JP2024066659A - フラッププローブ及びその使用 - Google Patents
フラッププローブ及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024066659A JP2024066659A JP2022176209A JP2022176209A JP2024066659A JP 2024066659 A JP2024066659 A JP 2024066659A JP 2022176209 A JP2022176209 A JP 2022176209A JP 2022176209 A JP2022176209 A JP 2022176209A JP 2024066659 A JP2024066659 A JP 2024066659A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- flap
- probe
- nucleic acid
- cleavage
- endonuclease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 161
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 129
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 103
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 103
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 95
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 95
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 34
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 10
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 12
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 11
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical group C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N ATTO 425-2 Chemical compound CC1CC(C)(C)N(CCCC(O)=O)C2=C1C=C1C=C(C(=O)OCC)C(=O)OC1=C2 WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100024058 Flap endonuclease GEN homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091064358 Holliday junction Proteins 0.000 description 1
- 102000039011 Holliday junction Human genes 0.000 description 1
- 101000833646 Homo sapiens Flap endonuclease GEN homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000006846 excision repair Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
【課題】フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置が制御されたＩｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）用のフラッププローブを提供する。【解決手段】ＩＣＡ用のフラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、フラッププローブ及びその使用に関する。具体的には、本発明は、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）においてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法、ＩＣＡに用いられるフラッププローブ、ＩＣＡ用キット、及びＩＣＡによる標的核酸の検出方法に関する。
微量な解析対象分子の検出方法として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法が知られている。
例えば、遺伝子診断において、標的核酸を正確かつ迅速に検出、定量する手法が数多く存在する。その中でも、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）は、操作性及び反応安定性が優れている（例えば、非特許文献１を参照。）。
ここで、図１を参照しながらＩＣＡについて説明する。図１は、ＩＣＡの一例を説明する模式図である。図１の例では、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出する。まず、標的核酸１００に相補的なフラッププローブ１１０及び侵入プローブ１２０をハイブリダイズさせる。その結果、侵入プローブ１２０は、標的核酸１００の、フラッププローブ１１０がハイブリダイズする位置に隣接する部位にハイブリダイズする。そして、侵入プローブ１２０の３’末端の少なくとも１塩基は、フラッププローブ１１０と標的核酸１００がハイブリダイズしている領域１４１の５’末端の位置に侵入し、第１の三重鎖構造１３０が形成される。
続いて、第１の三重鎖構造１３０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第１の三重鎖構造１３０のフラップ部位１４０が切断され、核酸断片１４０が生成される。続いて、核酸断片１４０は、蛍光プローブ１５０にハイブリダイズして第２の三重鎖構造１６０を形成する。
図１の例では、蛍光プローブ１５０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、蛍光プローブ１５０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。蛍光物質Ｆと消光物質Ｑは空間的近傍に位置する。このため、蛍光物質Ｆが発する蛍光は、消光物質Ｑにより消光される。
続いて、第２の三重鎖構造１６０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第２の三重鎖構造１６０のフラップ部位１７０が切断され、核酸断片１７０が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出することができる。
Eis P. S. et al., "An invasive cleavage assay for direct quantitation of specific RNAs.", Nature Biotechnology, Vol. 19、Issue 7, pp. 673-676, 2001.
