CN108251531B - Ensg00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ENSG00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用，本发明通过高通量测序发现ENSG00000267549在发生转移的骨肉瘤患者中显著上调，进一步研究发现，ENSG00000267549与骨肉瘤的转移相关。通过检测ENSG00000267549的表达水平，可以判断骨肉瘤是否发生转移。

Description

ENSG00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及ENSG00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用。

背景技术

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一种常见的恶性成骨性肿瘤，临床诊断中最常见的原发性恶性肿瘤，病患以儿童和青少年最为普遍。该肿瘤是一种源自间充质的原始转换细胞表现出成骨细胞的分化、产生恶性类骨质的激进的恶性肿瘤。骨肉瘤的瘤体常常呈梭形，瘤体的病理切面呈棕红或灰白色的鱼肉状，骨的皮质、髓质和骨膜都有可能成为受累部位。骨肉瘤按组织类型分类，可分为骨母细胞性骨肉瘤、软骨母细胞性骨肉痈和纤维母细胞性骨肉瘤。

典型的骨肉瘤在临床病例中较少见，约1000人中只有3人发病，是恶性肿瘤发病率的0.2％，是原发性骨肿瘤发病率的15％。最常见的骨肉瘤的主要部位在股骨远端，胫骨近端和近端肱骨，一半以上发病于膝盖附近。骨肉瘤发生血行转移较早，且发生率高、进展迅速。约10％至20％的患者的骨肉瘤诊断出具有转移性。骨肉瘤诊断时，大约10-20％的患者表现为有肉眼可见的转移性疾病，90％的为肺部转移。在肺部广泛受累时会出现呼吸道症状，而骨肉瘤患者的死亡原因通常是大范围的肺组织受到累及而使呼吸功能障碍、呼吸衰竭。转移还可以发生在骨组织(8％-10％)，很少发生在淋巴结。然而，80％-90％的患者被认为有微转移疾病，这是亚临床型的疾病，使用目前的诊断方法还无法检测到。

随着生物技术的发展，例如免疫治疗、基因治疗和分子靶向治疗等生物治疗方法也逐渐成为骨肉瘤的新的可行性治疗手段，研究与骨肉瘤相关的基因成为目前研究的热点，如专利CN2016106163887、CN201610616368X中研究了与骨肉瘤相关的lncRNA。尽管现今骨肉瘤治疗有了巨大进步，但近些年临床试验试图通过强化治疗或改善新药剂来提高生存率却没有达到广泛的成功。大多数的骨肉瘤主要病因不明。细胞遗传学研究表明骨肉瘤的发生涉及一些染色体的各种复杂变化，但没有任何特定模式。因此，现今研究的重点方向依然是对骨肉瘤的基本生物的认识，从而实现对骨肉瘤更深入的了解，为骨肉瘤相关药物的研发提供理论依据，指导临床治疗，以提高骨肉瘤患者的生存率。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种lncRNA诊断标志物，该诊断标志物为ENSG00000267549。

本发明的目的之二，提供一种产品，能够实现骨肉瘤是否转移的诊断，提高骨肉瘤患者的生存率和生活质量。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测ENSG00000267549的试剂在制备判断骨肉瘤转移的产品中的应用。

进一步，所述产品包括芯片和/或试剂盒。

进一步，所述产品包括通过使用RT-PCR、实时定量PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测ENSG00000267549的水平的试剂。

其中，ENSG00000267549在骨肉瘤组织中表达上调，与对照相比，当患者样本中的ENSG00000267549显著升高时，可以判断患者发生骨肉瘤发生转移或者存在转移的风险。

进一步，使用实时定量PCR检测ENSG00000267549的水平的试剂至少包括一对特异性扩增ENSG00000267549的引物。

进一步，所述特异性扩增ENSG00000267549的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明提供了一种诊断骨肉瘤转移的产品，所述产品包括检测样本中ENSG00000267549水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别ENSG00000267549的探针；或

特异性扩增ENSG00000267549的引物。

进一步，所述特异性扩增ENSG00000267549的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明提供了一种诊断骨肉瘤转移的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增ENSG00000267549的引物序列，所述引物序列如SEQ ID NO.2～3，其中高于ENSG00000267549参照水平的ENSG00000267549水平指示骨肉瘤发生转移。

