CN105074472B

CN105074472B - 用于分析物同系物的测定

Info

Publication number: CN105074472B
Application number: CN201480020437.XA
Authority: CN
Inventors: 魏铁全; W.贝兹克; E.加西亚
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2034-04-04
Also published as: EP2984489A4; CN105074472A; US20140308751A1; JP2016518598A; WO2014168826A1; EP2984489A1; JP6419161B2; EP2984489B1; ES2769899T3

Abstract

方法包括调节两种分析物同系物之一对在用于确定样品中的两种分析物同系物的总量的测定中得到的信号的量的贡献。采用一种非测定受体，其对所述两种分析物同系物中的任何一种具有更大结合亲和力，所述任何一种对信号的量的贡献要进行调节。非测定受体的量足以实现所述分析物同系物对所述信号的贡献的调节。进行用于确定两种分析物同系物的总量的测定，其中所述测定利用至少一种测定抗体。

Description

用于分析物同系物的测定

本申请要求享有于2013年4月12日提交的非临时申请美国系列号13/861,422的权益。前述申请的整体内容明确地通过引用并入本文。

背景技术

本发明涉及用于准确地确定疑似含有分析物同系物的样品中的分析物同系物的总量的组合物、方法和试剂盒。

许多小分子化合物或半抗原诸如，例如药物和维生素，以同系物形式存在，它们中的每一种直接地或通过它们的代谢产物中的一种或多种的中间性而为化合物的总生物学功能做出贡献。为了得到活性分析物的总量的准确测量，重要的是测量基本上等摩尔量的同系物形式，因为，在同系物形式的量不相等的情况下，在测定中得到的信号是畸变的，且不会代表同系物形式的总量。围绕基本上等摩尔量的分析物同系物的测量的一些问题包括，例如，难以得到同样地结合分析物同系物的抗体，和被内源性结合物质结合的分析物同系物的不相等释放。

需要用于准确的和灵敏的确定在疑似含有这类分析物的样品中以同系物形式（它们都是有活性的）存在的分析物的总量的试剂和方法。例如，需要用于准确地和灵敏地确定维生素D的同系物形式的浓度的试剂和方法。

发明概述

根据本文描述的原理的一些实例涉及这样的方法：其调节两种分析物同系物之一对在用于确定样品中的两种分析物同系物的总量的测定中得到的信号的量的贡献。在所述方法中，在测定介质中提供组合。所述组合包含：疑似含有两种分析物同系物的样品；用于进行测定的试剂，所述测定用于确定样品中的两种分析物同系物的总量，其中所述试剂包含至少一种结合所述两种分析物同系物的测定受体；和非测定受体，其对所述两种分析物同系物中的任何一种具有更大结合亲和力，所述任何一种对信号的量的贡献要进行调节。非测定受体的量足以实现所述分析物同系物对所述信号的贡献的调节。进行用于确定两种分析物同系物的总量的测定。

根据本文描述的原理的一些实例涉及确定样品中的第一种分析物同系物和第二种分析物同系物的量的方法。在所述方法中，在测定介质中提供组合。所述组合包含：疑似含有所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物的样品；试剂，其用于进行所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物的测定；和非测定受体，其对所述第一种分析物同系物或所述第二种分析物同系物中的任何一种具有更大结合亲和力，所述任何一种对信号的量的贡献要进行调节。用于进行测定的试剂包含：测定抗体，其能够结合所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物中的每一种以形成复合物；和信号产生系统的成员，其产生与所述复合物中的所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物的量有关的信号。非测定受体的量足以实现所述第一种分析物同系物或所述第二种分析物同系物对所述信号的贡献的调节。在用于形成所述复合物的条件下温育所述测定介质。确定得自所述复合物的信号的量，并与所述样品中所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物的总量关联。

根据本文描述的原理的一些实例涉及确定样品中的25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的总量的方法。在测定介质中提供组合。所述组合包含：疑似含有25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的样品，用于进行25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的测定的试剂，和对25-羟基维生素D₂具有更大结合亲和力的非测定抗体。用于进行测定的试剂包含：测定抗体，其能够结合25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃以形成复合物；和信号产生系统的成员，其产生与25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃复合物的量有关的信号。非测定抗体的量足以实现25-羟基维生素D₂对信号的量的贡献的调节。在用于形成所述复合物的条件下温育所述测定介质。确定得自所述复合物的信号的量，并与所述样品中25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的总量关联。

附图简述

图1是维生素D的同系物形式，即，25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的化学式的描绘。

特定实施方案详述

一般讨论

根据本文描述的原理的方法涉及调节两种或更多种分析物同系物对在用于确定样品中分析物同系物的总量的测定中得到的信号的量的贡献。为何分析物同系物对在测定中得到的信号的贡献可能导致样品中分析物同系物的总量的不准确确定，存在许多原因。这些原因包括，但不限于：测定抗体没有同样地结合存在于样品中的不同分析物同系物，和/或分析物同系物之一可以被置换试剂从内源性结合物质置换的事实，所述置换试剂的量大于另一种分析物同系物的量。以上两种情形引起在以下情况下产生的不等量信号的产生：分析物同系物之一对信号的量的贡献会提供错误地反映原始样品中的分析物同系物的总量的总信号量。例如，作为例证和不进行限制，存在2个为25-羟基维生素D₂的较高测定信号做出贡献的潜在因素。第一个因素是，25-羟基维生素D₂与维生素D结合蛋白的结合强度低于25-羟基维生素D₃，所以25-羟基维生素D₂更容易从维生素D结合蛋白释放并造成可被测定抗体接近的游离25-羟基维生素D₂分子的较高浓度。第二个因素是，在一些情况下，测定抗体对25-羟基维生素D₂类似物的亲和力大于25-羟基维生素D₃。两个因素一起起作用可以导致来自25-羟基维生素D₂的信号远高于来自25-羟基维生素D₃的信号，这是非等摩尔浓度的根本原因。

通过监测针对校准器（其跨越分析物的疑似目标浓度范围）得到的信号的量的差异，可以监测特定测定形式在医学决策范围的低端处的性能。例如，校准器（诸如，例如，校准器L1和校准器L2，或校准器L2和校准器L3，或校准器L1和校准器L4）的信号之间的大差异或分离是期望的。在一些实例中，可以采用5个校准器，其任意命名为L1-L5。通过如下确定信号的量，可以评价信噪比：使用不含有分析物的校准器，即任意命名的校准器L1 (背景)；和针对含有高于零的第一种已知量的分析物的校准器（任意命名的校准器L2）得到的信号的量。该评价还可以包括，使用校准器L1和含有高于零的第二种已知量的分析物的校准器（任意命名的L3）的信号的量，确定信号的量。这样的评价也可以包括使用校准器L4和L5的这类确定，其中每个校准器含有已知增加量的分析物。取决于测定形式，信号的差异可以是信号的增加或信号的减小。例如，对于竞争性测定，在大多数情况下，将存在与分析物的浓度有关的信号的减小；和，对于夹心测定，在大多数情况下，将存在与分析物的浓度有关的信号的增加。

将在从使用已知分析物浓度的校准器上测定得到的信号的量相对于每个校准器中的分析物浓度绘图，以形成校正曲线或标准曲线。将在含有未知量的信号的样品上在测定中得到的结果与校正曲线进行对比，以基于在分析物测定中得到的信号的量确定未知样品中分析物的量。

在分析物同系物或它们各自的代谢产物是有效的情况下，根据本文描述的原理的方法测量两种或更多种分析物同系物的总量。短语“分析物同系物”或“分析物的同系物形式”表示这样的分析物形式：其在结构和功能上相关，且彼此相差一个或多个化学部分，诸如，例如，亚甲基、甲基、氢、酮基和例如差向异构体。术语“有效”表示就特别的功能而言分析物的活性程度，其可以是例如生物学功能，诸如，例如骨代谢。例如，物质的生物学活性涉及物质的增强或抑制生物学功能的能力，诸如，例如，维持主体中的适当的矿物质和盐水平、细胞功能。作为例证和不进行限制，维生素D维持主体中的适当的钙和磷酸盐水平，其与钙体内稳态和骨代谢有关。

在两种或更多种同系物形式是有效的情况下，准确地评估生物样品中具有两种或更多种同系物形式的分析物的总量是特别重要的。分析物的存在可能指示，例如，疾病状态、缺乏、基因突变或与药物遗传学有关的代谢模式。例如，测量生物样品中的维生素D水平是重要的，因为维生素D缺乏与哺乳动物中的许多病症有关。例如，在婴儿中，不准确的维生素D测量结果会导致婴儿中的维生素D水平的不准确评估，这又可以导致适当补充的缺乏。重要的是测量维生素D的活性形式的总量，从而婴儿可以接受适当的维生素D治疗（如果必要的话）。

术语“维生素D”表示一组脂溶性的开环甾类化合物。在人类中，维生素D是独特的，因为它可以作为胆骨化醇(维生素D₃)或麦角钙化醇(维生素D₂)摄入，且因为当日光照射充分时身体也可以合成它(从胆固醇)。因为该后一种性质，尽管大多数人认为它是必需的营养物，有人认为维生素D是一种非必需的饮食维生素。维生素D在钙离子体内稳态的正向调节中具有重要的生理学作用。维生素D₃是由动物合成的维生素的形式。象维生素D₂一样，它也是添加到乳制品和某些食物产品中的常见补充物。在图1中描绘了25-羟基维生素D₃和25-羟基维生素D₂的结构。

