル３内で蛍光標識してもよい。
　基板の厚みは、適宜決定することができるが、例えば基板側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、例えば０ｍｍ超５ｍｍ以下、０ｍｍ超２ｍｍ以下、あるいは０ｍｍ超０．６ｍｍ以下であることが好ましい。
　マイクロウェルアレイ４を使用した生体分子２１の観察には、蛍光以外にも、例えば濁度等を利用することもできる。濁度は、例えば４００～１０００ｎｍ程度の波長の光の透過性により測定することができる。
　親水性部分を形成する樹脂（以下「親水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、樹脂の構成成分の分子が、親水性を発現する親水性基を有するものが挙げられる。親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。
　より具体的には、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド－ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン－酢酸ビニル共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。親水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
　なお、親水性部分（親水性部分の材質）は、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満とされることも可能である。
　また、前述する基板が存在する場合には、基板と疎水層とを密着させる機能も有していてもよい。例えば、熱硬化性のシランカップリング剤等を基板に塗布し、熱硬化させてシロキサンポリマーを形成することにより、親水層を形成してもよい。
　疎水性部分を形成する樹脂（以下「疎水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触が７０度以上であるものを適宜選択して使用することができる。疎水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
　疎水性部分は、例えばレジストで形成されていてもよい。レジストは、微細構造を形成しやすい観点から、フォトレジストであってもよい。フォトレジストは、例えば、感光性のノボラック樹脂であってもよい。
　図１および図２に示すように、マイクロウェルアレイ４には、マイクロウェルアレイ４とともにマイクロ流体デバイス１の流路２を構成する蓋部材５が設けられている。蓋部材５は、板状又はシート状に形成された部材であり、マイクロウェルアレイ４の開口面６に対向して配置されている。マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との間には、流路２として機能する隙間が存在している。
　蓋部材５は、その厚さ方向に貫通する複数の貫通孔１５を有する。各貫通孔１５は、マイクロ流体デバイス１の流路２に連通し、流路２内に流体を供給する入口や、流体を排出する出口として機能する。本実施形態において、蓋部材５は二つの貫通孔１５Ａ、１５Ｂ（第一貫通孔１５Ａ及び第二貫通孔１５Ｂ）を有する。二つの貫通孔１５Ａ、１５Ｂは、長方形とされたウェル形成領域８のうち互いに向かい合う二つの角部に対応する位置に配されている。各貫通孔１５は、小孔部１６と、貫通方向から見た大きさが小孔部１６よりも大きな大孔部１７と、を有している。
（第二実施形態の効果）
　本実施形態に係る核酸検出方法によれば、第一実施形態同様、検出用試薬２３を流体２０に一度だけ混合するだけで検出に係る時間を増大させることなく、検出時におけるシグナル／ノイズ比を高められることが可能となる。さらに、ウェル（微小空間）３を用いて、効果的に検出結果を可視化することができる。
　次に、本実施形態に係るマイクロウェルアレイ４を備えたマイクロ流体デバイス１を用いた核酸検出方法について説明する。図４から図５は、マイクロ流体デバイス１の使用例を説明するための図である。
　はじめに、標的核酸である生体分子２１を含有する流体２０と、封止液と、を準備する。流体２０は、生体分子２１及び溶媒流体２２から構成されており、さらに検出用試薬２３が混合されている。封止液は、例えばオイルである。
　次に、マイクロ流体デバイス１を、流路２における流体２０及び封止液の流れが水平方向になるように、かつ、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くように配置する。
　続いて、ピペットを用いて、流体２０をマイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に注入する。図４は、流体２０を注入し終わったところを示している。
　その後、封止液をマイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に注入し、流路２を封止液で満たす。すなわち、流路２内の流体２０を封止液に置換する。これにより、各ウェル３内の流体２０が封止液によって封止される。封止を行った後に、マイクロ流体デバイス１を加熱することによって内部で生化学反応が起こる。流体２０中に標的核酸が含有されている場合、二段階の侵入構造の切断反応により、被切断物が生成される。その被切断物を検出することで、生体分子２１がウェル３内に格納されていることを検出する。
