JP2024000309A - 蛍光を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】解析対象分子の存在下で、蛍光物質及び消光物質を有する蛍光プローブから発せられる蛍光強度がより高められる検出方法を提供する。【解決手段】蛍光物質と消光物質と基体本体とを有する基体から蛍光を検出するための方法を採用する。この方法は、基体における蛍光物質と消光物質とを離間させることにより、蛍光物質から蛍光を発光させる工程を含み、蛍光物質は、消光物質の空間的近傍にある場合に、蛍光物質からの蛍光発光は、消光物質により抑制されており、消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である、方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、蛍光を検出するための方法に関する。

微量な解析対象分子の検出方法として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）を応用した方法が知られている。

例えば、遺伝子診断において、標的核酸を正確かつ迅速に検出、定量する手法は数多く存在する。その中でも、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ （ＩＣＡ）は、５’－Ｎｕｃｌｅａｓｅ等の核酸切断酵素を用いるインベーダ反応、及びＦＲＥＴを適用した手法であり、操作性及び反応安定性が優れている（例えば、非特許文献１）。

ここで、図１Ａを参照しながらＩＣＡについて説明する。図１Ａは、ＩＣＡの一例を説明する模式図である。図１Ａの例では、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出する。まず、標的核酸１００に相補的なフラッププローブ１１０及び侵入プローブ１２０をハイブリダイズさせる。その結果、侵入プローブ１２０は、標的核酸１００の、フラッププローブ１１０がハイブリダイズする位置に隣接する部位にハイブリダイズする。そして、侵入プローブ１２０の３’末端の少なくとも１塩基は、フラッププローブ１１０と標的核酸１００がハイブリダイズしている領域１４１の５’末端の位置に侵入し、第１の三重鎖構造１３０が形成される。

続いて、第１の三重鎖構造１３０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第１の三重鎖構造１３０のフラップ部位１４０が切断され、核酸断片１４０が生成される。続いて、核酸断片１４０は、核酸断片１５０にハイブリダイズして第２の三重鎖構造１６０を形成する。

図１Ａの例では、核酸断片１５０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片１５０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている（核酸断片１５０を蛍光基質という場合がある）。蛍光物質Ｆと消光物質Ｑは空間的近傍に位置する。このため、蛍光物質Ｆが発する蛍光は、消光物質Ｑにより消光される。

続いて、第２の三重鎖構造１６０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第２の三重鎖構造１６０のフラップ部位１７０が切断され、核酸断片１７０が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出することができる。
本明細書において、フラッププローブは、アレルプローブという場合がある。
本明細書において、侵入プローブは、インベーダオリゴという場合がある。

非特許文献１に記載のＩＣＡでは、蛍光物質と消光物質とを有するＦＲＥＴカセットを用いる。反応系に標的核酸が存在しない場合、蛍光物質は消光物質の空間的近傍にある。これにより、蛍光物質からの蛍光発光は、前記消光物質により抑制されている。反応系に標的核酸が存在する場合、核酸切断酵素によりインベーダ反応が進行して、蛍光物質と消光物質とが離間する。これにより、蛍光物質から蛍光が発光する。

ＩＣＡにおいては、複数種類の標的核酸に対応させた、蛍光波長の異なる複数種類のプローブを用いることにより、複数種類の標的核酸を同時に検出することも可能である。例えば、蛍光が、青色、緑色、黄色、橙色、赤色の５色である場合、５種類の異なる標的核酸を一回の測定で同時に検出することが可能である。

また、微小ウェル等の微小空間でＩＣＡを行う場合、見かけ上、反応系における解析対象分子の濃度を濃縮することができる。これにより、微小空間において、検出シグナルが十分な強度になるまでの時間を短縮することができる。例えば、特許文献１には、１ｐｌ以下の容積の微小空間内で酵素反応を行うことで遺伝子検査が可能であることが記載されている。

特開２００４－３０９４０５号公報

Eis et al, An invasive cleavage assay for direct quantitation of specific RNAs, Nature Biotechnology, Vol. 19, 673-676 (2001).

しかしながら、例えば、多種類の蛍光プローブを用いる場合、蛍光分子の特性上、青色及び赤色の蛍光の強度は弱いため、蛍光の検出が困難である。
そこで本発明は、解析対象分子の存在下で、蛍光物質及び消光物質を有する蛍光プローブから発せられる蛍光強度がより高められる検出方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］蛍光物質と消光物質と基体本体とを有する基体から蛍光を検出するための方法であって、前記基体における前記蛍光物質と前記消光物質とを離間させることにより、前記蛍光物質から蛍光を発光させる工程を含み、前記蛍光物質は、前記消光物質の空間的近傍にある場合に、前記蛍光物質からの蛍光発光は、前記消光物質により抑制されており、前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である、方法。
［２］前記蛍光物質から蛍光発光させる工程は、標的物質の存在下で行われる。［１］に記載の方法。
［３］前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して５０～１００ｎｍ短い、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記基体本体は核酸である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長は、６００～７００ｎｍであり、前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、５５０～６４０ｎｍである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記蛍光物質から蛍光発光させる工程において、核酸切断酵素の作用により、前記基体における前記蛍光物質と前記消光物質とが離間される、［４］に記載の方法。
［７］前記蛍光物質から蛍光発光させる工程は、微小空間内で行われる、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記標的物質は、核酸である、［２］に記載の方法。
［９］更に、前記蛍光を蛍光顕微鏡で観察する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、解析対象分子の存在下で、蛍光物質及び消光物質を有する蛍光プローブから発せられる蛍光強度がより高められる検出方法を提供することができる。

Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）の一例を説明する模式図である。 流体デバイスへ試薬液を送液する方法を説明する模式断面図である。 第１開裂構造体を模式的に示した図である。 第２α開裂構造体を模式的に示した図である。 第２β開裂構造体を模式的に示した図である。 実験例１における、ＩＣＡの反応機構を模式的に示した図である。 実験例１における、ＦＲＥＴカセット４－１を用いた場合の蛍光を撮影した写真である。 実験例１における、ＦＲＥＴカセット４－２を用いた場合の蛍光を撮影した写真である。 実験例１における、ＦＲＥＴカセット４－３を用いた場合の蛍光を撮影した写真である。 実験例１における、ＦＲＥＴカセット４－１を用いた場合のシグナル強度のヒストグラムである。 実験例１における、ＦＲＥＴカセット４－２を用いた場合のシグナル強度のヒストグラムである。 実験例１における、ＦＲＥＴカセット４－３を用いた場合のシグナル強度のヒストグラムである。 実験例１における、Ｓ／Ｎ値を示すグラフである。 実験例１における、Ｓ－Ｎ値を示すグラフである。 実験例１において、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質を用いた場合の結果を示すグラフである。 実験例１において、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質を用いた場合の結果を示すグラフである。