饮食和内在合成的维生素D₃和维生素D₂必须经历代谢活化以产生生物活性的代谢物。在人类中，维生素D₃活化的初始步骤主要发生在肝脏中并涉及羟基化以形成中间代谢物25-羟基胆骨化醇(也被称作骨化二醇、骨化二醇（calcifediol）、25-羟基胆骨化醇或25-羟基维生素D₃)。骨化二醇是循环系统中的维生素D₃的主要形式。维生素D₂也经历向25-羟基维生素D₂的类似代谢活化。共同地，这些化合物被称作25-羟基维生素D (缩写25(OH)D)，且它们是确定维生素D状态而在血清中测量的主要代谢物；25(OH)D是需要转化成1,25(OH)D以发挥生物学功能的前激素。

根据本文描述的原理的方法提供了调节两种分析物同系物之一对在用于确定样品中的两种分析物同系物的总量的测定中得到的信号的量的贡献，特别是在采用一个受体或特异性结合对成员诸如抗体的情况下，其结合样品中的所有分析物同系物。在一些实例中，重要的是，调节来自一种同系物的信号的量超过另一种同系物的信号的量，以便使测量的总信号量反映样品中的分析物同系物的基本上等摩尔量。如上所述，围绕基本上等摩尔量的分析物同系物的测量的一些问题包括，例如，难以得到受体诸如同样地结合分析物同系物的抗体，和被内源性结合物质结合的分析物同系物的不相等释放。短语“基本上等摩尔量”是指，测定介质中的分析物同系物的量是相等的，或彼此相差不超过例如约10%、或约9%、或约8%、或约7%、或约6%、或约5%、或约4%、或约3%、或约2%、或约1%、或0%。

理想地，对于两种或更多种分析物同系物的测定，采用一种受体诸如抗体，其同样地结合两种或更多种分析物同系物。但是，在许多情况下，这样的受体难以得到，且必须使用不同样地结合两种或更多种分析物同系物的受体。在采用不同样地结合分析物同系物的受体的情况下，所述测定可以产生关于样品中的分析物同系物的总浓度的不准确结果。在这样的情况下，通常仅使用分析物同系物之一来形成校准器。如果在测定中使用的受体更强力地结合分析物同系物之一，从该分析物同系物产生更多的信号，且总信号量增加。当将该总信号量与校正曲线对比时，从校正曲线得到的分析物同系物的对应总量将高于样品中的分析物同系物的实际总量。根据本文描述的原理的方法会提供用于调节得到的信号的量使得所述信号可以与样品中分析物同系物的实际总量准确地关联的方式。

如上所述，在分析物同系物的测定中得到的不准确信号的另一个原因是被内源性结合物质结合的分析物同系物的不相等释放。许多分析物同系物被内源性结合物质结合。这样的内源性结合物质是存在于取自其来源的样品中的那些。内源性结合物质的性质依赖于例如样品的一种或多种性质、样品的来源的性质、分析物的性质和包含分析物的分子复合物的性质。

如本文中讨论的，可以通过置换试剂将内源性结合物质结合的分析物同系物从这样的物质释放。内源性结合物质包括内源性特异性结合物质和内源性非特异性结合物质。特异性结合物质是在表面上或在空腔中具有这样的区域的物质：所述区域特异性地结合分析物的特定空间和极性组构并因此被定义为与其互补，或反之亦然。特异性结合与非特异性结合有区别，因为特异性结合涉及两种不同分子中的一种对另一种的特异性识别（与其它分子的实质上更低的识别相比）。非特异性结合物质是结合分析物的物质，一般而言，借助于分子之间的非共价结合，其相对独立于特定表面结构。分析物的内源性结合物质包括，但不限于：特异性地结合分析物的蛋白，诸如，例如，抗-分析物抗体和受体，和非特异性地结合分析物的结合蛋白。在特定实例中，作为例证和不进行限制，所述分析物是维生素D，且所述内源性结合物质是维生素D结合蛋白。

在涉及内源性结合物质的情况下，可以采用置换试剂从内源性结合物质释放分析物。使用置换试剂的一个问题是，在许多情况下，所述置换试剂不会从内源性结合物质置换等量的分析物同系物。相反，与相同分析物的另一种同系物的置换相比，可以以更大的量置换一种分析物同系物。该现象促成在测定中不会得到基本上等摩尔量的信号的问题，甚至在测定所用的分析物同系物的受体基本上同样地结合测定中的待测分析物同系物的情况下。根据本文描述的原理的方法提供了用于调节得到的信号的量使得所述信号可以与样品中分析物同系物的实际总量准确地相关的方式。

如上所述，分析物同系物的测量可以在已经用置换试剂处理过的样品上进行。加入样品中的置换试剂的量是足以从内源性结合物质置换基本上所有的分析物同系物的量。短语“从内源性结合物质置换基本上所有的分析物同系物”是指，所述分析物同系物从内源性结合物质置换了至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少99%、或至少99.5%、或至少99.9%或100%，且在测定过程中可用于检测。

加入置换试剂以后，在从内源性结合物质置换基本上所有的分析物同系物的条件下将样品温育一段时间。温育的持续时间和条件依赖于例如置换试剂的一种或多种性质、分析物同系物的性质、和疑似的分析物同系物的浓度。在一些实施方案中，该步骤的温育温度可以是例如约5℃至约99℃、或约15℃至约70℃、或约20℃至约45℃。温育的时间段是例如约0.2秒至约24小时、或约1秒至约6小时、或约2秒至约1小时、或约1至约15分钟。温育可以在介质中进行，为了方便，所述介质可以是如本文所讨论的测定介质，但是不一定是。

在根据本文描述的原理的测定方法中，在测定介质中提供组合。所述组合包含：疑似含有两种分析物同系物的样品；用于进行测定的试剂，所述测定用于确定样品中的两种分析物同系物的总量，其中所述试剂包含至少一种结合所述两种分析物同系物的测定受体；和非测定受体，其对所述两种分析物同系物中的任何一种具有更大结合亲和力，所述任何一种对信号的量的贡献要进行调节。非测定受体的量足以实现预定量的所述分析物同系物对所述信号的贡献的调节。进行用于确定两种分析物同系物的总量的测定。

非测定受体是这样的物质：其优先结合一种分析物同系物胜过另一种分析物同系物，且其没有涉入形成与分析物同系物在样品中的存在或量有关的复合物。作为例证和不进行限制，所述非测定受体可以是例如抗体、分子印迹聚合物、反义RNA或反义DNA。

通过例证和不进行限制的方式，描述了根据本文描述的原理制备抗体的方法的实例。需要至少两种不同的抗体：测定抗体和非测定抗体，它们具有根据本文描述的原理的性能。所述测定抗体对疑似存在于样品中的分析物同系物表现出足够的测定结合亲和力。所述非测定抗体结合过量的分析物同系物的结合亲和力大于对非过量的分析物同系物的结合亲和力。在一些实例中，所述非测定抗体表现出对过量的分析物同系物的足够结合亲和力，但是表现出对非过量的分析物同系物的不足结合亲和力或基本上无结合亲和力。

短语“测定结合亲和力”表示测定抗体结合对应分析物同系物以产生与分析物同系物结合的测定抗体的复合物所用的强度。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各种类型和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可以包括Fab、Fv和F(ab')₂、Fab'等。另外，在适当的情况下，只要维持对特定分子的结合亲和力，可以使用免疫球蛋白的聚集体、聚合物和缀合物或它们的片段。

通过本领域众所周知的技术，诸如制备连续杂交细胞系和收集分泌的蛋白(体细胞杂交技术)，可以制备单克隆抗体。根据Köhler和Milstein, Nature265:495-497, 1975的标准技术，可以生产单克隆抗体。单克隆抗体技术的综述，参见Lymphocyte Hybridomas,Melchers, 等人编. Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977),Science 208: 692 (1980), 和Methods of Enzymology 73 (部分B): 3-46 (1981)。

在抗体制备的另一个方案中，可以将编码抗体结合位点的序列从染色体DNA切离并插入克隆载体中，所述克隆载体可以在细菌中表达以产生具有对应的抗体结合位点的重组蛋白。该方案涉及克隆和表达至少编码天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变处理过的形式。

在单克隆抗体生产的一个方案中，第一步包括用抗原（例如，用免疫原）免疫接种生产抗体的动物诸如小鼠、大鼠、山羊、绵羊或母牛。可以用或不用佐剂诸如完全弗氏佐剂或其它佐剂诸如单磷酰脂质A和合成的海藻糖二霉菌酸酯（trehalose dicorynomycolate）佐剂进行免疫接种。下一步包括从生产抗体的动物分离脾细胞和将生产抗体的脾细胞与适当的融合配偶体（通常是骨髓瘤细胞）融合，诸如通过使用聚乙二醇或其它技术。通常，使用的骨髓瘤细胞是这样的细胞：其在次黄嘌呤-胸苷(HT)培养基中正常生长，但是不可以在用于选择融合的细胞的次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长。下一步包括选择融合的细胞，通常在HAT培养基中选择。下一步包括，使用免疫测定诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或适用于筛选的其它免疫测定，筛选克隆的杂合体用于适当的抗体生产。

通过众所周知的筛选方法，可以选择如上所述对分析物同系物具有必要结合亲和力的测定抗体，作为例证和不进行限制，所述筛选方法包括例如ELISA、斑点印迹、蛋白质印迹分析、和表面等离子体共振。

如上所述，非测定受体的功能是，提供调节两种分析物同系物之一对在用于确定样品中的两种分析物同系物的总量的测定中得到的信号的量的贡献。在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定受体在测定中提供基本上等摩尔量的信号。为此目的，选择非测定受体诸如非测定抗体。例如，针对它的结合一种分析物同系物胜过另一种分析物同系物的能力(它的结合亲和力)选择非测定抗体。非测定抗体应当表现出对已知在如上所述的测定介质中过量的分析物同系物的优先结合亲和力。