　反応後にマイクロウェルアレイ４のウェル３内において測定対象となるシグナルとしては、蛍光や、発光、燐光等が挙げられる。これらの波長域は、可視光や、紫外線、赤外線等の電磁波として観測可能なものを対象とできる。このため、このような波長域を測定できる測定機器を有している検出機器を、本実施形態に係る検出機として利用可能である。
　具体的に、本実施形態では、反応を検出するための検出機として蛍光顕微鏡を使用している。
　マイクロウェルアレイ４が光を通すように構成されている場合、マイクロ流体デバイス１は、蛍光顕微鏡でマイクロウェルアレイ４側から観察できるように配置される。蛍光顕微鏡で観察した画像は、例えば図５のように示される。図５の例では、蛍光顕微鏡により蛍光を観察している。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　以下に示す実施例および比較例においては、表１に示す配列を用いて以下の試薬量および条件でＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ＡｓｓａｙによるＲＮＡ検出を行った。
　表１の第一核酸の下線部分は第一フラップ部位を表す。第四核酸の下線部分は第二フラップ部位を表す。また第四核酸のＦは蛍光色素を表し、Ｑは消光物質を表す。
　実施例では標的ＲＮＡ上において第一核酸と第二核酸がハイブリダイズして、第一核酸切断酵素が第一フラップ部位を切断することで第三核酸が生成する。第三核酸は第四核酸上にハイブリダイズした状態で第二核酸切断酵素により第二フラップ部位が切断されて遊離する。これにより消光物質から蛍光物質が離れて蛍光発光を観測できるようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例１〕
　本実施例では、第一核酸切断酵素および第二核酸切断酵素を含む検出用試薬を用いて核酸の検出を行った。
（条件）
　一反応あたり全量が１０μＬとなるように標的ＲＮＡ（３０ｐＭ，０ｐＭ）と第一核酸（１μＭ）、第二核酸(１μＭ)、第四核酸 (２μＭ)、３－モルフォリノプロパンスルフォン酸(ｐＨ７．９, １０ｍＭ)、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ　２０（０．０５％ｖ／ｖ）、第一核酸切断酵素として５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅ（分子量：９２２９０）（０．０９ｍｇ／ｍＬ）と、第二核酸切断酵素としてＦｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１（分子量：３６９６０）（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、および蒸留水からなる反応液を調製した。標的ＲＮＡの濃度が異なる二種類の反応液を用意した。
（手順）
　反応液を微量試験チューブに入れ、リアルタイムＰＣＲ装置において６５℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起：４９０ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を測定した。
（結果）
　結果を図６に示す。標的ＲＮＡの濃度が高い方が、蛍光強度の立ち上がりが速くなっていることが観測できた。
〔比較例１〕
　本実施例では、第二核酸切断酵素を含み、第一核酸切断酵素を含まない検出用試薬を用いて核酸の検出を行った。
（条件）
　第一核酸切断酵素を含まず、第二核酸切断酵素としてＦｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１（０．０３ｍｇ／ｍＬ）を混合していること以外の条件は、実施例１と同様である。
（手順）
　実施例１の手順と同様である。
（結果）
　結果を図７に示す。標的ＲＮＡの濃度によって、蛍光強度の変化は観測されなかった。
〔比較例２〕
　本実施例では、第一核酸切断酵素を含み、第二核酸切断酵素を含まない検出用試薬を用いて核酸の検出を行った。
（条件）
　第二核酸切断酵素を含まず、第一核酸切断酵素として５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅ（０．０９ｍｇ／ｍＬ）を混合していること以外の条件は、実施例１と同様である。
（手順）
　実施例１の手順と同様である。
（結果）
　結果を図８に示す。標的ＲＮＡの濃度が高い（３０ｐＭ）方が、蛍光強度の立ち上がりが速くなることが観測できた。
　実施例１は、核酸切断酵素が１種類のとき（比較例１および比較例２）と比較して、標的ＲＮＡの濃度が同一の条件において、蛍光強度の立ち上がりが速くなっている。
　実施例１の結果において、ＲＮＡを標的核酸とした場合において、第一核酸切断酵素および第二核酸切断酵素を含む検出用試薬２３を用いることで、検出のシグナル／ノイズ比を高められることが可能であることが示されている。また、第一核酸切断酵素および第二核酸切断酵素を含む検出用試薬２３を用いることで、蛍光強度の立ち上がりが速くなっており、検出時間の増大を阻止できることが示されている。
〔実施例２〕
　本実施例では、第一核酸切断酵素と第二核酸切断酵素の活性比が、標的ＲＮＡの検出におけるシグナル／ノイズ比に与える影響を確認した。
