CN105385684B

CN105385684B - 用于为核酸扩增作对照的寡核苷酸

Info

Publication number: CN105385684B
Application number: CN201510542064.9A
Authority: CN
Inventors: E.H.菲斯; N.牛顿
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2018-03-16
Anticipated expiration: 2035-08-28
Also published as: EP2990491A1; JP2016049106A; EP2990491B1; US10059993B2; CN105385684A; JP6659273B2; CA2901832C; CA2901832A1; US20180327840A1; US10358675B2; US20160060694A1; ES2644949T3

Abstract

提供了用于定性和/或定量目的检测内部对照核酸的方法和寡核苷酸。

Description

用于为核酸扩增作对照的寡核苷酸

发明领域

本发明属于体外诊断学的领域。在此领域内，它特别关注用于定性和/或定量目的扩增和检测对照核酸。

背景技术

在分子诊断学领域中，从许多来源中扩增核酸已经具有相当大的意义。用于核酸扩增和检测的诊断应用的例子是病毒(如人类乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗河病毒(WNV))的检测，或针对人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)存在的献血常规筛查。此外，所述扩增技术适用于细菌目标(如分枝杆菌(mycobacteria))，或肿瘤学标志物的分析。

最突出和广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增反应特别包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、缺口-LCR，修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)以及Qβ-扩增。

用于基于PCR的分析的自动化系统经常利用在PCR过程期间在同一反应容器中的产物扩增的实时检测。这种方法的关键在于使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。

已经表明在同一容器中扩增和检测超过一种目标核酸是可能的。此方法通常称作“多重(multiplex)”扩增，并且如果进行实时检测，那么需要用于区分的不同标记物。

出于定性(性能(performance)对照)和/或定量(使用对照作为参考确定目标核酸的量)的目的，使用具有已知序列的对照核酸来为相应的扩增作对照在临床核酸诊断学领域中通常是期望的或者甚至是强制性的。考虑到特别是诊断目标(包括原核、真核以及病毒核酸)的多样性，以及考虑到不同类型核酸(如RNA和DNA)之间的多样性，通常以特定方式设计对照核酸。

EP 2759604公开了一种用于检测一组非竞争性内部对照核酸(non-competitiveinternal control nucleic acid)的方法。

本文中所描述的是用于此目的的经改善的寡核苷酸和方法。

发明内容

本文中所描述的第一方面是具有SEQ ID NO 1的序列的分离的寡核苷酸(anisolated oligonucleotide with the sequence of SEQ ID NO 1)。此寡核苷酸可以作为探针使用以实现对包括SEQ ID NO 4的序列的对照核酸的改善的检测。

因此，本文中描述的另一方面是具有SEQ ID NO 1的探针用于检测包括SEQ ID NO4的对照核酸的用途。

SEQ ID NO 4的序列是一种杂混序列(scrambled sequence)，其不与任何天然存在的序列显示任何显著的同源性，使得它可以充当非竞争性内部对照核酸序列以定性和/或定量检测多个目标核酸，如EP 2759604中所述的。

在核酸扩增测定法(例如PCR测定法，如实时PCR测定法)中，可以用包括具有SEQID NO 2的第一引物和具有SEQ ID NO 3的第二引物的特异性引物组有效扩增SEQ ID NO4。

因此，本文中所描述的一个方面是包括具有SEQ ID NO 1、2和3的寡核苷酸的组合物。

这些核酸可以以套组(kit-of-parts)提供给技术人员，所述套组还包括适当的扩增和检测目标，即具有SEQ ID NO 4的序列的对照核酸。

因此，本文中所描述的另一方面是用于为多个目标核酸的检测作对照的试剂盒(kit)，所述试剂盒包括具有SEQ ID NO 1的检测探针，具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO 3的扩增引物对，以及包括SEQ ID NO 4的对照核酸。

如本文中所描述的，使用包括SEQ ID NO 4的序列的对照核酸和通过具有SEQ IDNO 1的探针的改善检测，有助于开发对多个参数和/或核酸类型进行，而对所述不同参数和/或核酸类型使用相同内部对照核酸序列(internal control nucleic acid sequence)的改善的同时测定法。因此，它有助于在各种水平上减少对应实验的整体复杂度：例如，仅必须设计一个内部对照核酸序列，并将其加入到相应的扩增混合物，从而节省用于设计和合成或购买多个对照核酸序列的时间和成本。可以简化(streamline)一个或多个测定法，并且降低处理错误的风险。此外，可以在相同条件下同时进行的一个测定法或并行测定法中采用的对照核酸序列越不同，作为结果而调整相应条件可能越复杂(the more complexit may result to adjust the respective conditions)。此外，使用适合于多个核酸的单个对照，所述对照可以从单个来源分配到含有所述不同目标核酸的不同容器中。在一些实施方案中，所述单个对照核酸序列也可以充当定性对照和充当定量对照。

如本文中的实施例所示，通过使用具有SEQ ID NO 1序列的探针对包括SEQ ID NO4的对照核酸的检测改善，提高了根据EP 2759604中描述的方法实施测量的可靠性。具有SEQ ID NO 1序列的探针不与EP 2759604中公开的任何寡核苷酸序列重叠，特别是不与具有SEQ ID NO 5序列的探针(在EP2759604中公开为SEQ ID NO 52)重叠，在当前实施例中，已针对所述具有SEQ ID NO 5序列的探针测试了SEQ ID NO 1。

使用包括SEQ ID NO 4的序列的对照核酸和通过具有SEQ ID NO 1的探针改善检测的方法可以如下有利地应用(A process in which the use of a control nucleicacid comprising the sequence of SEQ ID NO 4with the improved detection by aprobe with SEQ ID NO 1can be advantageously applied is the following)：

一种用于在有内部对照的情况下分离并同时扩增第一和第二目标核酸的方法，所述第一和第二核酸可以存在于一个或多个流体样品中(A process for internallycontrolled isolating and simultaneously amplifying a first and a secondtarget nucleic acid that may be present in one or more fluid samples)，所述方法包括下列自动化步骤：

a.将包括SEQ ID NO 4序列的内部对照核酸加入到每个所述流体样品(each ofsaid fluid samples)，

b.在一定的条件下在一个或多个容器中将固体支持材料和所述一个或多个流体样品组合在一起达一定的时间段，所述条件和时间段足以允许包括在存在于所述一个或多个流体样品上的情况下的所述目标核酸和所述内部对照核酸的核酸在所述固体支持材料上固定化(combining together a solid support material and said one or morefluid samples in one or more vessels for a period of time and underconditions sufficient to permit nucleic acids comprising the target nucleicacids,if present on said one or more fluid samples,and the internal controlnucleic acid to be immobilized on the solid support material)；

c.在分离站(separation station)中将固体支持材料与存在于流体样品中的其它材料分离，

d.在所述分离站中纯化核酸，并且使用清洗缓冲剂清洗固体支持材料一次或多次，

e.在至少两个反应容器中使纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸接触扩增试剂，所述扩增试剂包括针对每个所述目标核酸的不同引物组和探针以及针对所述内部对照核酸的包括具有SEQ ID NO 2的第一引物和具有SEQ ID NO 3的第二引物的引物组和具有SEQ ID NO 1的探针，其中第一反应容器包括针对所述第一目标核酸的引物和探针，并且至少第二反应容器包括针对所述第二目标核酸的引物和探针，并且其中所述针对第一目标核酸的引物和探针不存在于(absent from)所述第二反应容器，并且所述针对第二目标核酸的引物和探针不存在于所述第一反应容器，