因此，制备非测定抗体并借助于适当的筛选方法进行选择，使得所述非测定抗体表现出胜过另一种分析物同系物的对一种分析物同系物的足够结合亲和力，从而调节在分析物同系物的测定中得到的信号，这由于以下之一或二者：分析物同系物的测定受体的结合亲和力的不均衡，和分析物同系物之一从内源性结合物质的不相等释放。就本说明书的目的而言，测定受体对其具有更大结合亲和力或以更大量从内源性结合物质释放的分析物同系物在本文中被称作“过量的分析物同系物”，且其它分析物同系物在本文中被称作“非过量的分析物同系物”。

在一些实例中，根据本文描述的原理，所述非测定受体是非测定抗体。通过众所周知的筛选方法，可以选择如上所述对分析物同系物具有必要结合亲和力的非测定抗体，作为例证和不进行限制，所述筛选方法包括例如ELISA、斑点印迹、蛋白质印迹分析和表面等离子体共振。

短语“优先结合亲和力”意指，非测定抗体对过量的分析物同系物的结合亲和力大于非测定抗体对非过量的分析物同系物的结合亲和力。在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定抗体对过量的分析物同系物的结合亲和力以系数大于它对非过量的分析物同系物的结合亲和力，例如，约10、或约10²、或约10³、或约10⁴、或约10⁵。例如，如果非测定抗体对过量的分析物同系物的结合亲和力是约10⁹升/摩尔，非测定抗体对非过量的分析物同系物的结合亲和力可以例如小于约10⁷升/摩尔，或小于约10⁶升/摩尔。在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定抗体对非过量的分析物同系物基本上不表现出结合亲和力。短语“基本上不表现出结合亲和力”意指，在非测定抗体和非过量的分析物同系物之间基本上不形成可检测的复合物。

在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定抗体对过量的分析物同系物的结合亲和力是例如至少约10⁷升/摩尔、或至少约10⁸升/摩尔、或至少约10⁹升/摩尔、或至少约10¹⁰升/摩尔、或至少约10¹¹升/摩尔、或至少约10¹²升/摩尔、或至少约10¹³升/摩尔、或至少约10¹⁴升/摩尔。在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定抗体对过量的分析物同系物的结合亲和力是例如约10⁷至约10¹⁴升/摩尔、或约10⁷至约10¹¹升/摩尔、或约10⁷至约10¹²升/摩尔、或约10⁸至约10¹⁴升/摩尔、或约10⁸至约10¹¹升/摩尔、或约10⁸至约10¹²升/摩尔。

在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定抗体对非过量的分析物同系物的结合亲和力例如小于约10⁷升/摩尔、或小于约10⁶升/摩尔、或小于约10⁵升/摩尔、或小于约10⁴升/摩尔、或小于约10³升/摩尔、或小于约10²升/摩尔、或小于约10升/摩尔。在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定抗体对非过量的分析物同系物的结合亲和力是例如约10至约10⁶升/摩尔、或约10至约10⁵升/摩尔、或约10至约10⁴升/摩尔、或约10至约10³升/摩尔、或约10至约10²升/摩尔、或约10²至约10⁶升/摩尔。

采用的非测定受体的量足以实现过量的分析物同系物对在分析物同系物的总量的测定中得到的信号的贡献的调节。在一些实例中，测定介质中的非测定受体的量是足以实现基本上等量的对测定介质中的过量的分析物同系物和非过量的分析物同系物的信号的量。非测定受体的量取决于许多因素，作为例证和不进行限制，所述因素包括例如非测定受体的性质和对不同分析物同系物的结合亲和力、测定受体的性质和对不同分析物同系物的结合亲和力、置换试剂释放的过量的分析物同系物的量与释放的非过量的分析物同系物的量的对比、分析物同系物的性质、测定的性质、测定试剂的性质、和临床样品的性质。在一些实例中，采用的非测定受体的量根据经验来确定，且是基于以上因素中的一种或多种。在一些实例中，根据本文描述的原理，非测定受体的量是例如约1µg/mL至约100µg/mL、或约1µg/mL至约75µg/mL、或约1µg/mL至约50µg/mL、或约1µg/mL至约25µg/mL、或约1µg/mL至约10µg/mL、或10µg/mL至约100µg/mL、或约10µg/mL至约75µg/mL、或约10µg/mL至约50µg/mL、或约10µg/mL至约25µg/mL。

包含分析物同系物的介质的处理，可以作为单独步骤进行，或与分析物同系物的测定结合进行。在过量的分析物同系物的量源自如本文所讨论的释放剂对样品的处理的情况下，在用释放剂处理之后进行用非测定受体对介质的处理。在过量的分析物同系物的量源自测定抗体对分析物同系物的测定结合亲和力的不均衡的情况下，在分析物同系物的测定过程中进行用非测定受体对介质的处理。

根据本文描述的原理处理包含分析物同系物的介质的条件可能与在分析物同系物的测定中采用的那些相同。在一些实例中，在中等pH的水性缓冲介质中进行所述处理，所述介质通常提供非测定受体与过量的分析物同系物的最适结合。所述水性介质可以是单独的水，或可以包括0.1至约40体积%的共溶剂。所述介质的pH将在例如，约4至约11的范围内，或在约5至约10的范围内，或在约6.5至约9.5的范围内。所述pH经常是任何特异性结合对的结合成员的最适结合之间的折中，测定的其它试剂（诸如信号产生系统的成员）的最适pH，诸如此类。可以使用多种缓冲剂来实现期望的pH并在测定过程中维持该pH。作为例证和不进行限制，示例性的缓冲剂包括例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、TRIS、巴比妥（barbital）、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。采用的特别的缓冲剂不是至关重要的，但是在单个测定中，一种或另一种缓冲剂可以是优选的。在用非测定受体的处理中可以使用多种辅助材料。例如，除了缓冲剂以外，所述介质可以包含介质的稳定剂和采用的试剂的稳定剂。

可以在一个或多个间隔将一个或多个温育时段施加于介质，所述间隔包括在非测定受体处理中采用的各种试剂的添加之间的任何间隔。经常将介质在一定温度温育一定时间，所述温度和时间足以使非测定受体与过量的分析物同系物结合。在测量时段中，通常采用中等温度进行所述方法，且经常是恒定温度，优选室温。在一些实例中，温育温度范围是例如约5℃至约99℃、或约15℃至约70℃、或约20℃至约45℃。在一些实例中，温育的时间段是例如约0.2秒至约24小时、或约1秒至约6小时、或约2秒至约1小时、或约1分钟至约15分钟。所述时间段取决于许多因素，包括，但不限于介质的温度以及非测定受体对过量的分析物同系物和对非过量的分析物同系物（例如，在适当的情况下）的结合亲和力。

然后进行所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物的测定，以确定样品中的所述第一种分析物同系物和所述第二种分析物同系物的量。用于进行测定的试剂包含：测定受体，诸如，例如，测定抗体，其能够结合每种分析物同系物以形成复合物；和信号产生系统的成员，其产生与所述复合物中的分析物同系物的量有关的信号。非测定受体的量足以实现所述第一种分析物同系物或所述第二种分析物同系物对所述信号的贡献的调节。在用于形成所述复合物的条件下温育所述测定介质。确定得自所述复合物的信号的量，并与样品中的分析物同系物的总量关联。所述测定可以选自如在下面更详细地讨论的任何数目的测定。

测定的一般描述

以下讨论是作为例证和不进行限制。利用抗体的任何适当测定(免疫测定)可以用在根据本文描述的原理所涉及的确定中。所述测定可以不经分离(同质的)或经过分离(异质的)任何测定组分或产物而进行。异质测定经常包括一个或多个分离步骤，且可以是竞争性的或非竞争性的。所述测定可以是手工的或自动化的。

要分析的样品是疑似含有两种或更多种分析物同系物的样品。所述样品可以是生物样品或非生物样品。生物样品可以得自哺乳动物主体或非哺乳动物主体。哺乳动物主体可以是例如人类或其它动物物种。生物样品包括生物流体诸如全血、血清、血浆、痰、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊液、泪液、粘液等；生物组织诸如毛发、皮肤、切片或从器官或其它身体部分切离的组织；等。在许多情况下，所述样品是全血、血浆或血清。非生物样品包括，但不限于，废物流，例如，也可以根据本文描述的原理使用化合物进行分析。

可以在任何方便的介质中制备样品，所述介质可以是例如在下文更完整地讨论的测定介质。在一些情况下，可以将预处理应用于样品，例如，以从内源性结合物质释放分析物同系物，或以裂解血细胞。在一些实例中，在不会随后干扰测定的介质中进行这样的预处理。

在许多实施方案中，免疫测定涉及标记的试剂。涉及标记的试剂的免疫测定包括例如化学发光免疫测定、酶免疫测定、荧光偏振免疫测定、放射免疫测定、抑制测定、诱导的发光测定和荧光氧通道测定。

免疫测定的一个常规组包括使用有限浓度的测定试剂之一的免疫测定。免疫测定的另一个组包括使用过量的一种或多种主要试剂。免疫测定的另一个组是无分离的同质测定，其中在测定抗体与样品中的分析物同系物结合以后，标记的试剂调节标记信号。

