JP6659273B2 - 核酸の増幅を検出するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
したがって、本明細書に記載の別の側面は、配列番号4を含む対照核酸を検出するための、配列番号1を有するプローブの使用である。
これらの核酸は、適切な増幅および検出の標的、すなわち配列番号4の配列を有する対照核酸をさらに含む部品キットとして当業者に提供してもよい。
1種以上の液体試料に存在し得る第1の標的核酸と第2の標的核酸に対する内部制御された単離と同時増幅のための方法であって、以下の自動化された工程:
a.配列番号4の配列を含む内部対照核酸を液体試料のそれぞれに添加する工程、
b.1つ以上の槽内で、固相担体材料と1種以上の液体試料とを、標的核酸を含む核酸が1種以上の液体試料中に存在する場合、標的核酸を含む核酸と内部対照核酸とが固相担体材料上に固定されるのに十分な時間と条件で化合する工程、
c.分離ステーション内で、固相担体材料を液体試料中に存在する他の物質から単離する工程、
d.分離ステーション内で核酸を精製し、固相担体材料を洗浄緩衝液で1回以上洗浄する工程、
e.少なくとも2つの反応槽内で、精製された標的核酸と精製された内部対照核酸を、標的核酸のそれぞれに対する異なるプライマーセットおよびプローブを含む増幅試薬、ならびに内部対照核酸に対する配列番号2を有する第1のプライマーと配列番号3を有する第2のプライマーを含むプライマーセットと配列番号1を有するプローブとを含む増幅試薬と接触させる工程であって、第1の反応槽は第1の標的核酸に対するプライマーおよびプローブを含み、少なくとも第2の反応槽は第2の標的核酸に対するプライマーおよびプローブを含み、第1の標的核酸に対するプライマーおよびプローブは第2の反応槽には存在せず、第2の標的核酸に対するプライマーおよびプローブは第1の反応槽には存在しない、
f.反応槽内で、精製された標的核酸と精製された内部対照核酸を増幅試薬と共に、標的核酸の有無を示す増幅反応が起こるのに十分な時間および条件でインキュベートする工程、および、
g.標的核酸の増幅産物が発する標的核酸の濃度に比例するシグナルを検出して測定し、内部対照核酸が発するシグナルを検出し測定する工程、
を含み、ここで、d〜gの工程の増幅および検出の条件は、第1の反応槽と第2の反応槽に対して同一であり、標的核酸と内部対照核酸に対しても同一である、前記方法。
「非競合的な内部対照核酸」は、標的とは異なるプライマー結合部位を有するため、異なるプライマーに結合する。このような構成の利点としては、特に、反応混合物中の異なる核酸の一回の増幅事象が互いに独立して起こり、競合作用がないということが含まれる。したがって、分析の検出限界に関して、競合的な構成の場合に生じ得るような有害作用は発生しない。
単一の反応槽内で行う多重分析では、異なる標的核酸の数が適切な標識の数によって限定されることが従来技術の課題であった。リアルタイムPCR分析では、たとえば、蛍光色素のスペクトルの潜在的な重複が分析の性能に大きく影響する(偽陽性の結果のリスクや精度の低下など)。したがって、診断試験の所望の性能を保証するためには、各蛍光色素分子は慎重に選択され、十分にスペクトルが分離されたものでなければならない。一般的に、使用可能な異なる蛍光色素分子の数は、PCR装置の蛍光チャネルの数(1桁)に対応する。
特に、液体試料が異なる生物に由来する標的核酸を含むと考えられる場合や異なる生物自体さえも含むと考えられる場合、または異なる核酸または生物のうちのどれが前記試料中に存在し得るかが明らかでない場合、態様は、第1の標的核酸および第2の標的核酸が異なる生物に由来する、本明細書に記載の方法である。
本明細書に記載の方法のさらなる態様では、第1の標的核酸および/または第2の標的核酸はウイルス由来でない核酸である。
先に記載したように、本明細書に記載の方法は少なくとも第1の標的核酸および第2の標的核酸の増幅を定性的または定量的に制御するために有用である。
i)反応の有効性をチェックする。
ii)力価計算の基準として機能することによって阻害による影響を補正し、調製手順および増幅手順を制御し、より正確な定量を可能にする。したがって、定性試験における定性的内部対照核酸が陽性を示さなければならないのは標的に陰性を示す反応のみであるのに対し、定量試験における定量対照核酸は反応対照と反応較正という2つの機能を有するため、標的に陰性を示す反応と標的に陽性を示す反応の両方で陽性かつ有効でなければならない。
h.標的核酸の1つ以上の量を決定する工程。
