CN114480632B - 人微卫星不稳定位点的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人微卫星不稳定(MSI)位点的检测方法及其应用。本发明公开了用于检测MSI的引物、探针、检测体系。本发明方法和试剂盒，可用于检测肿瘤患者是否存在MSI‑H，并根据检测结果来指导用药或指导风险评估，具有高灵敏度、高特异性、抗干扰能力强等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域，具体地，涉及人微卫星不稳定位点的检测方法及其应用。
背景技术
DNA的错配修复(mismatch repair,MMR)基因突变或启动子甲基化是引发癌症的重要原因之一。MMR基因编码的蛋白质在DNA复制过程中对碱基错配进行监察，以避免错误的发生。错配修复蛋白包括MutS和MutL两大家族，前者包括MSH2/MSH3和MSH6等，后者包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2。MSH2和MLH1分别与其同源错配修复蛋白组成复合体以发挥作用。例如，MSH2分别与MSH6、MSH3组成复合体MutSα、MutSβ；MLH1则分别与PMS2、PMS1或MLH3形成复合体MutLα、MutLβ或MutLγ。MutSα或MutSβ错配修复碱基的步骤如下：识别错配碱基后，与DNA碱基结合，再与MutL结合，激活ATP酶，水解错配的碱基，同时激活核酸内切酶1，切除并修复错配的碱基。
微卫星(microsatellite)是一种短串联重复序列，每单元长度在1～6bp之间。其广泛存在于原核及真核生物基因组中，具有较高的遗传稳定性。但在细胞的错配修复基因功能发生异常时，子代细胞微卫星的重复核苷酸数量可增多或减少，导致微卫星的长度发生变化，这种现象称微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)。
错配修复基因发生突变或启动子甲基化可引起DNA错配修复功能的降低，导致MSI。很多重要的生长调节相关基因，如Ⅱ型TGF-β、IGF2R、PTEN、BAX，其编码区或启动子区含有微卫星。错配修复异常导致的MSI可引起这些基因在复制过程中发生错义突变或移码突变，使得这种复制错误不断累积，成为导致肿瘤发生的重要因素。因此MSI可作为肿瘤的分子标志物。目前，已在多种肿瘤中发现了高频率的MSI，如结直肠癌、胃癌、小肠癌、子宫内膜癌等。
此外，目前虽然有一些MSI检测的方法，但现有MSI检测技术操作繁琐，样品之间容易相互污染，耗时长，阳性判读主观性强，且对于样本的类型与质量要求高，大多需要提供组织样本。
综上所述，本领域迫切需要开发一种高灵敏度、高特异性、消除样品污染可能性、抗干扰能力强的检测肿瘤MSI的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏度、高特异性、消除样品污染可能性、抗干扰能力强的检测肿瘤MSI的方法。
本发明还提供了一种人微卫星不稳定(MSI)位点的检测方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种人微卫星不稳定(MicrosatelliteInstability，MSI)位点检测试剂的用途，用于制备一种诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断MSI相关疾病和/或用于对MSI相关疾病进行预后；
其中，所述的MSI位点选自下组A的一个或多个位点：
(Z1)chr3:30650236-30650508；
(Z2)chr11:106739898-106740117；
(Z3)chr16:18841298-18841518；
(Z4)chr17:19411505-19411722；
(Z5)chr20:62921533-62921750；
(Z6)chr2:47408320-47408461；
(Z7)chr2:147906719-147906938；
(Z8)chr6:142407071-142407290；
(Z9)chr14:93268657-93268877；
(Z10)chr20:47779916-47780134；
(Z11)chr7:143306180-143306440；
(Z12)chr1:201819424-201819543；
(Z13)chr1:201771449-201771558；
(Z14)chr2:61827581-61827677；
(Z15)chr2:147857500-147857584；
(Z16)chr4:82821524-82821646；
(Z17)chr5:172998578-172998712；
(Z18)chr6:142337918-142338138；
(Z19)chr14:93244766-93244900；
(Z20)chr15:45593287-45593508；
(Z21)chr15:33349068-33349160；
(Z22)chr15:33764931-33765150；
(Z23)chr16:18854033-18854164。
在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：引物、探针、向导RNA(guild RNA，用于CRISPR)、芯片、或其组合。
在另一优选例中，所述的MSI位点选自下组：
(Z1)chr3:30650236-30650508；
(Z2)chr11:106739898-106740117；
(Z3)chr16:18841298-18841518；
(Z4)chr17:19411505-19411722；
(Z5)chr20:62921533-62921750；
(Z6)chr2:47408320-47408461；
(Z7)chr2:147906719-147906938；
(Z8)chr6:142407071-142407290；
(Z9)chr14:93268657-93268877；
(Z10)chr20:47779916-47780134；
(Y1)Z1～Z10的任意组合。
在另一优选例中，所述的MSI位点包括选自Z1～Z5中至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，或5个。
在另一优选例中，所述的MSI位点包括Z1、Z2、Z3、Z4和Z5。
在另一优选例中，所述的MSI位点包括选自Z1～Z10中至少1个，至少2个，至少3个。
在另一优选例中，所述的MSI位点还包括除Z1～Z10的额外的MSI位点。
在另一优选例中，所述的MSI位点包括(a)选自Z1～Z5中的一个或多个(如2、3、4、或5)位点；和(b)除Z1～Z5的额外的MSI位点。
在另一优选例中，所述的MSI位点包括(a)Z1、Z2、Z3、Z4和Z5；和(b)除Z1～Z5的额外的MSI位点。
在另一优选例中，所述的额外的MSI位点选自下组：BAT-26、BAT-25、MONO-27、NR-21、NR-24、D5S346、D2S123、D17S250或其组合。
在另一优选例中，所述的MSI相关疾病为肿瘤或癌症。
在另一优选例中，所述的肿瘤或癌症选自下组：结直肠癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、胃癌、小肠癌、宫颈癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胆囊癌、睾丸癌、前列腺癌、输卵管癌、外阴癌、肾上腺皮质癌、原发性腹腔肿瘤、胆管癌、乳腺癌、神经内分泌肿瘤、胸腺癌、甲状腺癌、小细胞肺癌、原发未知的肿瘤等。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于选自下组的检测：血清检测、血浆检测、细胞检测、组织样品检测。
在另一优选例中，所述的检测为PCR检测或测序检测；较佳地，为数字PCR(digitalPCR，ddPCR)检测。
在另一优选例中，所述的检测包括单一检测或多重检测(如n重检测，其中，n为2-20的任一正整数，较佳地n为3-15，更佳地5-10)。
在另一优选例中，所述的多重检测包括：在一个反应体系中进行多重扩增，并随后进行检测。
较佳地，所述的“随后进行检测”包括荧光检测、毛细管电泳、测序、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测人微卫星不稳定(MicrosatelliteInstability，MSI)位点的试剂，所述位点选自hg38染色体中的位点1～位点10(SEQ IDNO.:1～10)；其中，所述试剂选自下组：
(a)用于检测chr3位点1(SEQ ID NO.:1)MSI的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID NO.:11和12所示的引物；
