JP6085564B2 - 標的核酸の検出法 - Google Patents
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Description
さらに、蛍光剤と消光剤(quencher)を用いることにより、標的核酸の増幅を定量的に検出する方法も確立されている(特許文献9)。具体的にはTaqMan(登録商標)probeに代表される、蛍光剤と消光剤が隣接付加されたオリゴヌクレオチドプローブをPCR増幅反応の際に加え、PCR反応を行う。PCRの上記ステップ(2)において該プローブも標的核酸にアニーリングされ、ステップ(3)の伸長反応に伴い、ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により該プローブが分解され、消光剤から遊離した蛍光剤の放出光を検出することにより、標的核酸の検出を可能にしている。
本発明者らは、さらに上記方法がLAMP法による増幅と組み合わせることができるだけでなく、他のいかなる核酸増幅方法とも組み合わせることが可能であり、また標的核酸の増幅工程を含まなくとも、すなわち蛍光標識プライマーを単なるプローブとして利用しても、実施可能であり、本発明の課題を解決出来ることを見出し、本発明を完成させた。
[1]試料中に存在する1種類以上の標的核酸を検出する方法であって、以下のステップを含む核酸を検出する方法:
(1)試料に
蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと、
消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度(Tm)の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
を添加し;
(2)該試料を該蛍光標識プライマーまたはプローブの融解温度(Tm)以下で、かつ該クエンチャー標識プローブの融解温度(Tm)より高い温度で保温し;
(3)該試料を該クエンチャー標識プローブの融解温度(Tm)以下の温度で保温し;
(4)標的核酸に結合した蛍光標識プライマーまたはプローブの蛍光を計測する。
[2]前記ステップ(2)の保温の間に標的核酸を増幅する、[1]に記載の検出方法。
[3]前記標的核酸の増幅を等温条件で行う[2]に記載の検出方法。
[4]前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、[1]−[3]のいずれかに記載の検出方法。
[5]前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、[1]−[3]のいずれかに記載の検出方法。
[6]前記蛍光標識プライマーまたはプローブを固相面に固定させて使用する、[1]−[5]のいずれかに記載の検出方法。
[7]2種類以上の標的核酸を検出するために、発光波長が異なる2種類以上の蛍光標識プライマーまたはプローブとそれぞれに対応するクエンチャー標識プローブの組み合わせを用いる[1]−[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記ステップ(4)における蛍光の計測が目視による判定である[1]−[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記ステップ(4)における蛍光の計測が蛍光検出機器による判定である[1]−[7]のいずれかに記載の方法。
蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと;
それぞれの蛍光剤に対応する消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度(Tm)の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
の組み合わせを;
含む標的核酸検出用キット。
[11]前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、[10]に記載の標的核酸検出用キット。
[12]前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、[10]に記載の標的核酸検出用キット。
[13]さらに核酸増幅用試薬を含む[10]−[12]に記載のキット。
[14]前記蛍光標識プライマーまたはプローブが固相面に固定されている[10]−[13]のいずれかに記載の標的核酸検出用キット。
かかる本発明の効果は増幅工程を含む非特許文献2の方法に対してだけでなく、増幅工程を含まない他の態様においても、有効に発揮される。
本発明は増幅反応後にクエンチャー標識プローブを添加する必要がないので、増幅産物の飛散による試料間あるいは実験環境の汚染の心配がない。また、従来のハイブリダイゼーション法に較べ、洗浄ステップなどを含まず、温度管理も比較的簡便でかつ、精密さを要求されないため、より簡便安価で、特別の手技、機器を必要とせずに標的核酸を検出することが可能である。
Tm={(1000ΔH)/(−10.8+ΔS+Rln(Ct/4))}−273.15+16.6log[Na+]
ここで、ΔHはハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計[kcal/mol] 、ΔSはハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計[cal/mol・K]、Rは気体定数(1.987cal/deg・mol)、Ctはオリゴのtotalモル濃度[mol/l]、およびNa+はモル濃度[mol/l]を示す。
図3Aは蛍光標識プライマー/プローブをプローブの態様(標的核酸の増幅する工程を含まない態様)で用いた模式図である。此の場合は、蛍光標識プライマー/プローブのオリゴヌクレオチドの3’末端で固定されていてもかまわない。
固定化の態様の例を図3Bに示す。
(1)蛍光標識プライマー/プローブのオリゴヌクレオチドの3’末端で固定化されている。この場合は対応するクエンチャー標識プローブは5’末端に消光剤が結合していることが望ましい。
(2)蛍光標識プライマー/プローブのオリゴヌクレオチドの3’末端に結合した蛍光剤を介して固定化されている。この場合は対応するクエンチャー標識プローブは5’末端に消光剤が結合していることが望ましい。
(3)蛍光標識プライマー/プローブのオリゴヌクレオチドの5’末端に蛍光剤が結合し、3’ 末端で固定化されている。この場合は対応するクエンチャー標識プローブは3’ 末端に消光剤が結合していることが望ましい。
図3Cは標的核酸の増幅する工程を含む態様である。この場合は、蛍光標識プライマー/プローブのオリゴヌクレオチドの3’領域で固定されていないことが好ましい。核酸増幅の工程を含む態様の場合、標的核酸と蛍光標識プライマー/プローブの結合がより安定する。
特に本発明の複数種類の標的核酸を検出する態様は、ヒトのインフルエンザウイルス(A型(H1N1、H3N2、H1N2、H2N2、H9N1、H5N1を含む)、B型およびC型)あるいは肝炎ウイルス(A型、B型およびC型)などの近接種ウイルスを1度に検出識別するのに有効である。また、性感染症の原因となる、淋菌、梅毒トレポネーマ菌、クラミジア・トラコマティスなどの有無を1度に検出識別するのにも有効である。さらに感染性胃腸炎の原因となる、ノロウイルスやロタウイルスなどの有無を1度に検出識別するのにも有効である。あるいは輸血用血液のスクリーニング検査としてエイズウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)およびC型肝炎ウイルス(HCV)の有無を1度に検出識別するのにも有効である。
前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さは前記蛍光標識プライマー/プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短いか、あるいは前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいるものが挙げられる。
前記蛍光標識プライマー/プローブが固相面に固定されていてもよい。また、本発明のキットは標的核酸を増幅させるための他の試薬を含んでよく、通常の核酸検出用に用いる他の試薬を必要に応じて、任意に含んでよい。
(1)測定鋳型
測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号21)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下CTプラスミド)を作製した。
クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないLAMP反応用のプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、LBの5’末端をFAMにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー/プローブとし、相補鎖の3’末端にBHQ1を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。また、クエンチャー標識プローブについては、5’末端側を3〜10塩基削除し、Tm値を下げたクエンチャー標識プローブも設計した。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。クエンチャー標識プローブのTm値は最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)の計算値を示している。
<クラミジア・トラコマティス プライマー>
CT−FIP:5’−CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’(配列番号1)
CT−BIP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’(配列番号2)
CT−F3:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号3)
CT−B3:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’(配列番号4)
CT−LF:5’−AAGATAACCCCGCACGT−3’(配列番号5)
CT−LB:5’−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号6)
<クラミジア・トラコマティス蛍光標識プライマー/プローブ>
FAM−CT−LB:5’−(FAM)−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号7)
<クラミジア・トラコマティス クエンチャー標識プローブ>
CT−LBc−Q1−0:5’−TGTCTTCGTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号8)Tm=60.6℃
CT−LBc−Q1−3:5’−CTTCGTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号9)Tm=53.9℃
CT−LBc−Q1−5:5’−TCGTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号10)Tm=49.7℃
CT−LBc−Q1−6:5’−CGTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号11)Tm=46.5℃
CT−LBc−Q1−7:5’−GTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号12)Tm=37.5℃
CT−LBc−Q1−9:5’−AACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号13)Tm=32.6℃
CT−LBc−Q1−10:5’−ACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号14)Tm=26.7℃
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。クエンチャー標識プローブは未添加を対照とし、CT−LBc−Q1−0(配列番号8)、CT−LBc−Q1−3(配列番号9)、CT−LBc−Q1−5(配列番号10)、CT−LBc−Q1−6(配列番号11)、CT−LBc−Q1−7(配列番号12)、CT−LBc−Q1−9(配列番号13)もしくはCT−LBc−Q1−10(配列番号14)の何れかを添加した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM dATP(GeneACT社)
・2.1mM dCTP(GeneACT社)
・2.1mM dGTP(GeneACT社)
・2.1mM dTTP(GeneACT社)
・38.4U Bst DNA Polymerase(New England Biolab社)
・プライマー、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブ
0.8μM CT−FIP(配列番号1)
0.8μM CT−BIP(配列番号2)
0.1μM CT−F3(配列番号3)
0.1μM CT−B3(配列番号4)
0.4μM CT−LF(配列番号5)
0.4μM FAM−CT−LB(配列番号7)
0.8μM CT−LBc−Q1−0(配列番号8)、CT−LBc−Q1−3(配列番号9)、CT−LBc−Q1−5(配列番号10)、CT−LBc−Q1−6(配列番号11)、CT−LBc−Q1−7(配列番号12)、CT−LBc−Q1−9(配列番号13)もしくはCT−LBc−Q1−10(配列番号14)
蒸留水(DW)またはCTプラスミド104copiesを1反応に添加し、リアルタイム濁度測定装置LA−320C(テラメックス社)を用い、65℃120分間増幅反応を行った。
LA−320Cにて増幅反応(LA−320Cでは、核酸の増幅反応をその副産物であるピロリン酸マグネシウムの生成による吸光度の変化、すなわち濁度の変化によりモニタリングする。Tt値:濁度測定データの演算値が反応開始から所定の判定値に到達するまでの時間、濁度曲線:濁度のリアルタイム測定データのプロット)の確認を行うとともに、増幅後反応チューブにUVを照射し、緑色の蛍光(FAM)を発しているものを陽性、蛍光が認められないものを陰性とした。
クエンチャー標識プローブを使用していない場合は、CTプラスミド104copiesの増幅は20.7分で認められた。それに対し、クエンチャー標識プローブを添加したものではクエンチャー標識プローブによって増幅時間が異なり、CT−LBc−Q1−0(配列番号8)では92.4分(+71.7分)、CT−LBc−Q1−3(配列番号9)では41.5分(+20.8分)、CT−LBc−Q1−5(配列番号10)では27.8分(+7.1分)、CT−LBc−Q1−6(配列番号11)では25.5分(+4.8分)、CT−LBc−Q1−7(配列番号12)では22.8分(+2.1分)、CT−LBc−Q1−9(配列番号13)では20.7分(+0.0分)、CT−LBc−Q1−10(配列番号14)では20.6分(−0.1分)であった。また、何れのクエンチャー標識プローブを用いた場合でも、CTプラスミドを添加したチューブではFAM由来の蛍光である緑が確認され、DWを添加したチューブでは蛍光が確認できなかった(表1)。
CT−LBc−Q1を添加していない場合は、DW添加においても蛍光標識がQuenchingされていないため蛍光が確認できた。CT−LBc−Q1を添加しているもの(Q1−0)では、何れもDW添加では消光しており、またCTプラスミドを添加しているものでは、CT−LBc−Q1のTm値に影響されることなく蛍光が確認できた。
[表1]が示すように、クエンチャー標識プローブのTm値が大きいほど増幅時間が遅延しているが、Tm値が32.6℃以下ではその影響がなくなっている。従ってクエンチャー標識プローブのTmは32.6℃以下が望ましいということが示唆された。
(1)測定鋳型
測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号21)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下CTプラスミド)を作製した。
クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、LBの5’末端をFAMにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー/プローブとし、相補鎖の3’末端にBHQ1を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマーおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
CT−FIP:5’−CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’(配列番号1)
CT−BIP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’(配列番号2)
CT−F3:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号3)
CT−B3:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’(配列番号4)
CT−LF:5’−AAGATAACCCCGCACGT−3’(配列番号5)
CT−LB:5’−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号6)
