JP2024000311A

JP2024000311A - 蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JP2024000311A
Application number: JP2022099033A
Authority: JP
Inventors: 雅之荻野; Masayuki Ogino; 美咲岩坂; Misaki Iwasaka; 洋一牧野; Yoichi Makino; 雄太鈴木; Yuta Suzuki; 陽介堀内; Yosuke Horiuchi
Original assignee: Toppan Holdings Inc
Current assignee: Toppan Holdings Inc
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2024-01-05

Abstract

【課題】ＩｎｖａｓｉｖｅＣｌｅａｖａｇｅＡｓｓａｙ（ＩＣＡ）におけるバックグラウンドの上昇を抑制する技術を提供する。【解決手段】蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む、一本鎖オリゴヌクレオチド。【選択図】なし

Description

本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。

微量な解析対象分子の検出方法として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法が知られている。

例えば、遺伝子診断において、標的核酸を正確かつ迅速に検出、定量する手法が数多く存在する。その中でも、ＩｎｖａｓｉｖｅＣｌｅａｖａｇｅＡｓｓａｙ（ＩＣＡ）は、操作性及び反応安定性が優れている（例えば、非特許文献１を参照。）。

ここで、図１を参照しながらＩＣＡについて説明する。図１は、ＩＣＡの一例を説明する模式図である。図１の例では、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出する。まず、標的核酸１００に相補的なフラッププローブ１１０及び侵入プローブ１２０をハイブリダイズさせる。その結果、侵入プローブ１２０は、標的核酸１００の、フラッププローブ１１０がハイブリダイズする位置に隣接する部位にハイブリダイズする。そして、侵入プローブ１２０の３’末端の少なくとも１塩基は、フラッププローブ１１０と標的核酸１００がハイブリダイズしている領域１４１の５’末端の位置に侵入し、第１の三重鎖構造１３０が形成される。

続いて、第１の三重鎖構造１３０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第１の三重鎖構造１３０のフラップ部位１４０が切断され、核酸断片１４０が生成される。続いて、核酸断片１４０は、核酸断片１５０にハイブリダイズして第２の三重鎖構造１６０を形成する。

図１の例では、核酸断片１５０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片１５０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。蛍光物質Ｆと消光物質Ｑは空間的近傍に位置する。このため、蛍光物質Ｆが発する蛍光は、消光物質Ｑにより消光される。

続いて、第２の三重鎖構造１６０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第２の三重鎖構造１６０のフラップ部位１７０が切断され、核酸断片１７０が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出することができる。

特開２００４－３０９４０５号公報

Eis P. S. et al, An invasive cleavage assay for direct quantitation of specific RNAs, Nature Biotechnology, 19 (7), 673-676, 2001.

発明者らは、図１に例示するようなＩＣＡにおいては、遺伝子多型又は遺伝子変異特異的なシグナルに加えて、バックグラウンドのシグナルが上昇する場合があることを見出した。バックグラウンドのシグナルの上昇は擬陽性判定につながり、遺伝子診断における誤判定をもたらす危険因子といえる。そこで、本発明は、ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む、一本鎖オリゴヌクレオチド。
［２］前記蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されている、［１］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［３］５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、［１］又は［２］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［４］前記蛍光物質よりも３’側に前記消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、［１］～［３］のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［５］ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制する方法であって、ＩＣＡの反応液に、蛍光基質を添加する工程を含み、前記蛍光基質は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含むものである、方法。

本発明によれば、ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制する技術を提供することができる。

図１は、ＩｎｖａｓｉｖｅＣｌｅａｖａｇｅＡｓｓａｙ（ＩＣＡ）の一例を説明する模式図である。図２（ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示すグラフである。

［一本鎖オリゴヌクレオチド］
一実施形態において、本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む、一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＩＣＡ用の蛍光基質であり、フラップエンドヌクレアーゼの基質であるということもできる。フラップエンドヌクレアーゼとしては、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１０１２５６１．１、Ｈｏｌｌｉｄａｙｊｕｎｃｔｉｏｎ５’ ｆｌａｐｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＧＥＮ１）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２３４８１．３）、ｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３７５３３．１等が挙げられる。