进一步，所述试剂盒还包括包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

所述试剂盒还包括针对现有技术中已经报道的诊断骨肉瘤转移的基因标志物的引物和/或探针。将多种基因的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种基因指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。一种代表性的ENSG00000267549核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

应当知道，本发明的ENSG00000267549包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，“变体”是指，与对应野生型lncRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型lncRNA基因产物的一个或多个生物活性的lncRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与骨肉瘤发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于lncRNA基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)而产生的变体。

本领域人员熟知，为了保证lncRNA的稳定性，可以在lncRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对lncRNA碱基进行修饰，但是不影响lncRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响ENSG00000267549功能的条件下，对ENSG00000267549进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

在本发明中，芯片(即微阵列)包含针对ENSG00000267549特异性的一组寡核苷酸(如寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种微小RNA的表达水平。lncRNA特异性的探针寡核苷酸或对lncRNA特异性的探针寡核苷酸是指具有经选择与特定lncRNA基因产物杂交或与该特定lncRNA基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针包括DNA、RNA、PNA、ZNA、LNA，及他们的组合，或其修饰之后的形式。该寡核苷酸探针也包括被修饰的寡核苷酸骨架。一些实例中，寡核苷酸探针至少包含连续的9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或者更多个与全长或部分靶标多核苷酸互补或者相同的核苷酸序列。一条寡核苷酸探针可能包含两段或更多段互补序列。一些实例中，寡核苷酸探针的5’或3’末端有活性基团，比如氨基，用于将该探针连接到基底材料上。

根据SEQ ID NO.1所示的核酸序列，可以生成用于给定lncRNA基因产物的RNA印记杂交的合适探针。标记的DNA和RNA采用常规方法制备，例如核酸探针用下述物质标记，如放射性核素³H、³²P、³³P、¹⁴C或³⁵S，重金属，能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体如生物素、抗生物素蛋白或抗体等，荧光分子，化学发光分子、酶等。

探针可通过多种方式连接到微阵列芯片的基底材料上。这些方式包括但不限于已列出来的方式：(1)基于光刻技术的原位合成，例如Affymetrix公司生产的高密度寡核苷酸阵列；(2)在玻璃、硅、尼龙或硝酸纤维上进行中低密度的点样或者印制；(3)屏蔽选择性合成；(4)在尼龙或硝酸纤维形成的杂交膜上打点杂交。寡核苷酸也可通过液相非共价键地固定到基底材料上，可利用微孔、微管道或毛细管等结构形成液相环境。

在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。

本发明所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断骨肉瘤的lncRNA的寡核苷酸探针。将多种lncRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种lncRNA指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断骨肉瘤lncRNA的引物和/或探针。将多种lncRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种lncRNA指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。

本发明的ENSG00000267549可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达ENSG00000267549的DNA片段的载体转染细胞获得。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了ENSG00000267549的表达水平与骨肉瘤的转移相关，通过检测ENSG00000267549的水平，可以判断患者是否发生骨肉瘤转移或者患骨肉瘤转移的风险。

本发明提供了一种诊断骨肉瘤转移的产品，该产品能够在判断骨肉瘤患者是否发生转移，提高患者的生存率和生活质量。

附图说明

图1显示利用qPCR检测ENSG00000267549在骨肉瘤转移和非转移患者的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 与骨肉瘤相关的lncRNA的筛选

1、样本的收集与临床信息

收集3例骨肉瘤转移患者(肿瘤转移病灶，转移部位为肺部)和3例非转移骨肉瘤患者(肿瘤原发病灶)的肿瘤组织，患者的临床信息如表1所示。所有样本的收集经伦理委员会批准，患者知情同意。

表1患者临床信息

2、RNA样品的制备

利用Invitrogen公司的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥20ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、高通量测序

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA，利用Illumina的Truseq RNAsample Prep Kit进行cDNA文库的构建，使用Hiseq2500测序平台对cDNA文库进行测序，每个样本的产出不低于10Gb的数据。

5、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析及处理，tophat比对到参考基因组上，参考基因组来自于Ensembl V84；使用cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；cuffdiff比较原发组跟转移组的表达差异，差异基因的筛选标准为P<0.01，abs(log2(fold change))>2。

6、结果

RNA-seq结果显示，与原发组相比，骨肉瘤转移组中的ENSG00000267549表达水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2 QPCR验证差异表达的ENSG00000267549

1、根据高通量测序结果选择ENSG00000267549进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肿瘤原发患者36例，肿瘤转移患者33例。

