CN101978074A

CN101978074A - 用于核酸测试的非竞争性内部对照物

Info

Publication number: CN101978074A
Application number: CN2009801094450A
Authority: CN
Inventors: J·德特默; X·蒋; M·乐; D·谢尔曼
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany; Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2008-03-20
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2011-02-16
Also published as: EP2252708A1; WO2009117537A1; EP2252708B1; EP2252708A4; US20110003309A1; CA2718946A1

Abstract

提供的是用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物，其是从生物体Methanobacterium thermoautrophicum(MET)和玉蜀黍(玉米)获得的。所述非竞争性内部对照物在DNA和RNA NAT中具有实用性，所述DNA和RNA NAT选自甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseria gonorrhea(GC)和乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

Description

用于核酸测试的非竞争性内部对照物

技术领域

本申请一般地涉及用于进行诊断分析的工具，更具体地涉及用于核酸测试(NAT)的不与目标核酸序列竞争的内部对照序列。

发明背景

为了确保核酸测试(NAT)正确地进行，分析需要存在内部对照物。在诊断NAT中，内部对照物的存在可以确保测试的完整性。具体地，通过在NAT中包括内部对照物，内部对照物和目标核酸测试为阳性的样品是真阳性的。相反，仅测试了内部对照物的样品是真阴性的，仅测试了目标核酸的样品是真阴性的，没有可检测的内部对照物或目标的样品是假阴性的。

需要存在内部对照物的最常用的诊断分析是聚合酶链式反应(PCR)分析，其在它的传统用途中是目标扩增分析，在它的修改的用途中是目标扩增和定量分析。存在几种类型的PCR分析：传统的PCR(DNA的扩增)；反-转录酶PCR(也称为“RT-PCR”；利用RNA作为起始材料的DNA的扩增)，实时PCR(DNA的同时定量和扩增)；和实时RT-PCR(利用RNA作为起始材料的DNA的同时定量和扩增)。

在扩增分析，例如PCR分析中，一般地，使用一种或两种内部对照物：竞争性内部对照物和非竞争性内部对照物。

使用竞争性内部对照物，目标和所述内部对照物在同样的条件下和在同一PCR试管中使用一组共同的引物来扩增。使用竞争性内部对照物，内部对照物核酸侧翼是用于启动目标核酸的扩增的相同的引物序列。当正确地进行PCR分析时，IC核酸将在扩增分析之后检测到。根据它的名字知道的是，竞争性内部对照物是基于目标DNA和内部对照物之间的竞争。为了使竞争性内部对照物有效，样品试管中的内部对照物的数量对于检测极限是关键的。使用竞争性内部对照物的缺点是基于它的结构，具体地，取决于核酸片段的摩尔比、长度、序列和二级结构，侧翼是相同的引物位点的两种不同的核酸片段的同时扩增有着一种或两种产物的抑制作用或增强作用的风险。竞争性内部对照物的另一个缺点是，它们不能用于多重分析，多重分析在单次分析中筛选多个目标。

对于非竞争性内部对照物，对每一种利用不同的引物组扩增目标和内部对照物；因而，非竞争性内部对照物需要一种PCR，在其中具有不同动力学的两个反应同时地进行。由于两种反应的动力学是不同的，对于引物没有竞争。当前使用的非竞争性内部对照物引物组一般靶向目标基因以外的基因(例如，编码rRNA)，其以比目标基因更高的拷贝数存在于样品中。本领域中最常用的非竞争性内部对照物利用特异于16S和23S核糖体DNA的保守序列的引物。本领域中仍然需要可以被制备用于多重分析的其他非竞争性内部对照物。非竞争性内部对照物的优点是，不同于竞争性内部对照物，非竞争性内部对照物可以被保存用于多个反应，也可以用于多重反应中。本领域中需要这样的非竞争性内部对照物。

发明概述

通过提供核酸序列，所述核酸序列可以在实验室中制备，并保存用于多个反应和用于多重NAT，本发明满足了本领域中对用于NAT的非竞争性内部对照物的需求。

在本发明的一个方面，提供了用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物，包含从选自Methanobacterium thermoautrophicum(MET)和玉蜀黍(Zea mays)的生物体获得的核酸。

在本发明的一个实施方式中，所述非竞争性内部对照物包含DNA，并用于选自由甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)(CT)、Neisseria gonorrhea(GC[用于gonococci])和乙型肝炎病毒(HBV)构成的组的DNA NAT。