本明細書に記載の内部制御された方法は、たとえば従来技術で用いられるリアルタイムPCR法に比べて操作時間が非常に短く、試験をはるかに簡単に実施できる。当該方法は、並行実験においてDNAウイルスやRNAウイルス、細菌、および/またはその他の病原体などの数種のウイルスに由来する核酸の並行増幅を可能にするため、臨床ウイルス学の分野で主な利点を提供する。当該方法は、ウイルスモニタリングを頻繁に行う必要がある移植後の患者の管理に特に有用である。そのため、当該方法はコスト効率の良い診断を促進し、抗ウイルス剤の使用やウイルスによる合併症と入院を減らすことに寄与する。このことは臨床微生物学の分野にも同様に当てはまる。一般に、所要時間が短縮され、試験の柔軟性が向上すると効率は高くなる。この結果、診断のために患者に必要な試験数が減り、可能性のある入院期間が短縮される(たとえば、診断をより早く提供できれば、抗菌治療が必要な患者はその治療をより早く受けることによってより早期に回復する)。また、患者の示す病的状態がより軽度となるため、支持治療(たとえば敗血症の診断の遅れに関連する集中治療)に関連して発生する費用がより少なくなる。陰性の結果をより早く提供することは、抗生物質の過剰処方に関して重要な意味を持つ可能性がある。たとえば、本発明の方法によって得られた試験結果によって標準のリアルタイムPCR法を用いた場合よりも早く病原体を除外することができれば、臨床医は経験から判断した抗生物質の使用を強いられずにすむ。あるいは、経験から判断した抗生物質を使用する場合、各治療の期間を短縮できる。
●ソフトウェアの複雑性が軽減される(結果としてプログラミングのミスのリスクが低減される)
●分析法の開発努力を化学と装置の制御パラメータではなく化学の最適化に集中させることができる
●常に単一の方法を用い、ハードウェアをこのプロトコルを実行するように最適に設計できるため、はるかに信頼性の高いシステムである
●上記の内部制御された方法を実施する当業者は複数の異なる分析を同方法の一部として並行して行う柔軟性を得られる
●コストを削減できる。
前記「第1の標的核酸」と「第2の標的核酸」は異なる核酸である。
本明細書中、「溶出緩衝液」は、固相担体から核酸を分離するのに適した液体である。このような液体は、蒸留水;またはTris HClなどのTris緩衝液やHEPESなどの塩類水溶液;または当業者に公知の他の適切な緩衝液であってもよい。この溶出緩衝液のpH値は一部の態様ではアルカリ性または中性である。当該溶出緩衝液は、EDTAのようなキレート剤など、単離された核酸を分解酵素の不活化によって安定させる成分をさらに含んでもよい。
‐融解温度が55℃〜90℃であることが好ましく、65℃〜85℃であることがより好ましく、70℃〜80℃であることがさらに好ましく、約75℃であることが最も好ましい。
‐長さが500塩基または塩基対までであることが好ましく、50〜300塩基または塩基対であることがより好ましく、100〜200塩基または塩基対であることがさらに好ましく、約180塩基または塩基対であることが最も好ましい。
‐GC含量が30%〜70%であることが好ましく、40%〜60%であることがより好ましく、約50%であることが最も好ましい。
一方、臨床的診断に重要な多くの核酸は、ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodeficiency Virus(HIV))、C型肝炎ウイルス(Hepatitis C Virus(HCV))、西ナイルウイルス(West Nile Virus(WNV))、ヒトパピローマウイルス(Human Papilloma Virus(HPV))、日本脳炎ウイルス(Japanese Encephalitis Virus(JEV))、セントルイス脳炎ウイルス(St. Louis Encephalitis Virus(SLEV))といったRNAウイルス由来の核酸などのリボ核酸である。本明細書に記載の方法は、このような核酸に容易に適用できる。この場合、標的核酸の特性を反映させるため、RNAからなる内部対照核酸を使用することが有利となり得る。内部対照核酸は、理想的には複数の標的が関与する分析の最も感度の高い標的に類似しているべきであり、通常はRNA標的をより厳密に制御しなければならないことから、RNAとDNAの両方を上記の方法で分析する場合、内部対照核酸はRNAであることが有利となり得る。