（条件）
　反応液に含まれる第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比０．１０eｑ．（０．００３ｍｇ／ｍＬ）、０．１７eｑ．（０．００５ｍｇ／ｍＬ）、０．３３eｑ．（０．０１０ｍｇ／ｍＬ）、０．６３eｑ．（０．０１９ｍｇ／ｍＬ）、１．２３eｑ．（０．０３７ｍｇ／ｍＬ）、１．５eｑ．（０．０４５ｍｇ／ｍＬ）、２．４６eｑ．（０．０７４ｍｇ／ｍＬ）、３．０eｑ．（０．０９ｍｇ／ｍＬ）、４．９３eｑ．（０．１４８ｍｇ／ｍＬ）、６．０eｑ．（０．１８ｍｇ／ｍＬ）、９．０eｑ．（０．２７ｍｇ／ｍＬ）、１２．０eｑ．（０．３６ｍｇ／ｍＬ）、１５．０eｑ．（０．４５ｍｇ／ｍＬ）を変えた１３種類の反応液を要したことおよび、標的ＲＮＡの濃度を３０ｐＭ及び／又は３００ｐＭとしたこと以外は、実施例１と条件は同一である。第二核酸切断酵素は、実施例１同様、Ｆｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１（０．０３ｍｇ／ｍＬ）である。
（手順）
　実施例１の手順と同様である。
（結果）
　結果を図９Ａ～Ｃに示す。標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭおよび３００ｐＭの場合、第一核酸切断酵素の濃度比によるシグナルの立ち上がりの変化は見られなかった。標的ＲＮＡの濃度が０ｐＭの場合、第一核酸切断酵素の濃度比が増加するに従って、立ち上りが速くなっていることが確認できた。
　これは、第一核酸切断酵素の量が少ないことで副反応を抑制し、ノイズを減少させたためである。さらに、第二核酸切断酵素を混合することで検出時間の増大を阻止したためである。また、第一侵入構造に対する活性が高くない第二核酸切断酵素を混在させることで、検出反応は維持されて、シグナル／ノイズ比（標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭまたは３００ｐＭの場合と０ｐＭの場合の蛍光強度の差）が高まる。特に、第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比が０．１０倍、０．１７倍、０．３３倍、０．６３倍、１．２３倍、１．５倍、２．４６倍、３．０倍、４．９３倍、６．０倍、９．０倍の場合に、好適なシグナル／ノイズ比となり、０．１０倍、０．１７倍、０．３３倍、０．６３倍、１．２３倍、１．５倍、２．４６倍、３．０倍、４．９３倍、６．０倍の場合に、更に好適なシグナル／ノイズ比となることが示されている。
〔実施例３〕
　本実施例では、第二核酸切断酵素の濃度に拠らず、第一核酸切断酵素と第二核酸切断酵素の活性比が、標的ＲＮＡの検出におけるシグナル／ノイズ比に与える影響を確認した。
（条件）
　反応液に含まれる第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比を０．６３eｑ．（０．０３７ｍｇ／ｍＬ）、１．２３eｑ．（０．０７４ｍｇ／ｍＬ）、２．４６eｑ．（０．１４８ｍｇ／ｍＬ）を変えた３種類の反応液を要したことおよび、標的ＲＮＡの濃度を３０ｐＭ及び／又は３００ｐＭとし、第二核酸切断酵素Ｆｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１を０．０６ｍｇ／ｍＬとしたこと以外は、実施例１と条件は同一である。
（手順）
　実施例１の手順と同様である。
（結果）
　結果を図９Ｄに示す。標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭおよび３００ｐＭの場合、第一核酸切断酵素の濃度比によるシグナルの立ち上がりの変化は見られなかった。標的ＲＮＡの濃度が０ｐＭの場合、第一核酸切断酵素の濃度比が増加するに従って、立ち上りが速くなっていることが確認できた。
　これは、第一核酸切断酵素の量が少ないことで副反応を抑制し、ノイズを減少させたためである。さらに、第二核酸切断酵素を混合することで検出時間の増大を阻止したためである。また、第一侵入構造に対する活性が高くない第二核酸切断酵素を混在させることで、検出反応は維持されて、シグナル／ノイズ比（標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭまたは３００ｐＭの場合と０ｐＭの場合の蛍光強度の差）が高まる。これらと実施例２の結果より、第二核酸切断酵素の濃度に拠らず、良好なシグナル／ノイズ比となることが示されている。特に、第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比が０．６３倍、１．２３倍、２．４６倍の場合に、好適なシグナル／ノイズ比となることが示されている。
　さらに、第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比が０．６３倍、１．２３倍の場合には、標的ＲＮＡの濃度に拠らず好適なシグナル／ノイズ比となることが示された。これにより、第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比が０．６倍以上１．３倍以下の場合、様々な濃度の標的核酸を好適なシグナル／ノイズ比で検出することができ、第二核酸切断酵素の濃度が０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．０６ｍｇ／ｍＬ以下であると、更に好適である。