在本发明的另一个实施方式中，所述非竞争性内部对照物包含RNA，并用于选自由丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)构成的组的RNA NAT。

在本发明的另一个方面，提供了制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物的方法，包括步骤：(a)从Methanobacteriumthermoautrophicum(MET)提取基因组DNA；(b)利用具有至少两个限制性内切酶位点和至少一个目标特异性序列的正向和反向引物，从步骤(a)的基因组DNA产生扩增子；(c)通过连接步骤(b)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；和(d)用与步骤(b)和(c)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产生MET内部对照DNA。

当需要RNA时，所述方法进一步包括步骤(e)：从步骤(d)的DNA制备MET内部对照RNA。

在本发明的进一步的方面，提供了制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物的方法，包括步骤：(a)从玉蜀黍(玉米(corn))提取基因组DNA；(b)利用具有至少两个限制性内切酶位点和目标特异性序列的正向和反向引物，从步骤(a)的基因组DNA产生扩增子；(c)通过连接步骤(b)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；(d)用与步骤(b)和(c)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产生玉米内部对照DNA。

当需要RNA时，所述方法进一步包括步骤：(e)从步骤(d)的DNA制备玉米内部对照RNA。

在本发明的一个实施方式中，步骤(b)和(d)的所述至少两个限制性内切酶位点(对于MET和玉米两者)相应于限制性内切酶XhoI和SpeI的序列。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(c)的启动子序列(对于MET和玉米两者)是T7启动子序列。

在本发明的进一步的实施方式中，MET或玉米内部对照DNA被用作选自以下构成的组的DNA NAT中的非竞争性内部对照物：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseria gonorrhea(GC)和乙型肝炎病毒(HBV)。

在本发明又一个实施方式中，MET或玉米内部对照RNA被用作选自以下构成的组的RNA NAT中的非竞争性内部对照物：丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

本发明的其他方面、优点和特征将在以下的说明书中部分地阐述，部分地，在本领域技术人员参阅下文时将变得显而易见，或可以通过本发明的实践来学习到。

附图的简要描述

附图1是制备本发明的内部对照序列的方法的示意图。

附图2是单个反应孔中沙眼衣原体(CT)(左侧曲线)和MET IC(右侧曲线)的扩增曲线的图形。

附图3是单个反应孔中Neisseria gonorrhea(GC)(左侧曲线)和MET IC(右侧曲线)的扩增曲线的图形。

附图4是单个反应孔中丙型肝炎病毒(HCV)(左侧曲线)和MET IC(右侧曲线)的扩增曲线的图形。

发明的详细描述

以下阐述的是当前被认为是所请求的发明的优选的实施方式和最好实施例的描述。在功能、目的或结构方面的任何替代或修饰意图由本申请的权利要求涵盖。

定义：

在描述和要求本发明的权利时，以下术语、以下定义仅被用于描述特定实施方式的目的，而不意图是限制性的。如在本说明书和附随的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的指代物，除非上下文明显地相反指示。

术语“非竞争性内部对照物”是指内部对照核酸序列，其包括在目标核酸序列中不存在的引物位点。

术语“竞争性内部对照物”是指内部对照核酸序列，其包括在目标核酸序列中也存在的引物位点。

术语“FW”和“FP”表示正向引物，术语“RV”和“RP”表示反向引物。术语“P”单独使用时是指探针。

术语“用于内部对照物(IC)克隆的构建的PCR引物”是指寡核苷酸，其被设计以通过重叠PCR反应将独特的序列和限制性位点引入新构建的IC质粒DNA中。

术语“扩增引物”(在此也称为“引物”)是指寡核苷酸，其与DNA或RNA分子互补，并提供了底物的3-OH末端，任何DNA聚合酶可以按照5到3的方向将增长中的DNA链的核苷酸添加到所述末端上。

术语“检测探针”(在此也称为“探针”)是指在合适的条件下能够选择性地与扩增的目标核酸杂交的寡核苷酸。检测探针可以由具有5-报告物染料(R)和3-淬灭剂染料(Q)的核苷酸组成。荧光报告物染料和荧光团，或为红位移荧光的或非荧光的淬灭剂可以共价连接到寡核苷酸的5-末端或3-末端。检测探针在扩增和检测过程期间作为

(Applied Biosystems，Foster City，CA)探针或其他检测探针，例如信标、非核酸酶实时扩增探针。

术语“诊断目标(未知的)”是指已经设计了PCR分析来特异性地检测的核酸序列。这些分析的实例包括一些目标，例如，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)。