RNAはアルカリ性pH、リボヌクレアーゼなどの影響によりDNAよりも分解され易いため、RNAで作製した内部対照核酸は外装された(armored)粒子として提供されることが好ましい。特にアーマードRNAなどの外装粒子が欧州特許出願公開第910643号に記載されている。簡潔にいえば、化学生成が可能なRNA、または好ましくは大腸菌などの細菌によって異種生成が可能なRNAの少なくとも一部をウイルスコートタンパク質で被包したものである。後者の場合、外部からの影響(特にリボヌクレアーゼ)に対するRNAの抵抗性が付与される。内部対照DNAをファージパッケージングによって保護された粒子として提供することもできることを理解しなければならない。本明細書の記載に関しては、被包されたRNAおよびDNAはいずれも内部対照核酸として有用である。一部の態様では、RNA対照核酸は大腸菌のMS2コートタンパク質で外装されている。さらなる態様では、DNA対照核酸はλファージGT11を用いて外装されている。
したがって、本明細書に記載の方法の一部の態様では、増幅試薬は逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含み、当該方法は工程eと工程fとの間に、「反応槽内で、精製された核酸を該1種以上の増幅試薬と共に、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適切な時間および条件でインキュベートする工程」をさらに含む。
a)CS5 DNAポリメラーゼ;
b)CS6 DNAポリメラーゼ;
c)テルモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)DNAポリメラーゼ;
d)テルムス・アクウァーティクス(Thermus aquaticus)DNAポリメラーゼ;
e)テルムス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)DNAポリメラーゼ;
f)テルムス・フラーブス(Thermus flavus)DNAポリメラーゼ;
g)テルムス・フィリホルミス(Thermus filiformis)DNAポリメラーゼ;
h)テルムス種sps17 DNAポリメラーゼ;
i)テルムス種Z05 DNAポリメラーゼ;
j)テルモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)DNAポリメラーゼ;
k)テルモシフォ・アフリカヌス(Termosipho africanus)DNAポリメラーゼ;および
l)テルムス・カルドフィルス(Thermus caldophilus)DNAポリメラーゼからなる群から選択される。
したがって、一部の態様では、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、それぞれの野生型ポリメラーゼと比べて改善した核酸伸長速度および/または改善した逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである。
本発明に関して特に有用となる点変異を有するポリメラーゼは、国際公開第2008/046612号に開示されている。特に、一部の態様では、本発明に関して使用される好ましいポリメラーゼは、ポリメラーゼドメイン内に少なくとも以下のモチーフを含む変異DNAポリメラーゼである:
T‐G‐R‐L‐S‐S‐Xb7‐Xb8‐P‐N‐L‐Q‐N(配列番号15):(式中、Xb7は、SまたはTから選択されるアミノ酸であり、Xb8は、G、T、R、K、およびLから選択されるアミノ酸であり、ポリメラーゼは、3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有し、野生型DNAポリメラーゼに比べて核酸伸長速度および/または逆転写効率が改善しており、野生型DNAポリメラーゼのXb8は、D、E、またはNから選択されるアミノ酸である)。
したがって、一部の態様では、第1および第2の標的核酸はRNAおよびDNAを含む。
増幅反応をリアルタイムでモニタリングすること、すなわち標的核酸および対照核酸の増幅中に増幅された標的核酸および増幅された対照核酸を検出することが有利となり得る。