如上所述，所述测定可以不经分离(同质的)或经过分离(异质的)任何测定组分或产物而进行。同质免疫测定的示例包括：EMIT®测定(Siemens Healthcare DiagnosticsInc., Deerfield, IL)，其公开在Rubenstein, 等人, 美国专利号3,817,837, 第3列第6行至第6列第64行；诱导的发光免疫测定(“LOCI®技术”)，其公开在美国专利号5,340,716(Ullman, 等人.)；免疫荧光方法，诸如在Ullman, 等人, 美国专利号3,996,345, 第17列第59行至第23列第25行中公开的那些；酶通道免疫测定(“ECIA”)，诸如在Maggio, 等人,美国专利号4,233,402, 第6列第25行至第9列第63行中公开的那些；荧光偏振免疫测定(“FPIA”)，例如，在美国专利号5,354,693中以及其它文献中公开的那些；酶免疫测定诸如酶联免疫吸附测定(“ELISA”)。异质测定的示例是在Yalow, 等人, J. Clin. Invest. 39:1157 (1960)中公开的放射免疫测定。以上公开内容都通过引用并入本文。

其它酶免疫测定是例如：Ngo和Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288讨论的酶调节介导的免疫测定(“EMMIA”)；Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem.(1984) 22:895-904公开的底物标记的荧光免疫测定(“SLFIA”)；Khanna, 等人, Clin.Chem. Acta (1989) 185:231-240公开的组合的酶供体免疫测定(“CEDIA”)；同质的颗粒标记的免疫测定诸如颗粒增强的比浊法抑制免疫测定(“PETINIA”)和颗粒颗粒增强的比浊法免疫测定(“PETIA”)等。

其它测定包括溶胶颗粒免疫测定(“SPIA”)、分散染料免疫测定(“DIA”)；金属免疫测定(“MIA”)；酶膜免疫测定(“EMIA”)；鲁米诺免疫测定(luminoimmunoassay，“LIA”)；等。其它类型的测定包括免疫传感器测定，其涉及监测在分析物结合以后试剂的光、声和电性能的变化。这样的测定包括，例如，光免疫传感器测定、声免疫传感器测定、半导体免疫传感器测定、电化学传感器免疫传感器测定、电位测定免疫传感器测定和电流计电极测定。

异质测定经常包括一个或多个分离步骤，且可以是竞争性的或非竞争性的。多种竞争性的和非竞争性的异质测定形式公开在Davalian, 等人, 美国专利号5,089,390, 第14列第25行至第15列第9行中，通过引用并入本文。在竞争性的异质测定的一个实例中，使具有抗体（针对与其结合的分析物）的支持物与含有样品的介质接触，所述样品疑似含有分析物同系物和包含标记的分析物类似物。在支持物上的测定抗体之前或伴随地，将根据本文描述的原理的非测定抗体与样品一起温育。样品中的分析物同系物与标记的分析物类似物竞争对分析物抗体的结合。在分离支持物和介质之后，通过常规技术确定支持物或介质的标记活性，并与样品中分析物的量关联。在以上竞争性异质测定的变体中，所述支持物包含分析物类似物，其与样品的分析物同系物竞争对根据本文描述的原理的测定抗体试剂的结合。

在一些实例中，对要分析的样品进行预处理以从内源性结合物质（诸如，例如，结合分析物的血浆或血清蛋白）释放分析物。例如，通过添加消化剂或释放剂或依次使用的消化剂和释放剂的组合，可以进行分析物从内源性结合物质的释放。消化剂是这样的试剂：其分解内源性结合物质，使得它们不再可以结合分析物。这样的试剂包括，但不限于：蛋白水解酶K和蛋白水解酶K和蛋白变性剂诸如，例如，去污剂(例如十二烷基硫酸钠)。作为例证和不进行限制，用于从内源性结合物质释放分析物的释放剂包括酸性的变性剂，诸如，例如水杨酸、华法令（warfarin）、磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、苯胺基萘磺酸(ANS) (包括、例如，1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)和8-苯胺基萘-1-磺酸(8-ANS))、水杨酸和以上试剂的衍生物。

用于进行消化和/或释放反应的条件（诸如，例如，持续时间、温度、pH和介质中释放剂的浓度）取决于例如分析物的性质、内源性结合物质的性质、样品的性质和释放剂的性质。一般而言，所述条件足以实现期望的作用或功能。在一些实例中，根据本文描述的原理，释放剂的有效浓度是约0.01至约20 mg/mL、或约0.01至约10 mg/mL、或约0.01至约5 mg/mL、或约0.1至约20 mg/mL、或约0.1至约10 mg/mL、或约0.1至约5 mg/mL、或约0.1至约1mg/mL。为了从内源性结合物质释放分析物而预处理样品，可以作为进行测定之前的一个单独步骤进行，或作为测定的第一个步骤进行。在任一种情况下，可能需要一种或多种试剂来停止消化剂和/或释放剂的作用。

根据本文描述的原理用于在样品上进行测定的条件包括，在通常提供最适测定灵敏度的中等pH的水性缓冲介质中进行测定。所述水性介质可以是单独的水，或可以包括0.1至约40体积%的共溶剂。例如，所述介质的pH将在约4至约11的范围内，或在约5至约10的范围内，或在约6.5至约9.5的范围内。所述pH经常是任何特异性结合对的结合成员的最适结合之间的折中，测定的其它试剂（诸如信号产生系统的成员）的最适pH，诸如此类。可以使用多种缓冲剂来实现期望的pH并在测定过程中维持该pH。作为例证和不进行限制，示例性的缓冲剂包括例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、TRIS、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。采用的特定缓冲剂不是至关重要的，但是在单个测定中，一种或另一种缓冲剂可以是优选的。

在测定方法中可以采用多种辅助材料。例如，除了缓冲剂以外，所述介质可以包含介质的稳定剂和采用的试剂的稳定剂。在一些实施方案中，除了这些添加剂以外，可以包括蛋白，诸如，例如，白蛋白；有机溶剂，诸如，例如，甲酰胺；季铵盐；聚阴离子，例如，硫酸葡聚糖；结合促进剂，例如，聚亚烷基二醇；多糖，诸如，例如，葡聚糖或海藻糖。所述介质还可以包含用于预防血凝块形成的试剂。这样的试剂是本领域众所周知的，并且包括，但不限于例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐、肝素。所述介质还可以包含一种或多种防腐剂，诸如，例如，但不限于，叠氮化钠、硫酸新霉素、PROCLIN®300、链霉素。所述介质另外可以包含一种或多种表面活性剂。如果采用的话，以上材料中的任一种以足以实现期望的作用或功能的浓度或量存在。

可以在一个或多个间隔将一个或多个温育时段施加于介质，所述间隔包括在测定（包括上述的那些）中采用的各种试剂的添加之间的任何间隔。经常将介质在一定温度温育一定时间，所述温度和时间足以允许试剂的各种组分的结合和样品中的分析物的结合（诸如，例如，非测定抗体与分析物同系物的结合，或测定抗体与分析物同系物的结合）发生。在测量时段中，通常采用中等温度进行所述方法，且经常是恒定温度，优选室温。在一些实例中，温育温度范围是例如约5℃至约99℃、或约15℃至约70℃、或约20℃至约45℃。在一些实例中，温育的时间段是例如约0.2秒至约24小时、或约1秒至约6小时、或约2秒至约1小时、或约1分钟至约15分钟。所述时间段取决于介质的温度以及各种试剂的结合速率，所述结合速率由结合速率常数、浓度、结合常数和解离速率常数确定。

本文中讨论的许多测定使用信号产生系统，其可能具有一种或多种组分，其中至少一种组分是标记。信号产生系统产生与分析物同系物在样品中的存在有关的信号。信号产生系统包括产生可测量的信号所需的所有试剂。可以在显影剂溶液中包括信号产生系统的其它组分，且可以包括，但不限于例如信号产生物质的结合所需的底物、促进剂、活化剂、化学发光化合物、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子和特异性结合物质。信号产生系统的其它组分可以是例如辅酶、与酶产物反应的物质、其它酶和催化剂。信号产生系统会提供通过外部装置、通过使用电磁辐射、理想地通过目检可检测的信号。示例性的信号产生系统描述在美国专利号5,508,178中，其有关的公开内容通过引用并入本文。

术语“标记”包括聚(氨基酸)标记和非聚(氨基酸)标记。术语“聚(氨基酸)标记部分”包括例如为蛋白的标记，诸如，例如，但不限于，酶、抗体、肽和免疫原。对于标记蛋白例如酶，分子量范围将是约10,000至约600,000、或约10,000至约300,000分子量。例如，每约200,000分子量的蛋白，经常存在至少一种根据本文描述的原理的化合物(类似物组)，或每约150,000分子量至少约1种，或每约100,000分子量至少约1种，或每约50,000分子量至少约1种。在酶的情况下，类似物组的数目经常是1至约20、约2至约15、约3至约12、或约6至约10。

作为例证和不进行限制，酶包括：氧化还原酶，诸如，例如，脱氢酶，例如，葡糖-6-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶；涉及过氧化氢的产生和过氧化氢将染料前体氧化为染料的用途的酶，诸如，例如，辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶；水解酶，诸如，例如，碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶；萤光素酶，诸如，例如，例如荧火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；转移酶；酶的组合，诸如，但不限于，糖氧化酶，例如，葡萄糖和半乳糖氧化酶，或杂环氧化酶，诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶（也就是说，例如过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶）偶联。

术语“非聚(氨基酸)标记”包括不是蛋白的那些标记。非聚(氨基酸)标记能够直接地检测或通过产生可检测信号的反应可检测到。非聚(氨基酸)标记可以是同位素或非同位素，且作为例证和不进行限制，可以是例如放射性同位素、发光的化合物(其包括，但不限于例如荧光化合物和化学发光化合物)、编码催化剂的多核苷酸、促进剂、染料、辅酶、酶底物、放射性基团和可扩增的多核苷酸序列。