术语“诊断目标(已知的)”是指独特的DNA或RNA目标，其以已知的浓度掺入到用于分离和扩增特定诊断目标的提取步骤或扩增混合物中，所述特定诊断目标在样品中的存在或数量是未知的。此外，识别RNA或DNA的独特片段的独特的引物和探针被添加到扩增混合物中。这些内部对照物可以用于监视实时kPCR分析中目标提取、扩增和检测的效力。

如在此使用的，术语“目标扩增”是指酶介导的过程，其能够产生核酸目标的数十亿的拷贝。本领域已知的酶介导的目标扩增过程的实例包括PCR、基于核酸序列的扩增(“NASBA”)、转录介导的扩增(“TMA”)、链置换扩增(“SDA”)和连接酶链式反应(“LCR”)。最广泛使用的目标扩增过程是PCR，由Mullins等人在美国专利No.4,683,195中和Mullis在美国专利No.4,683,202中首先描述用于DNA的扩增。PCR过程是本领域普通技术人员公知的。当PCR反应的起始材料是RNA时，互补DNA(“cDNA”)通过逆转录由RNA制成。用于扩增RNA产物的PCR被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。

在PCR技术中，DNA的样品在溶液中与摩尔过量的、各自10-30碱基对的两种寡核苷酸引物，所述引物各自制备为互补于DNA双链体的每条链的3′末端；摩尔过量的未连接的核苷酸碱基(即，dNTPs)；和DNA聚合酶(优选的Taq聚合酶，其是对热稳定的)，其催化从寡核苷酸引物和dNTP的DNA形成，混合。两种引物中，一种是正向引物，其将以5′-3′方向结合变性的DNA被分析物的一条链的3′末端，另一个是反向引物，其将以3′-5′方向结合变性的DNA被分析物的另一条链的5′末端。溶液加热到94-96℃来将双链DNA变性为单链的DNA。当溶液冷却时，引物结合独立的链，DNA聚合酶通过将dNTP结合到引物上来催化被分析物的新的链。当重复该过程时，从引物合成的延伸产物从它们的互补物上分离，每个延伸产物充当了从另一个引物合成的互补延伸产物的模板。换句话说，从正向引物合成的延伸产物，在分离时，将充当从反向引物合成的互补的延伸产物的模板。类似地，从反向引物合成的延伸产物，在分离时，将充当从正向引物合成的互补的延伸产物的模板。这样，引物之间的DNA的区域随着过程的每次重复被选择性地复制。由于在每个循环之后序列被扩增加倍，十亿个拷贝的理论上的扩增可以在重复该过程几个小时后获得；因而，极小数量的DNA可以利用PCR在相对短的时间内扩增。

如在此使用的，术语“扩增子”是指扩增的核酸产物，例如，扩增的PCR产物。

当PCR反应的起始材料是RNA时，互补DNA(“cDNA”)通过逆转录由RNA制成。产生的cDNA然后利用如上所述的PCR方案扩增。逆转录酶作为在逆转录病毒中发现的酶是本领域普通技术人员已知的，其可以从mRNA序列作为模板合成互补的DNA单链。所述酶被用于遗传工程中来从mRNA的纯化的制品产生特定的cDNA分子。用于扩增RNA产物的PCR被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。

术语“实时PCR”和“实时RT-PCR”本领域中也称为“动力PCR”(“kPCR”)或“动力RT-PCR”(“kRT-PCR”)，是指用于DNA的同时扩增和定量的修改的PCR分析。对于实时PCR，通过由发荧光染料分子和淬灭剂部分与相同的或不同的寡核苷酸底物的偶联所产生的荧光信号，来检测PCR产物。在kPCR和kRT-PCR中通常使用的探针的实例包括以下探针：

探针(Applied Biosystems，Foster City，CA)、分子信标探针(PHRI，Neward，N.J.)、

探针(DXS Ltd，Manchester，UK)和

Green探针(Invitrogen，Carlsbad，CA)。简要地，探针、分子信标和

探针各自具有附着到探针的5′末端的荧光报告物染料(也称为“荧光剂”)和偶联到探针的3′末端的淬灭剂部分。在未杂交的状态下，荧光剂和淬灭分子的接近阻止了来自探针的荧光信号的检出。相反，在PCR期间，当聚合酶复制其上结合了探针的模板时，聚合酶的5′-核酸酶活性裂解探针，因而每个复制循环提高荧光。