<クラミジア・トラコマティス 蛍光標識プライマー>
FAM−CT−LB:5’−(FAM)−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号7)
<クラミジア・トラコマティス Quencher標識プローブ>
CT−LBc−Q1−0:5’−TGTCTTCGTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号8)
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM dATP(GeneACT社)
・2.1mM dCTP(GeneACT社)
・2.1mM dGTP(GeneACT社)
・2.1mM dTTP(GeneACT社)
・38.4U Bst DNA Polymerase (New England Biolab社)
・プライマーおよび蛍光標識プライマー/プローブ
0.8μM CT−FIP(配列番号1)
0.8μM CT−BIP(配列番号2)
0.1μM CT−F3(配列番号3)
0.1μM CT−B3(配列番号4)
0.4μM CT−LF(配列番号5)
0.4μM FAM−CT−LB(配列番号7)
また、増幅反応後以下の試薬を添加した。
・クエンチャー標識プローブ
0.8μM CT−LBc−Q1−0(配列番号8)
DWまたはCTプラスミド104copiesを1反応に添加し、LA−320Cを用い、65℃120分間増幅反応を行った。
実施例1と同様に、LA−320Cにて増幅反応の確認を行った(表2、図4)。
DWを添加した反応チューブでは、Tt値は検出されず、濁度の上昇は見られなかった。一方、CTプラスミドを添加した反応チューブでは、Tt値が18.7分、および濁度の上昇が確認された。これらのことからCTプラスミド、すなわち標的核酸が含まれる反応チューブでのみ増幅反応が起こったことが確認された。
(1)測定鋳型
内部標準物質鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号21)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下、CTプラスミドという。)を作製した。また、標的核酸鋳型として、淋菌mtrA領域の一部(配列番号32)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下、NGプラスミドという。)を作製した。
クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、TAMRA標識ループプライマーおよびBHQ2標識Quenchingプローブの合成は、J−Bios社に依頼した。
<クラミジア・トラコマティス プライマー>
CT−FIP:5’−CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’(配列番号1)
CT−BIP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’(配列番号2)
CT−F3:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号3)
CT−B3:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’(配列番号4)
CT−LB:5’−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号6)
<クラミジア・トラコマティス TAMRA標識ループプライマー>
TAM−CT−LF:5’−(TAMRA)−AAGATAACCCCGCACGT−3’(配列番号15)
<クラミジア・トラコマティス BHQ2標識Quenchingプローブ>
CT−LFc−Q2:5’−GGGGTTATCTT−(BHQ2)−3’(配列番号16)
淋菌のmtrA領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、FAM標識ループプライマーおよびBHQ1標識Quenchingプローブの合成は、J−Bios社に依頼した。
<淋菌 プライマー>
NG−FIP:5’−CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA−3’(配列番号17)
NG−BIP:5’−ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC−3’(配列番号18)
NG−F3:5’−GCGGTTATCTCTGCATCG−3’(配列番号19)
NG−B3:5’−GGTGTCGTAGCGGAAAC−3’(配列番号20)
NG−LF:5’−CGGGAAAAATACAATATCGCCC−3’(配列番号22)
<淋菌 FAM標識ループプライマー>
FAM−NG−LB:5’−(FAM)−CGACAAAACGGCACATTTATGG−3’(配列番号23)
<淋菌 BHQ1標識Quenchingプローブ>
NG−LBc−Q1:5’−CGTTTTGTCG−(BHQ1)−3’(配列番号24)
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM ATP
・2.1mM CTP
・2.1mM GTP
・2.1mM TTP
・38.4U Bst DNAポリメラーゼ(New England Biolab社)
・クラミジア・トラコマティスプライマー、TAMRA標識ループプライマーおよびBHQ2標識Quenchingプローブ
0.8μM CT−FIP(配列番号1)およびCT−BIP(配列番号2)
0.1μM CT−F3(配列番号3)およびCT−B3(配列番号4)
0.4μM CT−LB(配列番号6)およびTAM−CT−LF(配列番号15)
0.8μM CT−LFc−Q2(配列番号16)
・淋菌 プライマー、FAM標識ループプライマーおよびBHQ1標識Quenchingプローブ
0.8μM NG−FIP(配列番号17)およびNG−BIP(配列番号18)
0.1μM NG−F3(配列番号19)およびNG−B3(配列番号20)
0.4μM NG−LF(配列番号22)およびFAM−NG−LB(配列番号23)
0.8μM NG−LBc−Q1(配列番号24)
DW、またはCTプラスミド104コピー、またはNGプラスミド104コピー、またはCTプラスミド104コピーおよびNGプラスミド104コピーを添加し、LA−320Cを用いて、65℃60分間増幅反応を行った。
クラミジア・トラコマティス由来の核酸(CT)が増幅されるとUV照射下において赤色(TAMRA)が目視でき、淋菌由来の核酸(NG)が増幅されると緑色(FAM)が目視できる。上記増幅反応後、UVを照射して蛍光を確認した結果(図6)、DW(陰性検体)では無色(Tube No. 1 - 4);淋菌陽性検体では緑色(Tube No. 5 - 8);クラミジア・トラコマティス陽性検体では赤色(Tube No. 9 - 12);両陽性検体では黄色(赤色+緑色)が目視できた(Tube No. 13 - 16)。
(1)測定鋳型
測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号21)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下CTプラスミド)、淋菌のmtrA領域の一部(配列番号32)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下NGプラスミド)、人工核酸配列(配列番号33)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下ARITA2プラスミド)を作製した。
クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域、淋菌のmtrA領域および人工核酸配列をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないLAMP反応用のプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、クラミジア・トラコマティス LFの5’末端をTAMRAに、淋菌LBの5’末端をFAMに、人工核酸配列LBの5’末端をAlexa FluorTM 350(以下Alexa350)にて蛍光標識したものを蛍光標識プライマーとし、クラミジア・トラコマティス LF相補鎖の3’末端にBHQ2を標識、淋菌LB相補鎖の3’末端にBHQ1を標識、人工核酸配列LB相補鎖の3’末端にBHQ0を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
CT−FIP:5’−CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’(配列番号1)