［方法］
第１の態様にかかる方法は、蛍光物質と消光物質と基体本体とを有する基体から蛍光を検出するための方法である。第１の態様にかかる方法は、基体における蛍光物質と消光物質とを離間させることにより、蛍光物質から蛍光を発光させる工程を含む。

（基体）
基体は、基体本体、蛍光物質、及び消光物質を有する。蛍光物質及び消光物質は、それぞれ、基体本体に結合している。

蛍光物質と基体本体との結合は、本発明効果が奏される限り特に限定されないが、化学結合であってもよい。消光物質と基体本体との結合は、本発明効果が奏される限り特に限定されないが、化学結合であってもよい。

基体本体は、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然のものであってもよいし、合成されたものであってもよい。基体本体としては、例えば、ポリマー等が挙げられる。ポリマーとしては、特に限定されないが、核酸、核酸類縁体、ポリアミノ酸、タンパク質、オリゴアミノ酸等が挙げられる。

天然の核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられる。天然の核酸は、生体から回収されたものであってもよいし、生体と接触した水、有機物等から回収されたものであってもよい。天然の核酸の回収方法としては、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法が挙げられる。

合成された核酸としては、例えば、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等が挙げられる。
合成された核酸の合成方法は特に限定されず、β－シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法、公知の核酸増幅方法、逆転写反応等が挙げられる。核酸増幅方法としては、例えば、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。

（蛍光物質）
蛍光物質としては、例えば、ＡＴＴＯ６４３、ＡＴＴＯ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｕｒ６４７、Ｃｙ５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＡＴＴＯ６６３等の赤色蛍光物質が挙げられる。

蛍光物質の蛍光スペクトルのピーク波長は、６００～７００ｎｍであることが好ましく、６１０～６９０ｎｍであることがより好ましく、６２０～６８０ｎｍであることが更に好ましく、６３０～６７０ｎｍであることが特に好ましく、６４０～６６０ｎｍであることが最も好ましい。

（消光物質）
消光物質としては、例えば、ＢＨＱ－１（登録商標）、ＢＨＱ－２（登録商標）、ＢＨＱ－３（登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（ＴＱ１、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＴＱ２、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３（ＴＱ３、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４（ＴＱ４、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５（ＴＱ５、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ、登録商標）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ、登録商標）、ＱＳＹ３５（登録商標）、ＱＳＹ７（登録商標）、ＱＳＹ９（登録商標）、ＱＳＹ２１（登録商標）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（登録商標）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ（登録商標）等が挙げられ、ＢＨＱ－２、ＴＱ４、ＴＱ４ＷＳ、ＴＱ５、ＴＱ５ＷＳ、ＱＳＹ２１及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱからなる群より選択される一種以上が好ましく、ＢＨＱ－２がより好ましい。

消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、５５０～６４０ｎｍであることが好ましく、５６０～６３０ｎｍであることがより好ましく、５７０～６２０ｎｍであることが更に好ましく、５７０～６００ｎｍであることが特に好ましい。

消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である。
消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して５０～１００ｎｍ短いことが好ましく、５５～８０ｎｍ短いことがより好ましく、６０～７０ｎｍ短いことが更に好ましい。

基体において、蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある場合、蛍光物質からの蛍光発光は消光物質により抑制される。

ここで、「蛍光発光が抑制される」とは、次のような意味である。
消光物質が存在しない場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＡとする。
消光物質が蛍光物質の空間的近傍に存在する場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＢとする。
「蛍光発光が抑制される」とは、Ｂ／Ａの値が、４０％以下であることを意味する。

蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある状態における、蛍光物質と消光物質距離との距離は、蛍光物質からの蛍光発光が消光物質により抑制される限り特に限定されないが、１０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以下であることがより好ましく、２ｎｍ以下であることが更に好ましい。

基体における蛍光物質と消光物質とを離間させる方法としては、蛍光物質から蛍光を発光させられる限り特に限定されないが、例えば、蛍光物資と消光物質とを有する基体に対し、剪断、加熱、冷却、電磁波照射等の物理的作用を与えるものであってもよいし、化学物質に暴露する等の化学的作用を与えるものであってもよいし、酵素反応等の生物学的作用を与えるものであってもよい。

蛍光物質と消光物質とを離間された状態における、蛍光物質と消光物質距離との距離は、蛍光物質から蛍光が発光する限り限定されないが、５ｎｍ以上であることが好ましく、１０ｎｍ以上であることがより好ましく、２０ｎｍ以上であることが更に好ましい。

蛍光物質から蛍光発光させる工程は、標的物質の存在下で行われてもよい。

（標的物質）
標的物質としては、直接的又は間接的に、蛍光物質と消光物質とを離間させるものである限り特に限定されないが、核酸、酵素、抗体等のタンパク質等が挙げられ、核酸が好ましい。

標的物質が核酸である場合、蛍光物質から蛍光発光させる工程において、核酸切断酵素の作用により、基体における蛍光物質と消光物質とが離間されてもよい。

（微小空間）
第１の態様にかかる方法において、蛍光物質から蛍光を発光させる工程は、微小空間内で行われることが好ましい。具体的には、微小な複数のウェルを有するウェルアレイを有するデバイスを用いることが好ましい。デバイスとしては、例えば、次に挙げるようなものを用いることができるが、これに限定されない。

ウェルの形状、寸法、及び配置は特に限定されないが、本発明の方法において用いられる標的核酸を含む液体、及び、検出工程で使用する一定量の試薬液等を収容可能なウェルから成るウェルアレイを使用することが好ましい。ウェルは、無処理でそのまま使用してもよいし、目的に応じて、予めウェル内壁に抽出試薬、抗体等の検出試薬、特異的結合物質等を固定化したり、ウェル開口部を脂質二重膜で覆ったりする等の前処理を施してもよい。

デバイスは、流路を有していてもよく、流路を介して標的核酸が分散した液体を送液してもよい。流路の形状、構造、容量等は特に限定されないが、構造体が分散した液体を送液した際にウェルアレイの各ウェルに構造体が導入され、かつ封止液を挿入した際に各ウェルが個別に封止され微小液滴を形成することができるような流路を有するデバイスを使用することが好ましい。