しかしながら、発明者らは、ＩＣＡにおいて、図１に示す三重鎖構造１３０で切断される核酸断片１４０は、主となる切断位置で切断された生成物に加えて、主となる切断位置の前後１塩基で切断された副生成物も存在することを見出した。これら副生成物の存在によって、適切な第２の三重鎖構造１６０が形成できず、ＩＣＡの反応効率が低下してしまう。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置が制御されたＩＣＡ用のフラッププローブ、並びに、前記フラッププローブを用いたＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法、ＩＣＡ用キット、及びＩＣＡによる標的核酸の検出方法を提供する。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法であって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、方法。
（２） 前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造が、ホスホチオエート結合である、（１）に記載の方法。
（３） Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙに用いられるフラッププローブであって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、フラッププローブ。
（４） 前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造が、ホスホチオエート結合である、（３）に記載のフラッププローブ。
（５） （３）又は（４）に記載のフラッププローブと、
侵入プローブと、
蛍光プローブと、
フラップエンドヌクレアーゼと、
を備え、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、且つ、前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、
前記蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された核酸断片に相補的な配列を有し、該核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質及び前記消光物質が遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ用キット。
（６） （３）又は（４）に記載のフラッププローブを用いることを含む、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙによる標的核酸の検出方法。
（１） Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法であって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、方法。
（２） 前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造が、ホスホチオエート結合である、（１）に記載の方法。
（３） Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙに用いられるフラッププローブであって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、フラッププローブ。
（４） 前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造が、ホスホチオエート結合である、（３）に記載のフラッププローブ。
（５） （３）又は（４）に記載のフラッププローブと、
侵入プローブと、
蛍光プローブと、
フラップエンドヌクレアーゼと、
を備え、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、且つ、前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、
前記蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された核酸断片に相補的な配列を有し、該核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質及び前記消光物質が遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ用キット。
（６） （３）又は（４）に記載のフラッププローブを用いることを含む、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙによる標的核酸の検出方法。
上記態様のフラッププローブによれば、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置が制御されたＩＣＡ用のフラッププローブを提供することができる。上記態様の方法によれば、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御することができる。上記態様のＩＣＡ用キットは、前記フラッププローブを備えており、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御することができる。上記態様のＩＣＡによる標的核酸の検出方法は、前記フラッププローブを用いており、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御することができる。
≪ＩＣＡ用のフラッププローブ≫
本実施形態のＩＣＡ用のフラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む。
本実施形態のＩＣＡ用のフラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む。
本実施形態のＩＣＡ用のフラッププローブは、上記構成を有することで、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御して、主となる切断位置で切断された生成物のみを優先的に生成することができ、主となる切断位置の前後一塩基で切断された副生成物の発生を抑制することができる。これにより、図１に示す第２の三重鎖構造１６０の形成に適した核酸断片１４０が生成されるため、ＩＣＡの反応性を向上させて、反応を高速化させることができる。
すなわち、一実施形態において、本発明は、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法であって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、方法を提供する。
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、方法を提供する。
上記実施形態の方法は、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法であって、
標的核酸、フラッププローブ、及び、侵入プローブを準備することと、
前記標的核酸、前記フラッププローブ、及び、前記侵入プローブを接触させることと、