Green探针结合双链DNA，并在激发时发射光线；因而随着PCR产物积累，荧光提高。

术语“互补的”和“基本上互补的”是指核苷酸或核酸之间的碱基配对，例如，在双链DNA分子的两条链之间，或在寡核苷酸引物和要测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间。互补的核苷酸一般是，A和T(或A和U)，以及G和C。在本发明的上下文中，要理解的是，列出的具体序列长度是说明性的，不是限制性的，并且，覆盖相同的图谱位置、但具有稍稍更少或更多数量的碱基的序列被认为是所述序列的等同物，并且属于本发明的范围，条件是它们将与所列序列一样杂交到目标上的相同位置。因为要理解的是，为了杂交，核酸不需要完全互补，在此公开的探针和引物序列可以被一定程度上修饰而不损失作为具体引物和探针的实用性。一般地，具有80％或更高同源性的序列属于本发明的范围。

如在此使用的，术语“克隆”被用于指“分子克隆”，其是产生核酸序列的多个拷贝(在此也称为″插入物″)的一种过程，例如，来自插入物的单个拷贝的独特基因或可选择的遗传标志物。克隆过程一般在“克隆载体”(在此也称为″载体″)中发生，其是一种能够在适合的宿主细胞中复制的DNA分子，例如，质粒或病毒DNA染色体。“质粒”是本领域已知的，从细菌物种获得的环状双链DNA分子。克隆载体一般具有用于核酸序列的插入的一个或更多个适合的位点。在成功的克隆中，克隆载体被导入宿主细胞中，克隆载体在宿主细胞中的复制产生转化的宿主细胞，其表达被插入到所述克隆载体中的所述核酸序列。克隆载体在宿主细胞中的复制一般经由“启动子”来启动，其是位于基因的上游(朝向5′区域)的DNA的调节区域，其结合RNA聚合酶和转录因子来启动RNA转录。利用这种操作和如附图1中所示的，克隆载体可以用作模板来通过常规转录反应产生RNA内部对照物，或通过限制性消化产生DNA内部对照物。

如在背景小节中解释的，当非竞争性内部对照物用于扩增反应，例如PCR时，不同的引物集被用于内部对照物和用于目标。非竞争性内部对照物的使用因而需要一种PCR，其中具有不同的动力学的两种反应同时进行，每个反应的动力学不受到对引物的竞争的影响。

非竞争性内部对照物相对竞争性内部对照物的一个优点是，由于非竞争性内部对照物是用它们自己的引物集来制备的，它们可以用于同一实验室中的许多不同的分析。非竞争性内部对照物的另一个优点是它们可以用于多重PCR分析。相反，竞争性内部对照物不能用于多重PCR分析，在多重PCR分析中需要几个引物对。如技术人员已知的，多重PCR对于分子诊断是非常有用的，因为产生相似症状的多种病原体可以在单个反应中同时地筛选。

本发明的非竞争性内部对照物具有至少两个引物结合位点和至少一个探针结合位点。作为非竞争性对照物，本发明的内部对照物具有独特的克隆序列，其不与目标核酸序列竞争。所述内部对照物是从生物体Methanobacterium thermoautrophicum(MET)和玉蜀黍(玉米)的基因组独立地设计的。分离自所述生物体的核酸被构建到带有克隆载体的质粒中。

用于克隆核酸的操作是本领域技术人员已知的。附图1显示了克隆本发明的内部对照物核酸的示范性的操作；附图1中阐述的操作被用于产生实施例中描述的非竞争性内部对照物。如附图1中所示，分离的基因组DNA用XhoI和SpeI限制性内切酶消化，产生的DNA插入物利用PCR来扩增并纯化。单独地，从

克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，California)制备载体片段，其用XhoI和SpeI限制性内切酶消化来形成具有XhoI和SpeI粘性末端的载体片段，其随后被纯化。DNA插入物和载体片段然后通过匹配XhoI和SpeI粘性末端来连接，形成包括了基因组DNA插入物、载体片段和T7启动子序列的质粒。T7启动子序列一般是20-mer T7启动子序列5’-TAA TAC GAG TCA CTA TAG GG-3’(SEQ ID NO.1)或21-mer T7启动子序列5’-TAA TAC GAG TCA CTA TAG GGA-3’(SEQ ID NO.2)。本发明的内部对照DNA序列通过用XhoI或SpeI消化质粒来产生。内部对照RNA序列通过在本领域技术人员已知的条件下转录DNA来获得。