図１Ｂは、デバイスの模式断面図である。図１Ｂに示すように、デバイス１００は、基材１０４と蓋材１０１とを備えている。

基材１０４は、光透過性樹脂から形成されていてよい。基材１０４は、実質的に透明であってもよい。

基材１０４は、複数のウェル１０５を有する。基材１０４のウェル１０５は、基材１０４の表面に開口している。ウェル１０５の形状、寸法、および配置は特に限定されない。
図１Ｂに示す例では、デバイス１００において、試薬液１０７（標的核酸が分散した液体）を収容可能な同形同大の複数のウェル１０５が基材１０４に形成されている。また、第１の態様にかかる検出方法において粒子が使用される場合には、粒子を１つ以上収容可能な形状及び寸法を有し、粒子を含んだ一定量の試薬液１０７を収容可能な同形同大のウェル１０５が基材１０４に形成されていてもよい。

デバイス１００では、ウェル１０５の直径は例えば３μｍ程度であってもよく、ウェル１０５の深さは例えば４．５μｍ程度であってもよい。また、ウェル１０５は、三角格子状又は正方格子状を形成するように整列して基材１０４に形成されていてもよい。

基材１０４の、複数のウェル１０５を含んだ領域は、分析対象となる試薬液１０７が充填される領域となっている。この領域の内側では、基材１０４と蓋材１０１との間に流路１０６が設けられている。

蓋材１０１は、基材１０４に対して溶着または接着されていてもよい。例えば、蓋材１０１は、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。

基材１０４は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び液滴を形成する際の封止液に対し耐性のあるものを用いることが好ましい。また、シグナルを蛍光観察する場合には、自家蛍光の少ない樹脂を選ぶことが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマーや、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂などが挙げられる。なお、基材１０４の例として示されたこれらの材質はあくまでも例であり、材質はこれらには限られない。

基材１０４に対しては、板厚方向の一方の面に複数のウェル１０５が形成されていてもよい。樹脂を用いた形成方法としては、射出成形のほか、熱インプリントや、光インプリントなどによってもよい。また、フッ素樹脂を用いる場合には、例えば、基材１０４の上にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）の層を有し、ＣＹＴＯＰ（登録商標）に形成された微小な孔がウェル１０５となっていてもよい。

蓋材１０１は、組立時に基材１０４に向けられる面に凸部を有するように成形される。例えば熱可塑性樹脂の流動体を、成形型を用いて成形することで、凸部を有する板状に成形してもよい。また、蓋材１０１には送液ポート１０２および廃液ポート１０３が形成されてもよい。

蓋材１０１および基材１０４が上記のように成形されたら、基材１０４においてウェル１０５が開口する側の面に蓋材の凸部が接するように、蓋材１０１と基材１０４とが重ねられる。さらに、蓋材１０１と基材１０４とが上記のように重ねられた状態で、レーザー溶着等により溶着される。

デバイスが有するウェルの個数は、１０万個～６００万個であることが好ましい。また、ウェルの総容量は０．１～１０μＬであることが好ましい。

（ＩＣＡ）
第１の態様にかかる方法は、例えば、インベーダ法を応用したＩＣＡ（Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ、インベーシブ・クリベージ・アッセイ）に適用することが可能である（例えば、非特許文献１を参照）。

第１の態様に係る方法における標的物質は、ＩＣＡにおける標的核酸であってもよい。
ＩＣＡにおいては、標的核酸にハイブリダイズし得る２種類のオリゴヌクレオチドを用いて、特異的な重なりあった構造を有する開裂構造体を形成させる。次いで、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により、得られた開裂構造体を切断し、この切断断片を検出することにより、標的核酸を検出する。

より具体的には、ＩＣＡは、次のような方法である。まず、標的核酸上の隣接する異なる部位に、２種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれアニーリングさせたときに、一方のオリゴヌクレオチドの５’側を、標的核酸にアニーリングしている他方のオリゴヌクレオチドにオーバーラップさせるようにアニーリングさせ、特異的な重なりあった構造を有する開裂構造体を構成させる。

この開裂構造体は、一方のオリゴヌクレオチドの下方に、他方のオリゴヌクレオチドの一部が侵入していることから、インベーダ反応と呼ばれており、この侵入するオリゴヌクレオチドをインベーダオリゴ、オーバーラップしているオリゴヌクレオチドをアレルプローブという。
開裂構造体中のこの侵入構造を、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が認識し、アレルプローブの５’側のオーバーラップしている部位を切断する。この切断されるアレルオリプローブを、５’ヌクレアーゼ活性による切断反応温度に近い融点を持つように設計することにより、切断後に残された標的核酸とアニーリングしていた部位も標的核酸から解離する。そして、切断前のアレルプローブが新たにアニーリングすることにより、再び開裂構造体が構成され、切断反応が繰り返され、切断された断片（フラップ断片）が増幅されていく。このため、このフラップ断片を測定することにより、標的核酸を検出することができる。

フラップ断片の測定方法として、様々な方法が開示されている。例えば、二次反応として、標的核酸とは異なる検出用核酸に対して、フラップ断片をインベーダオリゴ、他のオリゴヌクレオチドをアレルプローブとして、それぞれアニーリングさせることにより開裂構造体を構成し、一次反応と同様にしてアレルプローブを切断し、第２次フラップ断片を増幅し、この第２次フラップ断片を検出することもできる（例えば、非特許文献１を参照。）。

二次反応において、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動)反応を利用して測定することも可能である（例えば、非特許文献１参照。）。具体的には、ＦＲＥＴカセット（蛍光物質と消光物質を有するプローブ）に、該フラップ断片がインベーダオリゴとして働くことにより開裂構造体を構成し、ＦＲＥＴカセットを切断して蛍光物質と消光物質を分離させ、生じた蛍光シグナルを測定することにより、高感度にフラップ断片を測定することができる。これらのフラップ断片の測定反応は、フラップ断片の産生反応と同じ反応溶液中で同時に進行させることができる。

上述のデバイスの各ウェルにおいてＩＣＡを行う場合、デバイスが有する各ウェルにおいて、標的物質を１個以下とすることが好ましい。

本態様に係る方法は、更に、前記蛍光を蛍光顕微鏡で観察する工程を含んでもよい。

以上説明した第１の態様にかかる方法によれば、解析対象分子の存在下で、蛍光物質及び消光物質を有する蛍光プローブから発せられる蛍光強度がより高められる。

第１の態様にかかる方法の一実施形態としては、例えば、以下の実施形態が挙げられる。本実施形態にかかる方法は、第１の態様において上述した基体を、図１Ａに例示されるＩＣＡ反応に適用したものである。