CT−BIP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’(配列番号2)
CT−F3:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号3)
CT−B3:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’(配列番号4)
CT−LB:5’−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号6)
<クラミジア・トラコマティス 蛍光標識プライマー/プローブ>
TAM−CT−LF:5’−(TAMRA)−AAGATAACCCCGCACGT−3’(配列番号15)
<クラミジア・トラコマティス クエンチャー標識プローブ>
CT−LFc−Q2:5’−ACGTGCGGGGTTATCTT−(BHQ2)−3’(配列番号16)
<淋菌 プライマー>
NG−FIP:5’−CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA−3’(配列番号17)
NG−BIP:5’−ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC−3’(配列番号18)
NG−F3:5’−GCGGTTATCTCTGCATCG−3’(配列番号19)
NG−B3:5’−GGTGTCGTAGCGGAAAC−3’(配列番号20)
NG−LF:5’−CGGGAAAAATACAATATCGCCC−3’(配列番号22)
<淋菌 蛍光標識プライマー/プローブ>
FAM−NG−LB:5’−(FAM)−CGACAAAACGGCACATTTATGG−3’(配列番号23)
<淋菌 クエンチャー標識プローブ>
NG−LBc−Q1:5’−CGTTTTGTCG−(BHQ1)−3’(配列番号24)
<人工核酸 プライマー>
ARITA2−FIP:5’−CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC−3’(配列番号25)
ARITA2−BIP:5’−ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC−3’(配列番号26)
ARITA2−F3:5’−GGACAATCGAAGCCAGAA−3’(配列番号27)
ARITA2−B3:5’−ATCACGGATCGTATGTGG−3’(配列番号28)
ARITA2−LF:5’−GCTAGCTAAGTGCCATCC−3’(配列番号29)
<人工核酸 蛍光標識プライマー/プローブ>
Ale−ARITA2−LB:5’−(Alexa350)−AACGATCGCACTAAGCAT−3’(配列番号30)
<人工核酸 クエンチャー標識プローブ>
ARITA2−LBc−Q0:5’−ATGCTTAGTGCGATCGTT−(BHQ0)−3’(配列番号31)
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM dATP (GeneACT社)
・2.1mM dCTP (GeneACT社)
・2.1mM dGTP (GeneACT社)
・2.1mM dTTP (GeneACT社)
・38.4U Bst DNA Polymerase (New England Biolab社)
・プライマーおよび蛍光標識プライマー/プローブ
0.6μM CT−FIP(配列番号1)、NG−FIP(配列番号17)
0.6μM CT−BIP(配列番号2)、NG−BIP(配列番号18)
0.1μM CT−F3(配列番号3)、NG−F3(配列番号19)
0.1μM CT−B3(配列番号4)、NG−B3(配列番号20)
0.3μM CT−LB(配列番号6)、NG−LF(配列番号22)
0.1μM ARITA2−FIP(配列番号25)、ARITA2−BIP(配列番号26)
0.02μM ARITA2−F3(配列番号27)、ARITA2−B3(配列番号28)
0.1μM ARITA2−LF(配列番号29)
0.4μM TAM−CT−LF(配列番号15)、FAM−NG−LB(配列番号23)、Ale−ARITA2−LB(配列番号30)
また、増幅反応後以下の試薬を添加した。
・クエンチャー標識プローブ
0.8μM CT−LFc−Q2(配列番号16)、NG−LBc−Q1(配列番号24)、ARITA2−LBc−Q0(配列番号31)
DW、CTプラスミド104copies、NGプラスミド104copiesまたはARITA2プラスミド102copiesのうち1種類もしくは複数種類を1反応に添加し、LA−320Cを用い、65℃120分間増幅反応を行った。
実施例1と同様に、LA−320Cにて増幅反応の確認を行った(表3、図7)。
DWを添加した(CT、NGおよびARITA2プラスミドすべて−)反応チューブでは、Tt値は検出されず、濁度の上昇は見られなかった。一方、CTプラスミド、NGプラスミドあるいはARITA2プラスミドを1種類、2種類組合せて、あるいは3種類すべてを添加した反応チューブでは、それぞれTt値が得られ、また、濁度の上昇が確認された。これらのことからCTプラスミド、NGプラスミドあるいはARITA2プラスミドを1種類あるいは複数種類含む反応チューブでのみ増幅反応が起こったことが確認された。増幅終了後の反応チューブに、CT−LFc−Q2(配列番号16)、NG−LBc−Q1(配列番号24)、ARITA2−LBc−Q0(配列番号31)0.8μM添加し、95℃5分加熱後に室温まで冷却した後、UVを照射して蛍光を観察した(図8)。
DWを添加した反応チューブでは増幅産物がないため、蛍光が確認できなかった(Tube No. 1)。CTプラスミド添加反応チューブでは、赤の蛍光が確認できた(Tube No. 2)。同様に、NGプラスミド添加反応チューブでは緑の蛍光(Tube No. 3)、ARITA2プラスミド添加反応チューブでは青の蛍光が確認できた(Tube No. 4)。二種のプラスミドを添加した反応チューブではそれぞれの蛍光色の中間色を示し、CTプラスミドとNGプラスミド添加反応チューブでは黄の蛍光(Tube No. 5)、CTプラスミドとARITA2プラスミド添加反応チューブでは紫の蛍光(Tube No. 6)、NGプラスミドとARITA2プラスミド添加反応チューブでは水色の蛍光が確認できた(Tube No. 7)。また、三種のプラスミドを添加した反応チューブでは白色の蛍光が確認できた(Tube No. 8)。
(1)試料の調製
試料には、反応後のLAMP反応液を用いた。LAMP反応条件については、各試薬組成と終濃度は以下に示すとおりとし、鋳型としてCTプラスミドを1反応あたり104copiesとなるように添加、あるいは鋳型の代わりにDWを添加し、LAMP最終反応溶液30μLとして、LA−320Cを用いて、65℃40分間増幅反応を行った。また、得られた反応液は80℃5分間加熱処理をすることでBst DNA Polymeraseの失活処理を行ない、後に行なう蛍光標識プライマー/プローブによる検出時に増幅反応が起こらないようにした。このようにして得られたLAMP反応液すなわち試料のうち、CTプラスミドを鋳型にして調製したものは陽性検体、DWを添加して調製したものは陰性検体とした。
<LAMP反応試薬組成および終濃度>
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM dATP (GeneACT社)
・2.1mM dCTP (GeneACT社)
・2.1mM dGTP (GeneACT社)
・2.1mM dTTP (GeneACT社)
・38.4U Bst DNA Polymerase (New England Biolab社)
<クラミジア・トラコマティス プライマー>
・ 0.8μM CT−FIP:5’−CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’ (配列番号1)
・ 0.8μM CT−BIP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’ (配列番号2)
・ 0.1μM CT−F3:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号3)
・ 0.1μM CT−B3:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’ (配列番号4)
・ 0.4μM CT−FL:5’−AAGATAACCCCGCACGT−3’ (配列番号5)
・ 0.4μM CT−BL:5’−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’ (配列番号6)
設計したプライマーのうち、BLの5’末端をFAMにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー/プローブとし、相補鎖の3’末端にBHQ1を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。なお、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