(b)用于检测chr11位点2(SEQ ID NO.:2)MSI的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID NO.:19和20所示的引物；
(c)用于检测chr16位点3(SEQ ID NO.:3)MSI的第三引物对，其中第三引物对包括SEQ ID NO.:23和24所示的引物；
(d)用于检测chr17位点4(SEQ ID NO.:4)MSI的第四引物对，其中第四引物对包括SEQ ID NO.:25和26所示的引物；
(e)用于检测chr20位点5(SEQ ID NO.:5)MSI的第五引物对，其中第五引物对包括SEQ ID NO.:29和30所示的引物；
(f)用于检测chr2位点6(SEQ ID NO.:6)MSI的第六引物对，其中第六引物对包括SEQ ID NO.:13和14所示的引物；
(g)用于检测chr2位点7(SEQ ID NO.:7)MSI的第七引物对，其中第七引物对包括SEQ ID NO.:15和16所示的引物；
(h)用于检测chr6位点8(SEQ ID NO.:8)MSI的第八引物对，其中第八引物对包括SEQ ID NO.:17和18所示的引物；
(i)用于检测chr14位点9(SEQ ID NO.:9)MSI的第九引物对，其中第九引物对包括SEQ ID NO.:21和22所示的引物；
(j)用于检测chr20位点10(SEQ ID NO.:10)MSI的第十引物对，其中第十引物对包括SEQ ID NO.:27和28所示的引物；
上述(a)至(j)任一项的组合。
在另一优选例中，所述的位点1所在序列位于chr3:30650236-30650508。
在另一优选例中，所述的位点2所在序列位于chr11:106739898-106740117。
在另一优选例中，所述的位点3所在序列位于chr16:18841298-18841518。
在另一优选例中，所述的位点4所在序列位于chr17:19411505-19411722。
在另一优选例中，所述的位点5所在序列位于chr20:62921533-62921750。
在另一优选例中，所述的位点6所在序列位于chr2:47408320-47408461。
在另一优选例中，所述的位点7所在序列位于chr2:147906719-147906938。
在另一优选例中，所述的位点8所在序列位于chr6:142407071-142407290。
在另一优选例中，所述的位点9所在序列位于chr14:93268657-93268877。
在另一优选例中，所述的位点10所在序列位于chr20:47779916-47780134。
在另一优选例中，所述检测人微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)的位点优选为位点1至位点5。
在另一优选例中，所述试剂还包括：
(a1)与第一引物对配合使用的第一探针，其中所述的第一探针选自下组：SEQ IDNO.:31所示的探针、SEQ ID NO.:32所示的探针或其组合；和/或
(b1)与第二引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：SEQ IDNO.:39所示的探针、SEQ ID NO.:40所示的探针、或其组合；和/或
(c1)与第三引物对配合使用的第三探针，其中所述的第三探针选自下组：SEQ IDNO.:43所示的探针、SEQ ID NO.:44所示的探针、或其组合；和/或
(d1)与第四引物对配合使用的第四探针，其中所述的第四探针选自下组：SEQ IDNO.:45所示的探针、SEQ ID NO.:46所示的探针、或其组合；和/或
(e1)与第五引物对配合使用的第五探针，其中所述的第五探针选自下组：SEQ IDNO.:49所示的探针、SEQ ID NO.:50所示的探针、或其组合；和/或
(f1)与第六引物对配合使用的第六探针，其中所述的第六探针选自下组：SEQ IDNO.:33所示的探针、SEQ ID NO.:34所示的探针、或其组合；和/或
(g1)与第七引物对配合使用的第七探针，其中所述的第七探针选自下组：SEQ IDNO.:35所示的探针、SEQ ID NO.:36所示的探针、或其组合；和/或
(h1)与第八引物对配合使用的第八探针，其中所述的第八探针选自下组：SEQ IDNO.:37所示的探针、SEQ ID NO.:38所示的探针、或其组合；和/或
(i1)与第九引物对配合使用的第九探针，其中所述的第九探针选自下组：SEQ IDNO.:41所示的探针、SEQ ID NO.:42所示的探针、或其组合；和/或
(j1)与第十引物对配合使用的第十探针，其中所述的第十探针选自下组：SEQ IDNO.:47所示的探针、SEQ ID NO.:48所示的探针、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一探针到第十探针为单链的核酸探针。
在另一优选例中，所述第一探针到第十探针的结构(5'-3')如式I所示：
L1-L2-L3 I
其中，
L1为荧光基团而L3为淬灭基团；或者L3为荧光基团而L1为淬灭基团；
L2为核苷酸的特异性互补核酸序列；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
在另一优选例中，所述的L2特异性核酸序列特异性靶向hg38中的位点1到位点10。
在另一优选例中，所述的L2含有锁核苷酸修饰。
在另一优选例中，所述的L2的序列选自下组：
CACCAGGCTTTTTTTTTTCCTTCA(SEQ ID NO.:31)；
CAGCATCTTCCAGAATAAAGTC(SEQ ID NO.:32)；
TTGAGAGGCACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATG(SEQ ID NO.:39)；
AGTCTTGCTCTGTCACC(SEQ ID NO.:40)；
TTGAGGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAC(SEQ ID NO.:43)；
TTGCTCTGTCGCCCATGCT(SEQ ID NO.:44)；
TCTAAATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCCAAGGAGAG(SEQ ID NO.:45)；
AAACAGAGCTTCATGGGAAAC(SEQ ID NO.:46)；
CAAATTGGAGCTGCAGCCAATTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO.:49)；
CCTGGGCGACAGAGACCC(SEQ ID NO.:50)；
TAATGTACTTTTTTTTTTTTTAAGG(SEQ ID NO.:33)；
CATGTAATATCTCAAATCT(SEQ ID NO.:34)；
TCAAGTCCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTTTA(SEQ ID NO.:35)；
ATACATGTGCAGAACATGCAGGT(SEQ ID NO.:36)；
ATGCTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGAGACG(SEQ ID NO.:37)；
CATTCTCCTGTAAATTAAC(SEQ ID NO.:38)；
ACTTAGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGA(SEQ ID NO.:41)；
TTGCTCAGCCGCCCAGG(SEQ ID NO.:42)；
CCCTAGTTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGA(SEQ ID NO.:47)；
TGACTCTGTTGCCCAGGCTG(SEQ ID NO.:48)。
在另一优选例中，所述的荧光基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和中部。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述的5'端、3'端、和/或中部。
在另一优选例中，所述荧光基团包括与DNA探针交联的荧光基团。
在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、HEX、FITC、BODIPY-FL、G-Dye100、FluorX、Cy3、Cy5、Texas Red，或其组合。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：DABCYL、TAMRA、BHQ 1、BHQ 2、BHQ3、MGB、BBQ-650、TQ1-TQ6、QSY 7carboxylic acid、TQ7、eclipse，或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有在本发明的第一方面所述的用于检测MSI位点的检测试剂。