f.在一定的条件下在所述反应容器中将所述纯化的目标核酸和所述纯化的内部对照核酸与所述扩增试剂孵育一定的时间段，所述条件和时间段足以发生指示所述目标核酸的存在或缺乏的扩增反应，

g.检测并测量由所述目标核酸的扩增产物生成的并且与所述目标核酸的浓度成比例的信号，并且检测并测量由所述内部对照核酸生成的信号，

其中对于所述第一和第二反应容器以及如此对于所述目标核酸和所述内部对照核酸，在步骤d.到g.中用于扩增和检测的条件是相同的。

作为本文所描述的方法的优点之一，在可能的后续实验中对具体的生物样品检测其它核酸无需涉及另一个样品制备规程及加入不同内部对照核酸(the testing of aparticular biological sample for other nucleic acids in possible subsequentexperiments need not involve another sample preparation procedure with theaddition of a different internal control nucleic acid)，因为包括SEQ ID NO 4的对照可以用于为不同核酸扩增作对照。因此，一旦已经加入内部对照核酸，就可以在相同条件下在相同样品中测试其他参数。

上文描述的内部对照核酸是非竞争性的。

“非竞争性内部对照核”酸与目标具有不同的引物结合位点，从而结合不同引物。这种设置的优点特别包括如下的实情：在反应混合物中的不同核酸的单个扩增事件可以彼此独立地发生而无任何竞争效果。因此，关于测定法的检测限没有发生不利效果，在竞争设置中情况就可以如此。

本文描述的方法涉及针对每个所述目标核酸和针对所述内部对照核酸的不同引物组的事实使所述方法相当灵活。在该非竞争性设置中，不必要如在竞争性设置的情况下一样将目标特异性结合位点引入到对照核酸中，并且避免了竞争性设置的缺点，如对扩增试剂的竞争。在非竞争性设置中，内部对照核酸与任何目标序列具有不同的序列，以便不竞争它们的引物和/或探针。内部对照核酸的序列与流体样品中的其他核酸序列不同。作为示例，如果流体样品衍生于人类，那么内部对照核酸没有也在人类中内源性地发生的序列。因此，序列中的差异至少足够显著，从而在严格条件下不允许引物和/或探针与相应的一种或多种内源性核酸(respective endogenous nucleic acid or acids)结合，如此不使设置成为竞争性的。SEQ ID NO 4是一种最初基于天然存在的基因组的杂混序列。如在本领域中已知，“杂混”是指将一些碱基突变引入到序列中。在SEQ ID NO 4的情况下，在本发明中使用的内部对照核酸的序列相对于衍生其的天然存在基因是实质性改变的。

包括如本文描述的自动化步骤的方法还显示各种另外的优点：

在现有技术中已经作为一项挑战的是，在单个反应容器中进行的多重测定法(multiplex assay)中的不同目标核酸的数量限于适当标记物的数量。在实时PCR测定法中，例如，荧光染料光谱的潜在重叠对测定法性能具有很大的影响(假阳性结果的风险，较低精度等)。因此，为了保证诊断测试的期望性能，相应的荧光团必须经过仔细选择并且是光谱上完全分开的。通常，不同的可用荧光团的数量对应于PCR仪荧光通道的单数位数量(single-digit number)。

相反，在本文中所描述的方法中，至少第一和第二目标核酸在有内部对照的情况下的扩增(the internally controlled amplification of at least a first and asecond target nucleic acid)发生在至少两个不同反应容器中，允许更高数量的不同目标核酸的同时扩增，因为可以彼此独立地检测不同反应容器中的信号。尽管如此，在本文中包括如下的实施方案，其中在多个反应容器中的一个或多个中进行多重反应，从而倍增(multiplying)可以同时且在相同条件下扩增的目标的数量。在此类实施方案中，内部对照核酸充当一个容器中的不同目标核酸以及不同容器中的不同目标核酸的对照。

因此，在本文中描述的方法的一些实施方案中，在相同反应容器中扩增至少两个目标核酸。

特别是如果怀疑流体样品含有来自不同生物体的目标核酸，或者甚至是不同生物体本身，或者如果不清楚在所述样品中可能存在哪些不同核酸或生物体，一个实施方案是本文中所描述的方法，其中所述第一目标核酸和第二目标核酸来自不同生物体。

在本文中描述的方法的一个实施方案中，第一和/或第二目标核酸是病毒核酸。

在本文中描述的方法的另一个实施方案中，第一和/或第二目标核酸是非病毒核酸。

在本文中描述的方法的又一个实施方案中，第一和/或第二目标核酸是细菌核酸。

如前文描述的，本文中描述的方法可用于为至少第一和第二目标核酸的扩增作定性或定量对照(the process described herein is useful for qualitatively orquantitatively controlling the amplification of at least a first and a secondtarget nucleic acid)。

在生物样品中对核酸的定性检测例如对于识别个体的感染是至关重要的。因此，用于检测微生物感染的测定法的一个重要要求是避免假阴性或假阳性结果，因为此类结果就相应患者的治疗而言几乎会不可避免地导致严重后果。因此，特别是在基于PCR的方法中，将定性内部对照核酸加到检测混合物。所述对照对于确认测试结果的有效性(validity)是特别重要的：至少在关于相应的目标核酸的阴性结果的情况下，在给定设置内定性内部对照反应必须表现为反应的，即必须检测到定性内部对照，否则测试本身被认为是不起作用的(inoperative)。然而，在定性设置中，在阳性结果的情况下不一定必须检测到所述定性内部对照。对于定性测试，保证并且严格控制反应的灵敏度是特别重要的。作为结果，定性内部对照的浓度必须相对较低，使得即使在轻微抑制的情况下检测不到定性内部并且因此该测试是无效的(invalidated)。

因此，在本文中所描述的方法的一些实施方案中，所述内部对照核酸的扩增产物的存在指示在反应混合物中发生扩增，即使是在缺乏一个或多个所述目标核酸的扩增产物的情况中。

另一方面，除了仅检测样品中的目标核酸的存在或缺乏之外，测定所述核酸的量经常是重要的。作为示例，可以基于病毒载量对病毒性疾病的阶段和严重性进行评估。此外，任何治疗的监测需要关于存在于个体中的病原体的数量的信息，以便评价所述治疗的成功。对于定量测定法，有必要引入定量标准核酸，其充当用于测定目标核酸的绝对量的参考(reference)。可以通过参考外部校准或通过实现内部定量标准品来完成定量。

在外部校准的情况下，在分开的反应中使用已知量的相同或相当的核酸来建立标准曲线。随后通过比较用所分析的样品获得的结果与所述标准函数来确定目标核酸的绝对量。然而，外部校准具有的缺点在于：在对照中没有反映可能的提取规程(procedure)、其变化的效力以及抑制扩增和/或检测反应的试剂的可能的并且经常不可预测的存在。

该情况适用于任何与样品有关的效果。因此，情况可能是，样品由于不成功的提取规程或其他基于样品的因素而被判断为阴性，而待检测和量化的目标核酸实际上存在于样品。

出于这些和其他原因，对测试反应本身加入的内部对照核酸是有利的。当充当定量标准品时，所述内部对照核酸在定量测试中具有至少下列两个功能：

i)其监测反应的有效性。

ii)在滴度计算中其充当参考，从而补偿抑制的效果，并为制备和扩增方法作对照，以允许更准确的定量。因此，相对于定性测试中仅在目标阴性反应中必须为阳性的定性内部对照核酸，定量测试中的定量对照核酸具有两个功能：反应对照和反应校准。因此，它必须在在目标阴性和目标阳性反应中都是阳性和有效的。