〔実施例４〕
　本実施例では、第一核酸切断酵素と第二核酸切断酵素の活性比が、標的ＲＮＡの検出におけるシグナル／ノイズ比に与える影響を確認した。本実施例では、第一核酸切断酵素の濃度を０．６３eｑ．と固定し、第二核酸切断酵素の濃度の種類を変えて実験した。
（条件）
　反応液に含まれる第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅの濃度比０．６３eｑ．とし、第二核酸切断酵素Ｆｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１を、０．００８ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．１２ｍｇ／ｍＬ、０．２４ｍｇ／ｍＬとし、第二核酸切断酵素の濃度に合わせて第一核酸切断酵素５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅを、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０３７ｍｇ／ｍＬ、０．０７４ｍｇ／ｍＬ、０．１４８ｍｇ／ｍＬとした５種類の反応液を要したことおよび、標的ＲＮＡの濃度を３０ｐＭ及び／又は３００ｐＭとしたこと以外は、実施例１と条件は同一である。
（手順）
　実施例１の手順と同様である。
（結果）
　結果を図９Ｅ、Ｆに示す。標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭおよび３００ｐＭの場合、第二核酸切断酵素の濃度によるシグナルの立ち上がりの変化は見られなかった。標的ＲＮＡの濃度が０ｐＭの場合、第二核酸切断酵素の濃度が増加するに従って、立ち上りが速くなっていることが確認できたが、第二核酸切断酵素の濃度０．０６ｍｇ／ｍＬ以上では大きな違いは確認できなかった。
　これは、第一核酸切断酵素の量が少ないことで副反応を抑制し、ノイズを減少させたためである。さらに、第二核酸切断酵素を混合することで検出時間の増大を阻止したためである。また、第一侵入構造に対する活性が高くない第二核酸切断酵素を混在させることで、検出反応は維持されて、シグナル／ノイズ比（標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭまたは３００ｐＭの場合と０ｐＭの場合の蛍光強度の差）が高まる。これらと実施例２の結果から、第二核酸切断酵素の濃度に拠らず、第一核酸切断酵素と第二核酸切断酵素の濃度比が一定の範囲内にあれば、良好なシグナル／ノイズ比になることが示された。特に、第二核酸切断酵素の濃度が、０．００８ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．１２ｍｇ／ｍＬの場合に、好適なシグナル／ノイズ比となり、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬの場合に、更に好適なシグナル／ノイズ比となることが示されている。しかし、第二核酸切断酵素と第一核酸切断酵素の濃度比が同じであっても、第一核酸切断酵素および第二核酸切断酵素の濃度が増加し過ぎると、シグナル／ノイズ比が良好でなく、第二核酸切断酵素の濃度が０．２４ｍｇ／ｍＬの場合には、十分なシグナル／ノイズ比が得られなかった。
〔実施例５〕
　本実施例では、ウェル３による蛍光シグナル確認における、シグナル／ノイズ比の改善の効果を確認した。
（条件）
　一反応あたり全量が２０μＬとなるように標的ＲＮＡ（０ｐＭ、３０ｐＭ）と第一核酸（１μＭ）、第二核酸（１μＭ）、第四核酸 (２μＭ)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン-塩酸緩衝液（ｐＨ９．０、１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ　２０（０．０５％ｖ／ｖ）、濃度比を変えた第一核酸切断酵素である５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅ（０．０４５、０．０９、０．１８、０．２７、０．３６、０．４５ｍｇ／ｍＬ）、第二核酸切断酵素であるＦｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１（０．０３ｍｇ／ｍＬ）および蒸留水からなる反応液を用意した。
（手順）
　反応液をマイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａに送液し、その後、封止液としての検出反応試薬と混ざり合わないＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ）を、第一貫通孔１５Ａを通じて８０μl送液することで、各ウェル３内に試薬を分割して封入した。これを６６℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。次に、蛍光顕微鏡（キーエンス製）を使用し、ＮＩＢＡの蛍光フィルタを用いて各微小孔の蛍光を検出した。
（結果）
　結果を図１０に示す。露光時間は、１０００ｍｓｅｃとした。図１０Ａは標的ＲＮＡの濃度が３０ｐＭの場合であり、ウェル３におけるノイズとは異なる強度の蛍光シグナルを確認することができた。図１０Ｂは標的ＲＮＡが０ｐＭのときの結果であり、ウェル３におけるノイズの蛍光強度が低いことが見て取れる。