在另一优选例中，所述的MSI位点选自组A的一个或多个位点(即Z1～Z23中的一个或多个)，优选地所述的MSI位点为选自Z1～Z10中的一个或多个。
在另一优选例中，所述试剂盒用于检测来自肿瘤细胞、肿瘤组织或疑似肿瘤组织中人DNA样品中的MSI位点。
在另一优选例中，所述的产品是针对循环游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)样本进行检测。
在另一优选例中，所述的cfDNA来自对象的血液、血浆、或血清。
在另一优选例中，所述的对象为肿瘤患者。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结直肠癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、胃癌、小肠癌、宫颈癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胆囊癌、睾丸癌、前列腺癌、输卵管癌、外阴癌、肾上腺皮质癌、原发性腹腔肿瘤、胆管癌、乳腺癌、神经内分泌肿瘤、胸腺癌、甲状腺癌、小细胞肺癌、原发未知的肿瘤等，或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种检测试剂的组合，所述的检测试剂组合包括用于检测人微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)位点的n种检测试剂，其中，所述的MSI位点选自组A的位点，并且n为≥2的正整数。
较佳地，n为2-25，更佳地n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23。
在另一优选例中，所述的MSI位点选自组A的一个或多个位点(即Z1～Z23中的一个或多个)，优选地所述的MSI位点为选自Z1～Z10中的一个或多个。
在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：引物、探针、芯片、或其组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂的组合为检测Z1～Z5的MSI位点的检测试剂所构成的组合。
在本发明的第五方面，提供了一种检测待测样本中MSI的方法，包括步骤：
(S1)提供一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有作为模板的待测样本、以及用于扩增的引物对，所述的引物对选自下组：
(a)用于检测chr3位点1(SEQ ID NO.:1)MSI的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID NO.:11和12所示的引物；
(b)用于检测chr11位点2(SEQ ID NO.:2)MSI的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID NO.:19和20所示的引物；
(c)用于检测chr16位点3(SEQ ID NO.:3)MSI的第三引物对，其中第三引物对包括SEQ ID NO.:23和24所示的引物；
(d)用于检测chr17位点4(SEQ ID NO.:4)MSI的第四引物对，其中第四引物对包括SEQ ID NO.:25和26所示的引物；
(e)用于检测chr20位点5(SEQ ID NO.:5)MSI的第五引物对，其中第五引物对包括SEQ ID NO.:29和30所示的引物；
(f)用于检测chr2位点6(SEQ ID NO.:6)MSI的第六引物对，其中第六引物对包括SEQ ID NO.:13和14所示的引物；
(g)用于检测chr2位点7(SEQ ID NO.:7)MSI的第七引物对，其中第七引物对包括SEQ ID NO.:15和16所示的引物；
(h)用于检测chr6位点8(SEQ ID NO.:8)MSI的第八引物对，其中第八引物对包括SEQ ID NO.:17和18所示的引物；
(i)用于检测chr14位点9(SEQ ID NO.:9)MSI的第九引物对，其中第九引物对包括SEQ ID NO.:21和22所示的引物；
(j)用于检测chr20位点10(SEQ ID NO.:10)MSI的第十引物对，其中第十引物对包括SEQ ID NO.:27和28所示的引物；
上述(a)至(j)任一项的组合。
(S2)对步骤(S1)的所述PCR反应体系进行PCR反应，从而获得扩增产物；
(S3)对步骤(S2)中产生的扩增产物进行分析，从而获得所述待测样本MSI情况；其中，以检测的位点数P总＝5为例，
若样本中的MSI位点数PMSI≥2，则判定为高度不稳定(MSI-H)；
若样本中的MSI位点数PMSI＝1，则判定为低度不稳定(MSI-L)；
若样本中的MSI位点数PMSI＝0，则判定为稳定(MSS)。
在另一优选例中，若检测的位点数P总≥5时，样本中的MSI位点数百分比为P(PMSI/P总)，
若P≥40％时，则判定为高度不稳定(MSI-H)；
若10≤P＜40％时，则判定为低度不稳定(MSI-L)；
若P＝0时，则判定为稳定(MSS)。
在另一优选例中，所述的分析为定性分析、定量分析或半定量分析。
在另一优选例中，所述的反应体系为测序反应体系，包括一代、二代、三代测序反应体系。
在另一优选例中，所述的PCR反应体系为数字PCR反应体系。
在另一优选例中，所述的数字PCR为ddPCR。
在另一优选例中，所述的方法为体外方法。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A-1H显示了293T和HCT116细胞DNA中40个位点对引物PCR电泳结果(M：DNAMarker)。
图2A-2E显示了筛选的5个位点的数字PCR二维图；其中，A图为SEQ ID NO.:1的数字PCR二维图；B图为SEQ ID NO.:2的数字PCR二维图；C图为SEQ ID NO.:3的数字PCR二维图；D图为SEQ ID NO.:4的数字PCR二维图；E图为SEQ ID NO.:5的数字PCR二维图。其中，灰色为无扩增片段，绿色为阳性信号，橙色为阴性信号。
图3A-3E显示了HCT-116细胞系MSI检测的数字PCR二维图；其中，A图为位点1(SEQID NO.:1)；B图为位点2(SEQ ID NO.:2)；C图为位点3(SEQ ID NO.:3)；D图为位点4(SEQ IDNO.:4)；E图为位点5(SEQ ID NO.:5)。
图4A-4E显示了RKO细胞系MSI检测的数字PCR二维图；其中，A图为位点1(SEQ IDNO.:1)；B图为位点2(SEQ ID NO.:2)；C图为位点3(SEQ ID NO.:3)；D图为位点4(SEQ IDNO.:4)；E图为位点5(SEQ ID NO.:5)。
图5A-5E显示了SW48细胞系MSI检测的数字PCR二维图；其中，A图为位点1(SEQ IDNO.:1)；B图为位点2(SEQ ID NO.:2)；C图为位点3(SEQ ID NO.:3)；D图为位点4(SEQ IDNO.:4)；E图为位点5(SEQ ID NO.:5)。
图6A-6E显示了病例SY029的MSI检测结果的数字PCR二维图；其中，A图为位点1(SEQ ID NO.:1)；B图为位点2(SEQ ID NO.:2)；C图为位点3(SEQ ID NO.:3)；D图为位点4(SEQ ID NO.:4)；E图为位点5(SEQ ID NO.:5)。
图7A-7E显示了病例HP306的MSI检测结果的数字PCR二维图；其中，A图为位点1(SEQ ID NO.:1)；B图为位点2(SEQ ID NO.:2)；C图为位点3(SEQ ID NO.:3)；D图为位点4(SEQ ID NO.:4)；E图为位点5(SEQ ID NO.:5)。
图8A-8B显示了病例SY029的MSI检测结果的数字PCR二维图；其中，A图为病例SY029血液样本位点5的检测结果；B图为病例SY029组织样本位点5的检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次鉴别出多个新颖的MSI位点。研究表明，这些新的MSI位点与MSI相关疾病(如结肠癌等肿瘤)存在高相关性，因此可用于MSI相关疾病的辅助诊断和/或预后。此外，本发明人还对基于这些新MSI位点的引物和/或探针序列进行优化，再结合数字PCR等检测方法，有效提高MSI检测效果并可用血浆/血清样本进行检测，从而突破了现有基因突变检测技术中病理组织作为起始材料、准确度低、灵敏度低等问题。在此基础上，本发明人完成了本发明。