它还必须适合于为高核酸浓度的计算提供可靠的参考值。因此，内部定量对照核酸的浓度需要是相对较高的。

因此，在一些实施方案中，在本文中描述的方法还包括下列步骤：

h.测定一个或多个所述目标核酸的量。

相比于例如现有技术中使用的实时PCR方法，本文中所描述的有内部对照的方法需要少得相当多的操作时间(hands-on time)，并且进行的测试简单得多。该方法在临床病毒学领域中提供主要的优点，因为其允许在平行实验中对来自几种病毒(如DNA和RNA病毒)、细菌和/或在其他病原体的核酸的平行扩增。所述方法在需要频繁的病毒监测的移植后的患者的管理中特别有用。因此所述方法促进节约成本的诊断，并且有助于减少抗病毒剂的使用和病毒并发症和住院治疗(hospitalizations)。这同样适用于临床微生物领域。通常，在更快的周转时间(turnaround time)和改善的测试灵活性中将获得效率。因此，这导致为了做出诊断对患者需要进行的测试的数量减少，以及潜在的更短的住院时间(hospital stays)(例如，如果可以更快地提供诊断，那么需要抗微生物治疗的患者将更快地接收它，并且因此更早地恢复)。此外，患者表现出较少的发病率并且因此引起更少的与支持治疗(supportive therapy)(例如，与败血症诊断延迟有关的重症监护(intensivecare))有关的费用。更快地提供阴性结果对于抗生素开药过量可以具有重要的影响。例如，如果与标准实时PCR方法相比，根据本发明的方法获得的测试结果能够更快地排除病原体，那么临床医生将不会被迫使用经验性抗生素(empirical antibiotics)。或者，如果使用经验性抗生素，那么可以缩短相应的治疗的持续时间。

关于基于本文中描述的方法设计特定测试，熟练技术人员将受益于下列优点：

·软件复杂度的降低(导致编程错误的风险降低)

·将测定法开发努力聚焦于化学优化，而不是化学及仪器控制参数(chemistryplus the instrument control parameter)

·可靠得多的系统，因为总是使用单个方法并且硬件可以最佳设计以执行该方案

·向进行上述有内部对照的方法的熟练技术人员提供灵活性，来平行运行多个不同测定作为相同方法的一部分

·成本降低

在本文中所描述的语境中，如在本文中使用的，术语“固体支持物”涉及分析物能够通过吸附直接且非特异性结合，或间接且特异性结合的任何类型的固体支持物。间接结合可以通过结合与感兴趣的核酸的目标序列同源的捕获核酸探针进行。因此，使用附着于固体支持物的捕获探针，可以将目标核酸与非目标材料或非目标核酸分离。这种捕获探针固定化在固体支持物上。此类固体支持物材料可以是聚合物、或聚合物的组合物。其他类型的固体支持材料包括磁性硅土颗粒(magnetic silica particles)、金属颗粒、磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维滤器、滤纸等，但固体支持材料不限于这些材料。

如在本文中使用的，“固定化(Immobilize)”是指以可逆或不可逆的方式捕获对象例如核酸。具体地，“在固体支持物材料上固定化”是指一个或多个对象出于将它们从任何周围介质分离的目的与固体支持物材料相结合，并且可以例如通过在稍后的时间点与固体支持物材料分离来回收。在该语境中，“固定化”可以包括将核酸吸附到如上文所述的玻璃或固体材料的其它适当表面。此外，核酸可以通过结合到捕获探针而被特异性地固定化，其中通过碱基配对将核酸结合到附着于固体支持物的基本上互补的核酸。在后一情况下，这种特异性的固定化导致目标核酸的主要结合。

如本文中所使用的，核酸的“纯化”、“分离”或“提取”涉及下列内容：在可以在诊断测定中通过扩增分析核酸之前，它们通常必须从含有不同组分的复杂混合物的生物样品中纯化、分离或提取。对于第一个步骤，可以使用允许核酸的富集的方法。在包括目标核酸的核酸从它们的天然环境中纯化或分离之后，可以通过本文中所描述的同时扩增和检测进行分析。

如本文中所使用的，“同时”是指在相同时间并且在相同物理条件下进行两个动作，例如扩增第一和第二或更多核酸。在一个实施方案中，在一个容器中进行至少第一和第二目标核酸的同时扩增。在另一个实施方案中，在相同时间并且在相同物理条件下(特别就温度和孵育时间而言)用一个容器中的至少一个核酸和第二容器中的至少第二核酸进行同时扩增，其中上述内部对照核酸存在于每个所述容器中。

“目标核酸”在本文中用于表示应被分析的样品中的核酸，即应确定其在样品中的存在、不存在和/或量。

“第一目标核酸”和“第二目标核酸”是不同的核酸。

术语“流体样品(fluid sample)”是指可潜在地包含感兴趣的分析物的材料。样品可以源自任何来源，特别是任何生物来源，例如生理流体，包括血液、唾液、眼晶状体液(ocular lens fluid)、脑脊液、汗液、尿液、粪便(stool)、精液、乳液(milk)、腹水、粘液、关节液、腹膜液、羊水、组织或培养的细胞等。经受本文中所描述的方法的流体样品可以在使用之前进行预处理，例如从血液制备血浆、稀释粘性液体、裂解等。处理方法可以涉及过滤、蒸馏、浓缩、干扰性组分的灭活(inactivation)和试剂的加入等。流体样品可以在从来源获得时直接使用，或者在预处理以改变样品的特性之后使用。在一些实施方案中，初始固体或半固体材料通过使用适当液体介质将其溶解或悬浮而呈现液态。怀疑流体样品含有某种目标核酸。

术语“反应容器”包括但不限于管或板的孔，例如微孔、深孔或其它类型的多孔板，其中发生用于液体样品分析的反应，诸如例如逆转录或聚合酶链式反应。这种容器的外部界限或壁是化学惰性的，使得它们不干扰内部发生的分析反应。优选地，如上所述的核酸的分离也在多孔板中进行。

在该语境中，分析系统中的多孔板允许多个样品的平行分离和分析或存储。可以对多孔板优化最大液体吸收(maximal liquid uptake)，或最大热传递。针对在自动化分析器中孵育或分离分析物优化在本发明的语境中使用的优选的多孔板。优选地，所述多孔板构造并排列为接触磁性装置和/或加热装置。

“分离站”是允许将固体支持物材料与存在于流体样品中的其他材料分离的分析系统的装置或组件。此类分离站可以例如包括但不限于离心机、具有过滤管的支架，磁体或其他适当组件。在本发明的一个优选实施方案中，所述分离站包括一个或多个磁体。优选地，一个或多个磁体用于分离作为固体支持物的磁性颗粒，优选磁性玻璃颗粒。如果例如流体样品与固体支持物材料在多孔板的孔中组合在一起，那么由分离站包括的一个或多个磁体可以例如通过将磁铁引入孔中而与流体样品本身接触，或者可以使得所述一个或多个磁体接近孔的外壁，来吸引磁性颗粒并且随后将它们从周围的液体中分离。