在一些实例中，信号产生系统的一个成员是小有机分子，其表示分子量为约200至约2,000、或约200至约1,500、或约200至约1,000、或约200至约500的分子。这样的小有机分子包括，但不限于例如生物素、荧光分子(例如诸如荧光素和罗丹明)、化学发光的分子和二硝基苯酚。小有机分子的结合配偶体是特异性地识别和结合小分子的分子。小分子的结合配偶体由小分子的性质定义，且包括，但不限于例如抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、小有机分子的抗体(其包括，但不限于荧光分子的抗体(例如诸如荧光素的抗体和罗丹明的抗体)、化学发光的分子的抗体、二硝基苯酚的抗体。

在测定的某些实例中，利用支持物。所述支持物可以包含有机或无机的、固体或流体的、不溶于水的材料，且其可以是透明的或部分地透明的。所述支持物可以具有许多形状中的任一种，诸如，但不限于，颗粒(微粒支持物)，包括例如珠子、薄膜、膜、管、孔、条、杆、纤维或平坦表面，诸如，例如平板或纸。所述支持物可以或不可以悬浮于在其中使用它的介质中。例如，可悬浮的支持物的实例是聚合材料诸如胶乳、脂质双层或脂质体、油微滴、细胞和水凝胶和磁性颗粒。其它支持物组合物包括聚合物，诸如，例如，作为例证和不进行限制，硝化纤维素、醋酸纤维素、聚（氯乙烯）、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚（对苯二甲酸亚乙醇酯）、尼龙、聚（丁酸乙烯酯），例如，无论是单独使用还是与其它材料结合使用。所述支持物可以或不可以用例如染料、催化剂或其它可检测的基团进一步标记。

在一些实例中，所述支持物可以是颗粒。所述颗粒具有至少约0.02微米且不超过约100微米的平均直径。在一些实例中，所述颗粒具有约0.05微米至约20微米、或约0.3微米至约10微米的平均直径。所述颗粒可以是有机的或无机的、可溶胀的或不可溶胀的、多孔的或无孔的，优选地具有接近水的密度，通常是约0.7 g/mL至约1.5 g/mL，且由可以是透明的、部分地透明的或不透明的材料组成。例如，所述颗粒可以是生物学材料诸如细胞和微生物，例如，红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和大肠杆菌（E. coli）、病毒。所述颗粒还可以是包含有机和无机聚合物、脂质体、胶乳颗粒、磁性或非磁性颗粒、磷脂囊泡、乳糜微粒、脂蛋白等的颗粒。在一些实例中，所述颗粒是二氧化铬(铬)颗粒或胶乳颗粒。

化学发光颗粒是具有与其结合的化学发光化合物的颗粒。本文中使用的短语“与其结合”是指，化合物（诸如，例如，化学发光化合物）和颗粒可以通过例如直接或间接键合、吸附、吸收、掺入或溶液而结合。可以利用的化学发光化合物的实例是在美国专利号5,340,716和6,251,581中阐述的那些，它们的有关公开内容通过引用并入本文。在一些实例中，根据本文描述的原理，所述化学发光化合物是光可活化的物质，其在光的直接或敏化激发以后或在与单态氧反应以后经历化学反应以形成亚稳定的反应产物，所述产物能够分解，并同时或随后发射光，所述光经常在250-1200 nm的波长范围内。术语“光可活化的”包括“光化学可活化的”。在一些实例中，所述化学发光化合物是与单态氧反应以形成二氧杂环丁烷或二氧杂环丁烷酮的那些。后者经常是富含电子的烯烃。这样的富含电子的烯烃的示例是烯醇醚、烯胺、9-亚烷基-N-烷基吖啶满、芳基乙烯基醚、二氧杂环己烯、芳基咪唑、9-亚烷基-黄原胶和光泽精。其它化合物包括鲁米诺和其它邻苯二甲酰肼以及被保护免于经历化学发光反应（通过用光化学不稳定的保护基保护它们）的化学发光化合物，这样的化合物包括、例如，荧火虫萤光素、水通道蛋白（aquaphorin）、和鲁米诺。可以利用的这样的化学发光化合物的实例是在美国专利号5,709,994中阐述的那些，其有关的公开内容通过引用并入本文。

敏化剂颗粒是具有与其结合的敏化剂化合物的颗粒，其包括，但不限于光敏剂化合物。可以利用的敏化剂化合物的实例是在美国专利号5,340,716和6,251,581中阐述的那些，它们的有关公开内容通过引用并入本文。

光敏剂是用于产生单态氧的敏化剂，其经常通过光激发。在一些实例中，光敏剂吸收比化学发光化合物更长的波长，且具有比化学发光化合物更低的能量三重峰。光敏剂可以是光可活化的(例如，染料和芳族化合物)。光敏剂经常是包含共价键合的原子的化合物，经常具有多个共轭的双键或三键。所述化合物吸收在200-1100 nm、经常300-1000 nm、优选450-950 nm的波长范围内的光。典型的光敏剂包括，但不限于例如丙酮、二苯甲酮、9-噻吨酮、曙红、9,10-二溴蒽、亚甲蓝、金属卟啉(例如，血卟啉)、酞菁、叶绿素、玫瑰红、巴克敏斯特富勒烯，和这些化合物的衍生物。其它光敏剂的实例列举在N.J. Turro, “MolecularPhotochemistry”, 第132页, W. A. Benjamin Inc., N.Y. 1965中。光敏剂会辅助光活化，其中活化是通过单态氧。光敏剂经常吸收光，且因此，形成的激发的光敏剂会活化氧以产生单态氧，所述单态氧与化学发光化合物反应以产生亚稳定的发光的中间体。

一些已知的测定利用采用第一和第二信号产生系统(sps)成员的信号产生系统。所述sps成员可能是相关的，因为sps的一个成员的活化会产生产物（例如，光或活化的产物），所述产物导致sps的另一个成员的活化。

在这样的测定的一个实例中，sps成员包含敏化剂（诸如，例如，光敏剂）和包括化学发光化合物的化学发光组合物，其中敏化剂的活化会产生活化化学发光组合物的产物。第二sps成员经常产生可检测信号，其与结合的和/或未结合的sps成员的量（即，与或未与要检测的分析物结合的sps成员的量）有关。在一些实例中，根据本文描述的原理，敏化剂试剂或化学发光试剂中的一种包含根据本文描述的原理的抗体试剂。

样品中可以测定的分析物同系物的浓度通常在例如约10^-5至约10^-17 M、或约10^-6至约10^-14 M之间变化。考虑因素诸如测定是否是定性的、半定量的或定量的(相对于存在于样品中的分析物的量)、特定检测技术和预期的分析物浓度，通常决定了各种试剂的浓度。

测定介质中的各种试剂的浓度通常取决于例如分析物同系物的目标浓度范围和测定的性质。但是，通常根据经验确定每种试剂的终浓度，以优化测定在目标范围内的灵敏度。也就是说，重要的分析物的浓度的变化应当会提供可准确测量的信号差异。考虑因素诸如信号产生系统的性质和分析物同系物的性质通常决定了各种试剂的浓度。

如上所述，在介质中组合提供样品和试剂。尽管向介质中加入的次序可能变化，对本文描述的测定形式的一些实施方案存在一些偏好。当然，最简单的加入次序是，同时加入所有材料，并确定测定介质对信号产生的影响，如在同质测定中。可选地，可以依次组合每种试剂或试剂组。在一些实施方案中，可以在如上面讨论的每次添加以后包括温育步骤。在异质测定中，还可以在一个或多个温育步骤以后采用洗涤步骤。

根据本文描述的原理的方法的具体实例

如以上所讨论的，根据本文描述的原理的方法，涉及在疑似含有分析物同系物的样品中，确定样品中两种或更多种分析物同系物的总量。通过使用测定受体（例如，测定抗体）在样品上进行测定，测量分析物同系物的总量。在此之前或与此同时，如在上面更详细地讨论的，将样品与非测定抗体一起温育。在下面阐述的实例中，测定抗体和非测定抗体是通过上述的一种或多种程序制备和筛选的单克隆抗体。

在以下特定实例中，作为例证和不进行限制，分析物同系物是维生素D₂和维生素D₃。根据本文描述的原理的一些实例涉及确定疑似含有维生素D同系物的样品中的维生素D₂和维生素D₃的总量的方法，且可以在本文中被称作“维生素D的测定”。如本文中关于下面讨论的具体测定所使用的，术语“维生素D同系物”表示维生素D₂和维生素D₃。

在一个实例中，可以采用诱导的发光免疫测定。在美国专利号5,340,716(Ullman)中提及诱导的发光免疫测定，其公开内容通过引用并入本文。在一个方案中，所述测定使用具有与其结合的光敏剂的颗粒，其中维生素D类似物与颗粒结合(颗粒-类似物试剂)。化学发光试剂包含这样的测定抗体：其对维生素D₂和维生素D₃同系物中的每一种表现出足够的测定结合亲和力。在该实例中，测定抗体对维生素D₂和维生素D₃同系物表现出基本上等同的结合亲和力。但是，用释放剂预处理样品，并且从内源性结合物质释放的维生素D₂同系物的量大于维生素D₃同系物的量。根据本文描述的原理，将如上所述制备的非测定抗体与包含释放的同系物的介质一起温育。非测定抗体表现出对维生素D₂同系物的优先结合亲和力，其被释放剂过量释放。非测定抗体的量足以调节在测定中得到的信号的量，以补偿释放的维生素D₂同系物的量（其超过维生素D₃同系物的量）。用包含维生素D₂和维生素D₃同系物的介质的处理，可以在单独步骤中进行，或者可以与使用测定抗体的测定结合进行。