本実施形態にかかる方法において、第１の態様にかかる方法における「前記基体における前記蛍光物質と前記消光物質とを離間させることにより、前記蛍光物質から蛍光を発光させる工程」は、蛍光物質及び消光物質で標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’側に相補的な塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを接触させる工程を含むものである。
本実施形態にかかる方法において、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、核酸切断酵素により切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである。

本実施形態にかかる方法において、前記蛍光物質は、前記消光物質の空間的近傍にある場合に、前記蛍光物質からの蛍光発光は、前記消光物質により抑制されている。
本実施形態にかかる方法において、前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である。

本実施形態にかかる方法は、蛍光を検出する工程を有していてもよい。蛍光は、蛍光顕微鏡により検出してもよい。

５’側に自己ハイブリダイゼーションによるヘアピン構造を有し、蛍光物質及び消光物質で標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、図１Ａにおける核酸断片１５０に対応する。前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’側に相補的な塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴヌクレオチドは、図１Ａにおけるフラップ部位１４０に由来する核酸断片１４０に対応する。５’末端部分に形成される三重鎖構造は、図１Ａにおける第２の三重鎖構造１６０に対応する。

実施例において後述するように、蛍光基質の蛍光物質が、塩基以外の部分に結合していることにより、三重鎖構造を効率よく形成することができ、ＩＣＡの反応性を向上させることができる。蛍光物質が塩基以外の部分に結合しているとは、蛍光物質が、蛍光基質を形成するオリゴヌクレオチドの、糖残基、リン酸基、塩基のうちの、糖残基又はリン酸基に結合していることを意味する。なかでも、蛍光物質が、蛍光基質のリン酸基に結合していることが好ましい。

本明細書において、ＩＣＡの反応性が向上するとは、ＩＣＡの結果検出される蛍光シグナルが、より短時間に所定の値に到達することであってもよい。あるいは、ＩＣＡの結果検出される蛍光シグナル強度が、より高い値に到達することであってもよい。あるいは、ＩＣＡの結果検出されるバックグラウンドの蛍光シグナルがより低い値に維持されることであってもよい。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、２０～１５０塩基程度の長さを有していることが好ましい。また、ヘアピン構造を形成する塩基対の数は５～５０個程度であることが好ましい。

蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光物質が結合している核酸と消光物質が結合している核酸との間の塩基数としては、１１塩基以上３０塩基以下が好ましく、４塩基以上１０塩基以下がより好ましく、１塩基以上３塩基以下が更に好ましい。

核酸切断酵素としては、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が好ましく、５’ヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性を欠く修飾ＤＮＡポリメラーゼがより好ましく、フラップエンドヌクレアーゼが更に好ましい。
フラップエンドヌクレアーゼとしては、例えば、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１０１２５６１．１、Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ５’ ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＧＥＮ１）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２３４８１．３）、ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３７５３３．１等が挙げられる。

蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド（これを蛍光基質という場合がある）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合していることが好ましい。

実施例において後述するように、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質と比較して、ＩＣＡの反応性が向上しており、三重鎖構造を効率よく形成することができる。

下記式（１）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。下記式（１）に示すように、蛍光物質は、炭素数１～１００程度の炭化水素基からなるリンカーを介して、５’末端に付加されたリン酸基に結合していてもよい。
リンカーの炭素数としては、１～３０個程度が好ましく、１～１０個程度がより好ましい。
リンカーの炭素数が前記下限値以上であることにより、蛍光物質と、核酸切断酵素による切断箇所との距離を適度に保つことが可能である。その結果、核酸切断酵素による切断反応は蛍光物質により阻害されにくくなり、核酸切断酵素による反応効率は向上する。
リンカーの炭素数が前記上限値以下であることにより、蛍光物質と消光物質との距離がより短くなる。その結果、消光物質による消光の効果が向上する。

下記式（２）は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。

あるいは、第１の態様にかかる方法の一実施形態としては、例えば、以下の第１実施形態が挙げられる。第１実施形態は、標的核酸を検出するための方法である。第１実施形態にかかる方法は、第１の態様において上述した基体を、上述のＩＣＡ反応に適用したものである。

（第１実施形態）
第１実施形態の方法は、以下の工程（ａ）～（ｅ）を有する。以下、第１実施形態について、適宜、図面を用いつつ、詳述する。

以下の工程において、第１オリゴヌクレオチドは上述のアレルプローブに対応し、第２オリゴヌクレオチドは上述のインベーダオリゴに対応する。検出用核酸は上述のＦＲＥＴカセットに対応する。

工程（ａ）：標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとで、第１開裂構造体を形成させる工程

工程（ｂ）：５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、第１開裂構造体を構成している第１オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第１オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第３オリゴヌクレオチドを生成させる工程

工程（ｃ）：第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドと検出用核酸とで、第２α開裂構造体を形成させる工程

工程（ｄ）：５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、第２α開裂構造体を構成している第４オリゴヌクレオチドを開裂させ、第４オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第５オリゴヌクレオチドを生成させる工程

工程（ｅ）：第５オリゴヌクレオチドを検出する工程

以下、工程（ａ）～（ｅ）について、詳細に説明する。

＜工程（ａ）＞
図２に例示するように、工程（ａ）では、標的核酸１と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとで、第１開裂構造体を形成させる。

標的核酸１は、第１領域（以下、Ｔ１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｔ２領域、ということがある。）、及び、第３領域（以下、Ｔ３領域、ということがある。）を含む。Ｔ１領域はＴ２領域に隣接してその下流に位置し、Ｔ２領域はＴ３領域に隣接してその下流に位置する。

第１オリゴヌクレオチドは、３’側部分にＴ３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、第２オリゴヌクレオチドは、３’側部分にＴ２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分にＴ１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものである。

つまり、第１オリゴヌクレオチドは、標的核酸のＴ３領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、第２オリゴヌクレオチドは、標的核酸のＴ１領域およびＴ２領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。このため、反応溶液中に、標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを添加し混合することにより、第２オリゴヌクレオチドがＴ１領域およびＴ２領域にアニーリングし、かつ第１オリゴヌクレオチドがＴ３領域にアニーリングした時に、第１オリゴヌクレオチドのうち、Ｔ３領域にアニーリングした領域の５’側部分が、Ｔ２領域にアニーリングした第２オリゴヌクレオチドの３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された第１開裂構造体を得ることができる。

図２は、第１開裂構造体を模式的に示した図である。図２中、「１」は標的核酸を、「Ｔ１」～「Ｔ３」はＴ１領域～Ｔ３領域を、「ｎ１」は第１オリゴヌクレオチドを、「ｎ２」は第２オリゴヌクレオチドを、それぞれ示している。このように、第１開裂構造体は、第２オリゴヌクレオチドが第１オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第１オリゴヌクレオチドの５’側がその上にオーバーラップした分岐構造をとる。