“清洗缓冲剂”是设计为特别是在纯化规程中去除不想要的组分的流体。此类缓冲剂在现有技术中是公知的。在核酸的纯化的语境中，清洗缓冲剂适用于清洗固体支持物材料，以便将固定化的核酸与任何不想要的组分分离。清洗缓冲剂可以例如在具有酸性pH且没有乙醇和/或离液剂的一个或多个缓冲溶液中含有乙醇和/或离液剂(The wash buffermay,for example,contain ethanol and/or chaotropic agents in a bufferedsolution or solutions with an acidic pH without ethanol and/or chaotropicagents)。通常，清洗溶液或其他溶液作为储液(stock solution)提供，所述储液使用之前必须稀释。

对于分离的核酸的下游加工(downstream processing)，在将它们进行扩增之前将它们与固体支持物材料分离可以是有利的。

如本文中所使用的，“洗脱缓冲剂”是适合于将核酸从固体支持物分离的流体。此类流体可以是蒸馏水或盐水溶液(aqueous salt solution)，例如Tris缓冲剂，如TrisHCl、或HEPES、或熟练技术人员已知的其他适当缓冲剂。在一些实施方案中，此类洗脱缓冲剂的pH值是碱性或中性的。所述洗脱缓冲剂可以包含通过使降解酶失活来使分离的核酸稳定的另外的组分，如螯合剂，如EDTA。

在本发明的语境中，“扩增试剂”是使核酸能够扩增的化学或生物化学组分。此类试剂包括但不限于核酸聚合酶、缓冲剂、单核苷酸(如三磷酸核苷)、寡核苷酸(例如寡核苷酸引物)、盐及它们相应的溶液、检测探针和染料等。

“寡核苷酸”和“经修饰的寡核苷酸”是从作为它们的单体单元的多个核苷酸形成的组分。磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA骨架的正常连接或主链是3’至5’磷酸二酯连接。用于制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的，并且包括例如合适序列的克隆和限制以及直接化学合成。在上述方法中，寡核苷酸可以是经化学修饰的，即引物和/或探针包括经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。那么，探针或引物是经修饰的寡核苷酸。

术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知的那样使用，并且是指寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，而且还指经修饰的寡核苷酸，其能够启动通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA合成，即引物的3’-末端提供游离的3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶对其附着进一步的核苷酸，从而建立3’-至5’-磷酸二酯连接，其中使用脱氧核苷三磷酸，且其中释放焦磷酸盐。

“探针”也表示天然或经修饰的寡核苷酸。如本领域中已知，探针服务检测分析物或扩增产物(amplificate)的目的。在上述方法的情况下，探针可以用于检测目标核酸的扩增产物。为此目的，探针通常携带标记物(label)。

“标记物”，经常称为“报告基团”，通常是使与其结合的一种核酸，特别是寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸，以及任何核酸与样品的剩余部分可区分的基团(已经附着标记物的核酸也可以被称为经标记的核酸结合化合物、经标记的探针或仅探针)。一些实施方案中，标记物是荧光标记物，其可以是荧光染料，例如荧光素染料、若丹明染料(rhodamine dye)、花青染料(cyanine dye)和香豆素染料(coumarin dye)。有用的荧光染料包括FAM、HEX、JA270、CAL635、Coumarin343、Quasar705、Cyan500、CY5.5、LC-Red 640，LC-Red705。

任何引物和/或探针可以是经化学修饰的，即引物和/或探针包括经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。那么，探针或引物是经修饰的寡核苷酸。

核酸扩增的方法是技术人员公知的聚合酶链式反应(PCR)，并公开在美国专利号4,683,202等中。

其它扩增反应特别包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、缺口-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qβ-扩增。

用于基于PCR的分析的自动化系统经常在同一反应容器中在PCR过程期间利用产物扩增的实时检测。这种方法的关键在于使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸，如上所述。

在本文中所描述的并且包括SEQ ID NO 4的序列的内部对照核酸优选地表现出与其序列有关的下列特性：

-从55℃至90℃，更优选地从65℃至85℃，更优选地从70℃至80℃，最优选地约75℃的解链温度(melting temperature)，

-高达500个碱基或碱基对，更优选地从50至300个碱基或碱基对，更优选地从100至200个碱基或碱基对，最优选地约180个碱基或碱基对的长度，

-从30％至70％，更优选从40％至60％，最优选地约50％的CG含量。

在一些实施方案中，内部对照核酸由SEQ ID NO 4或其互补物组成。如在本文中所使用的，“序列”是核酸的一级结构，即组成相应的核酸的单个核碱基的特定排列。必须理解的是，术语“序列”不表示特定类型的核酸，如RNA或DNA，但适用于这两者以及其它类型的核酸，如PNA或其它。在核碱基彼此对应的情况下，特别是在尿嘧啶(存在于RNA中)和胸腺嘧啶(存在于DNA中)的情况下，可以认为这些碱基在RNA和DNA序列之间是等同的，如相关领域中公知的。

临床相关核酸经常是DNA，其可以源自DNA病毒，如乙肝病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)等，或细菌，如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)等。在此类情况下，可以有利的是使用由DNA组成的内部对照核酸，以便反映目标核酸特性。

因此，在一些实施方案中，所述内部对照核酸是DNA。

另一方面，临床诊断学相关的许多核酸是核糖核酸，如来自RNA病毒(如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙肝病毒(HCV)、西尼罗河病毒(WNV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis Encephalitis Virus，SLEV)等)的核酸。在本文中描述的方法可以容易地应用于此类核酸。在该情况下，可以有利是使用由RNA组成的内部对照核酸，以便反映目标核酸特性。如果RNA和DNA两者都要在上文描述的方法中分析，那么内部对照核酸可以有利的是RNA，因为理想地，内部对照核酸应模拟涉及多个目标的测定法的最灵敏的目标，并且RNA目标通常必须是更紧密对照的(RNA targets usually have tobe more closely controlled)。

因此，在一些实施方案中，在本文中描述的内部对照核酸是RNA。

因为RNA由于碱性pH、核糖核酸酶等的影响而比DNA更易于降解，因此由RNA制成的内部对照核酸优选地作为装甲颗粒(armored particles)提供。在EP 910643中描述了装甲颗粒，如特别是装甲RNA。简言之，可以化学产生或优选地由细菌(如大肠杆菌(E.coli))异源产生的RNA至少部分地包囊(encapsulated)在病毒外壳蛋白中。后者赋予RNA对外部影响(特别是核糖核酸酶)的抗性。必须理解的是，内部对照DNA也可以作为噬菌体包装的(phage-packaged)且因而受保护的颗粒提供。包囊的RNA和DNA两者在本文描述的语境中作为内部对照核酸是有用的。在一些实施方案中，在大肠杆菌中用MS2外壳蛋白装甲RNA对照核酸。在又一个实施方案中，使用λ噬菌体GT11装甲DNA对照核酸。

通常，在基于扩增的核酸诊断学中，在扩增和检测前将RNA模板转录为DNA。

因此，在本文中描述的方法的一些实施方案中，所述扩增试剂包括具有逆转录酶活性的聚合酶，所述方法在步骤e.和步骤f.之间进一步包括如下的步骤：在一定的条件下在所述反应容器中孵育所述纯化的核酸与所述一个或多个扩增试剂达一定的时间段，所述条件和时间段适合于通过所述具有逆转录酶活性的聚合酶发生RNA的转录。

“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。一旦RNA已经被逆转录为单链cDNA，其还能够形成双链DNA。在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。