在以上的实例中，将测定抗体与小分子连接，所述小分子结合至在化学发光颗粒上的所述小分子的结合配偶体。该化学发光试剂可以预先形成或在原位形成。维生素D分析物同系物与颗粒-类似物试剂竞争对维生素D的测定抗体的结合。如果维生素D分析物同系物存在，与化学发光试剂紧密靠近的颗粒-类似物试剂的分子的数目更少。因此，将存在测定信号的下降。当两种标记紧密靠近时，光敏剂产生单态氧并活化化学发光试剂。活化的化学发光试剂随后产生光，其中在有分析物存在下观察到信号的下降。产生的光的量与形成的复合物的量相关，所述复合物的量又与存在于样品中的维生素D₂和维生素D₃同系物的总量相关。

在使用维生素D作为一个实例的诱导的发光免疫测定的另一个特定实例中，作为例证和不进行限制，所述测定使用具有与其结合的化学发光化合物的颗粒，其中维生素D类似物结合至颗粒(颗粒-类似物试剂)。采用包含测定抗体的光敏剂试剂，所述测定抗体对维生素D₂同系物表现出的结合亲和力大于它对维生素D₃同系物的结合亲和力。将测定抗体连接至小分子，所述小分子又结合至在化学发光颗粒上的小分子的结合配偶体。

在该实例中，测定抗体对维生素D₂同系物表现出的结合亲和力大于它对维生素D₃同系物的结合亲和力。用释放剂预处理样品，这会提供基本上等量的维生素D同系物从内源性结合物质的释放。根据本文描述的原理，将如上所述制备的非测定抗体与包含释放的同系物的介质一起温育。非测定抗体对维生素D₂同系物表现出优先结合亲和力，测定抗体对所述维生素D₂同系物具有更大结合亲和力。非测定抗体的量足以调节在测定中得到的信号的量，以补偿被测定抗体结合的维生素D₂同系物的量，该量大于维生素D₃同系物的量。与使用测定抗体的测定结合地进行包含维生素D₂和维生素D₃同系物的介质的处理。

维生素D₂和维生素D₃同系物二者与颗粒-类似物试剂竞争对维生素D的测定抗体的结合。如果维生素D分析物同系物存在，与光敏剂试剂紧密靠近的颗粒-类似物试剂的分子的数目更少。因此，存在测定信号的下降。当两种标记紧密靠近时，光敏剂产生单态氧并活化颗粒-类似物试剂的化学发光化合物。活化的化学发光化合物随后产生光，其中在有分析物存在下观察到信号的下降。产生的光的量与形成的复合物的量相关，所述复合物的量又与存在于样品中的维生素D₂和维生素D₃同系物的量相关。

在使用维生素D的诱导的发光测定的另一个特定实例中，作为例证和不进行限制，采用与小分子的结合配偶体缀合的光敏剂颗粒，诸如，例如，抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(其为生物素的结合配偶体)。采用包含与测定抗体连接的生物素的测定抗体试剂，所述测定抗体结合两种维生素D分析物同系物。采用化学发光试剂作为检测系统的一部分。

在该实例中，测定抗体对维生素D₂同系物表现出的结合亲和力大于它对维生素D₃同系物的结合亲和力。此外，用释放剂预处理样品，并且从内源性结合物质释放的维生素D₂同系物的量大于维生素D₃同系物的量。根据本文描述的原理，将如上所述制备的非测定抗体与包含释放的同系物的介质一起温育。非测定抗体对维生素D₂同系物表现出优先结合亲和力，测定抗体对所述维生素D₂同系物具有更大结合亲和力，且所述维生素D₂同系物从内源性结合物质释放的量大于维生素D₃同系物的量。非测定抗体的量足以调节在测定中得到的信号的量，以补偿被测定抗体结合的维生素D₂同系物的量（该量大于维生素D₃同系物的量）并补偿释放的维生素D₂同系物的量（该量超过释放的维生素D₃同系物的量）。与使用测定抗体的测定结合进行用包含维生素D₂和维生素D₃同系物的介质的处理。

将包含以上试剂的反应介质温育，以允许光敏剂颗粒的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素借助于抗生物素蛋白和生物素之间的结合而结合测定抗体试剂的生物素，并且也允许测定抗体试剂的测定抗体（其现在连接至光敏剂颗粒）之间的特异性结合，以结合样品的分析物同系物和作为化学发光试剂的一部分的分析物。所述温育还允许非测定抗体和维生素D₂分析物同系物之间的结合。然后，用光照射介质以激发光敏剂，其能够在激发态活化氧为单峰态。因为更少的化学发光试剂现在与光敏剂紧密靠近（由于分析物同系物的存在），存在更少的单态氧对化学发光试剂的活化和更少的发光。然后关于发光或发射的光的存在和/或量来检查介质，其存在与分析物同系物的存在和/或量有关，其中在有分析物存在下观察到信号的下降。产生的光的量与形成的复合物的量有关，所述复合物的量又与存在于样品中的维生素D₂和维生素D₃同系物的量有关。

作为例证和不进行限制，用于检测样品中的维生素D的测定形式的另一个实例是ACMIA测定形式。对于ACMIA测定形式，采用铬颗粒作为第一组分，所述铬颗粒被维生素D或维生素D类似物包被(铬颗粒试剂)。第二组分是包含维生素D₂和维生素D₃同系物的第一测定抗体的测定抗体试剂。在抗体试剂中，借助于连接基团将第一测定抗体连接至报告酶(例如，β-半乳糖苷酶)以形成测定抗体-酶缀合物。

在该实例中，测定抗体对维生素D₂和维生素D₃同系物表现出基本上等同的结合亲和力。但是，用释放剂预处理样品，并且从内源性结合物质释放的维生素D₂同系物的量大于维生素D₃同系物的量。根据本文描述的原理，将如上所述制备的非测定抗体与包含释放的同系物的介质一起温育。非测定抗体对释放剂过量释放的维生素D₂同系物表现出优先结合亲和力。非测定抗体的量足以调节在测定中得到的信号的量，以补偿释放的维生素D₂同系物的量（其超过维生素D₃同系物的量）。用包含维生素D₂和维生素D₃同系物的介质的处理，可以在单独步骤中进行，或者可以与使用测定抗体的测定结合进行。

用第二测定抗体试剂处理包含样品的介质，所述第二测定抗体试剂包含对每种维生素D分析物同系物表现出基本上等同的测定结合亲和力的第二测定抗体；所述第二测定抗体结合样品中的维生素D同系物。所述介质还含有如上面讨论的非测定抗体。将抗体-酶缀合物与介质中的样品混合，以允许维生素D分析物同系物结合第一测定抗体。接着，加入铬颗粒试剂以结合任何过量的抗体-酶缀合物。然后，施加磁体，其将所有铬颗粒和过量的抗体-酶从悬液拉出，并将上清液转移至最终的反应容器。将报告酶的底物加入最终的反应容器，并通过分光光度计法将酶活性测量为吸光度随时间的变化。该信号的量与样品中维生素D的两种同系物形式的量有关。

用于测定样品中的维生素D的同系物形式的另一个实例(作为例证和不进行限制)是使用顺磁颗粒作为固相的吖啶酯标记免疫测定(ADVIA免疫测定)。用于维生素D测定的本实例的检测系统包括：小分子标记的维生素D (捕获部分)，作为小分子缀合物或捕获缀合物；小分子包被的顺磁胶乳颗粒的结合配偶体，作为固相(SP)；和维生素D₂和维生素D₃同系物的吖啶酯标记的测定抗体(检测抗体)。所述小分子可以是例如生物素或荧光素，且所述各种结合配偶体可以是抗生蛋白链菌素或荧光素的抗体。所述维生素D类似物可以直接地或通过连接基团（诸如，例如，蛋白，例如，牛血清白蛋白(BSA)）连接至小分子。患者样品中的维生素D₂和维生素D₃同系物与捕获部分的维生素D类似物竞争对吖啶酯标记的检测抗-维生素D测定抗体的结合。

对疑似含有维生素D同系物的样品进行使用1,8-ANS的预处理。在该实例中，测定抗体对维生素D₂和维生素D₃同系物表现出基本上等同的结合亲和力。但是，作为用1,8-ANS预处理的结果，从内源性结合物质释放的维生素D₂同系物的量大于维生素D₃同系物的量。根据本文描述的原理，将如上所述制备的非测定抗体与包含释放的同系物的介质一起温育。非测定抗体表现出对维生素D₂同系物的优先结合亲和力，其被释放剂过量释放。非测定抗体的量足以调节在测定中得到的信号的量，以补偿释放的维生素D₂同系物的量（其超过维生素D₃同系物的量）。用非测定抗体处理包含维生素D₂和维生素D₃同系物的介质，可以在单独步骤中进行，或者可以与使用测定抗体的测定结合进行。根据伴随提供的生产商的说明书，可以使用ADVIA CENTAUR®、ADVIA CENTAUR®XP或ADVIA CENTAUR®CP设备(SiemensHealthcare Diagnostics Inc., Newark DE)进行所述测定。

根据本文描述的原理的分析物测定的另一个实例是使用顺磁颗粒作为固相的吖啶酯标记免疫测定(ADVIA免疫测定)。用于维生素D同系物测定的本实例的检测系统包括：测定抗体试剂，其包含测定抗体和与所述测定抗体连接的小分子(捕获抗体)作为捕获缀合物；顺磁胶乳颗粒，作为被测定抗体试剂的小分子的结合配偶体包被的固相(SP)；和吖啶酯标记的维生素D分析物类似物(检测半抗原)。吖啶酯标记可以直接地结合至分析物类似物以形成检测半抗原，或可以采用连接基团，其包括，诸如，例如蛋白例如BSA。样品的维生素D₂和维生素D₃同系物与吖啶酯标记的检测半抗原竞争对测定抗体的结合。