具体地，本发明选取了人基因组中40个由单核苷酸重复(polyA或polyT)组成的微卫星位点，分别设计扩增引物对，在MSI不稳定的结直肠癌细胞株中进行PCR扩增。从扩增结果筛选的微卫星位点中，进一步选取了最优的10个微卫星位点，设计了能同时检测到稳定型及不稳定型微卫星位点的探针，对引物和探针序列进行优化，采用优化后的引物和探针进行数字PCR，并优化出低频检出的最佳条件。应用该方法在原发结直肠癌病人肿瘤组织、血液等样本中进行了验证。本发明的MSI检测方法具有高特异性和高灵敏度，操作快捷方便，判读简单，不仅可以准确检测组织、体液样本，还可以处理血浆/血清等难度高的样本，用于不同样本的MSI液体活检。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“血液”可以为血浆、血清，但不包括血细胞。
如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
微卫星位点
微卫星(microsatellite)是一种短串联重复序列，每单元长度在1～6bp之间。其广泛存在于原核及真核生物基因组中，具有较高的遗传稳定性。但在细胞的错配修复基因功能发生异常时，子代细胞微卫星的重复核苷酸数量可增多或减少，导致微卫星的长度发生变化，这种现象称微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)。
人类基因组中有许多微卫星位点。1998年，MSI国际研究合作组织推荐对BAT26、BAT25、D5S346、D2S123和D17S250五个位点进行检测。以结直肠癌为例，约15％的结直肠癌经MSI途径发生，其中3％左右为家族遗传性(Lynch综合征)，12％为散发性。根据微卫星位点不稳定的数量，将结直肠癌分为高频MSI(MSI-H，具有两个或两个以上位点改变)、低频MSI(MSI-L，仅有一个位点发生改变)以及微卫星稳定型(MSS，没有位点发生改变)。由于在临床表现和病理改变上，MSI-L结直肠癌与MSS肿瘤无明显差别，因此MSI-L结直肠癌通常被归入MSS肿瘤型。临床研究发现，MSI-H结直肠癌发生转移的风险较低，提示预后好于MSS结直肠癌；MSI-H结直肠癌对5-氟尿嘧啶和顺铂等化疗药物不敏感，而对伊立替康等化疗药物敏感，同时MSI结直肠癌对放疗比较敏感。
使用本发明方法检测结直肠癌患者MSI情况，若检测结果具有两个或两个以上位点发生改变，则判定为MSI-H，提示患者预后良好，且不宜采用5-氟尿嘧啶和铂类为主的治疗方案，可以考虑伊立替康等化疗药物；若检测结果为MSI-L(仅有一个位点发生改变)或MSS(没有位点发生改变)，则提示患者预后情况可能不佳，也不排斥5-氟尿嘧啶和铂类为主的治疗方案。
如本文所用，本发明中“新的有效位点”，指人基因组中挑选的40个单核苷酸重复(polyA或polyT)位点中，经设计引物PCR筛选，与人正常细胞相比，在MSI不稳定的结直肠癌细胞株中能被低频检出的位点。在另一优选例中，所述MSI位点中“新的有效位点”为选自实施例1表4中的组A：
(Z1)chr3:30650236-30650508
(Z2)chr11:106739898-106740117
(Z3)chr16:18841298-18841518
(Z4)chr17:19411505-19411722
(Z5)chr20:62921533-62921750
(Z6)chr2:47408320-47408461
(Z7)chr2:147906719-147906938
(Z8)chr6:142407071-142407290
(Z9)chr14:93268657-93268877
(Z10)chr20:47779916-47780134
(Z11)chr7:143306180-143306440
(Z12)chr1:201819424-201819543
(Z13)chr1:201771449-201771558
(Z14)chr2:61827581-61827677
(Z15)chr2:147857500-147857584
(Z16)chr4:82821524-82821646
(Z17)chr5:172998578-172998712
(Z18)chr6:142337918-142338138
(Z19)chr14:93244766-93244900
(Z20)chr15:45593287-45593508
(Z21)chr15:33349068-33349160
(Z22)chr15:33764931-33765150
(Z23)chr16:18854033-18854164
数字PCR(digital PCR)技术
数字PCR(digital PCR)技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，扩增结束后对各个微滴的荧光信号进行分析，有核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
数字PCR与常规的qPCR相比，其能够精确地定量分析和高灵敏度地检测靶核酸分子。分析常规qPCR的结果的方法是模拟方法，其中，所述数字PCR方法，其结果是通过数字方法(因为得到的信号具有“0”或“1”的数值)分析的，具有可分析大体积样本、可同时检测不同样本以及同时进行不同测试的优点。数字PCR技术是一种可使用不具有标准曲线的单分子计数法来绝对定量DNA样本的技术，并且可以通过PCR对每孔单个液滴进行更精确的绝对定量(参见Gudrun Pohl和le-Ming Shih，数字PCR的原理和应用(Principle andapplications of digital PCR)，Expert Rev.Mol.Diagn.4(1),41-47(2004))。数字PCR具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。
在数字PCR中，含有经制备从而可用于稀释至平均拷贝数目为0.5-1的样本基因模板、扩增引物和荧光探针的各液滴分配到单个孔中，并进行微乳液PCR。然后，显示荧光信号的孔计数为数值“1”，因为具有基因拷贝数目为1的样本分配到所述孔中并且扩增后显示荧光信号，而没有显示信号的孔计数为“0”，因为具有基因拷贝数目为0的样本分配到所述孔中，由于无扩增，不显示荧光信号。采用这种方式，可以实现绝对定量。
引物和探针的修饰
在本发明中，所述引物的核酸序列包括未修饰的或经修饰的的引物序列。
优选地，本发明人通过对探针用锁核苷酸进行修饰，可以显著提高探针的特异性，从而提高检测结果的灵敏度和特异性。
在本发明的一个优选例中，所述修饰的方式选自：磷酸化(Phosphorylation)、生物素(Biotin)、地高新(Digoxigenin)、内部氨基修饰、5'氨基修饰、3'氨基修饰、巯基(Thiol)、间臂(Spacer)、硫代(Phosphorthioate)、脱氧脲嘧啶(DeoxyUridine，dU)、脱氧次黄嘌呤(deoxyInosine，dI)、或其组合。
磷酸化修饰：5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
生物素修饰：引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
地高新修饰：地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交(Southern blotting)、DNA-RNA杂交(Northern blotting)、斑点杂交(Dotblotting)、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析(ELISA)。
内部氨基修饰：主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶)，目前提供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin修饰。
5'氨基修饰：可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片(DNAMicroarray)和多重标记诊断系统。目前提供5'C6氨基修饰和5'C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
3'氨基修饰：目前提供3'C6氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
巯基修饰：5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体(5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite)。用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基(trityl)，而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。