＜工程（ｂ）＞
５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ａ）において生成された第１開裂構造体を構成している第１オリゴヌクレオチドを開裂させ、第１オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第３オリゴヌクレオチドを生成させる。

ここで用いられる５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤は、第１開裂構造体中の分岐構造、すなわち、第１オリゴヌクレオチドの、Ｔ３領域とアニーリングしている３’側部分と、第２オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分の境界部分（図２中、「▼」で示した部分）を認識して切断する。この切断により生成された第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域にアニーリングした領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第３オリゴヌクレオチドとする。

工程（ｂ）において、切断反応が生じた後、第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域とアニーリングしている３’側部分が、標的核酸から解離すると、未切断の第１オリゴヌクレオチドが再びＴ３領域とアニーリングし、第１開裂構造体を形成する。これにより、熱変性等の操作を要することなく、インベーダ反応が繰り返され、微量な標的核酸も高感度に検出することができる。

第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレオチド配列、用いる開裂剤の種類、インベーダ反応における反応温度、反応溶液の種類等を考慮して、常法により設計し合成することができる。ここで、第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、反応温度よりも十分に高い場合には、第２オリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションが強くなりすぎる恐れがある。一方、第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、反応温度よりも低すぎる場合には、標的核酸とのアニーリング効率が悪くなりすぎる。そこで、第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値は、反応温度程度であることが好ましい。

また、インベーダ反応が効率よく繰り返されるためには、切断反応後速やかに第１オリゴヌクレオチドの３’側部分が、Ｔ３領域から解離することが必要である。このため、第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域とハイブリダイズする領域のＴｍ値が、インベーダ反応の反応温度よりも十分に低いことが好ましい。

また、第２オリゴヌクレオチド中、Ｔ２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列の３’端が、第２オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目のヌクレオチドであることが好ましい。これにより、第２オリゴヌクレオチドの３’末端が、第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域とアニーリングする部位の５’端のヌクレオチドとオーバーラップするため、効率よく、第１開裂構造体を得ることができる。この場合に、第２オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、標的核酸の対応するヌクレオチドと相補的なヌクレオチドであってもよく、非相補的なヌクレオチドであってもよいが、非相補的なヌクレオチドであることがより好ましい。第１開裂構造体中の分岐構造部分がより不安定となり、インベーダ反応の効率がより改善されるためである。

標的核酸が、遺伝子多型等のヌクレオチド配列中の特定のヌクレオチド（標的塩基）を含むものである場合には、この標的塩基は、標的核酸中、Ｔ２領域又はＴ３領域にあることが好ましく、第１開裂構造体中の分岐構造付近にあることが好ましく、分岐構造付近のＴ２領域にあることがより好ましい。分岐構造付近に標的塩基がくるように、第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドを設計することにより、標的塩基の検出精度を向上させることができる。

工程（ｂ）において用いられる５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤は、前記分岐構造を認識し得るものであって５’ヌクレアーゼ活性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、構造特異的酵素であることが好ましい。また、５’ヌクレアーゼ活性のみを有する酵素であってもよく、他の酵素活性を有する酵素であってもよい。また、このような構造特異的酵素は、いかなる生物種由来の酵素であってもよく、合成酵素であってもよい。
このような開裂剤として、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が好ましく、５’ヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性を欠く修飾ＤＮＡポリメラーゼがより好ましく、フラップエンドヌクレアーゼが更に好ましい。
フラップエンドヌクレアーゼとしては、例えば、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１０１２５６１．１、Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ５’ ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＧＥＮ１）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２３４８１．３）、ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３７５３３．１等が挙げられる。

５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤として、５’ヌクレアーゼ活性を有する耐熱性酵素であることが好ましい。耐熱性酵素を用いることにより、標的核酸を予めＰＣＲにより増幅させたものを用いる場合に、同一の反応系を用いてＰＣＲとインベーダ反応を行うことができる。

また、反応溶液に添加する第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドの量は、特に限定されるものではないが、第２オリゴヌクレオチドよりも第１オリゴヌクレオチドを多く添加することが好ましい。第１オリゴヌクレオチドの添加量が多い場合に、より効率よくインベーダ反応が繰り返されることが期待できるためである。例えば、第１オリゴヌクレオチドの添加量を、第２オリゴヌクレオチドの添加量の２倍以上にすることが好ましく、２～１００倍程度にすることがより好ましく、５～５０倍程度にすることがさらに好ましく、１０倍程度にすることが特に好ましい。

なお、反応溶液の組成は、開裂構造体を形成し得るものであって、かつ用いる開裂剤の５’ヌクレアーゼ活性を阻害しない組成であれば、特に限定されるものではなく、標的核酸の種類、第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドの種類、使用する開裂剤の種類等を考慮して、適宜決定することができる。また、反応温度も、使用する開裂剤の種類、第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。

＜工程（ｃ）＞
図３に例示されるように、工程（ｃ）では、工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドと検出用核酸２とで、第２α開裂構造体を形成させる。

検出用核酸は第１領域（以下、Ｄ１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｄ２領域、ということがある。）および第３領域（以下、Ｄ３領域、ということがある。）を含み、Ｄ１領域はＤ２領域に隣接してその下流に位置し、Ｄ２領域はＤ３領域に隣接してその下流に位置する。また、第４オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、第３オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に検出用核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものである。

つまり、第４オリゴヌクレオチドは、検出用核酸のＤ３領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、第３オリゴヌクレオチドは、検出用核酸のＤ１領域およびＤ２領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。このため、反応溶液中に、検出用核酸と第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとを添加し混合することにより、第３オリゴヌクレオチドがＤ１領域およびＤ２領域にアニーリングし、かつ第４オリゴヌクレオチドがＤ３領域にアニーリングした時に、第４オリゴヌクレオチドのうち、Ｄ３領域とアニーリングした領域の５’側部分が、Ｄ２領域にアニーリングした第３オリゴヌクレオチドの３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された第２α開裂構造体を得ることができる。

図３は、第２α開裂構造体を模式的に示した図である。図３中、「２」は検出用核酸を、「Ｄ１」～「Ｄ３」はＤ１領域～Ｄ３領域を、「ｎ３」は第３オリゴヌクレオチドを、「ｎ４」は第４オリゴヌクレオチドを、それぞれ示している。このように、第３オリゴヌクレオチドが第４オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第４オリゴヌクレオチドの５’側がその上にオーバーラップした分岐構造をとっており、この第２α開裂構造体においては、第４オリゴヌクレオチドがアレルプローブ、第３オリゴヌクレオチドがインベーダオリゴとして働く。

＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）では、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｃ）において生成された第２α開裂構造体を構成している第４オリゴヌクレオチドを開裂させ、第４オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第５オリゴヌクレオチドを生成させる。

具体的には、工程（ｂ）と同様にして、図３中、「▼」で示されている、第４オリゴヌクレオチドの、Ｄ３領域とアニーリングしている３’側部分と、第３オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分の境界部分が、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により切断される。この切断により生成された第４オリゴヌクレオチドのＤ３領域とアニーリングした領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第５オリゴヌクレオチドとする。

第４オリゴヌクレオチドは、第１の態様において上述した基体であってもよい。
第４オリゴヌクレオチドとしては、例えば、５’側部分（第５オリゴヌクレオチドとなる部分）に蛍光物質として機能する蛍光分子を、Ｄ３領域とアニーリングする部位に消光物質として機能する蛍光分子を、それぞれ標識したものを用いてもよい。

すなわち、第４オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光物質は、消光物質の空間的近傍にあり、前記蛍光物質からの蛍光発光は、前記消光物質により抑制されている。消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である。

第４オリゴヌクレオチドが蛍光物質及び消光物質で標識されている場合、蛍光物質が結合している核酸と消光物質が結合している核酸との間の塩基数としては、１１塩基以上３０塩基以下が好ましく、４塩基以上１０塩基以下がより好ましく、１塩基以上３塩基以下が更に好ましい。

第４オリゴヌクレオチドの蛍光物質が、塩基以外の部分に結合していることにより、三重鎖構造を効率よく形成することができ、ＩＣＡの反応性を向上させることができる。蛍光物質が塩基以外の部分に結合しているとは、蛍光物質が、蛍光基質を形成するオリゴヌクレオチドの、糖残基、リン酸基、塩基のうちの、糖残基又はリン酸基に結合していることを意味する。なかでも、蛍光物質が、蛍光基質のリン酸基に結合していることが好ましい。

第４オリゴヌクレオチド（これを蛍光基質という場合がある）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合していることが好ましい。

実施例において後述するように、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質と比較して、ＩＣＡの反応性が向上しており、三重鎖構造を効率よく形成することができる。

上記式（１）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。上記式（１）に示すように、蛍光物質は、炭素数１～１００程度の炭化水素基からなるリンカーを介して、５’末端に付加されたリン酸基に結合していてもよい。
リンカーの炭素数としては、１～３０個程度が好ましく、１～１０個程度がより好ましい。
リンカーの炭素数が前記下限値以上であることにより、蛍光物質と、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤による切断箇所との距離を適度に保つことが可能である。その結果、開裂剤による切断反応は蛍光物質により阻害されにくくなり、開裂剤による反応効率は向上する。
リンカーの炭素数が前記上限値以下であることにより、蛍光物質と消光物質との距離がより短くなる。その結果、消光物質による消光の効果が向上する。

工程（ｄ）における切断反応により、第４オリゴヌクレオチドにおける蛍光物質と消光物質とが離間し、蛍光物質から蛍光が発光する。

＜工程（ｅ）＞
工程（ｅ）では、工程（ｄ）において生成した第５オリゴヌクレオチドの蛍光物質から発光した蛍光を検出する。蛍光は、蛍光顕微鏡で観察してもよい。

あるいは、第１の態様にかかる方法の一実施形態としては、例えば、以下の第２実施形態が挙げられる。第２実施形態は、標的核酸を検出するための方法である。第２実施形態にかかる方法は、第１の態様において上述した基体を、上述のＩＣＡ反応に適用したものである。

（第２実施形態）
第２実施形態は、上述の工程（ａ）～（ｂ）の後に、工程（ｃ）～（ｅ）に替えて、工程（ｆ）～（ｈ）を含むものである。

以下の工程において、第１オリゴヌクレオチドは上述のアレルプローブに対応し、第２オリゴヌクレオチドは上述のインベーダオリゴに対応する。第６オリゴヌクレオチドは上述のＦＲＥＴカセットに対応する。

＜工程（ｆ）＞
図４に例示されるように、工程（ｆ）では、工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドとで、第２β開裂構造体を形成させる。

第６オリゴヌクレオチドは、第１領域（以下、Ｐ６－１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｐ６－２領域、ということがある。）および第３領域（以下、Ｐ６－３領域、ということがある。）を含み、Ｐ６－１領域はＰ６－２領域に隣接してその下流に位置し、Ｐ６－２領域はＰ６－３領域に隣接してその下流に位置するものであり、Ｐ６－１領域は第３オリゴヌクレオチドに完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、Ｐ６－２領域は分子内ヘアピン構造を形成し得るヌクレオチド配列を有するものである。

図４は、第２β開裂構造体を模式的に示した図である。図４中、「ｎ３」は第３オリゴヌクレオチドを、「ｎ６」は第６オリゴヌクレオチドを、「Ｐ６－１」～「Ｐ６－３」はＰ６－１領域～Ｐ６－３領域を、それぞれ示している。このように、第３オリゴヌクレオチドが第６オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第６オリゴヌクレオチドのＰ６－３領域がその上にオーバーラップした分岐構造をとっており、この第２β開裂構造体においては、第６オリゴヌクレオチドがアレルプローブ、第３オリゴヌクレオチドがインベーダオリゴとして働く。

＜工程（ｇ）＞
工程（ｇ）では、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｆ）において生成された第２β開裂構造体を構成している第６オリゴヌクレオチドを開裂させ、第６オリゴヌクレオチド由来の５’側部分（すなわち、Ｐ６－３領域）からなる第７オリゴヌクレオチドを生成させる。

具体的には、工程（ｂ）と同様にして、図４中、「▼」で示されている、第６オリゴヌクレオチドの、Ｐ６－２領域と、第３オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分のＰ６－３領域との境界部分が、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により切断される。この切断により生成された第６オリゴヌクレオチドのＰ６－２領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第７オリゴヌクレオチドとする。

第６オリゴヌクレオチドは、第１の態様において上述した基体であってもよい。
第６オリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｐ６－３領域中（第７オリゴヌクレオチドとなる部分）に蛍光物質として機能する蛍光分子を、Ｐ６－２領域中に消光物質（Ｑ）として機能する蛍光分子を、それぞれ標識したものを用いてもよい。

すなわち、第６オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光物質は、消光物質の空間的近傍にあり、前記蛍光物質からの蛍光発光は、前記消光物質により抑制されている。消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である。