在该实例中，测定抗体对维生素D₂同系物表现出的结合亲和力大于它对维生素D₃同系物的结合亲和力。对疑似含有维生素D₂和维生素D₃同系物的样品进行使用释放剂和消化剂中的一种或多种的预处理，所述预处理会提供基本上等量的维生素D同系物从内源性结合物质的释放。根据本文描述的原理，将如上所述制备的非测定抗体与包含释放的同系物的介质一起温育。非测定抗体表现出对维生素D₂同系物的优先结合亲和力，测定抗体对所述维生素D₂同系物具有更大结合亲和力。非测定抗体的量足以调节在测定中得到的信号的量，以补偿被测定抗体结合的维生素D₂同系物的量（其大于维生素D₃同系物的量）。用包含维生素D₂和维生素D₃同系物的介质的处理，与使用测定抗体试剂的测定结合进行。

根据伴随提供的生产商的说明书，可以使用ADVIA CENTAUR®、ADVIA CENTAUR®XP或ADVIA CENTAUR®CP设备(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE)进行以上测定。在以上吖啶酯测定的变体中，所述小分子可以是例如生物素或荧光素，且所述小分子的结合配偶体可以分别是例如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素或荧光素的抗体。

检查步骤

在测定方法的一个步骤中，根据本文描述的原理关于包含分析物的同系物形式和分析物的抗体的复合物的存在来检查介质。复合物的量指示样品中分析物的同系物形式的量。

短语“测量分析物的量”表示分析物的同系物形式的定量、半定量和定性确定。定量、半定量和定性方法以及用于确定分析物的所有其它方法被视作测量分析物的量的方法。例如，认为在本发明范围内包括仅仅检测分析物在疑似含有所述分析物的样品中的存在或不存在的方法。在本发明范围内预见到术语“检测”和“确定”以及测量的其它常见同义词。

在许多实施方案中，介质的检查涉及检测来自介质的信号。信号的存在和/或量与样品中分析物的同系物形式的存在和/或量有关。特别的检测模式取决于信号产生系统的性质。如以上所讨论的，存在众多使信号产生系统的标记可以产生通过外部装置可检测的信号的方法。信号产生系统的活化取决于信号产生系统成员的性质。

在测量过程中的温度通常范围为例如约10℃至约70℃、或约20℃至约45℃、或约20℃至约25℃。在一个方案中，使用如上所述的已知维生素D分析物浓度形成标准曲线。还可以使用校准器和其它对照。

可以视觉地、通过照片、用测光表、通过分光光度计法测量发光或从任何标记产生的光，诸如通过使用光电倍增管或光电二极管，或通过任意其它方便的装置来确定其量，所述量与介质中的分析物同系物的量有关。信号的存在和/或量的检查也包括信号的检测，其通常仅仅是在其中读出信号的步骤。通常使用仪器读出信号，所述仪器的性质取决于信号的性质。所述仪器可以是、但不限于例如分光光度计、荧光计、吸收波谱仪、光度计和化学光度计。

用于进行测定的包含试剂的试剂盒

可以制备试剂盒，其用于在疑似含有分析物的同系物形式的样品部分上进行测定。所述试剂盒包含抗体试剂，其包括样品中的分析物同系物的至少一种测定抗体。所述试剂盒进一步包含根据本文描述的原理的非测定受体。非测定受体的量足以实现两种分析物同系物之一对信号的贡献的调节。所述试剂盒可以进一步包括用于进行测定的其它试剂，其性质取决于特别的测定形式。

所述试剂可以各自在单独的容器中，或可以将多种试剂组合在一个或多个容器中，取决于试剂的交叉反应性和稳定性。所述试剂盒可以进一步包括用于进行测定的其它单独包装的试剂，诸如例如另外的特异性结合对成员、信号产生系统成员和辅助试剂。

试剂盒中的各种试剂的相对量可以宽泛地变化，以提供这样的试剂浓度：其实质上优化在本发明方法过程中需要发生的反应，并进一步实质上优化测定的灵敏度。在适当的情况下，可以将试剂盒中的一种或多种试剂作为干粉（经常经过低压冻干，包括赋形剂）提供，其在溶解后将会提供具有适当浓度的试剂溶液，用于根据本文描述的原理执行使用化合物试剂的方法或测定。所述试剂盒可以进一步包括根据本文描述的原理利用试剂的方法的书面描述，所述试剂包括化合物试剂。

本文中使用的命名“第一”和“第二”是完全任意的，且不意在提示提及的部分之间的任意次序或排序或在本发明方法中添加部分的任何次序。

本文中使用的短语“至少”是指，指定的项目的数目可以等于或大于列举的数目。本文中使用的短语“约”是指，列举的数目可以相差±10%；例如，“约5”是指4.5-5.5的范围。

通过例证和不进行限制的方式，以下讨论涉及根据本文描述的原理的具体实例；具体实例无意限制本公开内容和所附权利要求的范围。可以设计众多修改和可选组合物、方法和系统，而不脱离本公开内容的精神和范围。

实施例

除非另有说明，以下实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich ChemicalCorporation (St. Louis MO)或Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI)。本文中公开的部分和百分比是按照重量/体积，除非另外指出。

定义：

mg = 毫克

g = 克

ng = 纳克

mL = 毫升

µL = 微升

µmol = 微摩尔

℃= 摄氏度

min =分钟

sec =秒

hr = 小时

w/v = 重量/体积

v/v = 体积/体积

EDA = 乙二胺

EDAC = N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐

sulfoNHS或SNHS = 磺基N-羟基琥珀酰亚胺

TLC = 薄层色谱法

HPLC = 高效液相色谱法

EDTA = 乙二胺四乙酸盐

PEG = 聚乙二醇

EtOAc =乙酸乙酯

DMF = 二甲基甲酰胺

DMSO = 二甲基亚砜

MeOP = 1-甲氧基-2-丙醇

MES = 2-(N-吗啉代)乙磺酸

DI = 蒸馏的

UPA = 超颗子分析仪（Ultra Particle Analyzer）

LOCI = 发光氧通道免疫测定（luminescent oxygen channeling immunoassay）

Ab = 抗体。

对25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃表现出基本上等摩尔测定结合亲和力的生物素化的测定抗体的制备

将维生素D抗体5H10 (绵羊单克隆抗体，得自Bioventix, Farnham, Surrey, UK)在10 mM PO₄、300 mM NaCl、pH 7.0中的溶液(0.8 mL，2.63 mg/mL)与43.2µL NHS-dPEG®4-生物素(Quanta Biodesign Ltd., Powell OH, 部分编号10200)的水溶液(2.0 mg/mL)混合。加入的生物素化试剂的量代表所述抗体对生物素化试剂的10倍摩尔挑战。将反应混合物在室温温育3小时，并然后通过加入80µL 0.5 M TRIS来淬灭反应。在Amicon®(YM10)装置中用10 mM PO₄、300 mM NaCl、pH 7.0对反应混合物进行缓冲液更换，直到流出物在260 nm的吸收≤0.03。将抗体溶液(1.04 mL，2.1 mg/mL蛋白)与10µL Proclin®300和10µL硫酸新霉素水溶液(10 mg/mL)混合，所述硫酸新霉素水溶液使用0.2 um Acrodisc®注射器式滤器(Pall Corporation)进行过滤并在2-8℃储存。

EPRM-EDA珠子的制备

将EPRM珠子(2000 mg, 20.0 mL)加入40-mL小瓶中。通过与在美国专利号7,179,660中描述的程序类似的程序，制备EPRM珠子，且化学发光化合物是具有铕螯合物的2-(4-(N,N, 双-十四烷基)-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩。将EDA (800 mg, 890µL)与10 mL MESpH 6缓冲液(“缓冲液”)和约4.2 mL 6N HCl组合。混合物的pH是，或将其调至是约6.9。在涡旋下将EDA溶液加入EPRM珠子，并将混合物在室温摇动15分钟。在15 mL小瓶中将氰基硼氢化钠(400 mg)与10 mL去离子水组合，并将所述组合加入得自以上的珠子混合物中。将混合物在37℃摇动18-20小时。将珠子转移至6个40 mL离心管。加入MES缓冲液以使体积达到35mL，并将混合物在19,000 rpm离心30 min。倾析上清液，并将珠子再悬浮于2 mL具有搅拌棒的缓冲液中，并加入另外的缓冲液至35 mL。将混合物在18瓦功率声处理30秒，使用冰保持混合物冷却。将洗涤/声处理步骤进行4次，以除去所有的活化化学品。最后一次MES缓冲液离心以后，将2 mL含有5%MeOP和0.1%Tween®20的缓冲液(“第二缓冲液”)加入用于再悬浮步骤的试管中。在声处理之前，加入另外的第二缓冲液至35 mL。将珠子悬液在19,000 rpm离心30 min。抛弃上清液。最终的声处理使用在每个试管中的12 mL第二缓冲液，以给定25mg/mL稀释液。如在UPA仪器上确定的，颗粒尺寸是277 nm。

以与在美国专利号6,153,442和美国专利申请公开号20050118727A（它们的有关公开内容通过引用并入本文）中描述的方法类似的方式，制备EPRM化学珠子（chemibead）。EPRM化学珠子包含氨基葡聚糖内层和具有游离醛官能度的葡聚糖醛外层。参见，例如，美国专利号5,929,049、7,179,660和7,172,906，它们的有关公开内容通过引用并入本文。在约5.5至约7.0、或约6的pH，在采用合适的缓冲剂（例如，MES）缓冲的水性介质中，在约0至约40℃的温度进行反应约16至约64小时的时段。通过加入合适的猝灭剂诸如，例如羧基甲氧基胺半盐酸盐(CMO)淬灭反应，并随后洗涤颗粒。