<クラミジア・トラコマティス 蛍光標識プライマー/プローブ>
FAM−CT−BL:5’−(FAM)−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号7)
<クラミジア・トラコマティス クエンチャー標識プローブ>
CT−BLc−Q1−0:5’−TGTCTTCGTAACTCGCTCC−(BHQ1)−3’(配列番号8)
(1)で調製した陽性検体と陰性検体それぞれに対して、0.4μM蛍光標識プライマー/プローブ(配列番号7)を添加し、95℃5分間加熱処理を行ない、鋳型の変性を行なった。続いて室温まで冷却し鋳型と蛍光標識プライマーをアニーリングさせた。
室温まで冷却した後、0.8μM クエンチャー標識プローブ(配列番号8)を添加し攪拌後、UV下その蛍光を確認した(図9)。
陽性検体、陰性検体のいずれも、蛍光標識プライマー/プローブの添加前では、蛍光は検出できず(Tube No. 1, 2)、蛍光標識プライマー/プローブであるFAM−CT−BL(配列番号7)の添加後は、蛍光が検出できた(Tube No. 3, 4)。これらを95℃5分加熱後、室温まで冷却し、クエンチャー標識プローブであるCT−BLc−Q1−0(配列番号8)を添加したところ、陰性検体では、LAMP産物は存在しないため、FAM−CT−BL(配列番号7)はCT−BLc−Q1−0(配列番号8)と結合するために、蛍光は消光(Quenching)された(Tube No. 5)。これに対し、陽性検体では、CTプラスミドを鋳型として増幅されたLAMP産物にFAM−CT−BL(配列番号7)が結合しており、CT−BLc−Q1−0(配列番号8)とは結合しないため、蛍光が保持されていた(Tube No. 6)。
従って実施例5は、図1に示す本願発明の最も基本的な態様は実施可能であることを示している。
(1)測定鋳型
測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号21)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下CTプラスミド)を作製した。
クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないSMAP2反応用のプライマー(FP、TP、OP1、OP2およびBPプライマーの計5本)を設計した。設計したプライマーのうち、TPプライマーによって増幅産物に生じるループ部分にアニールするBPプライマーの5’末端をAlexa350にて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー/プローブとした。さらにBPプライマーの相補鎖の3’末端にBHQ0を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
CT−FP:5’−TTTATATATATATAAAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’(配列番号34)
CT−TP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’(配列番号35)
CT−OP1:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’(配列番号36)
CT−OP2:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号37)
<クラミジア・トラコマティス 蛍光標識プライマー/プローブ>
Ale−CT−BP:5’−(Alexa350)−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号38)
<クラミジア・トラコマティス クエンチャー標識プローブ>
CT−BPc−Q0:5’−AACTCGCTCC−(BHQ0)−3’(配列番号39)
SMAP2最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM dATP(GeneACT社)
・2.1mM dCTP(GeneACT社)
・2.1mM dGTP(GeneACT社)
・2.1mM dTTP(GeneACT社)
・38.4U Bst DNA Polymerase (New England Biolab社)
・プライマー、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブ
1.33μM CT−FP(配列番号34)
1.33μM CT−TP(配列番号35)
0.17μM CT−OP1(配列番号36)
0.17μM CT−OP2(配列番号37)
0.67μM Ale−CT−BP(配列番号38)
1.33μM CT−BPc−Q0(配列番号39)
DWまたはCTプラスミド106copiesを1反応に添加し、リアルタイム濁度測定装置 LoopampEXIATM(テラメックス社)を用い、65℃45分間増幅反応を行った。
LoopampEXIATMにて増幅反応の確認を行った(LoopampEXIATMでは、核酸の増幅反応をその副産物であるピロリン酸マグネシウムの生成による吸光度の変化、すなわち濁度の変化によりモニタリングする。Tt値:濁度測定データの演算値が反応開始から所定の判定値に到達するまでの時間、濁度曲線:濁度のリアルタイム測定データのプロット)(表4、図10)。
DWを添加した反応チューブでは、Tt値は検出されず、濁度の上昇はみられなかった。一方、CTプラスミドを添加した反応チューブでは、Tt値が23.2分、および濁度の上昇が確認された。これらのことから、CTプラスミド、すなわち標的核酸が含まれる反応チューブでのみ増幅反応が起こったことが確認された。
増幅反応終了後の各反応チューブにUVを照射して蛍光を観察した結果(図11)、DWを添加した反応チューブ(Tube No. 1)では蛍光は観察されず、CTプラスミドを添加した反応チューブ(Tube No. 2)では蛍光を認めた。
(1)測定鋳型
測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号21)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下CTプラスミド) 、淋菌のmtrA領域の一部(配列番号32)をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下NGプラスミド)、人工核酸配列(配列番号33)をサブクローニングしたプラスミドDNA (以下ARITA2プラスミド)を作製した。
クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域、淋菌のmtrA領域および人工核酸配列をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないLAMP反応用のプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、クラミジア・トラコマティスBLの5’末端をAlexa350にて蛍光標識、淋菌BLの5’末端をTAMRAにて蛍光標識、人工核酸配列BLの5’末端をFAMにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー/プローブとし、クラミジア・トラコマティスBL相補鎖の3’末端にBHQ0を標識、淋菌BL相補鎖の3’末端にBHQ2を標識、人工核酸配列BL相補鎖の3’末端にBHQ1を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
CT−FIP:5’−CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC−3’(配列番号1)
CT−BIP:5’−GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT−3’(配列番号2)
CT−F3:5’−ATGTCGGAGTCTGAGCAC−3’(配列番号3)
CT−B3:5’−CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC−3’(配列番号4)
CT−LF:5’−AAGATAACCCCGCACGT−3’(配列番号5)
<クラミジア・トラコマティス 蛍光標識プライマー/プローブ>
Ale−CT−LB:5’−(Alexa350)−GGAGCGAGTTACGAAGACA−3’(配列番号40)
<クラミジア・トラコマティス クエンチャー標識プローブ>
CT−LBc−Q0:5’−AACTCGCTCC−(BHQ0)−3’(配列番号41)
<淋菌 プライマー>