在通过DNA聚合酶的RNA分子扩增中，第一次延伸反应是使用RNA模板的逆转录，并且产生DNA链。使用DNA模板的第二次延伸反应产生双链DNA分子。因此，通过DNA聚合酶从RNA模板合成互补DNA链为扩增提供起始材料。

热稳定的DNA聚合酶可以在偶联的(coupled)单酶逆转录/扩增反应中使用。在该语境中，术语“同质(homogeneous)”是指用于RNA目标的逆转录和扩增的两步骤单次添加反应。同质是指在逆转录(RT)步骤后，在扩增步骤前不需要打开反应容器或在其它方面调整反应组分。在非同质RT/PCR反应中，在逆转录后且在扩增前，可以调节、添加或稀释一个或多个反应组分，例如扩增试剂，对此必须打开反应容器，或至少必须操作其内容物。

逆转录是RT/PCR中的一个重要步骤。例如，在本领域中已知RNA模板表现出形成二级结构的倾向，所述二级结构可以妨碍引物结合和/或通过相应的逆转录酶的cDNA链延伸。因此，RT反应的相对较高温度就转录的效率而言是有利的。另一方面，提高孵育温度也意味着更高的特异性，即RT引物将不退火至与预期的一个或多个序列表现出错配的序列。特别是在多个不同目标RNA的情况下，可以期望也转录并且随后扩增以及检测到带有单个错配的序列，例如，在流体样品中可能存在未知的或罕见的生物体亚株(substrains)或亚种的情况下。

为了受益于在上文中描述的两个优点，即二级结构的减少和具有失配的模板的逆转录，在一些实施方案中，在多于一个(more than one)不同的温度进行RT孵育。

因此，在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的聚合酶的所述孵育在从30℃至75℃、从45℃至70℃、或从55℃至65℃的不同温度进行。

作为逆转录的另一个重要方面，长RT步骤可以破坏可能存在于流体样品中的DNA模板。如果所述流体样品包含RNA和DNA种类两者，那么如此可以是有利的是将RT步骤的持续时间尽可能短地保持，但同时确保为随后的扩增和可选的扩增产物检测合成足够量的cDNA。

因此，在一些实施方案中，用于孵育具有逆转录酶活性的聚合酶的时间段是高达(up to)30分钟、20分钟、15分钟、12.5分钟、10分钟、5分钟或1分钟。

在又一个实施方案中，具有逆转录酶活性并且包含突变的聚合酶选自下组：

a)CS5DNA聚合酶

b)CS6DNA聚合酶

c)海栖热袍菌(Thermotoga maritima)DNA聚合酶

d)水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶

e)嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶

f)黄栖热菌(Thermus flavus)DNA聚合酶

g)丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA聚合酶

h)栖热菌属物种s17(Thermus sp.sps17)DNA聚合酶

i)栖热菌属物种Z05(Thermus sp.Z05)DNA聚合酶

j)那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶

k)Termosipho africanus DNA聚合酶

l)Thermus caldophilus DNA聚合酶

特别适用于这些要求的是在聚合酶域中携带按照更快的延伸速率增强其逆转录效率的突变的酶。

因此，在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的聚合酶是包括突变的酶，所述突变赋予相对于相应的野生型聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。

在一些实施方案中，具有逆转录酶活性的聚合酶是包括突变的酶，所述突变赋予相对于相应的野生型聚合酶改善的逆转录酶活性。

在WO2008/046612中公开了携带使得它们在本发明的语境下特别有用的点突变的聚合酶。具体地，在一些实施方案中，在本发明的语境中使用的聚合酶是至少在聚合酶域中包括下述基序的突变DNA聚合酶：

T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N(SEQ ID NO 15)；其中X_b7是从S或T中选择的氨基酸，并且其中X_b8是从G、T、R、K或L中选择的氨基酸，其中聚合酶包括3’-5’外切核酸酶活性并且具有相对于野生型DNA聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录效率，其中在所述野生型DNA聚合酶中X_b8是从D、E或N中选择的氨基酸。

特别有用的是来自栖热菌物种Z05(Thermus species Z05)(例如在US5455170中描述)的热稳定性DNA聚合酶的突变体(mutants)，所述变异(variations)包含与相应的野生型酶Z05相比在聚合酶域中的突变。特别有用的是突变体Z05DNA聚合酶，其中位置580处的氨基酸选自下组：G、T、R、K和L。

对于使用热稳定性聚合酶的逆转录，Mn2+可以用作二价阳离子，并且通常作为盐包括在内，例如氯化锰(MnCl2)、乙酸锰(Mn(OAc)2)或硫酸锰(MnSO4)。如果含有50mMTricine缓冲剂的反应中包含MnCl2，那么例如MnCl2通常以0.5-7.0mM的浓度存在；当使用各200mM dGTP、dATP、dUTP和dCTP时，可以存在0.8-1.4mM；以及可以存在2.5-3.5mM MnCl2。此外，在一些实施方案中，Mg2+作为二价阳离子用于逆转录。

由于在一些实施方案中包含它以将RNA目标核酸逆转录为cDNA，同时保留DNA目标核酸，从而cDNA和DNA两者都可以用于随后的扩增，在本文中描述的内部对照方法特别可用于同时扩增和检测源自具有RNA的生物体或具有DNA基因组的生物体两者的目标核酸。该优点相当大地增加可以在相同物理条件下进行分析的不同生物体(特别是病原体)的范围(spectrum)。

因此，在一些实施方案中，第一和第二目标核酸包括RNA和DNA。

扩增步骤的目标可以是RNA/DNA杂合分子。目标可以是单链或双链核酸。虽然最广泛使用的PCR规程使用双链目标，但这不是必要的。在单链DNA目标的第一个扩增循环之后，反应混合物含有由单链目标和新合成的互补链组成的双链DNA分子。类似地，在RNA/cDNA目标的第一个扩增循环后，反应混合物含有双链cDNA分子。在该点上，如上所述进行扩增的连续循环。

在一些实施方案中，在扩增反应期间或之后检测扩增的目标核酸和扩增的内部对照核酸，以便评估分析结果。

可以有利的是实时监测扩增反应，即在扩增自身期间检测扩增的目标核酸和扩增的内部对照核酸。

因此，在一些实施方案中，探针并且特别是具有SEQ ID NO 1的探针，使用供体荧光部分(donor fluorescent moiety)和对应的受体荧光部分(acceptor fluorescentmoiety)标记。

上文所述的方法优选地基于供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)。代表性的供体荧光部分是荧光素，而代表性的对应的受体荧光部分包括LC-Red 640，LC-Red 705、Cy5和Cy5.5。通常，检测包括在由供体荧光部分吸收的波长处激发样品并且显现和/或测量由对应的受体荧光部分发射的波长。在根据本发明的方法中，检测优选继之以定量FRET。优选地，在每个循环步骤之后进行检测。最优选地，实时进行检测。通过使用市售的实时PCR仪(例如，LightCycler^TM或)，可以以显著减少的循环时间在单个封闭的小杯(single closed cuvette)中组合PCR扩增和扩增产物的检测。因为检测与扩增同时发生，因此实时PCR方法消除了操作扩增产物的需要，并且减少了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR大大减少周转时间并且是临床实验室中常规PCR技术的有吸引力的替代。

LightCycler^TM仪是一种与利用高质量光学器件(optics)的微体积荧光计(microvolume fluorometer)结合的快速热循环器。该快速热循环技术使用薄玻璃小杯作为反应容器。通过交替加热的和环境的空气来控制反应室的加热和冷却。由于空气的低质量和小杯的高表面积与体积比率，可以在热室中实现非常快速的温度交换速率。