对附图1中所示操作的修饰，例如，用本领域已知的其他启动子替换T7启动子，例如T3和SP6启动子，或在MET或玉米插入物侧翼插入超过一个启动子，处于本领域技术人员的技术水平之内。类似地，处于本领域技术人员的技术水平之内的是，用其他适合的限制性内切酶的结合位点替换XhoI和SpeI限制性结合位点，来修改在此阐述的方法。

本发明的DNA内部对照物在DNA核酸测试(DAT)中具有实用性，无限制地包括：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseria gonorrhea(GC)和乙型肝炎病毒(HBV)。

本发明的RNA内部对照物在RNA核酸测试(NAT)中具有实用性，无限制地包括：丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

实际上，要理解的是，本发明的内部对照物被包括在与被靶向的样品相同的反应混合物中。在本发明的一个实施方式中，在病毒裂解的步骤引入内部对照物，因而，可以用于在样品制备步骤监测RNA或DNA目标捕获或释放，和/或监测在实时PCR期间的目标扩增和检测。

内部对照物片段和引物和探针集：

序列表描述了(i)克隆期间的DNA插入物；(ii)基于限制性内切酶消化之后的纯化，产生的完整的双链DNA序列；和(iii)产自带有附着的载体序列的T7启动子的单链RNA的序列。

MET核酸片段

表1显示了用于从M thermoautrophicum(MET)基因组提取核酸片段的正向(FP)和反向(RP)引物的序列，其被用于克隆本发明的MET内部对照物(MET IC)。引物被设计具有限制性内切酶结合位点(以粗体突出)和目标特异性结合位点(下划线的)。如其中所示，正向引物被设计具有XhoI限制性内切酶序列(C/TCGAG)，反向引物被设计具有SpeI限制性内切酶序列(A/CTAGT)。

如上所指出的，本发明的内部对照物包括至少两个引物结合位点和至少一个探针结合位点。表2到8阐述了各种正向和反向扩增引物序列和检测探针结合序列，其被用于产生MET IC扩增子，这也在表格中提供了。表2到8中阐述的扩增子可以用于制备用于以下疾病状态的核酸诊断测试的非竞争性对照物：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseria gonorrhea(GC)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

玉米核酸片段

表9显示了用于从玉蜀黍(玉米)基因组提取核酸片段的正向(FP)和反向(RP)引物的序列，其被用于克隆本发明的玉米内部对照物(玉米IC)。引物被设计具有限制性内切酶结合位点(以粗体突出)和目标特异性结合位点(下划线的)。如其中所示，正向引物被设计具有XhoI限制性内切酶序列(C/TCGAG)，反向引物被设计具有SpeI限制性内切酶序列(A/CTAGT)。

如上所指出的，本发明的内部对照物包括至少两个引物结合位点和至少一个探针结合位点。表10到12阐述了各种正向和反向扩增引物序列和检测探针结合序列，其可被用于产生玉米IC扩增子，这也在表格中提供了。表10到12中阐述的扩增子可以用于制备用于以下疾病状态的核酸诊断测试的非竞争性对照物：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSVA)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseriagonorrhea(GC)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

要理解的是，虽然连同其优选的具体实施方式描述了本发明，以上的描述以及随后的实施例意图说明而不是限制本发明的范围。本发明的范围内的其他方面、优点和修改对于本发明所属领域技术人员是显而易见的。

在此提及的所有专利和公开文件通过引用完全合并在此。

实施例

提出以下实施例，以为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物的完整公开和描述。实施例意图作为本发明的非限制性实例。虽然已经进行了努力来确保关于变量，例如，数量、温度等等的准确度，实验误差和偏离应当被考虑。除非另外标明，份数是按重量份，温度是摄氏度，压力是处在或接近大气压。除非另有陈述，所有的成分是商业上获得的。

一般方案：

以下方案、装置和试剂盒被用于进行以下实施例。

基因组DNA的提取：通过人工的Qiagen(Valencia，CA)样品制备试剂盒纯化的天然目标。

PCR条件和装置：PCR在MJ Research(Ramsey，MN)仪器上使用以下热分布来进行：95°10分钟-1步

72°10分钟

4°过夜(直到移除)