　〔比較例３〕
　副反応の程度を確かめるために、標的ＲＮＡが存在しない条件で第四核酸と第一核酸および第一核酸切断酵素である５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅが混合された反応液が示す挙動を観察した。
（条件）
　一反応あたり全量が１０μＬとなるように第一核酸(１μＭ)、第四核酸(２μＭ)、３－モルフォリノプロパンスルフォン酸（ｐＨ７．９、１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ　２０（０．０５％ｖ／ｖ）、第一核酸切断酵素として５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅ（０．０９ｍｇ／ｍＬ）、および蒸留水からなる反応液を調製した。
（手順）
　反応液を微量試験チューブに入れ、リアルタイムＰＣＲ装置において６５℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起：４９０ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を測定した。
（結果）
　図１１に結果を示す。蛍光強度は、標的ＲＮＡが無い状態でも、時間経過に従って上昇してゆくことが観測できた。この結果から、少なくとも第一核酸と第四核酸がノイズ（標的ＲＮＡが無くても蛍光強度が上昇）の増加に寄与していることが確認された。
〔比較例４〕
　副反応の程度を確かめるために、標的ＲＮＡが存在しない条件で第四核酸と第一核酸および第二核酸切断酵素であるＦＥＮ－１が混合された反応液が示す挙動を観察した。
（条件）
　反応あたりの全量が１０μＬとなるように第一核酸（１μＭ）、第四核酸（２μＭ）、３－モルフォリノプロパンスルフォン酸（ｐＨ７．９、１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ　２０（０．０５％ｖ／ｖ）、第二核酸切断酵素としてＦｌａｐｅｎｄｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　１（０．０３ｍｇ／ｍＬ）および蒸留水からなる反応液を調製した。
（手順）
　反応液を微量試験チューブに入れ、リアルタイムＰＣＲ装置において６５℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起：４９０ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を測定した。
（結果）
　図１２に結果を示す。蛍光強度は、標的ＲＮＡが無い状態でも時間経過に従って上昇してゆくことが観測できた。しかし、図１１と比較してノイズとしての寄与は少ないものであることが確認された。この結果からも、少なくとも第一核酸と第四核酸がノイズ（標的ＲＮＡが無くても蛍光強度が上昇）の増加に寄与していることが確認された。
　ノイズの増加に影響を与える要素は、第一核酸、第四核酸と酵素であり、第一核酸切断酵素の方が第二核酸切断酵素よりもその影響が大きい。標的核酸の検出に係る時間を早めようとして第一核酸切断酵素の量を増やすことが容易に考えられるが、逆に第一核酸切断酵素の量を減じることで、検出時におけるシグナル／ノイズ比を高めることができ、より効果的に標的核酸を検出可能となる。一方で、第二核酸切断酵素を混合することで検出時間の増大を阻止することもできる。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。
　本発明によれば、標的核酸を含有する流体から標的核酸を迅速に検出する核酸検出方法を提供することができ、前記核酸検出方法を実施するための検出用試薬を提供することが可能である。
１　マイクロ流体デバイス
３　ウェル（微小空間）
４　マイクロウェルアレイ
５　蓋部材
６　開口面
７　周縁領域
８　ウェル形成領域
９　底面
１５　貫通孔
１５Ａ　第一貫通孔
１５Ｂ　第二貫通孔
１６　小孔部
１７　大孔部
２０　流体
２３　検出用試薬（微小液滴）

Claims (20)

  1. 　標的核酸を含有する流体から標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
    　第一核酸切断酵素と、第二核酸切断酵素とを備える検出用試薬を前記流体に混合する検出用試薬混合工程を備え、
    　前記標的核酸と、第一フラップ部位を有する第一核酸および第二核酸とが、複合体形成することで現れる第一侵入構造に付随する前記第一フラップ部位を前記第一核酸切断酵素で切断し、第三核酸を生成し、
    　前記第三核酸と、第二フラップ部位を有する第四核酸とが、複合体形成することで現れる第二侵入構造に付随する前記第二フラップ部位を前記第二核酸切断酵素で切断し、被切断物を生成する、核酸検出方法。
  2. 　前記標的核酸がＲＮＡであり、
    　前記第一核酸の少なくとも前記第一フラップ部位、前記第二核酸、前記第四核酸がＤＮＡを含む、請求項１に記載の核酸検出方法。
  3. 　前記標的核酸および前記第四核酸がＤＮＡであり、
    　前記第一核酸および前記第二核酸がＲＮＡを含む、請求項１に記載の核酸検出方法。
  4. 　前記第三核酸と、第二フラップ部位を有する第四核酸と、第五核酸とが複合体形成することで、前記第二新入構造が現れ、