前記接触による反応物にフラップエンドヌクレアーゼを接触させることと、を含み、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含み、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、
前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、三重鎖構造が形成され、フラップエンドヌクレアーゼは前記三重鎖構造を認識して、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置においてフラッププローブを切断し、核酸断片が切り出される方法であるということもできる。
標的核酸、フラッププローブ、及び、侵入プローブを準備することと、
前記標的核酸、前記フラッププローブ、及び、前記侵入プローブを接触させることと、
前記接触による反応物にフラップエンドヌクレアーゼを接触させることと、を含み、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含み、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、
前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、三重鎖構造が形成され、フラップエンドヌクレアーゼは前記三重鎖構造を認識して、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置においてフラッププローブを切断し、核酸断片が切り出される方法であるということもできる。
また、上記実施形態の方法は、ＩＣＡの反応性を向上させる方法ということもできる。
なお、本明細書において、ＩＣＡの反応性が向上するとは、ＩＣＡの結果検出される蛍光シグナルが、より短時間に所定の値に到達することであってもよい。或いは、ＩＣＡの結果検出される蛍光シグナル強度が、より高い値に到達することであってもよい。或いは、ＩＣＡの結果検出されるバックグラウンドの蛍光シグナルがより低い値に維持されることであってもよい。
本実施形態のＩＣＡ用のフラッププローブは、フラップエンドヌクレアーゼによって切断されることから、フラップエンドヌクレアーゼの基質であるということもできる。
フラップエンドヌクレアーゼとしては、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１０１２５６１．１、Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ５’ ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＧＥＮ１）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２３４８１．３）、ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３７５３３．１等が挙げられる。
本実施形態のフラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造は、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置又は１塩基後の位置の核酸が含めばよく、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置の核酸及び１塩基後の位置の核酸の両方が含んでもよい。後述する実施例に示すように、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置の核酸がフラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含むことで、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含まないフラッププローブよりもＳ／Ｎ比が最大となる時間が早くなる。
また、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造は、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に加えて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の２、３、４、又は５塩基前後の位置の核酸が更に含んでもよい。
フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造としては、ホスホチオエート結合であることが好ましい。フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置の核酸において、ホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換されていることで、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性をフラッププローブに付与することができる。
なお、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置の核酸のホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換されているとは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置の核酸と、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の核酸との間のホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換されていることを意味する。また、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基後の位置の核酸のホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換されているとは、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基後の位置の核酸と、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の２塩基後の核酸との間のホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換されていることを意味する。
また、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置の核酸をＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）、又はＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）に置換することで、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性をフラッププローブに付与してもよい。
本実施形態のフラッププローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、１５塩基以上３０塩基以下程度の長さを有していることが好ましい。また、標的核酸に相補的な配列は、８塩基以上２０塩基以下程度の長さを有していることが好ましい。