PCR产物的纯化：PCR产物利用Qiagen试剂盒(Valencia，CA)来纯化。

克隆操作：克隆利用用于在使用

克隆载体(Carlsbad，CA)的Invitrogen克隆方案的产品插页中阐述的操作来进行。连接操作：DNA片段向

克隆载体的连接利用Invitrogen T4连接酶(Carlsbad，CA)的说明来进行。

载体片段的纯化：载体的纯化利用Clontech

RNA纯化试剂盒(Mountain View，CA)来进行。

RNA转录方案：转录根据Ambion T7

试剂盒(Austin，TX)的产品插页中的说明来进行。RNA的纯化根据Qiagen

迷你试剂盒(Valencia，CA)中的说明来进行。

实施例1

MET IC DNA插入物序列的制备

基因组DNA从MET样品提取。DNA插入物通过使用表1的片段引物对基因组DNA进行PCR来制备。以下序列是MET IC PCR产物(213bp)的序列(SEQ ID NO：37)。XhoI和SpeI限制性酶位点用黑体下划线标出。

1 AGTAGTC

CATGTGCA GGGATCCTGA CACGGTACTG

TCATCAG

GTACACGT CCCTAGGACT GTGCCATGAC

41 GAGGCAGGCA GGGCCGCCAT AAGAGCCATA GAGGAGGTTG

CTCCGTCCGT CCCGGCGGTA TTCTCGGTAT CTCCTCCAAC

81 AGGGTGTTGT GACGCCCTTT GATATCTGCT CCGCAGCATC

TCCCACAACA CTGCGGGAAA CTATAGACGA GGCGTCGTAG

121 AAAGCCAGAG ACAAATTACC CCTGGATAGG CCCCACCACG

TTTCGGTCTC TGTTTAATGG GGACCTATCC GGGGTGGTGC

161 AACCACCCCT ACTGCCCGAG CCTGAAGGAG GTGCTCGGTG

TTGGTGGGGA TGACGGGCTC GGACTTCCTC CACGAGCCAC

201 AA

CGA CGA

TT

GCT GCT

实施例2

纯化的MET IC DNA插入物序列

以下序列是在上文鉴定的位点处限制性内切酶消化后纯化的195bp dsDNA序列(SEQ ID NO：38)：

1 TCGAGCATGT GCAGGGATCC TGACACGGTA CTGGAGGCAG

41 GCAGGGCCGC CATAAGAGCC ATAGAGGAGG TTGAGGGTGT

81 TGTGACGCCC TTTGATATCT GCTCCGCAGC ATCAAAGCCA

121 GAGACAAATT ACCCCTGGAT AGGCCCCACC ACGAACCACC

161 CCTACTGCCC GAGCCTGAAG GAGGTGCTCG GTGAA

实施例3

MET IC DNA转录产物序列

通过将实施例2的纯化的MET IC DNA插入物序列连接到纯化的载体片段并添加T7启动子序列，来制备质粒。纯化的载体片段经由限制性内切酶XhoI和SpeI的消化分离自

克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，California)。通过匹配DNA插入物和载体的XhoI和SpeI粘性末端形成质粒。附图1显示了克隆过程的示意图。

产生的质粒用XhoI和SpeI线性化，来产生以下的247bp MET ICDNA转录产物序列。载体序列是用粗体下划线突出的(SEQ ID NO：39)：

1

CTC GAGCATGTGC

41 AGGGATCCTG ACACGGTACT GGAGGCAGGC AGGGCCGCCA

81 TAAGAGCCAT AGAGGAGGTT GAGGGTGTTG TGACGCCCTT

121 TGATATCTGC TCCGCAGCAT CAAAGCCAGA GACAAATTAC

161 CCCTGGATAG GCCCCACCAC GAACCACCCC TACTGCCCGA

201 GCCTGAAGGA GGTGCTCGGT GAACTAGT

241

实施例4

MET IC RNA转录产物序列

以下序列是从实施例3的DNA序列制备的247bp MET IC RNA转录产物序列。载体序列是用粗体下划线突出的(SEQ ID NO：40)：

1CUC GAGCAUGUGC

41 AGGGAUCCUG ACACGGUACU GGAGGCAGGC AGGGCCGCCA

81 UAAGAGCCAU AGAGGAGGUU GAGGGUGUUG UGACGCCCUU

121 UGAUAUCUGC UCCGCAGCAU CAAAGCCAGA GACAAAUUAC

161 CCCUGGAUAG GCCCCACCAC GAACCACCCC UACUGCCCGA

201 GCCUGAAGGA GGUGCUCGGU GAACUAGU

241

实施例5

玉米IC插入物序列的制备

基因组DNA从玉蜀黍(玉米)样品提取。DNA插入物通过使用表9的片段引物对基因组DNA进行PCR来制备。以下序列是玉米ICPCR产物(284bp)的序列(SEQ ID NO：41)。XhoI和SpeI限制性内切酶位点是用粗体下划线标明的。