ここで、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に形成される三重鎖構造は、図１に示す第２の三重鎖構造１６０に対応する。すなわち、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップ部位１４０に由来する核酸断片１４０に対応する。

実施例において後述するように、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含むことにより、ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制することができる。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、相補的でない塩基対の数は、１～３であってもよく、１又は２であってもよく、１であってもよい。

本明細書において、ＩＣＡにおけるバックグラウンドとは、例えば、標的核酸の非存在下でＩＣＡを行った場合に検出される蛍光シグナルを意味する。ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制するとは、ＩＣＡの結果検出されるバックグラウンドの蛍光シグナルがより低い値に維持されることを意味する。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、２０～１５０塩基程度の長さを有していることが好ましい。また、ヘアピン構造を形成する塩基対の数は５～５０個程度であることが好ましい。

（蛍光物質）
蛍光物質としては、特に限定されず、例えば、フルオレセイン、ＡＴＴＯ４２５、Ａｌｅｘａ４８８、ＡＴＴＯ５４２、ＹａｋｉｍａＹ、ＲｅｄｍｏｎｄＲ、ＡＴＴＯ６４３、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ５６８、ＦＡＭ、ＡＴＴＯ６３３、Ｃｙ５、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ６４７、ＡＴＴＯ６６３等が挙げられる。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、蛍光物質が５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、消光物質が、相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されていることが好ましい。

実施例において後述するように、このような蛍光基質を用いてＩＣＡを行うことにより、バックグラウンドを顕著に抑制することができる。

（消光物質）
消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものであれば特に限定されず、例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）（登録商標）－１、ＢＨＱ（登録商標）－２、ＢＨＱ（登録商標）－３、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ１（ＴＱ１）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ２（ＴＱ２）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ３（ＴＱ３）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ４（ＴＱ４）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ５（ＴＱ５）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ）、ＴｉｄｅＱｕｅｎｃｈｅｒ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ）、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ、ＩｏｗａＢｌａｃｋＲＱ等が挙げられる。消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものを選択する。

蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある場合、蛍光物質からの蛍光は消光物質により消光される。「蛍光を消光する」とは、次のような意味である。消光物質が存在しない場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＡとする。また、消光物質が蛍光物質の空間的近傍に存在する場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＢとする。ここで、「蛍光を消光する」とは、上記Ｂ／Ａの値が、４０％以下であることを意味する。

蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある状態における、蛍光物質と消光物質距離との距離は、蛍光物質からの蛍光発光が消光物質により抑制される限り特に限定されず、１０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以下であることがより好ましく、２ｎｍ以下であることが更に好ましい。

（オリゴヌクレオチド）
本実施形態の蛍光基質を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよいし、合成された核酸であってもよい。

天然の核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられる。天然の核酸は、生体から回収されたものであってもよいし、生体と接触した水、有機物等から回収されたものであってもよい。天然の核酸の回収方法としては、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法が挙げられる。

合成された核酸としては、例えば、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＢｒｉｄｇｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＢＮＡ）、ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＬＮＡ）等が挙げられる。

核酸の合成方法は特に限定されず、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ固相合成等の公知の化学的合成法、公知の核酸増幅方法、逆転写反応等が挙げられる。核酸増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。

本実施形態の蛍光基質において、５’末端のヌクレオチド残基の近傍に蛍光物質が配置されており、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であることが好ましい。プリン塩基には蛍光物質の蛍光を消光する傾向がある。このため、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であれば、蛍光物質の蛍光の消光が抑制され、好ましい。

［ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制する方法］
一実施形態において、本発明は、ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制する方法であって、ＩＣＡの反応液に、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む蛍光基質を添加する工程を含む方法を提供する。

ＩＣＡの蛍光基質は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである。

本実施形態の方法において、ＩＣＡ、蛍光物質、消光物質、オリゴヌクレオチド等については上述したものと同様である。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、蛍光物質が５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、消光物質が、相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されていることが好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、５’末端のヌクレオチド残基の近傍に蛍光物質が配置されており、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であることが好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、蛍光物質よりも３’側に消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離するものであることが好ましい。