本実施形態のフラッププローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されるフラップ部位は、図１に示す核酸断片１４０に対応する。核酸断片１４０は、蛍光プローブ１５０にハイブリダイズして、第２の三重鎖構造１６０を形成することから、本実施形態のフラッププローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、蛍光プローブ１５０の３’側に相補的な配列を有することが好ましい。蛍光プローブ１５０の３’側に相補的な配列は、８塩基以上１５塩基以下程度の長さを有していることが好ましい。
＜オリゴヌクレオチド＞
本実施形態のフラッププローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよく、合成された核酸であってもよい。
本実施形態のフラッププローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよく、合成された核酸であってもよい。
天然の核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられる。天然の核酸は、生体から回収されたものであってもよいし、生体と接触した水、有機物等から回収されたものであってもよい。天然の核酸の回収方法としては、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法が挙げられる。
合成された核酸としては、例えば、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。
オリゴヌクレオチドの合成方法は特に限定されず、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ固相合成等の公知の化学的合成法等が挙げられる。
本実施形態のフラッププローブは、ホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換された核酸等、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む核酸と、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含まない核酸を用いて、上記合成方法により合成することができる。
ホスホジエステル結合がホスホチオエート結合に置換された核酸は、例えば、参考文献１（Lyer RP et al., “3H-1,2-Benzodithiole-3-one 1,1-Dioxide as an Improved Sulfurizing Reagent in the Solid-Phase Synthesis of Oligodeoxyribonucloside Phoshorothioates.”, J. Am. Chem. Soc. Vol. 112, pp. 1253-1254, 1990.）等に記載の方法を用いて、合成することができる。
具体的には、以下の反応式（Ａ）に示すように、ジヌクレオチド（１）に３Ｈ－１，２－ｂｅｎｚｏｄｉｔｈｉｏｌｅ－３－ｏｎｅ １，１－ｄｉｏｘｉｄｅ（２）を反応させることで、合成することができる。反応式（Ａ）中、Ｂａｓｅは塩基を示し、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。
≪ＩＣＡ用キット≫
本実施形態のＩＣＡ用キットは、上述したフラッププローブと、
侵入プローブと、
蛍光プローブと、
フラップエンドヌクレアーゼと、
を備える。
本実施形態のＩＣＡ用キットは、上述したフラッププローブと、
侵入プローブと、
蛍光プローブと、
フラップエンドヌクレアーゼと、
を備える。
本実施形態のＩＣＡ用キットにおいて、フラッププローブ及びフラップエンドヌクレアーゼは、上記「フラッププローブ」に記載のものを用いることができる。
本実施形態のＩＣＡ用キットは、上述したフラッププローブを備えることで、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御して、主となる切断位置で切断された生成物のみを優先的に生成することができ、主となる切断位置の前後一塩基で切断された副生成物の発生を抑制することができる。その結果、図１に示す第２の三重鎖構造１６０の形成に適した核酸断片１４０が生成されるため、ＩＣＡの反応性を向上させて、反応を高速化させることができる。
＜侵入プローブ＞
侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列のみからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列のみからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、侵入プローブの標的核酸に相補的な配列は、異なる配列である。図１に示すようにフラッププローブ１１０と侵入プローブ１２０は標的核酸１００の隣接した位置にハイブリダイズする。
侵入プローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、１５塩基以上３０塩基以下程度の長さを有していることが好ましい。また、標的核酸に相補的な配列は、１５塩基以上３０塩基以下程度の長さを有していることが好ましい。
＜蛍光プローブ＞
蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。
蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。
蛍光プローブは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された核酸断片に相補的な配列を有し、該核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質及び前記消光物質が遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである。
ここで、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成される三重鎖構造は、図１に示す第２の三重鎖構造１６０に対応する。すなわち、３’側にハイブリダイズする、フラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された核酸断片は、フラッププローブ１１０に由来するフラップ部位１４０に対応する。
蛍光プローブは、２０塩基以上１５０塩基以下程度の長さを有していることが好ましい。また、ヘアピン構造を形成する塩基対の数は５個以上５０個以下程度であることが好ましい。
（蛍光物質）
蛍光物質としては、特に限定されず、例えば、フルオレセイン（分子量３３２．３）、ＡＴＴＯ４２５（分子量４０１．４５）、Ａｌｅｘａ４８８（分子量５３４．４７）、ＡＴＴＯ５４２（分子量９１４）、Ｙａｋｉｍａ Ｙ（分子量７１８．３３）、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒ（分子量４４５．３）、ＡＴＴＯ６４３（分子量８３６）、Ａｌｅｘａ６４７（分子量８６０）、Ａｌｅｘａ６８０（分子量１０５０）、Ａｌｅｘａ５６８（分子量６９４．７）、ＦＡＭ（分子量３３２．３）、ＡＴＴＯ６３３（分子量６５２．２）、Ｃｙ５（分子量４８３．７）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（分子量１２０５．６）、ＡＴＴＯ６６５（分子量７２３）、Ａｌｅｘａ５９４（分子量７２２．８）、Ｃｙ３（分子量４５７．６）、ＲＯＸ（分子量５３４．６）等が挙げられる。蛍光物質の分子量は３５０以上１１００以下であることが好ましく、４４５以上１１００以下であることがより好ましく、４４５以上９１４以下であることが更に好ましい。蛍光物質の分子量が上記の範囲であると、より高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が得られる傾向にある。