    　前記第五核酸がＤＮＡを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  5. 　前記第一侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性は、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性よりも小さく、前記第二侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性は前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性よりも小さい、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  6. 　前記第一侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性は、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性に比して９０％以下であり、前記第二侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性は前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して９０％以下である、請求項４に記載の核酸検出方法。
  7. 　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性が、前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して小さい、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  8. 　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第四核酸に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性が、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して小さい、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  9. 　前記第四核酸に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第四核酸に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性が、前記第一侵入構造に対する前記第一核酸切断酵素の切断活性および前記第二侵入構造に対する前記第二核酸切断酵素の切断活性に比して８０％以下である、請求項８に記載の核酸検出方法。
  10. 　前記第一核酸切断酵素の濃度が、前記第二核酸切断酵素の濃度に比して９倍以下である、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  11. 　前記第一核酸切断酵素の濃度が、０．２７ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  12. 　前記第二核酸切断酵素の濃度が、０．１２ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  13. 　侵入構造を形成する前記第一核酸および前記第四核酸の少なくとも一方は蛍光標識されており、蛍光強度の変化で、前記侵入構造の切断を検出できる標的核酸確認工程をさらに有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  14. 　電気泳動により反応前後の移動度を比較することで前記被切断物を検出する標的核酸確認工程をさらに有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  15. 　前記検出試薬混合工程による、前記第一核酸切断酵素と前記第二核酸切断酵素とによる前記被切断物の生成は、微小空間において行われる、請求項１３に記載の核酸検出方法。
  16. 　前記微小空間の高さが１０ｎｍ～１００μｍである、請求項１５に記載の核酸検出方法。
  17. 　前記微小空間が、１０万～１０００万個/ｃｍ２の密度で設けられる、請求項１５または１６に記載の核酸検出方法。
  18. 　前記標的核酸確認工程は、前記微小空間において生成された前記被切断物を検出することで、前記標的核酸の検出が行われる、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  19. 　前記第一核酸切断酵素が５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅであり、前記第二核酸切断酵素がＦＥＮ－１である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸検出方法。
  20. 　前記第一核酸切断酵素と、前記第二核酸切断酵素とを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の核酸検出方法を実施するための検出用試薬。
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