NG−FIP:5’−CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA−3’(配列番号17)
NG−BIP:5’−ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC−3’(配列番号18)
NG−F3:5’−GCGGTTATCTCTGCATCG−3’(配列番号19)
NG−B3:5’−GGTGTCGTAGCGGAAAC−3’(配列番号20)
NG−LF:5’−CGGGAAAAATACAATATCGCCC−3’(配列番号22)
<淋菌 蛍光標識プライマー/プローブ>
TAM−NG−LB:5’−(TAMRA)−CGACAAAACGGCACATTTATGG−3’(配列番号42)
<淋菌 クエンチャー標識プローブ>
NG−LBc−Q2:5’−CGTTTTGTCG−(BHQ2)−3’(配列番号43)
<人工核酸 プライマー>
ARITA2−FIP:5’−CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC−3’(配列番号25)
ARITA2−BIP:5’−ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC−3’(配列番号26)
ARITA2−F3:5’−GGACAATCGAAGCCAGAA−3’(配列番号27)
ARITA2−B3:5’−ATCACGGATCGTATGTGG−3’(配列番号28)
ARITA2−LF:5’−GCTAGCTAAGTGCCATCC−3’(配列番号29)
<人工核酸 蛍光標識プライマー/プローブ>
FAM−ARITA2−LB:5’−(FAM)−AACGATCGCACTAAGCAT−3’(配列番号44)
<人工核酸 クエンチャー標識プローブ>
ARITA2−LBc−Q1:5’−ATGCTTAGTGCGATCGTT−(BHQ1)−3’(配列番号45)
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・30mM Tris−HCl(pH8.8)
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM ATP
・2.1mM CTP
・2.1mM GTP
・2.1mM TTP
・38.4U Bst DNAポリメラーゼ(New England Biolab社)
プライマーについては、以下3種類のプライマーと蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブのセットを1種類もしくは複数種類を1反応に添加した。
プライマーと蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブのセットの組合せは、単項目増幅では、クラミジア・トラコマティス、淋菌、人工核酸の3通り、2項目同時増幅では、クラミジア・トラコマティスと淋菌、クラミジア・トラコマティスと人工核酸、淋菌と人工核酸の3通り、3項目同時増幅では、クラミジア・トラコマティスと淋菌と人工核酸の1通りである。
<クラミジア・トラコマティス プライマーと蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブ>
0.67μM CT−FIP(配列番号1)
0.67μM CT−BIP(配列番号2)
0.17μM CT−F3(配列番号3)
0.17μM CT−B3(配列番号4)
0.33μM CT−LF(配列番号5)
0.67μM Ale−CT−LB(配列番号40)
1.33μM CT−LBc−Q0(配列番号41)
<淋菌 プライマーと蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブ>
1.20μM NG−FIP(配列番号17)
1.20μM NG−BIP(配列番号18)
0.17μM NG−F3(配列番号19)
0.17μM NG−B3(配列番号20)
0.67μM NG−LF(配列番号22)
0.67μM TAM−NG−LB(配列番号42)
1.33μM NG−LBc−Q2(配列番号43)
<人工核酸 プライマーと蛍光標識プライマー/プローブおよびクエンチャー標識プローブ>
0.20μM ARITA2−FIP(配列番号25)
0.20μM ARITA2−BIP(配列番号26)
0.03μM ARITA2−F3(配列番号27)
0.03μM ARITA2−B3(配列番号28)
0.13μM ARITA2−LF(配列番号29)
0.67μM FAM−ARITA2−LB(配列番号44)
1.33μM ARITA2−LBc−Q1(配列番号45)
DW、CTプラスミド103copies、NGプラスミド103copiesまたはARITA2プラスミド103copiesのうち1種類もしくは複数種類を1反応に添加し、LoopampEXIATMを用い、65℃45分間増幅反応を行った。
LoopampEXIATMにて増幅反応の確認を行った。
増幅反応終了後、反応チューブにUVを照射し、蛍光の観察を行った。
また、増幅反応後の反応液を希釈液にて100倍に希釈したものを分光蛍光光度計 RF−5300PC(SHIMADZU社製)にて各蛍光標識に対応した励起光を照射し蛍光波長のスキャンを行った。
<希釈液の組成>
・30mM Tris−HCl pH8.8
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
各蛍光標識に対応する励起光として以下の波長を用いた。
・Alexa350 350nm
・TAMRA 555nm
・FAM 495nm
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表5 鋳型CT“−”より、Tt値は検出されず;図12のDWの増幅曲線より、濁度の上昇なし)、UV照射下で蛍光が確認できない(図13 Tube No.1)が、CTプラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表5 鋳型CT“+”のTt値 13.3分;図12のCTの増幅曲線より濁度の上昇あり)、UV照射下ではAle−CT−LB(配列番号40)に由来すると思われる青の蛍光が確認できた(図13 Tube No.2)。蛍光波長においても同様に、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、鋳型(−)(DWを添加した)の反応液では(図14 A)、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認した。一方、鋳型(+)(CTプラスミドを添加した)の反応液では(図14 B)、350nm付近に励起光と、398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表6 鋳型NG“−”より、Tt値は検出されず;図15のDWの増幅曲線より、濁度の上昇なし)、UV照射下で蛍光が確認できない(図16 Tube No.1)が、NGプラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表6 鋳型NG“+”より、Tt値 11.6分;図15のNGの増幅曲線より、濁度の上昇あり)、UV照射下ではTAM−NG−LB(配列番号42)に由来すると思われる赤の蛍光が確認できた(図16 Tube No.2)。蛍光波長においても同様に、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、鋳型(−)(DWを添加した)の反応液では(図17 A)、555nm付近に励起光のみを確認した。一方、鋳型(+)(NGプラスミドを添加した)の反応液では(図17 B)、555nm付近に励起光と、580nm付近にTAM−NG−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表7 鋳型ARITA2“−”より、Tt値は検出されず;図18のDWの増幅曲線より、濁度の上昇なし)、UV照射下で蛍光が確認できない(図19 Tube No.1)が、ARITA2プラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表7 鋳型ARITA2“+”より、Tt値は、反応時間内に検出されなかったが、図18のARITA2の増幅曲線より、濁度の上昇を確認したことから、核酸は増幅したと判断した)、FAM−ARITA2−LB(配列番号44)に由来すると思われる緑の蛍光が確認できた(図19 Tube No.2)。