蛍光物質としては、特に限定されず、例えば、フルオレセイン（分子量３３２．３）、ＡＴＴＯ４２５（分子量４０１．４５）、Ａｌｅｘａ４８８（分子量５３４．４７）、ＡＴＴＯ５４２（分子量９１４）、Ｙａｋｉｍａ Ｙ（分子量７１８．３３）、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒ（分子量４４５．３）、ＡＴＴＯ６４３（分子量８３６）、Ａｌｅｘａ６４７（分子量８６０）、Ａｌｅｘａ６８０（分子量１０５０）、Ａｌｅｘａ５６８（分子量６９４．７）、ＦＡＭ（分子量３３２．３）、ＡＴＴＯ６３３（分子量６５２．２）、Ｃｙ５（分子量４８３．７）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（分子量１２０５．６）、ＡＴＴＯ６６５（分子量７２３）、Ａｌｅｘａ５９４（分子量７２２．８）、Ｃｙ３（分子量４５７．６）、ＲＯＸ（分子量５３４．６）等が挙げられる。蛍光物質の分子量は３５０以上１１００以下であることが好ましく、４４５以上１１００以下であることがより好ましく、４４５以上９１４以下であることが更に好ましい。蛍光物質の分子量が上記の範囲であると、より高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が得られる傾向にある。
（消光物質）
消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものであれば特に限定されず、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）（登録商標）－１、ＢＨＱ（登録商標）－２、ＢＨＱ（登録商標）－３、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（ＴＱ１）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＴＱ２）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３（ＴＱ３）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４（ＴＱ４）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５（ＴＱ５）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ）、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ等が挙げられる。消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものを選択する。
消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものであれば特に限定されず、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）（登録商標）－１、ＢＨＱ（登録商標）－２、ＢＨＱ（登録商標）－３、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（ＴＱ１）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＴＱ２）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３（ＴＱ３）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４（ＴＱ４）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５（ＴＱ５）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ）、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ等が挙げられる。消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものを選択する。
蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある場合、蛍光物質からの蛍光は消光物質により消光される。「蛍光を消光する」とは、次のような意味である。消光物質が存在しない場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＡとする。また、消光物質が蛍光物質の空間的近傍に存在する場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＢとする。ここで、「蛍光を消光する」とは、上記Ｂ／Ａの値が、４０％以下であることを意味する。
蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある状態における、蛍光物質と消光物質距離との距離は、蛍光物質からの蛍光発光が消光物質により抑制される限り特に限定されず、１０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以下であることがより好ましく、２ｎｍ以下であることが更に好ましい。
侵入プローブ及び蛍光プローブを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよいし、合成された核酸であってもよい。核酸の種類としては、上記「フラッププローブ」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
≪ＩＣＡによる標的核酸の検出方法≫
本実施形態のＩＣＡによる標的核酸の検出方法は、上述したフラッププローブを用いることを含む。
本実施形態のＩＣＡによる標的核酸の検出方法は、上述したフラッププローブを用いることを含む。
本実施形態のＩＣＡによる標的核酸の検出方法は、上述したフラッププローブを用いることで、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御して、主となる切断位置で切断された生成物のみを優先的に生成することができ、主となる切断位置の前後一塩基で切断された副生成物の発生を抑制することができる。その結果、図１に示す第２の三重鎖構造１６０の形成に適した核酸断片１４０が生成されるため、ＩＣＡの反応性を向上させて、反応を高速化させることができる。
本実施形態のＩＣＡによる標的核酸の検出方法では、上記フラッププローブに加えて、侵入プローブ、蛍光プローブ、及びフラップエンドヌクレアーゼを用いることが好ましい。すなわち、一実施形態において、本発明は、上述したＩＣＡ用キットを用いることを含む、ＩＣＡによる標的核酸の検出方法を提供する。
本実施形態の方法は、ＩＣＡによる標的核酸の検出方法であって、
フラッププローブ、侵入プローブ、及び蛍光プローブを準備することと、
標的核酸と、フラッププローブと、侵入プローブと、を接触させることと、