本実施形態の第６オリゴヌクレオチドは、２０～１５０塩基程度の長さを有していることが好ましい。また、ヘアピン構造を形成する塩基対の数は５～５０個程度であることが好ましい。

第６オリゴヌクレオチドが蛍光物質及び消光物質で標識されている場合、蛍光物質が結合している核酸と消光物質が結合している核酸との間の塩基数としては、１１塩基以上３０塩基以下が好ましく、４塩基以上１０塩基以下がより好ましく、１塩基以上３塩基以下が更に好ましい。

第６オリゴヌクレオチドの蛍光物質が、塩基以外の部分に結合していることにより、三重鎖構造を効率よく形成することができ、ＩＣＡの反応性を向上させることができる。蛍光物質が塩基以外の部分に結合しているとは、蛍光物質が、蛍光基質を形成するオリゴヌクレオチドの、糖残基、リン酸基、塩基のうちの、糖残基又はリン酸基に結合していることを意味する。なかでも、蛍光物質が、蛍光基質のリン酸基に結合していることが好ましい。

第６オリゴヌクレオチド（これを蛍光基質という場合がある）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合していることが好ましい。

実施例において後述するように、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質と比較して、ＩＣＡの反応性が向上しており、三重鎖構造を効率よく形成することができる。

上記式（１）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。上記式（１）に示すように、蛍光物質は、炭素数１～１００程度の炭化水素基からなるリンカーを介して、５’末端に付加されたリン酸基に結合していてもよい。
リンカーの炭素数としては、１～３０個程度が好ましく、１～１０個程度がより好ましい。
リンカーの炭素数が前記下限値以上であることにより、蛍光物質と、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤による切断箇所との距離を適度に保つことが可能である。その結果、開裂剤による切断反応は蛍光物質により阻害されにくくなり、開裂剤による反応効率は向上する。
リンカーの炭素数が前記上限値以下であることにより、蛍光物質と消光物質との距離がより短くなる。その結果、消光物質による消光の効果が向上する。

工程（ｇ）における切断反応により、第７オリゴヌクレオチドにおける蛍光物質と消光物質（Ｑ）とが離間し、蛍光物質から蛍光が発光する。

＜工程（ｈ）＞
工程（ｈ）では、工程（ｇ）において生成した第７オリゴヌクレオチドの蛍光物質から発光した蛍光を検出する。蛍光は、蛍光顕微鏡で観察してもよい。

上述の第１開裂構造体、第２α開裂構造体及び第２β開裂構造体を形成する反応溶液の温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等について特に制限はなく、当業者が適宜設定することができる。
反応溶液のｐＨとしては、６．５～１０．０が好ましく、７．５～９．０がより好ましい。緩衝作用のある塩の濃度としては、５～２５０ｍＭが好ましく、１０～１００ｍＭがより好ましい。緩衝作用のある塩としては特に限定されないが、例えば、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩等が挙げられる。
反応溶液は、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましく、塩化ナトリウム及び／又は塩化マグネシウムを含むことがより好ましい。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
複数種の標的核酸、アレルプローブ、インベーダオリゴ、ＦＲＥＴカセットを含む反応液を調製し、ＩＣＡを行い、赤色蛍光を検出した。

以下の表１に示す標的核酸、アレルプローブ、インベーダオリゴ、ＦＲＥＴカセットを準備した。

標的核酸１と標的核酸２とは、下線部の一塩基以外は同じ塩基配列からなる標的核酸である。標的核酸３と標的核酸４とは、下線部の一塩基以外は同じ塩基配列からなる標的核酸である。
標的核酸１は、標的核酸１とハイブリダイズし得るアレルプローブ１、インベーダオリゴ１、及びＦＲＥＴカセット１により検出される。標的核酸１及びアレルプローブ１における小文字の塩基は、互いにハイブリダイズし得る塩基対である。
標的核酸２は、標的核酸２とハイブリダイズし得るアレルプローブ２、インベーダオリゴ１、及びＦＲＥＴカセット３により検出される。標的核酸２及びアレルプローブ２における小文字の塩基は、互いにハイブリダイズし得る塩基対である。
標的核酸３は、標的核酸３とハイブリダイズし得るアレルプローブ３、インベーダオリゴ２、及びＦＲＥＴカセット２により検出される。標的核酸３及びアレルプローブ３における小文字の塩基は、互いにハイブリダイズし得る塩基対である。
標的核酸４は、標的核酸４とハイブリダイズし得るアレルプローブ４、インベーダオリゴ２、並びに、ＦＲＥＴカセット４－１、４－２又は４－３により検出される。標的核酸４及びアレルプローブ４における小文字の塩基は、互いにハイブリダイズし得る塩基対である。

各ＦＲＥＴカセットにおける、蛍光物質及び消光物質は以下の通りである。
ＦＲＥＴカセット１：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＢＨＱ－１
ＦＲＥＴカセット２：ＡＴＴＯ５４２、ＢＨＱ－１
ＦＲＥＴカセット３：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、ＢＨＱ－２
ＦＲＥＴカセット４－１：ＡＴＴＯ６４３、ＢＨＱ－２
ＦＲＥＴカセット４－２：ＡＴＴＯ６４３、ＢＨＱ－１
ＦＲＥＴカセット４－３：ＡＴＴＯ６４３、ＢＨＱ－３

以下の表２に示すように、試薬類を混合して、反応液１～３を調製した。

反応液１～３は、それぞれ、ＦＲＥＴカセット１、ＦＲＥＴカセット２、及びＦＲＥＴカセット３、並びに、ＦＲＥＴカセット４－１、ＦＲＥＴカセット４－２、及びＦＲＥＴカセット４－３から選択される一種を含む。
反応液１はＦＲＥＴカセット４－１を含み、反応液２はＦＲＥＴカセット４－２を含み、反応液３はＦＲＥＴカセット４－３を含む。

（測定デバイス）
多数の微小のウェルを設けた基材をＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）で作製し、ＣＯＰ製の蓋材を貼合することで測定デバイスを作製した。１ｃｍ^２あたりのウェルの総体積は０．９３μＬであった。計測に用いられた総ウェル数は、１００００００個であった。

（反応混合溶液の送液）
デバイスに、反応液１を８μｌ送液し、各ウェルに導入した。続いて、封止液としてＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を２００μｌ送液し、各ウェルを封止した。
これにより、１ウェル当たり１分子以下の標的核酸がウェル内に封止される。すなわち、各ウェルは、標的核酸を含むか、又は、標的核酸を含まないか、のいずれかである。