技术利用标记有两个荧光部分的单链杂交探针。当使用适当波长的光激发第一荧光部分时，根据FRET的原理，吸收的能量被转移到第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂(quencher)分子。以该形式使用的典型荧光染料特别是例如FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan和CY5.5。在PCR反应的退火步骤期间，经标记的杂交探针结合目标核酸(即，扩增产物)，并且在随后的延伸阶段期间由Taq或另一适当聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。作为结果，激发的荧光部分和猝灭剂部分变为空间上彼此分离的。作为结果，在没有猝灭剂时激发第一荧光部分后，可以检测来自第一荧光部分的荧光发射。

在上述两种检测形式中，发射的信号的强度可以与初始目标核酸分子的数量相关。

作为FRET的替代，可以通过使用双链DNA结合染料检测扩增产物，如荧光DNA结合染料(例如，SYBRGREEN或(Molecular Probes))。在与双链核酸相互作用时，这种荧光DNA结合染料在使用适当波长的光进行激发之后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料，如核酸嵌入染料(nucleic acid intercalating dye)。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析以确认扩增产物的存在。

与FRET一起的分子信标(molecular beacon)也可以用于使用本发明的实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用标记有第一荧光部分和第二荧光部分的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，并且荧光标记物通常位于探针的每个末端。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，这两种荧光部分是空间上邻近的。当与扩增产物杂交之后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变为彼此分离，使得使用适当波长的光激发之后，可以检测到第一荧光部分的发射。

因此，在一些实施方案中，本文所描述的方法使用FRET，其中探针包括允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所述第一和第二荧光部分之间的空间接近。

高效的FRET仅可以当所述荧光部分局部极其接近(in direct local proximity)时并且供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时发生。

因此，在一些实施方案中，所述供体和受体荧光部分在所述探针上彼此在不超过5个核苷酸内(within no more than 5nucleotides of each other on said probe)。

在进一步的实施方案中，所述受体荧光部分是猝灭剂。

进一步有利的是仔细选择扩增子的长度，其作为上文所述方法的结果产生。通常，相对较短的扩增子增加扩增反应的效率。因此，本发明的优选方面是上文所述的方法，其中扩增的片段包括高达450个碱基，优选地高达300个碱基，进一步优选地高达200个碱基，并且进一步优选地高达150个碱基。

本文中描述的内部对照核酸可以充当“定量标准核酸”，其易于作为并用作参考，以便量化，即测定目标核酸的数量。为了该目的，一个或多个定量标准核酸与目标核酸一起经历所有可能的样品准备步骤。此外，在整个方法中在相同反应混合物内加工定量标准核酸。在目标核酸存在或缺乏这两种情况中它都必须直接或间接生成可检测的信号。为了该目的，在每一次测试中必须仔细优化定量标准核酸的浓度，以便不干扰灵敏度，而且也为了在非常高的目标浓度生成可检测的信号。关于相应测定法的检测限(LOD，见下)，“定量标准核酸”的浓度范围在一些实施方案中是20-5000x LOD，在另一些实施方案是20-1000x LOD，在又一些实施方案中是20-5000x LOD。在反应混合物中定量标准核酸的终浓度取决于所完成的定量测量范围。

“检测限”或“LOD”是指样品中核酸的最低可检测量或浓度。低“LOD”对应于高灵敏度，反之亦然。“LOD”通常通过单位“cp/ml”表示，特别是如果所述核酸是病毒核酸，或表示为IU/ml。“Cp/ml”是指“拷贝每毫升”，其中“拷贝”是相应核酸的拷贝。IU/ml代表“国际单位/ml”，参照WHO标准。

用于计算LOD的广泛使用的方法是“概率单位分析(Probit Analysis)”，其是分析刺激(剂量)和量子(quantal)(全有或全无(all or nothing))响应之间的关系的方法。在典型的量子响应实验中，给予动物组不同剂量的药物。记录每个剂量水平的死亡百分比(percent dying)。随后，可以使用概率单位分析来分析这些数据。概率单位模型假定百分比响应与对数剂量呈累积正态分布相关(the percent response is related to the logdose as the cumulative normal distribution)。即，对数剂量可以用作变量(variables)以从累积正态分布读取死亡百分比。使用正态分布，而不是其他概率分布，影响在可能剂量的高末端和低末端处的预测响应速率，但在中间附近具有很小的影响。

可以在不同“命中率(hitrate)”应用概率单位分析。如本领域已知的，“命中率”通常以百分比[％]表示，并且指示在分析物的特定浓度处的阳性结果的百分比。因此，例如，可以在95％的命中率确定LOD，这意味着对于其中95％的有效结果为阳性的设置计算LOD。

如何基于充当定量标准核酸的内部对照核酸，进行TaqMan形式的定量结果的计算的示例描述如下：根据来自整个PCR运行的经仪器校正的荧光值的输入数据计算滴度。包含目标核酸和充当定量标准核酸的内部对照核酸的一组样品在使用指定温度概况(specified temperature profile)的热循环器上经历PCR。在PCR概况期间选择的温度和时间处，通过过滤光照射样品，并且对于目标核酸和内部对照核酸，对于每一个样品收集过滤的荧光数据。在PCR运行完成之后，处理荧光读数以得到内部对照核酸的一组染料浓度数据和目标核酸的一组染料浓度数据。以相同方式处理每一组染料浓度数据。在几次似真性检查(plausibility check)之后，对于内部对照核酸和目标核酸计算肘值(elbow value,CT)。所述肘值定义为目标核酸或内部对照核酸的荧光与预定阈值(荧光浓度)相交的点。滴度测定基于如下的假设：目标核酸和内部对照核酸以相同效率扩增，以及在计算的肘值处，扩增并检测到目标核酸和内部对照核酸的相等量的扩增子拷贝。因此，(CTQS–CT目标)与log(目标浓度/QS浓度)成线性。在该语境中，QS表示充当定量标准核酸的内部对照核酸。然后，可以例如通过使用下述等式中的多项式校准公式计算滴度T：

T′＝10(a(CTQS–CT目标)2+b(CTQS–CT目标)+c)

已知多项式常数和定量标核酸的浓度，因此等式中的唯一变量是差(CTQS-CT目标)。

此外，内部对照核酸在一些实施方案中可以充当“定性内部对照核酸”。“定性内部对照核酸”特别可用于确认定性检测测定法的测试结果的有效性：即使在阴性结果的情况下，也必须检测到定性内部对照，否则测试本身认为是不起作用的。然而，在定性设置中，它在阳性结果的情况下不一定必须检测到。作为结果，其浓度必须是相对较低的。它必须针对相应的测定法和其灵敏性经过仔细改编(It has to be carefully adapted to therespective assay and its sensitivity)。在一些实施方案中，定性内部核酸的浓度在每反应1拷贝至每反应1000拷贝的范围内。关于相应测定法的检测限(LOD)，在一些实施方案中其浓度在测定法的LOD和LOD的25倍值之间，在进一步的实施方案中，在LOD和10x LOD之间。在再进一步的实施方案中，其在2x LOD和10x LOD之间。在其他实施方案中，其在5x LOD和10x LOD之间，或其是5x或10x LOD。

在一些实施方案中，可以有利的是将不同内部对照核酸添加到流体样品，但是仅使用它们中的一个(至少包括SEQ ID NO 4的序列的一个)来通过仅添加具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的引物和具有SEQ ID NO 1的探针的扩增和检测。