前記標的核酸と、前記フラッププローブと、前記侵入プローブとの接触による反応物にフラップエンドヌクレアーゼを接触させて、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断された第１の核酸断片を生成させることと、
前記第１の核酸断片と、前記蛍光プローブと、を接触させることと、
前記第１の核酸断片と、前記蛍光プローブとの接触による反応物にフラップエンドヌクレアーゼを接触させて、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断された第２の核酸断片を生成させることと、を含み、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含み、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、
前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、三重鎖構造が形成され、フラップエンドヌクレアーゼは前記三重鎖構造を認識して、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置においてフラッププローブを切断し、第１の核酸断片が切り出され、
前記蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された第１の核酸断片に相補的な配列を有し、該第１の核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質及び前記消光物質が遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである方法であるということもできる。
フラッププローブ、侵入プローブ、及び蛍光プローブを準備することと、
標的核酸と、フラッププローブと、侵入プローブと、を接触させることと、
前記標的核酸と、前記フラッププローブと、前記侵入プローブとの接触による反応物にフラップエンドヌクレアーゼを接触させて、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断された第１の核酸断片を生成させることと、
前記第１の核酸断片と、前記蛍光プローブと、を接触させることと、
前記第１の核酸断片と、前記蛍光プローブとの接触による反応物にフラップエンドヌクレアーゼを接触させて、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断された第２の核酸断片を生成させることと、を含み、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含み、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、
前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、三重鎖構造が形成され、フラップエンドヌクレアーゼは前記三重鎖構造を認識して、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置においてフラッププローブを切断し、第１の核酸断片が切り出され、
前記蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された第１の核酸断片に相補的な配列を有し、該第１の核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質及び前記消光物質が遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである方法であるということもできる。
本実施形態の方法において、ＩＣＡは微小空間内で行うことが好ましい。具体的には、微小な複数のウェルを有するウェルアレイを有するデバイスを用いてＩＣＡを行うことが好ましい。
ウェルは、無処理でそのまま使用してもよく、目的に応じて、予めウェル内壁に抽出試薬、抗体等の検出試薬等を固定化する、ウェル開口部を脂質二重膜で覆う等の前処理を施してもよい。
デバイスは、流路を有していてもよく、流路を介してＩＣＡの反応溶液をウェルアレイのウェルに供給してもよい。
ウェルの直径は例えば３μｍ程度であってよく、ウェルの深さは例えば４．５μｍ程度であってよい。ウェルは、基材上に、三角格子状又は正方格子状を形成するように整列してウェルアレイを形成していてもよい。
基材の材質としては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。
ウェルアレイにおけるウェルの個数は、１デバイスあたり１０万個～６００万個程度であることが好ましい。また、１ウェルあたりの容量は１ｆＬ～６ｐＬであることが好ましい。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（フラッププローブの検討）
フラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置周辺の塩基のホスホジエステル結合をホスホチオエート結合に置換してフラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を付与し、該フラッププローブを用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。
（フラッププローブの検討）
フラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置周辺の塩基のホスホジエステル結合をホスホチオエート結合に置換してフラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を付与し、該フラッププローブを用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。
下記表１に示す核酸断片を用いてＩＣＡを行なった。表１中の標的核酸（配列番号１）は検出対象となる核酸である。本実験例のＩＣＡでは標的核酸中の小文字で示したｇ（グアニン）の存在を検出した。フラッププローブ（配列番号２～６）及び侵入プローブ（配列番号７）は、それぞれ、標的核酸（配列番号１）に相補的な塩基配列を有している。
標的核酸（配列番号１）に、フラッププローブ（配列番号２～６）及び侵入プローブ（配列番号８）がそれぞれハイブリダイズすると、三重鎖構造が形成される。ここで、フラッププローブ（配列番号２～６）の「５’－ＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣ－３’」（配列番号９）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成する。
フラップエンドヌクレアーゼは、上記三重鎖構造を認識して、フラッププローブ（配列番号２～６）を切断し、通常、核酸断片１（配列番号９）が切り出される。このとき、フラッププローブ標準（配列番号２）では、副生成物として、核酸断片１（配列番号９）よりも一塩基短い核酸断片２（配列番号１０）や、核酸断片１（配列番号９）よりも一塩基長い核酸断片３（配列番号１１）が切り出される。
上記表１に示すフラッププローブ（配列番号２～６）の小文字で表記されたｐは糖リン酸骨格中のホスホジエステル結合を示し、フラッププローブ１０Ｓ、１１Ｓ、１２Ｓ、１０Ｓ１２Ｓ及び２２Ｓ２３Ｓ（配列番号３～６）における小文字のｓはホスホチオエート結合を示す。蛍光プローブ（配列番号１２）は蛍光物質が塩基に結合している蛍光プローブである。蛍光プローブにおけるＦはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。