间臂修饰：Spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或"替代"一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。Spacer 18常用于引进一个强亲水基团。
硫代修饰：硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
脱氧脲嘧啶修饰：脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7℃。
脱氧次黄嘌呤修饰：脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基，但当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC>dI:dA>dI:dG>dI:dT.在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。
cfDNA
血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化(Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients)。但是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumorDNA,简称“ctDNA”)质量更是参差不齐、含量高低不一。不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard et al报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。
检测和判定标准
本发明的绝对定量的方法可通过荧光的二维图，判定微卫星位点是否发生改变(表1)，并根据发生改变的个数来判定是否MSI-H(表2)。本发明的MSI的检测和判定标准如下表所示：
表1.检测结果表
表2.MSI判定(以5个位点为例)
| 1 | ≥2个位点阳性 | MSI-H | ≥40％ |
| 2 | 1个位点阳性 | MSI-L | 20-40％ |
| 3 | 0个位点阳性 | MSS | 0 |
在本发明中，例如当采用≥5个位点时，阳性位点的百分比P为0时，可判定为MSS；百分比P为10-40％时，可判定为MSI-L；百分比P为≥40％时，可判定为MSI-H。
本发明的主要优点包括
1、灵敏度高：由于本方法采用数字PCR平台，能将反应体系分成20000或更多个微小反应，理论上能够检测到单个拷贝的变化，具有其他技术无法匹敌的灵敏度优势。现有MSI检测基于的普通PCR方法一般需要肿瘤组织样品，由于数字PCR优异的灵敏度，使在cfDNA中检测微量肿瘤DNA带有的MSI成为可能。
2、特异性强：设计的引物分别针对MSI检测的微卫星位点所在的序列，能特异性扩增稳定型微卫星和不稳定微卫星；设计的探针，一条探针(P1)覆盖稳定型微卫星位点，另一条探针(P2)覆盖微卫星位点附近的序列，P1探针5'端有FAM、Cy5、Texas Red或ROX等荧光基团修饰，P2探针5'端有HEX或Vic等基团修饰。
3、对样本的类型与质量要求宽松，抗干扰力强：由于其灵敏度高的特性，本发明适用的样本类型除了一般方法常用的新鲜组织样本、石蜡切片，还可以使用的外周血样本；并且，由于其数字PCR平台的独特性，即能将反应体系分成约20000或更多个小体系，同时也能将干扰物质分成同样份数，能够大大减少干扰物质对反应的影响，当然也就可以检测更复杂背景的样本。这是其他平台无法做到的。
4、阳性判读方法简单：本发明在PCR反应结束即得到最终检验结果，与目前其它MSI检测方法相比具有不可比拟的时效性。
5、成本低廉：虽然目前肿瘤液体活检中二代测序(Next generation sequencing,NGS)也能进行MSI的检测，但是由于血液中ctDNA浓度整体偏低，NGS测序深度大大超过肿瘤组织来源DNA的测序深度，直接导致测序成本增加。而且由于在深度测序时测序本身的错误开始显现，需要进行复杂的前处理和生物信息学分析来得到正确的测序信息，使取得检测报告所需要的时间较长。而基于ddPCR的MSI检测则不存在此类问题，一般可以在两个小时内即完成检测，并且在检测完成的同时得到结果，无需复杂的结果分析，大大缩短了肿瘤患者的等待时间，可以尽快用药。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
引物、探针和位点的序列
实施例中，序列的染色体位置皆以hg38为准，使用的引物、探针及DNA位点的核酸序列信息如表3所示：
表3.引物、探针及DNA位点的核酸序列
注：探针均为荧光探针，一端带有荧光基团，另一端带有淬灭基团。
实施例1微卫星位点的筛选
表4.筛选的微卫星位点
注：+表示有扩增并且2个细胞系有差异，-表示无差异或无扩增。
其中，表4中所有新的有效位点为下表A：
| 序号 | 位置 | 长度 | 泳道 | 结论 | 备注 |
| Z1 | chr3:30650236-30650508 | 131 | 图1A-1,2 | + | 位点1 |
| Z2 | chr11:106739898-106740117 | 115 | 图1E-3,4 | + | 位点2 |
| Z3 | chr16:18841298-18841518 | 116 | 图1F-21,22 | + | 位点3 |
| Z4 | chr17:19411505-19411722 | 110 | 图1G-27,28 | + | 位点4 |
| Z5 | chr20:62921533-62921750 | 118 | 图1G-31,32 | + | 位点5 |
| Z6 | chr2:47408320-47408461 | 108 | 图1A-3,4 | + | 位点6 |
| Z7 | chr2:147906719-147906938 | 129 | 图1B-13,14 | + | 位点7 |
| Z8 | chr6:142407071-142407290 | 125 | 图1D-35,36 | + | 位点8 |
| Z9 | chr14:93268657-93268877 | 102 | 图1E-9,10 | + | 位点9 |
| Z10 | chr20:47779916-47780134 | 110 | 图1G-29,30 | + | 位点10 |
| Z11 | chr7:143306180-143306440 | 120 | 图1A-5,6 | + | |
| Z12 | chr1:201819424-201819543 | 120 | 图1A-9,10 | + | |
| Z13 | chr1:201771449-201771558 | 110 | 图1A-11,12 | + | |
| Z14 | chr2:61827581-61827677 | 97 | 图1B-17,18 | + | |
| Z15 | chr2:147857500-147857584 | 85 | 图1B-19,20 | + | |
| Z16 | chr4:82821524-82821646 | 123 | 图1C-25,26 | + | |
| Z17 | chr5:172998578-172998712 | 135 | 图1C-29,30 | + | |
| Z18 | chr6:142337918-142338138 | 120 | 图1C-31,32 | + | |
| Z19 | chr14:93244766-93244900 | 135 | 图1E-7,8 | + | |
| Z20 | chr15:45593287-45593508 | 117 | 图1F-15,16 | + | |
| Z21 | chr15:33349068-33349160 | 93 | 图1F-17,18 | + | |
| Z22 | chr15:33764931-33765150 | 103 | 图1F-19,20 | + | |
| Z23 | chr16:18854033-18854164 | 132 | 图1F-23,24 | + |
如表4所示，从人基因组中挑选40个单核苷酸重复(polyA或polyT)位点，分别设计若干对引物对(引物合成自美国IDT公司)，进行筛选。具体人基因组位点和引物序列如表3所示。
筛选PCR体系:Takara Taq HS Perfect Mix 10ul，引物1 1ul，引物2 1ul，人肾上皮细胞293T或人结肠癌细胞HCT116细胞基因组DNA模板5ul，水补齐体系至20ul。筛选PCR程序：32个循环(94℃5s，56℃1s，68℃20s)。