在本文中所描述的方法的一些实施方案中，所有步骤是自动化的。“自动化”是指方法的步骤适合于使用能够在很少或没有外部控制或个体影响的情况下操作的设备或机器进行。仅所述方法的制备步骤可能必须由手工完成，例如，必须填充和放置存储容器，样品的选择必须由人类进行，并且进一步的步骤对本领域技术人员是已知的，例如控制计算机的操作。设备或机器可以自动添加液体、混合样品或者在特定温度进行孵育步骤。通常，这种机器或设备是由执行规定单一步骤和命令的程序的计算机控制的自动仪器(robot)。

附图说明

图1：

如在本发明的一个实施方案中使用的样品制备工作流程的示意图。

向下指的箭头表示添加组分或试剂到上述深孔板的每一个相应的孔，向上指的箭头表示它们的相应去除。这些动作在步骤2、3、4、21和22中手动进行，在步骤10、14、16、18和24中通过装置的处理头部(process head)进行，以及在步骤5、6、7、11、15和19中通过装置的试剂头部(reagent head)进行。

图2：

图2描绘了增长曲线。对微孔板上包括的所有样品使用该概况，在所有样品中实现扩增和检测。这表明也成功地实施了扩增前的样品制备。为清楚起见，图2中分开描述定量HCV内部对照的结果。可以看出，对照在所有情况下也成功扩增。通过与充当定量标准品的相应的内部对照核酸进行比较，计算在定量设置中的HCV目标的定量。

必须理解的是，在本发明的精神内可以灵活地调整所使用的体积，优选地公开数值的至少约达30％。具体地，在步骤2的情况下，样品体积优选地是可变的，以便考虑到可能需要或多或少的起始材料以获得正确结果的不同类型的流体样品，如技术人员已知的。优选地，范围为从约100ul至约850ul。更优选地，范围为约100ul、约500ul或约850ul。优选地，在步骤3中使用稀释剂将相应容器中的体积调节到相同总体积。优选地，如在图1所示的方案中，总体积增加到达约850ul。

实施例

本实施例描述了靶向SEQ ID NO 4的两个不同寡核苷酸组(组2包含SEQ ID NO 2、3和5(在MMx R2-SEQ ID NO 5中，而组3包含SEQ ID NO2、3和1(在MMx R2-SEQ ID NO 1中))，以及靶向SEQ ID NO 9的包含SEQ ID NO 6、7和8的参考组1(在MMx R2-参考/SEQ IDNO 6中)之间的性能比较。

简言之，在所描述的实施方案中，使用包括SEQ ID NO 4和SEQ ID NO9两者序列的内部对照核酸对RNA病毒(HCV)进行实时PCR。在同一个实验中，即在同一块多孔板上处理和分析所有样品。

制备并随后分析下列样品：

适当的其他类型的标准品或目标对于熟练技术人员是已知和可用的。

根据相应的制造商的说明使用下表中列出的仪器：

对于样品制备，下列试剂用作稀释剂：

提前制备下述稀释物并存储过夜(血浆稀释物于-60至-90℃，BULK MP SPECIMENDILUENT PMC稀释物于2-8℃)：

将每一个相应的样品(500ul)和每一个相应的样本稀释剂(350ul)手动移液到深孔板中。向包含HCV样品的每一个孔手动添加50ul的上述定量对照核酸(3000个颗粒/样品)。

相应的对照核酸存储于下列缓冲剂中：

IC/IQS–存储缓冲剂,MPSD	浓度或pH
		Tris(mM)	10
EDTA(mM)	0.1
		叠氮化钠(w/v,％)	0.05
聚rA RNA(mg/l)	20
		pH	8

遵循根据图1中所描述的方案的工作流程并使用下列试剂，在处理单元(Roche Diagnostics AG,Rotkreuz,CH)上进行样品制备：

蛋白酶试剂	浓度或pH
		Tris(mM)	10
EDTA(mM)	1
		氯化钙(mM)	5
醋酸钙(mM)	5
		Esperase(mg/ml)	80

甘油(w/v,％)	50
		pH	5.5

MGP试剂	浓度或pH
		MPG粉末(mg/ml)	60
Tris(mM)	30
		对羟基苯甲酸甲酯(w/v,％)	0.1
叠氮化钠(w/v,％)	0.095
		pH	8.5

裂解试剂	浓度或pH
		硫氰酸胍(M)	4
柠檬酸钠(mM)	50
		Polydocanol(w/v,％)	5
二硫苏糖醇(w/v,％)	2
		pH	5.8

清洗缓冲剂	浓度或pH
		柠檬酸钠(mM)	7.5
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,％)	0.1
		pH	4.1

洗脱缓冲剂	浓度或pH
		Tris(mM)	30
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,％)	0.09
		pH	9.1

在最后的样品制备步骤(洗脱液冷却)期间，将包含扩增试剂MMx R1和MMx R2的工作主混合物(working Master Mixes,MMx)手动添加到微孔板的每一个孔中。然后，通过仪器将洗脱液(包含分离的核酸)从p板转移到微孔板并与MMx混合。接着，微孔板自动密封并手动转移到独立的分析循环器(stand-alone analytical cycler)以进行扩增和检测。

使用下列主混合物(每一个由两种试剂R1和R2组成)：

对于MMx R2-参考/SEQ ID NO 6：

R1试剂	浓度/50μl-PCR[μM]
		水(PCR级)
Mn(Ac)₂*4H₂O(使用醋酸调整为pH 6.1)	3300
		NaN3/Ri,,在pH7使用10mM Tris缓冲[％]	0.018

R2试剂	浓度/50μl-PCR[μM]
		DMSO[％]	5.400％
NaN3/Ri,在pH7使用10mM Tris缓冲[％]	0.027％
		醋酸钾pH 7.0	120’000
甘油[％]	3.000％
		土温(Tween)20(％)	0.015％
Tricine pH 8.0	60'000
		NTQ21-46A-适体(Aptamer)	0.2222
UNG(U/uL)	0.2
		dGTP	400
dATP	400
		dCTP	4000
dUTP	800
		用于引物的10mM Tris缓冲液	1.800
SEQ ID NO 10(HCV引物)	0.100
		SEQ ID NO 11(HCV引物)	0.100
SEQ ID NO 12(HCV引物)	0.100
		SEQ ID NO 7(IC引物)	0.300
SEQ ID NO 8(IC引物)	0.300
		探针存储缓冲剂FAM/HEX	0.550
SEQ ID NO 13(HCV引物)	0.100
		SEQ ID NO 14(HCV引物)	0.100
SEQ ID NO 6(IC探针)	0.100
		Z05-D聚合酶(U/uL)	40(U/反应)

水

对于在MMx R2-SEQ ID NO 5中：

对于在MMx R2-SEQ ID NO 1中：

为了扩增和检测，使用处理单元(见上文)中的自动板密封器密封微孔板，并将板手动转移到分析循环器(见上文)。

对于使用表1所示的通用PCR概况的三种主混合物，同时并在相同条件下进行扩增和检测(实时PCR)。总共运行7个扩增检测板以获得需要的重复。

表1：热循环概况

表2：循环概述

名称	循环
		预PCR	1
第1测量	5
		第2测量	45
冷却	1

表3：整合时间(Integration times)