蛍光プローブに、切り出された核酸断片１（配列番号９）がハイブリダイズした場合、上記表１において、蛍光プローブの小文字で表すｔ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。
まず、下記表２に示す組成で反応溶液をそれぞれ調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。
図２は、各フラッププローブを用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。なお、各サンプルはそれぞれＮ＝２で測定を行った。
図２に示すように、フラッププローブにおいて切断部位である５’末端から１１番目の核酸の１塩基前後の位置、すなわち、５’末端から１０番目の核酸及び５’末端から１２番目の核酸のうち少なくともいずれか一方の核酸の糖リン酸骨格中のホスホジエステル結合をホスホチオエート結合に置換することで、蛍光強度の立ち上がりが早くなっており、ＩＣＡの反応性が向上することが明らかとなった。また、５’末端から１０番目の核酸の糖リン酸骨格中のホスホジエステル結合をホスホチオエート結合に置換することで、蛍光強度の立ち上がりがより早くなる傾向がみられ、一方で、５’末端から１２番目の核酸の糖リン酸骨格中のホスホジエステル結合をホスホチオエート結合に置換することで、標的核酸が存在しない条件下での蛍光強度（バックグラウンド）を抑えられる傾向がみられた。
また、上記表２に示す組成で反応溶液をそれぞれ調製し、ウェルアレイを備えた流体デバイスのウェルに導入した。ウェルアレイは約９３万個のウェルを有しており、ウェル１つあたりの容積は約１６８３ｆＬであった。
続いて、流体デバイスをアルミブロック恒温槽（型式「ＤＴＵ－Ｍｉｎｉ」、タイテック社）にセットし、６６℃で２５分間加熱した後、顕微鏡（製品名「オールインワン蛍光顕微鏡」、型式「ＢＺ－Ｘ８１０」、キーエンス社）を用いて観察した。
続いて、顕微鏡観察画像に基づいて、発光ウェル（Ｓ）及び未発光ウェル（Ｎ）を識別し、発光ウェル及び未発光ウェルの輝度を算出した。続いて、発光ウェルの輝度及び未発光ウェルの輝度の比、すなわち、Ｓ／Ｎ比を算出した。図３は、各フラッププローブを用いた場合のＳ／Ｎ比を示すグラフである。
図３に示すように、フラッププローブにおいて切断部位である５’末端から１１番目の核酸の１塩基前後の位置、すなわち、５’末端から１０番目の核酸及び５’末端から１２番目の核酸のうち少なくともいずれか一方の核酸の糖リン酸骨格中のホスホジエステル結合をホスホチオエート結合に置換することで、Ｓ／Ｎ比が最大となる時間が、フラッププローブ標準（コントロール）を用いた場合よりも、数百秒早くなることが確かめられた。
以上の結果から、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置の核酸に、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を付与することで、ＩＣＡの反応を高速化できることが示唆された。
［実施例２］
（フラッププローブの濃度の検討）
実施例１で良好な結果が得られたフラッププローブの濃度をふってＩＣＡを行い、反応性を比較した。
（フラッププローブの濃度の検討）
実施例１で良好な結果が得られたフラッププローブの濃度をふってＩＣＡを行い、反応性を比較した。
具体的には、フラッププローブ１０Ｓ、１２Ｓ、及び１０Ｓ１２Ｓについて、反応溶液中の濃度を０．５μＭ、１μＭ及び２μＭとした以外は、上記実施例１と同様の方法を用いて、Ｓ／Ｎ比を算出した。また、コントロールとして、フラッププローブ標準について、反応溶液中の濃度を２μＭとした条件においても同様にＳ／Ｎ比を算出した。図４は、異なる濃度の各フラッププローブを用いた場合のＳ／Ｎ比を示すグラフである。
図４に示すように、フラッププローブ１０Ｓ及び１２Ｓについては、０．５μＭまで使用量を削減しても、Ｓ／Ｎ比が最大となる時間が、フラッププローブ標準を用いた場合よりも、早くなることが確かめられた。フラッププローブ１０Ｓ１２Ｓについては、１μＭまで使用量を削減しても、Ｓ／Ｎ比が最大となる時間が、フラッププローブ標準を用いた場合よりも、早くなることが確かめられた。
以上の結果から、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置の核酸に、フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を付与し、ＩＣＡの反応が高速化されたことにより、フラッププローブの使用量を削減できることが示めされた。
本実施形態のフラッププローブによれば、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置が制御されたＩＣＡ用のフラッププローブを提供することができる。本実施形態の方法によれば、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御することができる。本実施形態のＩＣＡ用キットは、前記フラッププローブを備えており、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御することができる。本実施形態のＩＣＡによる標的核酸の検出方法は、前記フラッププローブを用いており、ＩＣＡにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御することができる。
１００…標的核酸、１０１…塩基、１１０…フラッププローブ、１２０…侵入プローブ、１３０…第１の三重鎖構造、１４０，１７０…フラップ部位（核酸断片）、１４１…領域、１５０…蛍光プローブ、１５１…ミスマッチ部位、１６０…第２の三重鎖構造、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。
Claims (6)
- Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙにおいてフラッププローブのフラップエンドヌクレアーゼによる切断位置を制御する方法であって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、方法。 - 前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造が、ホスホチオエート結合である、請求項１に記載の方法。
- Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙに用いられるフラッププローブであって、
前記フラッププローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、
前記フラッププローブにおいて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断位置の１塩基前の位置及び１塩基後の位置のうち少なくともいずれか一方の位置に、前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造を含む、フラッププローブ。 - 前記フラップエンドヌクレアーゼに対する切断耐性を有する構造が、ホスホチオエート結合である、請求項３に記載のフラッププローブ。
- 請求項３又は４に記載のフラッププローブと、
侵入プローブと、
蛍光プローブと、
フラップエンドヌクレアーゼと、
を備え、