蛍光波長においては、FAMに対応する励起光を照射した場合、鋳型(−)(DWを添加した)の反応液(図20 A)と鋳型(+)(ARITA2プラスミドを添加した)の反応液(図20 B)はともに、495nm付近に励起光、522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光のピークがみられたが、鋳型(−)の反応液ではより小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)であり、鋳型(+)の反応液においてより大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表8 鋳型CT“−”およびNG“−”より、Tt値は検出されず;図21のDWの増幅曲線より、濁度の上昇はなし)、UV照射下で蛍光は確認できない(図22 Tube No.1)が、CTプラスミドのみ添加、NGプラスミドのみ添加あるいはCTプラスミドとNGプラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表8 鋳型CTのみ“+”、鋳型NGのみ“+”、鋳型CT“+”およびNG“+”のTt値はそれぞれ12.8分、13.6分、12.2分;図21のCT、NG、CT+NGの増幅曲線よりいずれも濁度の上昇あり)、UV照射下ではそれぞれ、Ale−CT−LB(配列番号40)に由来すると思われる青の蛍光(図22 Tube No.2)、TAM−NG−LB(配列番号42)に由来すると思われる赤の蛍光(図22 Tube No.3)、Ale−CT−LBとTAM−NG−LBに由来すると思われる紫の蛍光(図22 Tube No.4)が確認できた。
蛍光波長においては、CTおよびNGともに鋳型(−)(DWを添加した)の反応液では(図23 A)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピーク、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光のみを確認した。
CTのみ鋳型(+)(CTプラスミドのみ添加した)の反応液では(図23 B)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光を確認しただけであった。
NGのみ鋳型(+)(NGプラスミドのみ添加した)の反応液では(図23 C)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と580nm付近にTAM−NG−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
CTおよびNGともに鋳型(+)(CTプラスミドとNGプラスミドを添加した)の反応液では(図23 D)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近にAlexa350のための励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と、580nm付近にTAM−NG−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表9 鋳型CT“−”およびARITA2“−”より、Tt値は検出されず;図24のDWの濁度曲線より、濁度の上昇なし)、UV照射下で蛍光は確認できない(図25 Tube No.1)が、CTプラスミドのみ添加、ARITA2プラスミドのみ添加あるいはCTプラスミドとARITA2プラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表9 鋳型CTのみ“+”、鋳型ARITA2のみ“+”、鋳型CT“+”およびARITA2“+”のTt値はそれぞれ12.0分、28.2分、13.6分;図24のCT、ARITA2、CT+ARITA2の濁度曲線より、いずれも濁度の上昇有あり)、UV照射下ではそれぞれ、Ale−CT−LB(配列番号40)に由来すると思われる青の蛍光(図25 Tube No.2)、FAM−ARITA2−LB(配列番号44)に由来すると思われる緑の蛍光(図25 Tube No.3)、Ale−CT−LBとFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる水色の蛍光(図25 Tube No.4)が確認できた。
蛍光波長においては、CTおよびARITA2ともに鋳型(−)(DWを添加した)の反応液では(図26 A)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピーク、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光のみを確認した。
CTのみ鋳型(+)(CTプラスミドのみ添加した)の反応液では(図26 B)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認した。
ARITA2のみ鋳型(+)(ARITA2プラスミドのみ添加した)の反応液では(図26 C)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
CTおよびARITA2ともに鋳型(+)(CTプラスミドとARITA2プラスミドを添加した)の反応液では(図26 D)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と、522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表10 鋳型NG“−”およびARITA2“−”より、Tt値は検出されず;図27のDWの濁度曲線より、濁度の上昇なし)、UV照射下で蛍光は確認できない(図28 Tube No.1)が、NGプラスミドのみ添加、ARITA2プラスミドのみ添加あるいはNGプラスミドとARITA2プラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表10 鋳型NGのみ“+”、鋳型ARITA2のみ“+”、鋳型NG“+”およびARITA2“+”のTt値はそれぞれ12.0分、29.0分、11.9分;図27のNG、ARITA2、NG+ARITA2の濁度曲線より、いずれも濁度の上昇あり)、UV照射下ではそれぞれ、TAM−NG−LB(配列番号42)に由来すると思われる赤の蛍光(図28 Tube No.2)、FAM−ARITA2−LB(配列番号44)に由来すると思われる緑の蛍光(図28 Tube No.3)、TAM−NG−LBとFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる黄の蛍光(図28 Tube No.4)が確認できた。
蛍光波長においては、NGおよびARITA2Gともに鋳型(−)(DWを添加した)の反応液では(図29 A)、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認した。
NGのみ鋳型(+)(NGプラスミドのみ添加した)の反応液では(図29 B)、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と580nm付近にTAM−NG−LB由来すると思われる蛍光のピークを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認した。
ARITA2のみ鋳型(+)(ARITA2プラスミドのみ添加した)の反応液では(図29 C)、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光のみを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
NGおよびARITA2ともに鋳型(+)(NGプラスミドとARITA2プラスミドを添加した)の反応液では(図29 D)、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と580nm付近にTAM−NG−LB由来すると思われる蛍光のピークを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
DWを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず(表11 鋳型CT“−”、NG“−”およびARITA2“−”より、Tt値は検出されず;図30のDWの濁度曲線より、濁度の上昇なし)、UV照射下で蛍光は確認できない(図31 Tube No.1)が、CTプラスミド、NGプラスミド、ARITA2プラスミドを1種類添加、2種類組み合わせて添加、あるいは3種類すべてを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ(表11 鋳型CTのみ“+”、鋳型NGのみ“+”、鋳型ARITA2のみ“+”、鋳型CT“+”およびNG“+”、鋳型CT“+”およびARITA2“+”、鋳型NG“+”およびARITA2“+”、鋳型CT“+”とNG“+”およびARITA2“+”のTt値はそれぞれ14.3分、13.5分、35.6分、12.3分、14.2分、13.5分、12.4分;図30のCT、NG、ARITA2、CT+NG、CT+ARITA2、NG+ARITA2、CT+NG+ARITA2の濁度曲線より、いずれも濁度の上昇あり)、UV照射下ではそれぞれ、Ale−CT−LB(配列番号40)に由来すると思われる青の蛍光(図31 Tube No.2)、TAM−NG−LB(配列番号42)に由来すると思われる赤の蛍光(図31 Tube No.3)、FAM−ARITA2−LB(配列番号44)に由来すると思われる緑の蛍光(図31 Tube No.4)、Ale−CT−LBとTAM−NG−LBに由来すると思われる紫の蛍光(図31 Tube No.5)、Ale−CT−LBとFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる水色の蛍光(図31 Tube No.6)、TAM−NG−LBとFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる黄の蛍光(図31 Tube No.7)、Ale−CT−LBとTAM−NG−LBおよびFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる白の蛍光(図31 Tube No.8)が確認できた。