本実施形態の方法において、ＩＣＡは微小空間内で行うことが好ましい。具体的には、微小な複数のウェルを有するウェルアレイを有するデバイスを用いてＩＣＡを行うことが好ましい。

ウェルは、無処理でそのまま使用してもよいし、目的に応じて、予めウェル内壁に抽出試薬、抗体等の検出試薬等を固定化する、ウェル開口部を脂質二重膜で覆う等の前処理を施してもよい。

デバイスは、流路を有していてもよく、流路を介してＩＣＡの反応液をウェルアレイのウェルに供給してもよい。

ウェルの直径は例えば３μｍ程度であってよく、ウェルの深さは例えば４．５μｍ程度であってよい。ウェルは、基材上に、三角格子状又は正方格子状を形成するように整列してウェルアレイを形成していてもよい。

基材の材質としては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。

ウェルアレイにおけるウェルの個数は、１デバイスあたり１０万個～６００万個程度であることが好ましい。また、１ウェルあたりの容量は１ｆＬ～６ｐＬであることが好ましい。

［実験例１］
（蛍光基質の検討）
ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含まない蛍光基質と、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。

下記表１及び表２に示す核酸断片を用いてＩＣＡを行った。表１中の標的核酸（配列番号１）は検出対象となる核酸である。本実験例のＩＣＡでは標的核酸中の小文字で示したｇ（グアニン）の存在を検出する。フラッププローブ（配列番号２）及び侵入プローブ（配列番号３）は、それぞれ、標的核酸（配列番号１）に相補的な塩基配列を有している。

標的核酸（配列番号１）に、フラッププローブ（配列番号２）及び侵入プローブ（配列番号３）がそれぞれハイブリダイズすると、三重鎖構造が形成される。ここで、フラッププローブ（配列番号２）の小文字部分「5’-cgcgccgaggc-3’」（配列番号４）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成する。

フラップエンドヌクレアーゼは、上記三重鎖構造を認識して、フラッププローブ（配列番号２）を切断し、核酸断片（配列番号４）が切り出される。

上記表２に示す蛍光基質１（配列番号５）は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含まない蛍光基質であり、具体的には下記式（１）のような構造を有する。蛍光基質１におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。下記式（１）に示すように、蛍光基質１は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含まない。

上記表２に示す蛍光基質２（配列番号６）は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む蛍光基質であり、具体的には下記式（２）のような構造を有する。蛍光基質２におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。下記式（２）に示すように、蛍光基質２は、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む。下記式（２）において、四角で囲んだＴ（チミン）残基及びＧ（グアニン）残基は互いに相補的でない。

蛍光基質１又は蛍光基質２に、切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合、上記表２において、蛍光基質１又は蛍光基質２の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表３に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。

図２（ａ）は、蛍光基質１を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。また、図２（ｂ）は、蛍光基質２を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２（ａ）及び（ｂ）中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。

その結果、ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む蛍光基質２を用いた場合、蛍光基質１を用いた場合と比較して、ＩＣＡ法におけるバックグラウンドの上昇が顕著に抑制されることが明らかとなった。

本発明によれば、ＩＣＡにおけるバックグラウンドの上昇を抑制することができる。

１００…標的核酸、１０１…塩基、１１０…フラッププローブ、１２０…侵入プローブ、１３０…第１の三重鎖構造、１４０，１７０…フラップ部位（核酸断片）、１４１…領域、１５０…核酸断片、１５１…ミスマッチ部位、１６０…第２の三重鎖構造、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims

蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、
自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含む、一本鎖オリゴヌクレオチド。
前記蛍光物質が、５’末端のヌクレオチド残基に標識されており、
前記消光物質が、前記相補的でない塩基対を構成するヌクレオチド残基のうち、より５’側に位置するヌクレオチド残基に標識されている、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、請求項１又は２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
前記蛍光物質よりも３’側に前記消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、請求項１又は２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
ＩｎｖａｓｉｖｅＣｌｅａｖａｇｅＡｓｓａｙ（ＩＣＡ）におけるバックグラウンドの上昇を抑制する方法であって、
ＩＣＡの反応液に、蛍光基質を添加する工程を含み、
前記蛍光基質は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記ヘアピン構造の内部に相補的でない塩基対を含むものである、方法。