2、RNA提取

利用Invitrogen公司的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、逆转录：

1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。

2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。

3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。

4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增ENSG00000267549的引物

正向引物：ACTGACTGTGGACAATAC(SEQ ID NO.2)

反向引物：ATCATTAGTGGCAGAGAAT(SEQ ID NO.3)

扩增snU6的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT(SEQ ID NO.4)

反向引物：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC(SEQ ID NO.5)

2)按照表2配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表2 PCR反应体系

	体积
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
正向引物	1μl
		反向引物	1μl
cDNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	8.5μl
总体积	25μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以snU6作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与原发组相比，骨肉瘤转移组样本中的ENSG00000267549的表达水平显著上调，与高通量测序结果一致(P<0.05)，提示ENSG00000267549可以作为生物标志物应用于骨肉瘤是否转移的临床诊断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 杨祚璋

<120> ENSG00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1550

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

acgggataga gttgcacacg cgcattgagg cgtgtcttcc ctggttctgc gtccgtgaag 60

cctagagatt cccgagcctg ggtcacccgg gcggtgtcgc atgtcgtctg cggggaggtt 120

ggggctgctc gcgcgaggcg ctctgggtct catttccgag gccgaaaatg ctggctccaa 180

agtggtgccc tgggagatga gggcgactcg cagattccac cctattctct gaatgggctt 240

cgagtctcca tggtaacggc ccctcccagt tcccctgtga cttcatagct gcccacggga 300

ggggagaaag ctgatgtgaa ggggctgtgg gttctcagcc aagctctgtc tttgaggcca 360

cctaccctat accactcgtc ccggaaaggg tgagccggtg acctttcacc ctctctgggc 420

ctcagtttcc ctttttgtga aataatgtct ggtacccctg ctgtgctccc ttactatttc 480

agggccccgg gcaagagaca cactctgtgt ctcagtttcc gcataggtaa agtgaggatg 540

atgttagaat ttgatgttaa aatttaggtg gtggttgtga gaattaaggg aacctcagag 600

caatggccag cacacaatga cccttcaaat gtcagcggct ttgatgatca ccattcttac 660

cttttctttg gagatttgga caagttaccg ccccaccttc ctccagggtc tttgtgtatt 720

gatctgcagg ttggatgtat tggatgttac gaccactaaa ctttcttctg agcacacacg 780

agcagtggtg ttgttctctc tgagaaatac tacaggcttt ggtgttaaga cactggaatt 840

ccggaaacct gtccctgtca taccagttgc tgtgtgacct ccgtcaatca tggttcttta 900

ctgagccctg agactccgca cgtgaaaatg gatggggatg aacttccagt ccaggcagtg 960

ccactgactt tgcttgggga cctggggcaa gctctgtggc ccagcattgc accatctgta 1020

acaacataac caaggggtgc gcaattgagc tttgaggtta atttcggtgc taaaatcccg 1080

gtcagtagtt ccgtcatctt cacagacctc accctaccca atgcccttat tgtgctccac 1140

atcccaatca acacttactg attccagatt tgtaattttt gccattgtag tgagaagtaa 1200

ttaactattt tatggttttt taaatttgaa tttttgacta tcaggattag catatttttt 1260

ttttcttcgt taaagactag tcaagtgcat tagtgaggag gggggaaaga gtagaccaag 1320

gaatttggtc tgtaactgac tgtggacaat acattggtag aactcactac ctttgagcca 1380

gccagaatct ttttattatt cactggatat tcaggttttg cctctgtaaa ttttctttca 1440

ttgccatttt tttcaaatag ttcattcaat ctttgttttc agatgtgctt tccacaatca 1500

ggttacaaat tctctgccac taatgatcat tacaattcct cttctcagcc 1550

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actgactgtg gacaatac 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcattagtg gcagagaat 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcacatat act 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgcttcacg aatttgcgtg tc 22

Claims (5)

1.检测ENSG00000267549表达水平的试剂在制备判断骨肉瘤转移的产品中的应用，其特征在于，所述ENSG00000267549的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过使用RT-PCR、实时定量PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测ENSG00000267549的表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，使用实时定量PCR检测ENSG00000267549的表达水平的试剂包括一对特异性扩增ENSG00000267549的引物。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增ENSG00000267549的引物序列如SEQ ID NO.2~3所示。

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