上記の方法は、供与体の蛍光部分と受容体の蛍光部分との間の蛍光共鳴エネルギー転移(Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET))に基づくことが好ましい。代表的な供与体蛍光部分はフルオレセインであり、対応する代表的な受容体蛍光部分としては、LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5およびCy5.5が挙げられる。一般的に、検出には、供与体蛍光部分により吸収される波長で試料を励起することと、対応する受容体蛍光部分により放出される波長を可視化および/または測定することが含まれる。本発明の方法では、検出後にFRETの定量を行うことが好ましい。検出を各サイクル工程後に実施することが好ましく、リアルタイムで行うことが最も好ましい。市販のリアルタイムPCR装置(たとえば、LightCycler(商標)またはTaqMan(登録商標))を使用することにより、PCR増幅と増幅産物の検出を単一の密閉キュベット内で同時に行うことができ、サイクル時間が劇的に短縮される。検出が増幅と同時に起こるために、リアルタイムPCR法では、増幅産物を操作する必要がなく、増幅産物間の相互汚染のリスクが低減される。リアルタイムPCRによって所要時間が大幅に短縮され、リアルタイムPCRは従来のPCR技術に代わる、臨床検査室では魅力的な方法である。
FRETの代替法として、蛍光DNA結合色素(たとえばSYBRGREEN I(登録商標)またはSYBRGOLD(登録商標)(Molecular Probes))などの二本鎖DNA結合色素を使用して増幅産物を検出してもよい。このような蛍光DNA結合色素は、二本鎖核酸と相互作用させた後に適切な波長の光で励起すると、蛍光シグナルを発光する。核酸インターカレート色素などの二本鎖DNA結合色素を使用することもできる。二本鎖DNA結合色素を使用する場合、通常、増幅産物の存在を確認するために融解曲線分析を行う。
したがって、一部の態様では、前記供与体蛍光部分と受容体蛍光部分は、プローブ上で互いから5ヌクレオチド以内の位置に存在する。
さらなる態様では、前記受容体蛍光部分はクエンチャーである。
T’=10(a(CTQS‐CT標的)2+b(CTQS‐CT標的)+c)
のような多項式による較正の公式を用いて力価Tを計算することができる。
さらに、一部の態様では、内部対照核酸は「定性的内部対照核酸」として機能し得る。「定性的内部対照核酸」は、定性検出分析の試験結果の有効性を確認するのに特に有用である。陰性結果の場合であっても、定性的内部対照が検出されなければならず、そうでなければ試験自体が無効と見なされる。しかし、定性的な構成では、陽性の結果の場合には必ずしも定性的対照が検出される必要はない。結果的に、定性的対照の濃度は比較的低くなければならない。定性的対照は、それぞれの分析やその感度に慎重に適合させなければならない。一部の態様では、定性的内部対照核酸の濃度範囲は、1回の反応につき1コピーから、1回の反応につき1000コピーまでの範囲を含む。それぞれの分析の検出限界(LOD)に関連して、定性的対照核酸の濃度は、一部の態様では分析のLOD〜LODの25倍の値、さらなる態様ではLOD〜10xLODである。さらに別の態様では、前記濃度は2x〜10xLODである。別の態様では、前記濃度は、5x〜10xLODである。一部の態様では、前記濃度は5xまたは10xLODである。
以下の試料を調製した後、分析した。
以下の表に示す装置を、それぞれの製造業者の指示書に従って使用した。
各対照核酸を以下の緩衝液中で保存した:
MMx R2‐基準/配列番号6について:
表1:熱サイクルのプロファイル
分析サイクラーの生データファイル(xmlファイル)を、PARTSソフトウェアを用いて分析した。最新のcobas(登録商標)6800/8800のHCV分析テンプレートを用いてデータ計算し、チャネル4/JA270(HCVシグナル)とチャネル5/Cy5.5(定量対照シグナル)の3種類のマスターミックスについての陽性/陰性も照会した。HCV標的と定量的対照については、最新のcobas(登録商標)6800/8800のHCV分析テンプレートを用いて、ヒット率、CT値、RFI値、F値を計算した。
3種類のマスターミックスのヒット率、CT値、RFI値、F値を表4および表5に示す。使用した分析テンプレートは、オリゴヌクレオチドの各セットに最適化したものではない。
3種類の内部対照オリゴヌクレオチドのセットを両側検定(side-by-side study)すると、ヒット率に有意差が示されなかった。MMx R2‐配列番号1(オリゴヌクレオチドセット3)については、より低いベースラインとRFI値が向上する傾向が同時に見られた。このことによって、配列番号4を含む対照核酸の検出の改善が可能になる。配列番号5の代わりに配列番号1を有するプローブを用いることより、配列番号4を含む内部対照核酸を用いた分析の信用性と頑健性がこのように向上する。
Claims (12)
- 配列番号1で示された核酸配列からなる単離されたオリゴヌクレオチド。