经过PCR筛选，最终确定的位点目的片段扩增效率较高，293T和HCT116扩增产物大小不同，且杂带较少，整体效果最好。其中部分有代表性的电泳图见图1。其中电泳结果有差异或有扩增的MSI新的有效位点见表A中的Z1-Z23。
基于图1的结果，优选10个位点(Z1-Z10)。
实施例2数字PCR法检测MSI的方法筛选
根据实施例1筛选出的10个位点的序列，分别设计探针(探针合成自美国IDT公司)，设计的探针序列如表3所示。对探针进行优化，步骤如下：
1.PCR体系的配置。在试剂准备区按照下表配置PCR体系：2×ddPCRSupermix(NodUTP)11ul，引物1(F)1.1ul，引物2(R)1.1ul，探针1(P1)0.55ul，探针2(P2)0.55ul，模板5.5ul，加水补齐至22ul。
2.加模板。在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照(293T细胞DNA)、阳性对照(HCT116细胞DNA)。
3.微滴的生成。按照微滴生成仪要求进行微滴生成。
4.PCR：按照以下程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56℃30s，72℃30s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。
5.数据读取。
根据实验结果，挑出5个位点，其阳性信号(仅有HEX信号)与阴性信号(有FAM及HEX信号)分离较好，其数字PCR二维图见图2A-2E。其中，橙色信号为阴性微滴信号，绿色信号为阳性(MSI)微滴信号。
实施例3数字PCR法检测肿瘤细胞系的MSI
从实施例2中，挑选5个位点(SEQ ID NO.:1-5)，以实施例2中的方法检测结直肠癌细胞系HCT-116、RKO、SW48的DNA，判断HCT-116、RKO和SW48为MSI-H。其数字PCR二维图见图3-5，检测结果如表5所示。
图3A～E为HCT-116细胞检测结果，图3A显示只有阴性信号点(橙色点)，判定为MSS；图3B、3C、3E只有阳性信号点(绿色点)，判定为MSI；图3D既显示阴性信号点，也显示阳性信号点，同样判定为MSI。因此，对于HCT-116细胞，5个位点中有4个判定为MSI，因此整体判定为MSI-H。
RKO与SW48的判定与此相同。
表5.几种直肠癌细胞系中不同位点的MSI检测结果
| 直肠癌细胞系 | HCT-116 | RKO | SW48 |
| 位点1(SEQ ID NO.:1) | MSS | MSI | MSI |
| 位点2(SEQ ID NO.:2) | MSI | MSI | MSS |
| 位点3(SEQ ID NO.:3) | MSI | MSI | MSI |
| 位点4(SEQ ID NO.:4) | MSI | MSI | MSI |
| 位点5(SEQ ID NO.:5) | MSI | MSI | MSI |
| 结果判定 | MSI-H | MSI-H | MSI-H |
实施例4数字PCR法检出患者MSI指导肿瘤治疗和预后判断
病例“SY029”和“HP306”为结直肠癌患者。其FFPE标本抽提基因组核酸。抽提核酸经Qubit定量，定量后储存于样本制备区-20℃冰箱内。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：阴性对照、病例核酸、阳性对照(10％)。
按照实施例2相同方法将PCR反应体系生成微滴。按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。打开仪器，按照要求进行设置，开始读板。本次MSI检测阴性对照背景干净，阳性对照拷贝数和突变比例正常。病例组织核酸样本检测结果见表6。
结果表明，SY029的5个位点中有4个为阴性，一个位点为阳性，判定为MSI-L(见图6)。
HP306的5个位点均为阳性，判读为MSI-H(见图7)，提示有良好的预后，并且建议使用伊立替康等化疗药物或使用免疫检查点抑制剂(例如PD-1、PD-L1或CTLA-4抗体等)。
表6.直肠癌病例中不同位点的MSI检测结果
实施例5基于血液样本的MSI检测
病例“SY029”的血液样本，收集于Streck游离核酸保存管(Streck Cell-Free DNABlood Collection Tube)中，共10ml。
血浆的分离：第一次离心，4℃、1900×g、10min。小心吸取血浆上清至干净15ml离心管中，不要碰到白细胞层；第二次高速离心，4℃、16000×g、10min。小心移取上清至50ml离心管，不要碰到沉淀。分离得约4.5ml血浆。
血浆游离核酸的提取：使用康为世纪游离核酸提取试剂盒，按说明书操作，以50ul无核酸酶水洗脱游离核酸。
按实施例4中的方法，检测位点5，同时以病例“SY029”的组织样本DNA为对照，结果表明，在血液中同样可以检出组织样本中存在的MSI。(见附图8A、8B)。
8A：病例“SY029”血液样本位点5的检测结果，检测结果为MSI，不稳定位点比例46.7％；
8B：病例“SY029”组织样本位点5的检测结果，检测结果为MSI，不稳定位点比例71％；
讨论
区分MSI结直肠癌的临床意义包括以下三个方面：
1、提示预后：临床研究发现，在Ⅱ期结直肠癌中，MSI-H结直肠癌的比例(22％)高于Ⅲ期结直肠癌(12％)，而在Ⅳ期肿瘤中仅占3.5％。这提示MSI-H结直肠癌发生转移的风险较低。特别是在Ⅱ期结直肠癌患者中，MSI状态可作为提示预后的独立预测因子：MSI-H肿瘤预后好于MSS肿瘤。Ⅱ期结直肠癌复发的高危因素包括：肿瘤组织学类型为低分化癌、有脉管/神经侵犯、淋巴结检出数量不足12个、发生梗阻或穿孔以及切缘阳性。但如肿瘤为MSI-H型时，则低分化癌不属高危因素。
2、指导治疗：研究发现，MSI-H结直肠癌对5-氟尿嘧啶和顺铂等化疗药物不敏感，而对伊立替康等化疗药物敏感，同时MSI结直肠癌对放疗比较敏感。美国国立综合癌症网络(NCCN)的结直肠癌临床实践指南明确指出，对MSI-H结直肠癌不宜采用5-氟尿嘧啶和铂类为主的治疗方案。
3、Lynch综合征患者筛查：Lynch综合征患者中，同时性或异时性多发结直肠癌较常见。如果术前能明确Lynch综合征的诊断，外科医师有可能采取更为广泛的切除术式。因此，针对结直肠癌患者进行MSI检测极为必要。
目前，MSI检测的主要方法有：
1、免疫组织化学检测错配修复蛋白：一种或多种错配修复蛋白的功能缺失可引起MSI-H，因此，检测错配修复蛋白缺失情况可间接反应肿瘤的MSI状态。目前，4种主要的错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均已有稳定的商品化抗体，但受组织固定、染色条件、抗体克隆号等不同因素的影响，可能会出现假阳性或假阴性结果。该方法不能用于血液样本的检测。
2、基于常规PCR的MSI检测：PCR检测MSI的原理是通过PCR方法扩增特定的微卫星序列，通过比较肿瘤组织与正常组织微卫星序列长度的差异判断是否存在MSI现象。由于该方法灵敏度有限，不适用于血液样本的检测，而且一般需要取得患者的正常组织和肿瘤组织。一般该方法通过两种检测手段进行：
(1)毛细管电泳法：迄今为止，最常用的方法是使用毛细管电泳分析标记物扩增产物的长度分布来诊断。最广为人知的“多重荧光PCR扩增和毛细管电泳”的分析方法是一种通过从正常组织和肿瘤组织中提取DNA、通过靶向卫星标记物的荧光PCR扩增DNA，然后使用毛细管电泳分析DNA的荧光来分析MSI的方法。然而，该方法需要昂贵的毛细管电泳装置分两步操作，在PCR结束后加样进行毛细管电泳的过程中存在实验室污染的可能，并且耗时较长，结果需要经验丰富训练有素的实验室人员进行分析。
(2)同位素标记PCR法：利用同位素的灵敏度，可以用同位素标记PCR引物，将扩增后的PCR产物电泳后进行曝光而检测PCR产物的长度。该方法需要进行同位素操作，对人体健康不利，耗时长，而且需要专门的操作空间和进行实验废物的处理，污染环境，目前已经不多见。
3、基于二代测序(NGS)的MSI检测：NGS检测MSI的原理是通过直接读出特定的微卫星序列来比较肿瘤组织与正常组织微卫星序列长度的差异判断是否存在MSI现象。虽然NGS可以用血液样本进行MSI检测，但是其成本和时效性均不能与数字PCR方法相比。综上所述，现有MSI检测技术操作繁琐，耗时长，阳性判读主观性强，且对于样本的类型与质量要求高，大多需要提供组织样本。
近年来，许多研究证实了单核苷酸重复序列的微卫星标志物检测比双核苷酸重复的微卫星标志物检测更具有灵敏度和特异性，MSI国际研究合作组织推荐的5个位点在数字PCR上的表现不尽如人意，因此本发明中重新筛选了一组全新的MSI位点，并开发了相应的数字PCR检测方法。本发明的检测MSI的方法具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江萤；黄昕