滤器组合	整合时间(秒)
		435-470	0.30
495-525	0.50
		540-580	0.50
610-645	0.20
		680-700	1.00

预PCR程序包括在55、60和65℃的初始变性和孵育，用于RNA模板的逆转录。在三种温度的孵育组合有利的效果，即较低温度时略微错配的目标序列(如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度时RNA二级结构的形成被抑制，从而导致更高效的转录。

PCR循环分为两次测量，其中两次测量都应用一步设置(组合退火和延伸)。在55℃时的前5次循环通过预扩增略微错配的目标序列而允许增加的包容性(inclusivity)，而第二测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度而提供增加的特异性。

对上述微孔板上包括的所有样品使用该概况，在所有样品中实现扩增和检测，如图2的增长曲线中所描绘的。这表明也成功地实施了扩增前的样品制备。

为清楚起见，图2中分开描述定量HCV内部对照的结果。可以看出，对照在所有情况下也成功扩增。通过与充当定量标准品的相应的内部对照核酸进行比较，计算在定量设置中的HCV目标的定量。

数据分析

使用PARTS软件对分析循环器的原始数据文件(xml文件)分析。使用当前HCV分析模板用于数据计算，以及在通道4/JA270(HCV信号)和通道5/Cy5.5(定量控制信号)中的三个主混合物的阳性/阴性调用。为了HCV目标和定量对照，使用当前HCV分析模板计算命中率、CT、RFI和F值。

结果

三个主混合物的命中率、CT-、RFI-和F值列于表4和5中。所使用的分析模板未对寡核苷酸组中的每一个进行优化。

表4：对于EDTA血浆使用500μL样品处理输入体积(sample process inputvolume)得到的HCV目标CT值和RFI值

表5：对于EDTA血浆使用500μL样品处理输入体积得到的内部对照CT值和RFI值

总结探针比较：

在并排研究中进行比较的三种内部对照寡核苷酸组在命中率中没有表现出显著差异。使用MMX R2-SEQ ID NO 1(寡核苷酸组3)观察到了趋于组合较低基线的更好RFI值(Atrend towards a better RFI value combined with a lower base line with MMx R2-SEQ ID NO 1(oligonucleotide set 3)was observed)。这允许对包括SEQ ID NO 4的对照核酸的改善的检测。通过使用具有SEQ ID NO 1而不是SEQ ID NO 5的探针，使用包括SEQID NO 4的内部对照核酸的测定法从而变为更可靠和稳健(robust)。

Claims

1.一种由SEQ ID NO 1组成的分离的寡核苷酸。

2.一种组合物，其包括由SEQ ID NO 1、2和3组成的寡核苷酸。

3.一种用于为多个目标核酸的检测作对照的试剂盒，所述试剂盒包含由SEQ ID NO 1组成的检测探针，由SEQ ID NO 2组成和SEQ ID NO 3组成的扩增引物对，以及包含SEQ IDNO 4的对照核酸。

4.由SEQ ID NO 1组成的探针用于检测包含SEQ ID NO 4的对照核酸的用途。

5.一种用于在有内部对照的情况下分离并同时扩增第一和第二目标核酸的方法，所述第一和第二目标核酸能存在于一个或多个流体样品中，所述方法包括下列自动化步骤：

a.将包含SEQ ID NO 4序列的内部对照核酸加入到每个所述流体样品，

b.在一定的条件下在一个或多个容器中将固体支持材料和所述一个或多个流体样品组合在一起达一定的时间段，所述条件和时间段足以允许包括在存在于所述一个或多个流体样品上的情况下的所述目标核酸和所述内部对照核酸的核酸在所述固体支持材料上固定化，

c.在分离站中将所述固体支持材料与存在于所述流体样品中的其它材料分离，

d.在所述分离站中纯化所述核酸，并且用清洗缓冲剂清洗所述固体支持材料一次或多次，

e.在至少两个反应容器中使纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸接触扩增试剂，所述扩增试剂包括针对每个所述目标核酸的不同引物组和探针以及针对所述内部对照核酸的包括由SEQ ID NO 2组成的第一引物和由SEQ ID NO 3组成的第二引物的引物组和由SEQID NO 1组成的探针，其中第一反应容器包括针对所述第一目标核酸的引物和探针，并且至少第二反应容器包括针对所述第二目标核酸的引物和探针，并且其中所述针对第一目标核酸的引物和探针不存在于所述第二反应容器，并且所述针对第二目标核酸的引物和探针不存在于所述第一反应容器，

其中对于所述第一和第二反应容器以及对于所述目标核酸和所述内部对照核酸，在步骤d.到g.中用于扩增和检测的条件是相同的。

6.权利要求5的方法，其中所述扩增试剂包括具有逆转录酶活性的聚合酶，所述方法在步骤e.和步骤f.之间进一步包括如下的步骤：在一定的条件下在所述反应容器中孵育所述纯化的核酸与所述一种或多种扩增试剂达一定的时间段，所述条件和时间段适合于通过所述具有逆转录酶活性的聚合酶发生RNA逆转录。

7.权利要求5至6中任一项的方法，其中所述内部对照核酸是RNA或DNA。

8.权利要求5至6中任一项的方法，其中所述内部对照核酸是装甲RNA(armored RNA)或噬菌体包装的DNA。

9.权利要求7的方法，其中所述内部对照核酸是装甲RNA(armored RNA)或噬菌体包装的DNA。

10.权利要求5，6，或9中任一项的方法，其中所述内部对照核酸的解链温度为50℃至90℃。

11.权利要求7的方法，其中所述内部对照核酸的解链温度为50℃至90℃。

12.权利要求8的方法，其中所述内部对照核酸的解链温度为50℃至90℃。

13.权利要求5，6，9，11，或12中任一项的方法，其中所述内部对照核酸具有高达500个碱基的长度。

14.权利要求7的方法，其中所述内部对照核酸具有高达500个碱基的长度。

15.权利要求8的方法，其中所述内部对照核酸具有高达500个碱基的长度。

16.权利要求10的方法，其中所述内部对照核酸具有高达500个碱基的长度。

17.权利要求5，6，9，11，12，或14-16中任一项的方法，其中所述内部对照核酸具有30％至70％的GC含量。

18.权利要求7的方法，其中所述内部对照核酸具有30％至70％的GC含量。

19.权利要求8的方法，其中所述内部对照核酸具有30％至70％的GC含量。

20.权利要求10的方法，其中所述内部对照核酸具有30％至70％的GC含量。

21.权利要求13的方法，其中所述内部对照核酸具有30％至70％的GC含量。

22.权利要求5，6，9，11，12，14-16，或18-21中任一项的方法，其中在步骤a.中添加多于一种内部对照核酸，但是在步骤f.中仅扩增所述内部对照核酸之一。

23.权利要求7的方法，其中在步骤a.中添加多于一种内部对照核酸，但是在步骤f.中仅扩增所述内部对照核酸之一。

24.权利要求8的方法，其中在步骤a.中添加多于一种内部对照核酸，但是在步骤f.中仅扩增所述内部对照核酸之一。

25.权利要求10的方法，其中在步骤a.中添加多于一种内部对照核酸，但是在步骤f.中仅扩增所述内部对照核酸之一。

26.权利要求13的方法，其中在步骤a.中添加多于一种内部对照核酸，但是在步骤f.中仅扩增所述内部对照核酸之一。

27.权利要求17的方法，其中在步骤a.中添加多于一种内部对照核酸，但是在步骤f.中仅扩增所述内部对照核酸之一。