1 AGTAGTC

TAAATAGC CCTCACCCAC CAACTAGCCG

TCATCAG

ATTTATCG GGAGTGGGTG GTTGATCGGC

41 TTACAGGCAA GTTACTGCGC GATGGCGCAC CGGACAGTCC

AATGTCCGTT CAATGACGCG CTACCGCGTG GCCTGTCAGG

81 GGTGCGCCAC CGGTGCGCCA CCGGTGCGCC ACCGGTGCGC

CCACGCGGTC GCCACGCGGT GGCCACGCGG TGGCCACGCG

121 CAACGGTCAC TTNCAACGGC TAGTTCTGAC ACAGAGCCGT

GTTGCCAGTG AANGTTGCCG ATCAAGACTG TGTCTCGGCA

161 TGGACTCATG ACGCACCGGA CAGTGAATAG TTCACTGTCC

ACCTGAGTAC TGCGTGGCCT GTCACTTATC AAGTGACAGG

201 GGTGCACACC GGACAGTCCG GTGCGGTGTC CGGTGTGCCA

CCACGTGTGG CCTGTCAGGC CACGCCACAG GCCACACGGT

241 CTAAAATTCA TCTCCGAAGC CTGCGCTCTC GGA

CG

GATTTTAAGT AGAGGCTTCG GACGCGAGAG CCT

GC

281 ACGA

TGCT

实施例6

纯化的玉米IC DNA插入物序列

以下序列是在上文鉴定的位点处限制性内切酶消化后纯化的266bp dsDNA序列(SEQ ID NO：42)：

1 TCGAGTAAAT AGCCCTCACC CACCAACTAG CCGTTACAGG

41 CAAGTTACTG CGVGATGGCG CACCGGACAG TCCGGTGCGC

81 CACCGGTGCG CCACCGGTGC GCCACCGGTG CGCCAACGGT

121 CACTTCCAAC GGCTAGTTCT GACACAGAGC CGTTGGACTC

161 ATGACGCACC GGACAGTGAA TAGTTCACTG TCCGGTGCAC

201 ACCGGACAGT CCGGTGCGGT GTCCGGTGTG CCACTAAAAT

241 TCATCTCCGA AGCCTGCGCT CTCGGA

实施例7

玉米IC DNA转录产物序列

通过将实施例6的纯化的MET玉米IC DNA插入物序列连接到具有粘性末端限制性位点和T7启动子序列的纯化的载体片段，来制备质粒。纯化的载体片段经由限制性内切酶XhoI和SpeI的消化分离自