<120> 人微卫星不稳定位点的检测方法及其应用
<130> P2020-1680
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ctcccctcgc ttccaatgaa tctcttcact ctaggagaaa gaatgacgag aacataacac 60
tagagacagt ttgccatgac cccaagctcc cctaccatga ctttattctg gaagatgctg 120
cttctccaaa gtgcattatg aaggaaaaaa aaaagcctgg tgagactttc ttcatgtgtt 180
cctgtagctc tgatgagtgc aatgacaaca tcatcttctc agaaggtgag ttttcttctc 240
ttaagggtgt gggacctgag atctgtgcca att 273
<210> 2
<211> 220
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
ccagagttta gctcctcaga ggtccctagc agcacgactg acatagcatc tttctagtct 60
gccgtaagta ccactacctt tacacctcat tgagaggcac tttttttttt tttttttttt 120
gagatggagt cttgctctgt caccccggct gcagtgcaat ggcacatctc agctcactgc 180
aacctccgcc tcccaggttc aagtgattct cctgcctcag 220
<210> 3
<211> 221
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
gcctgtagca gaattgcttg aacctgggag gcagaagttg cagtgaccca aaaccacacc 60
actgcactcc agcatgggcg acagagcaag actgtgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
agtacctcaa aaatactctc ctagggacct caagtctttt ccttctttaa ctgcttataa 180
acatgcaaaa atggtccagt aagtctacaa gtatttcaca t 221
<210> 4
<211> 218
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
aagggccctc cttgggctgg gggatgggcc gggggtgggg aggatgaggg gtccctggaa 60
atccagggtg aagatagaag tctggattat gttctaaatc tttttttttt ttttttttct 120
ccaaggagag aaaacagagc ttcatgggaa acagcggcaa cagttggtaa gtagcagggc 180
cttccaggct gggatgggtg cagtgaggcc aggcaggt 218
<210> 5
<211> 218
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
agatgatggc caccctaagt tcaggtggag agaatggggt ttcttcttta aaaacccttc 60
tctcacaaga atttgcttct caaattggag ctgcagccaa tttttttttt ttttttttgg 120
agacagggtc tctgtcgccc aggctggagg gcaatggagc gactgatcac ggctcactgc 180
agcctcaatc tccctgggct caggttatcc ttctacct 218
<210> 6
<211> 142
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
atcagcagca tgaagtccag ctaatacagt gcttgaacat gtaatatctc aaatctgtaa 60
tgtacttttt ttttttttaa ggagcaaaga atctgcagag tgttgtgctt agtaaaatga 120
attttgaatc ttttgtaaaa ga 142
<210> 7
<211> 220
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
cattttgagt attatatcag gcactataca gatcacttta cacatattaa ctcatttaat 60
ttgttagtac catggggttc tgtcctgttt atcaagtcca tttttttttt tttttttttt 120
taactttaaa ttctgggata catgtgcaga acatgcaggt ttgttacata ggtatatctg 180
tgccatggtg gtatgctgca cctatcaacc cgtcagctag 220
<210> 8
<211> 220
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
gtgcctgtaa tcctagcact ttgggaggct gaggagggag gattgcttga gaccaagagt 60
tcaaggccaa tcaagccaac atagtgagac ccgtctcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
ggaagcatat gttcagtttc taaagttaat ttacaggaga atgaaaaaac tttaaaggtt 180
ctgtggtgct cccctatcat agagggcaag gtacgatggt 220
<210> 9
<211> 221
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
aggttataca tctaggaaga aacaagtcct acctaaacat atccttcctt cccctcccaa 60
aagttcccct tcccagcctt ttatgcctct aacttagacc tttttttttt tttttttttt 120
tgagacagat tttgctcagc cgcccaggct ggagtgcagc agcacgatct cagctcacta 180
caaccaccac ctcctgggtt caagggattc tcccgtctca g 221
<210> 10
<211> 219
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
ttttatttaa aataaagtct aaaatttctt agcatggcct gtatttctca tctctgacgt 60
gccctccccc acttactcct gaccctctac cctagttgac tttttttttt tttttttttg 120
agacagagtc tgactctgtt gcccaggctg gaatgcagaa gtgtgatccc ggctcacagc 180
aacccctgcc tcccgggttc aagtgattct cctgtctca 219