蛍光波長においては、CT、NGおよびARITA2すべて鋳型(−)(DWを添加した)の反応液では(図32 A)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と、398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光のみを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認した。
CTのみ鋳型(+)(CTプラスミドを添加した)の反応液では(図32 B)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え、443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光のみを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認した。
NGのみ鋳型(+)(NGプラスミドのみ添加した)の反応液では(図32 C)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光に加え、580nm付近にTAM−NG−LB由来すると思われる蛍光のピークを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認した。
ARITA2のみ鋳型(+)(ARITA2プラスミドのみ添加した)の反応液では(図32 D)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光のみを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
CTおよびNGともに鋳型(+)(CTプラスミドとNGプラスミドを添加した)の反応液(図32 E)では、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近にAlexa350のための励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と、580nm付近にTAM−NG−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認したが、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度20未満の)ピーク(バックグラウンド)を確認しただけであった。
CTおよびARITA2ともに鋳型(+)(CTプラスミドとARITA2プラスミドを添加した)の反応液では(図32 F)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光のみを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と、522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
NGおよびARITA2ともに鋳型(+)(NGプラスミドとARITA2プラスミドを添加した)の反応液では(図32 G)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近に励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と580nm付近にTAM−NG−LB由来すると思われる蛍光のピークを確認し、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
CT、NGおよびARITA2すべて鋳型(+)(CTプラスミドとNGプラスミドおよびARITA2プラスミドを添加した)の反応液では(図32 H)、Alexa350に対応する励起光を照射した場合、350nm付近にAlexa350のための励起光と398nm付近に水のラマン分光のピークに加え443nm付近にAle−CT−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、TAMRAに対応する励起光を照射した場合、555nm付近に励起光と、580nm付近にTAM−NG−LBに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、さらに、FAMに対応する励起光を照射した場合、495nm付近に励起光と、522nm付近にFAM−ARITA2−LBに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度80超の)ピークを確認した。
実施例7は、本願発明が、単項目、多項目によらず等温増幅反応における核酸の増幅を検出するために、蛍光検出機器による蛍光の計測が実施可能であることを示している。
Claims (12)
- 試料中に存在する1種類以上の標的核酸を検出する方法であって、以下のステップを含む核酸を検出する方法。
(1)試料に
蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと、
消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度(Tm)の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
を添加し;
(2)該試料を該蛍光標識プライマーまたはプローブの融解温度(Tm)以下で、かつ該クエンチャー標識プローブの融解温度(Tm)より高い温度で保温し、保温の間に等温条件で鎖置換反応を用いて該標的核酸の増幅を行い;
(3)該試料を該クエンチャー標識プローブの融解温度(Tm)以下の温度で保温し;
(4)標的核酸に結合した蛍光標識プライマーまたはプローブの蛍光を計測する。 - 前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、請求項1に記載の検出方法。
- 前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記蛍光標識プライマーまたはプローブを固相面に固定させて使用する、請求項1−3のいずれかに記載の検出方法。
- 2種類以上の標的核酸を検出するために、発光波長の異なる2種類以上の蛍光標識プライマーまたはプローブとそれぞれに対するクエンチャー標識プローブの組み合わせを用いる請求項1−4のいずれかに記載の方法。
- 前記ステップ(4)における蛍光の計測が目視による判定である請求項1−5のいずれかに記載の方法。
- 前記ステップ(4)における蛍光の計測が蛍光検出機器による判定である請求項1−5のいずれかに記載の方法。
- 請求項1−7のいずれかに記載の検出方法に用いるためのキットであって、1種類又は複数種類の
蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと;
それぞれの蛍光剤に対応する消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度(Tm)の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
の組み合わせを;
含む標的核酸検出用キット。 - 前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、請求項8に記載の標的核酸検出用キット。
- 前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、請求項8に記載の標的核酸検出用キット。
- さらに核酸増幅用試薬を含む請求項8−10のいずれかに記載のキット。
- 前記蛍光標識プライマーまたはプローブが固相面に固定されている請求項8−11のいずれかに記載の標的核酸検出用キット。
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