前記侵入プローブは、標的核酸に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、前記フラッププローブの標的核酸に相補的な配列と、前記侵入プローブの前記標的核酸に相補的な配列は、異なる配列であり、且つ、前記フラッププローブと前記侵入プローブは標的核酸の隣接した位置にハイブリダイズし、
前記蛍光プローブは、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に前記フラッププローブがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されて形成された核酸断片に相補的な配列を有し、該核酸断片のハイブリダイズにより、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質及び前記消光物質が遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ用キット。 - 請求項３又は４に記載のフラッププローブを用いることを含む、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙによる標的核酸の検出方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022176209A JP2024066659A (ja) | 2022-11-02 | 2022-11-02 | フラッププローブ及びその使用 |
| US18/498,339 US20240167090A1 (en) | 2022-11-02 | 2023-10-31 | Flap probe and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022176209A JP2024066659A (ja) | 2022-11-02 | 2022-11-02 | フラッププローブ及びその使用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024066659A true JP2024066659A (ja) | 2024-05-16 |
Family
ID=91067602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022176209A Pending JP2024066659A (ja) | 2022-11-02 | 2022-11-02 | フラッププローブ及びその使用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240167090A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024066659A (ja) |
-
2022
- 2022-11-02 JP JP2022176209A patent/JP2024066659A/ja active Pending
-
2023
- 2023-10-31 US US18/498,339 patent/US20240167090A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240167090A1 (en) | 2024-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7667024B2 (en) | Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores | |
| Wang et al. | Molecular engineering of DNA: molecular beacons | |
| JP4457001B2 (ja) | ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法 | |
| EP2473634B1 (en) | Td probe and its uses | |
| JP6085564B2 (ja) | 標的核酸の検出法 | |
| JP5632476B2 (ja) | 核酸の違いを検出するためのプローブの形式 | |
| US8133984B2 (en) | Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids | |
| JP2013511292A (ja) | プローブハイブリダイゼーションおよび制限を使用したシグナル増幅による標的核酸のアッセイ方法 | |
| JPWO2014014106A1 (ja) | 光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法 | |
| US20110033855A1 (en) | Method for quantifying target nucleic acid molecules and kit for quantifying target nucleic acid molecules | |
| KR20120042100A (ko) | 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 | |
| US20120225428A1 (en) | Type of universal probe for the detection of genomic variants | |
| JP2024066659A (ja) | フラッププローブ及びその使用 | |
| KR20180072480A (ko) | 자가 형광 신호 증폭이 가능한 마이크로 rna 검출용 바이오 프로브 세트 및 이의 용도 | |
| CN105555969A (zh) | 具有通用元件的基于荧光团的寡核苷酸探针 | |
| JP7276571B1 (ja) | フラップエンドヌクレアーゼの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法 | |
| JP2024000311A (ja) | 蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド | |
| JP2024000313A (ja) | 蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド | |
| WO2023248568A1 (ja) | 蛍光を検出するための方法 | |
| CN107109398B (zh) | 单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针及单核苷酸多态性检测方法 | |
| EP1086245B1 (en) | Multi-fluorescent hairpin energy transfer oligonucleotides | |
| US6768000B1 (en) | Multi-fluorescent hairpin energy transfer oligonucleotides | |
| CN114250286B (zh) | 用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用 | |
| JP2024000312A (ja) | 蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド | |
| JP2024000309A (ja) | 蛍光を検出するための方法 |