在还原胺化条件下使外葡聚糖醛层上的醛基与乙二胺反应以形成试剂EPRM-EDA，其具有包含亚乙基链和末端胺基的侧基部分（pendant moiety）。还原胺化条件包括还原剂（诸如，例如，金属氢化物）的使用。在约20℃至约100℃的反应温度在水性介质中进行反应约1小时至约48小时的时段。

25-OH维生素D₃ 3-氨基甲酸酯(25-OH维生素D₂ 3-氨基甲酸酯)的合成

在5-ml烧瓶(用箔覆盖)中将22 mg (55µmol) 25-OH VD₃（购自ChemReagents.com, Sugarland TX）、100 mg (420µmol)碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)、100µL三乙胺在1 mL无水乙腈中的混合物在氮气下在室温搅拌18小时以制备活化的25-OH VD₃。TLC (EtOAc:己烷= 2:1)表明没有起始原料剩余。通过将150 mg羧基甲氧基胺半盐酸盐(CMO)、0.3 ml三乙胺和1 ml DMF加入10 ml烧瓶中，制备悬液。在搅拌下将含有活化的25-OH VD₃的溶液逐滴加入CMO悬液中，将其继续另外18小时。施加真空以尽可能多地除去溶剂(加热浴温度应当不超过50℃)。将EtOAc (25 ml)加入残余物中，将其用2 ml盐水洗涤3次。将有机相用无水Na₂SO₄干燥并过滤；使用旋转蒸发器除去溶剂。干燥以后得到粗产物(42mg)，并通过HPLC进行纯化。在高真空下干燥以后得到纯产物(24 mg)。将产物溶解在1.2 ml无水DMSO中。将等分试样转移进小瓶，将其保持在-70℃。

EPRM-EDA和25-OH维生素D₃ 3-氨基甲酸酯的偶联以产生化学珠子试剂

将25-OH维生素D₃ 3-氨基甲酸酯(10µL在DMSO中的等分试样，如上所述制备)(0.2 mg)加入2-mL小瓶中。将EDAC (6.8 mg)和SNHS (9.4 mg) + 2.27 mL无水DMSO (3mg/mL)加入5-mL小瓶中。将EDAC/SNHS溶液(190µL)与得自以上的2-mL小瓶的内容物(1 mg/mL)组合，以制备活化的25-OH维生素D₃ 3-氨基甲酸酯。将混合物在室温旋转18小时。用3.6mL去离子水将0.4 mL的16%GAFAC®表面活性剂溶液(GAF Corporation, Wayne NJ)(0.15%)的等分试样稀释至1.6%。

组合维生素D₃(8.5 mg)和850µL DMSO (10 mg/mL)。向配有搅拌棒的10-mL圆底烧瓶(标记 3323-064B)中加入2.0 mL (200MG) EPRM-EDA，随后加入400µL (4 mg)得自以上的维生素D₃溶液。将混合物在室温搅拌过夜。

向配有搅拌棒的10-mL圆底烧瓶中加入2.0 mL (200 mg) EPRM-EDA (如上所述制备)，随后在中等搅拌下加入260µL 1.6%GAFAC®表面活性剂溶液(0.15%)。向小试管中加入504µL无水DMSO，随后加入60µL (0.06 mg)如上所述制备的活化的维生素D₃-3-氨基甲酸酯；并将混合物加入EPRM-EDA珠子混合物。珠子悬液的总DMSO含量是20%。将反应容器在室温搅拌过夜。然后，借助于渗滤方式来洗涤珠子。

用10%MeOP/1%GAFAC®/MES pH6缓冲液将每个珠子批次补充至20 mL工作容积。将混合物用5体积的缓冲液渗滤，然后用超声处理器探头在18-21瓦声处理，使用冰保持混合物冷却。渗滤/声处理继续至50体积，在35、40、45和50体积取流出物样品。将缓冲液交换至LOCI半抗原洗涤缓冲液(50 mM HEPES, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.01%硫酸新霉素,0.1%Triton®405X和0.15%Proclin®300, pH 7.2)，使用10个体积。将混合物减少至约7mL，并进行UPA。颗粒尺寸是3323-064A = 289 nm和3323-064B = 298 nm。确定固体百分比，并用LOCI半抗原洗涤缓冲液pH7.2使珠子批次达到10 mg/mL。产量是160.4 mg。

25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的总量的测定

按照LOCI测定方案，并使用含有不同量的25-羟基维生素D₃的校准器溶液，在DIMENSION®VISTA®分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL)上进行测定。在该实施例中，所述测定使用如上所述制备的化学珠子试剂作为化学发光试剂。对疑似含有维生素D的样品进行在pH 7.5的HEPES缓冲液(5 mM HEPES、4.9 mM HEPES钠、300 mM氯化钠、10%乙二醇、12.26 mM胆酸钠和0.20%PLURONIC®25R2)中用5%三氯乙酸钠和6%水杨酸钠的预处理。

预处理的条件如下：将8µL含有约45ng/mL 25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃的血清样品与以上预处理试剂和生物素化的测定抗体试剂一起温育约18分钟。然后，将25OHD3包被的化学珠子试剂加入以净化未反应的(未结合的)生物素化的测定抗体。接着，然后将抗生蛋白链菌素包被的敏化珠子（sensibead）试剂加入以产生未结合的测定抗体的LOCI信号。25-羟基维生素D浓度与LOCI信号成反比。作为预处理的结果，从内源性结合物质释放并与测定抗体结合的25-羟基维生素D₂的量是63 ng/mL，且从内源性结合物质释放的25-羟基维生素D₃的量是42 ng/mL。显而易见，释放的25-羟基维生素D₂的量大于释放的25-羟基维生素D₃的量。

使样品与如上所述制备的生物素化的测定抗体试剂反应，并然后与化学珠子试剂反应。采用维生素D抗体3A10 (小鼠单克隆抗体，得自Bioventix Inc., Farnham, Surrey,UK)作为非测定抗体（作为溶液），且非测定抗体以40µg/mL (或5H10抗体的量的53倍)的量存在以补偿释放的25-羟基维生素D₂相对于释放的25-羟基维生素D₃的量的过量。化学珠子结合没有被来自样品的分析物占据的单克隆抗体结合位点的一部分。随后，将抗生蛋白链菌素偶联的敏化剂珠子加入反应混合物中。这导致化学珠子/敏化珠子对的形成，其浓度与维生素D的两种形式(第一样品部分)或维生素D的表面形式（epi form）(第二样品部分)的浓度相反地关联。在680 nm照射以后，敏化剂珠子产生单态氧，其扩散进与敏化珠子配对的化学珠子中，与烯族染料反应并触发在大约612 nm的化学发光信号，该信号与分析物浓度相反地关联。

使用与在美国专利号6,153,442、7.022,529、7,229,842和美国专利申请公开号20050118727A中描述的方法类似的方法，制备抗生蛋白链菌素-敏化剂珠子(“敏化珠子”)。光敏剂是双-(三己基)-硅-叔丁基-酞菁。敏化珠子试剂的浓度是在含有150 mM NaCl的HEPES缓冲液（pH 8.0）中的200µg/mL。将如上所述制备的EPRM-EDA-25-OH维生素D₃颗粒试剂在含有150 mM NaCl和0.1%去污剂的HEPES缓冲液（pH 7.2）中以200µg/mL的浓度用作“化学珠子试剂”。

在时间t = 0秒，将20µL生物素化的抗体试剂和20µL水加入反应容器。在21.6秒以后加入12µL样品，随后加入8µL水。在t = 414.0秒，加入40µL化学珠子试剂，随后加入20 mL水。然后在457.2秒分配Sensibead试剂。在反应顺序开始以后601.2秒，进行测量。

使用以上测定形式，在含有不同量的25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的血清样品上进行测定。分别使用单克隆抗体5F6和6F11 (两种绵羊单克隆抗体，得自Bioventix,Farnham, Surrey, UK)替代单克隆抗体10H9，重复以上测定。将结果制成下表，并如下解释：

在本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入。

应当理解，上述的实施例仅仅是许多代表本文描述的原理的具体实施例中的一些的实例。显然，本领域技术人员可以容易地设计众多其它安排，而不脱离由下述权利要求限定的范围。

Claims

1.一种确定样品中的25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的总量的方法，所述方法包括：

(a) 提供在测定介质中的组合：

(i) 疑似含有25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的样品，

(ii) 用于进行25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的测定的试剂，其中所述试剂包含测定抗体，其能够结合25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃以形成复合物；和信号产生系统的成员，其产生与25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃复合物的量有关的信号，和

(iii) 非测定抗体，其对25-羟基维生素D₂的结合亲和力为10⁷-10¹⁴升/摩尔，对25-羟基维生素D₃的结合亲和力为10-10⁶升/摩尔，其中非测定抗体的量是1 µg/mL -100 µg/mL；

(b) 在用于形成所述复合物的条件下温育所述测定介质；

(c) 确定得自所述复合物的信号的量，和通过将所述信号量与校准曲线进行对比，将所述信号量与样品中25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃的总量关联。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号产生系统的成员是包含标记的维生素D分析物类似物，其中所述维生素D类似物能够结合所述测定抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中用于进行所述测定的所述试剂进一步包含颗粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号产生系统的成员包含光敏剂试剂，且所述测定试剂进一步包含化学发光颗粒。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述光敏剂试剂包含颗粒。