- 配列番号1で示された核酸配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号2で示された核酸配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号3で示された核酸配列からなるオリゴヌクレオチドの三種のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
- 複数の標的核酸の検出を制御するためのキットであって、配列番号1で示された核酸配列からなる検出プローブと、配列番号2で示された核酸配列からなる増幅プライマーと配列番号3で示された核酸配列からなる増幅プライマーの組み合わせと、配列番号4で示された核酸配列を含む対照核酸とを含む、前記キット。
- 配列番号4で示された核酸配列を含む対照核酸の検出のための、配列番号1で示された核酸配列からなるプローブの使用。
- 1種以上の液体試料に存在し得る第1の標的核酸と第2の標的核酸に対する内部制御された単離と同時増幅のための方法であって、下記の自動化された工程:
a.配列番号4で示された核酸配列を含む内部対照核酸を液体試料のそれぞれに添加する工程、
b.1つ以上の槽内で、固相担体材料と1種以上の液体試料とを、標的核酸を含む核酸が1種以上の液体試料中に存在する場合、標的核酸を含む核酸と内部対照核酸とが固相担体材料上に固定されるのに十分な時間と条件で化合する工程、
c.分離ステーション内で、固相担体材料を液体試料中に存在する他の物質から単離する工程、
d.分離ステーション内で核酸を精製し、固相担体材料を洗浄緩衝液で1回以上洗浄する工程、
e.少なくとも2つの反応槽内で、精製された標的核酸と精製された内部対照核酸を、標的核酸のそれぞれに対する異なるプライマーセットおよびプローブを含む増幅試薬、ならびに内部対照核酸に対する配列番号2で示された核酸配列からなる第1のプライマーと配列番号3で示された核酸配列からなる第2のプライマーを含むプライマーセットと配列番号1で示された核酸配列からなるプローブとを含む増幅試薬と接触させる工程であって、第1の反応槽は第1の標的核酸に対するプライマーおよびプローブを含み、少なくとも第2の反応槽は第2の標的核酸に対するプライマーおよびプローブを含み、第1の標的核酸に対するプライマーおよびプローブは第2の反応槽には存在せず、第2の標的核酸に対するプライマーおよびプローブは第1の反応槽には存在しない、
f.反応槽内で、精製された標的核酸と精製された内部対照核酸を増幅試薬と共に、標的核酸の有無を示す増幅反応が起こるのに十分な時間および条件でインキュベートする工程、および、
g.標的核酸の増幅産物が発する標的核酸の濃度に比例するシグナルを検出して測定し、内部対照核酸が発するシグナルを検出し測定する工程、
を含み、
d〜gの工程の増幅および検出の条件は、第1の反応槽と第2の反応槽に対して同一であり、標的核酸と内部対照核酸に対しても同一である、前記方法。 - 増幅試薬が逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含み;工程eと工程fとの間に、反応槽内で、精製された核酸を1種以上の増幅試薬と共に、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適切な時間および条件でインキュベートする工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 内部対照核酸がRNAまたはDNAである、請求項5または6に記載の方法。
- 内部対照核酸がアーマードRNAまたはファージパッケージドDNAである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 内部対照核酸の融解温度が50℃〜90℃である、請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 内部対照核酸が500塩基までの長さを有する、請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 内部対照核酸の配列が30%〜70%のGC含量を有する、請求項5〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 2種以上の内部対照核酸が工程aにおいて添加されるが、内部対照核酸のうち一つのみが工程fにおいて増幅される、請求項5〜11のいずれか一項に記載の方法。
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