（核酸検出反応）
反応混合溶液の送液後の上記デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で２５分間、反応させた。これにより、アレルプローブ及びインベーダオリゴによる標的核酸の認識、ＦＥＮ－１によるアレルプローブの切断、放出されたアレルプローブ断片のＦＲＥＴ カセットへの結合、ＦＥＮ－１によるＦＲＥＴ カセットの切断が進行し、蛍光シグナルが発せられた。この反応過程の模式図を図５に示す。

（蛍光強度測定）
反応液１を収容したデバイス１を、６６℃で２５分間加熱した後、蛍光顕微鏡（ＢＺ－７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）で４倍の対物レンズ、蛍光フィルター（励起：６０７ｍｎ／７０ｎｍ、ダイクロイックミラー：６６５ｎｍ、蛍光：７００ｎｍ／７５ｎｍ）を用いて、露光時間を２秒間に設定し、デバイスにおける各ウェルの蛍光シグナル画像を撮影した。結果を図６に示す。
同様に、反応液２、反応液３を用いた以外は同様にして、取得した蛍光シグナル画像をそれぞれ、図７、図８に示す。

各反応液の蛍光強度の測定結果を図９～１１に示す。図９は、反応液１の蛍光強度の測定結果であり、図１０は、反応液２の蛍光強度の測定結果であり、図１１は、反応液３の蛍光強度の測定結果である。

図９中、蛍光強度が３０００～１２０００のものはノイズ（Ｎ）であり、蛍光強度が１５０００～４５０００のものは蛍光シグナル（Ｓ）であると判定した。
図１０中、蛍光強度が１５００～９０００のものはノイズ（Ｎ）であり、蛍光強度が１２０００～４２０００のものは蛍光シグナル（Ｓ）であると判定した。
図１１中、蛍光強度が１０００～３０００のものはノイズ（Ｎ）であり、蛍光強度が３００００～１２０００のものは蛍光シグナル（Ｓ）であると判定した。

上述の判定基準に従って、ノイズ（Ｎ）及び蛍光シグナル（Ｓ）について、平均値、標準偏差を算出した。また、Ｓ／Ｎ値（すなわち、Ｓの平均値をＮの平均値で除したもの）及びＳ－Ｎ値（すなわち、Ｓの平均値とＮの平均値との差）を算出した。結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ値のグラフを図１２に示し、Ｓ－Ｎ値を図１３に示す。

ＦＲＥＴカセット４－１、４－２、４－３のうち、４－１を用いた場合に、Ｓ／Ｎ値及びＳ－Ｎ値はいずれも最も高かった。

ＡＴＴＯ６４３に対しては、消光物質としてＢＨＱ－３が推奨されている。しかしながら、上述したように、予想外にも、ＢＨＱ－２は、ＢＨＱ－３よりも、Ｓ／Ｎ値及びＳ－Ｎ値が高かった。したがって、ノイズとシグナルとをより正確に判別する観点から、蛍光物質としてＡＴＴＯ６４３を用いる場合には、消光物質としてＢＨＱ－２を用いる方がより好ましいことが示された。

［実験例２］
（蛍光基質の検討）
蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質と、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。

下記表４及び表５に示す核酸断片を用いてＩＣＡを行った。表４中の標的核酸（配列番号１７）は検出対象となる核酸である。本実験例のＩＣＡでは標的核酸中の小文字で示したｇ（グアニン）の存在を検出する。フラッププローブ（配列番号１８）及び侵入プローブ（配列番号１９）は、それぞれ、標的核酸（配列番号１７）に相補的な塩基配列を有している。

標的核酸（配列番号１７）に、フラッププローブ（配列番号１８）及び侵入プローブ（配列番号１９）がそれぞれハイブリダイズすると、三重鎖構造が形成される。ここで、フラッププローブ（配列番号１８）の小文字部分「5’-cgcgccgaggc-3’」（配列番号２０）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成する。

フラップエンドヌクレアーゼは、上記三重鎖構造を認識して、フラッププローブ（配列番号１８）を切断し、核酸断片（配列番号２０）が切り出される。

蛍光基質は、上述のＦＲＥＴカセットに対応する。上記表５に示す蛍光基質１（配列番号２１）は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質であり、具体的には下記式（５）のような構造を有する。蛍光基質１におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。

上記表５に示す蛍光基質２（配列番号２２）は、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質であり、具体的には下記式（６）のような構造を有する。蛍光基質２におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。

蛍光基質１又は蛍光基質２に、切り出された核酸断片（配列番号２０）がハイブリダイズした場合、上記表５において、蛍光基質１又は蛍光基質２の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表６に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。

図１４Ａは、蛍光基質１を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。また、図１４Ｂは、蛍光基質２を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図１４Ａ及び図１４Ｂ中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。

その結果、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質２を用いた方が、ＩＣＡの反応性が高いことが明らかとなった。

本発明によれば、解析対象分子の存在下で、蛍光物質及び消光物質を有する蛍光プローブから発せられる蛍光強度がより高められる検出方法を提供することができる。この検出方法は、ＩＣＡを用いたデジタル計測に好適に用いられる。

１００…標的核酸、１０１…塩基、１１０…フラッププローブ、１２０…侵入プローブ、１３０…第１の三重鎖構造、１４０，１７０…フラップ部位（核酸断片）、１４１…領域、１５０…核酸断片、１５１…ミスマッチ部位、１６０…第２の三重鎖構造、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (9)

1. 蛍光物質と消光物質と基体本体とを有する基体から蛍光を検出するための方法であって、
   前記基体における前記蛍光物質と前記消光物質とを離間させることにより、前記蛍光物質から蛍光を発光させる工程を含み、
   前記蛍光物質は、前記消光物質の空間的近傍にある場合に、前記蛍光物質からの蛍光発光は、前記消光物質により抑制されており、
   前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して短波長側である、方法。
2. 前記蛍光物質から蛍光発光させる工程は、標的物質の存在下で行われる。請求項１に記載の方法。
3. 前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長に対して５０～１００ｎｍ短い、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記基体本体は核酸である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長は、６００～７００ｎｍであり、
   前記消光物質の吸収スペクトルのピーク波長は、５５０～６４０ｎｍである、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記蛍光物質から蛍光発光させる工程において、核酸切断酵素の作用により、前記基体における前記蛍光物質と前記消光物質とが離間される、請求項４に記載の方法。
7. 前記蛍光物質から蛍光発光させる工程は、微小空間内で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
8. 前記標的物質は、核酸である、請求項２に記載の方法。
9. 更に、前記蛍光を蛍光顕微鏡で観察する、請求項１又は２に記載の方法。

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