产生的质粒用XhoI和SpeI线性化，来产生以下的318bp玉米ICDNA转录产物序列。载体序列用粗体下划线突出(SEQ ID NO：43)：

1

CTC GAGTAAATAG

41 CCCTCACCCA CCAACTAGCC GTTACAGGCA AGTTACTGCG

81 CGATGGCGCA CCGGACAGTC CGGTGCGCCA CCGGTGCGCC

121 ACCGGTGCGC CACCGGTGCG CCAACGGTCA CTTNCAACGG

161 CTAGTTCTGA CACAGAGCCG TTGGACTCAT GACGCACCGG

201 ACAGTGAATA GTTCACTGTC CGGTGCACAC CGGACAGTCC

241 GGTGCGGTGT CCGGTGTGCC ACTAAAATTC ATCTCCGAAG

281 CCTGCGCTCT CGGACTAGT

实施例8

玉米IC RNA转录产物序列

以下序列是从实施例7的DNA序列制备的318bp玉米IC RNA转录产物序列。载体序列用粗体下划线突出(SEQ ID NO：44)：

1

CUC GAGUAAAUAG

41 CCCUCACCCA CCAACUAGCC GUUACAGGCA AGUUACUGCG

81 CGAUGGCGCA CCGGACAGUC CGGUGCGCCA CCGGUGCGCC

121 ACCGGUGCGC CACCGGUGCG CCAACGGUCA CUUNCAACGG

161 CUAGUUCUGA CACAGAGCCG UUGGACUCAU GACGCACCGG

201 ACAGUGAAUA GUUCACUGUC CGGUGCACAC CGGACAGUCC

241 GGUGCGGUGU CCGGUGUGCC ACUAAAAUUC AUCUCCGAAG

281 CCUGCGCUCU CGGACUAGU

实施例9

在CT、GC和HCV分析中MET IC的用途用

探针(Applied Biosystems，Foster City，CA)对CT、GC和HCV分别进行独立的RT-PCR分析。每个分析包括处在单独的反应孔中的目标核酸(CT和GC的DNA，HCV的RNA)以及本发明的MET IC。附图2、3和4显示了扩增分析的结果(循环数对比deltaRn)。Rn，标准化的报告物信号，是报告物染料的荧光信号除以内部参考染料的荧光信号。Delta Rn(dRn)通过公式Rⁿ⁺-R^n-来确定，其中Rⁿ⁺是涉及所有成分的反应的Rn值，R^n-是未反应的样品的值。在每个图中，左侧的曲线代表目标的扩增，右侧的曲线代表IC的扩增。

Claims

1.一种用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物，包含从选自Methanobacterium thermoautrophicum(MET)或玉蜀黍(Zea mays)的生物体获得的核酸。

2.权利要求1的非竞争性内部对照物，其中所述核酸是DNA。

3.权利要求2的非竞争性内部对照物，其中所述NAT选自以下构成的组：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、沙眼衣原体(CT)和Neisseria gonorrhea(GC)。

4.权利要求1的非竞争性内部对照物，其中所述核酸是RNA。

5.权利要求4的非竞争性内部对照物，其中所述诊断NAT选自以下构成的组：丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

6.权利要求1的非竞争性内部对照物，其中所述核酸包括至少两个引物结合位点和至少一个探针结合位点。

7.一种制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物的方法，包括步骤：

(a)从Methanobacterium thermoautrophicum(MET)提取基因组DNA；

(b)利用具有至少两个限制性内切酶位点和目标特异性序列的正向和反向引物，从步骤(a)的基因组DNA产生扩增子；

(c)通过连接步骤(b)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；

(d)用与步骤(b)和(c)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产生MET内部对照DNA。

8.权利要求7的方法，进一步包括步骤：

(e)从步骤(e)的DNA制备MET内部对照RNA。

9.权利要求7的方法，其中步骤(b)和(d)的所述至少两个限制性内切酶位点相应于限制性内切酶XhoI和SpeI的序列。

10.权利要求7的方法，其中所述步骤(b)的正向引物具有SEQID NO：3的序列，步骤(b)的反向引物具有SEQ ID NO：4的序列。

11.权利要求7的方法，其中步骤(c)的启动子序列是T7启动子序列。

12.权利要求7的方法，其中所述MET内部对照DNA被用作用于以下疾病状态的DNA核酸诊断测试中的内部对照物：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、沙眼衣原体(CT)和Neisseria gonorrhea(GC)。

13.权利要求8的方法，其中所述MET内部对照RNA被用作用于以下疾病状态的RNA核酸诊断测试中的内部对照物：丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

14.一种制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物的方法，包括步骤：

(a)从玉蜀黍(玉米)提取基因组DNA；

(c)通过连接步骤(c)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；

(d)用与步骤(b)和(c)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产生玉米内部对照DNA。

15.权利要求14的方法，进一步包括步骤：

(e)从步骤(e)的DNA制备玉米内部对照RNA。

16.权利要求14的方法，其中步骤(b)和(d)的所述至少两个限制性内切酶位点相应于限制性内切酶XhoI和SpeI的序列。

17.权利要求14的方法，其中步骤(d)的启动子序列是T7启动子序列。

18.权利要求14的方法，其中所述玉米内部对照DNA被用作用于以下疾病状态的DNA核酸诊断测试中的内部对照物：甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、B型呼吸道合胞体病毒(RSV B)、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体、Neisseria gonorrhea和乙型肝炎病毒(HBV)。

19.权利要求15的方法，其中所述玉米内部对照RNA被用作用于以下疾病状态的RNA核酸诊断测试中的内部对照物：丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。

20.权利要求14的方法，其中所述步骤(b)的正向引物具有SEQID NO：27的序列，步骤(b)的反向引物具有SEQ ID NO：28的序列。