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtttgccat gaccccaagc 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actcatcaga gctacaggaa cac 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgaagtccag ctaatacagt gct 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attttactaa gcacaacact ctgc 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccatggggtt ctgtcctgtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagcatacca ccatggcaca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccaacatag tgagacccgt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgatagggga gcaccacaga 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agcacgactg acatagcatc t 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggtgacaga gcaagactcc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tccttccttc ccctcccaaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcggctgagc aaaatctgtc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcagtgaccc aaaaccacac 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
acttgaggtc cctaggagag t 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccagggtgaa gatagaagtc tgg 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acttaccaac tgttgccgct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctcccccac ttactcctga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccgggatcac acttctgcat 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aacccttctc tcacaagaat ttgc 24
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgatcagtc gctccattgc 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caccaggctt ttttttttcc ttca 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cagcatcttc cagaataaag tc 22
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
taatgtactt tttttttttt taagg 25
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
catgtaatat ctcaaatct 19
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcaagtccat tttttttttt tttttttttt aacttta 37
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atacatgtgc agaacatgca ggt 23
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atgcttcctt tttttttttt ttttttttaa agagacg 37
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cattctcctg taaattaac 19
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttgagaggca cttttttttt tttttttttt tgagatg 37
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agtcttgctc tgtcacc 17
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acttagacct tttttttttt tttttttttt gagacaga 38
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttgctcagcc gcccagg 17
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttgaggtact tttttttttt tttttttttt gagacac 37
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ttgctctgtc gcccatgct 19
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tctaaatctt tttttttttt ttttttctcc aaggagag 38
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aaacagagct tcatgggaaa c 21
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccctagttga cttttttttt tttttttttt gagacaga 38
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgactctgtt gcccaggctg 20
<210> 49
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
caaattggag ctgcagccaa tttttttttt tttttttt 38
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cctgggcgac agagaccc 18
Claims (17)
1.一种人微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)位点检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断MSI相关疾病和/或用于对MSI相关疾病进行预后；
其中，所述的MSI位点为(Z5)chr20:62921533-62921750，或其与选自下组位点的组合：
(Z2)chr11:106739898-106740117；
(Z3)chr16:18841298-18841518；
(Z4)chr17:19411505-19411722。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的MSI位点还包括选自下组的一个或多个MSI位点：
(Z1)chr3:30650236-30650508；
(Z6)chr2:47408320-47408461；
(Z7)chr2:147906719-147906938；
(Z8)chr6:142407071-142407290；
(Z9)chr14:93268657-93268877；
(Z10)chr20:47779916-47780134；
(Z11)chr7:143306180-143306440；
(Z12)chr1:201819424-201819543；
(Z13)chr1:201771449-201771558；
(Z14)chr2:61827581-61827677；
(Z15)chr2:147857500-147857584；
(Z16)chr4:82821524-82821646；
(Z17)chr5:172998578-172998712；
(Z18)chr6:142337918-142338138；
(Z19)chr14:93244766-93244900；
(Z20)chr15:45593287-45593508；
(Z21)chr15:33349068-33349160；
(Z22)chr15:33764931-33765150；
(Z23)chr16:18854033-18854164。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的MSI位点还包括
(Z7)chr2:147906719-147906938；或
(Z1)chr3:30650236-30650508。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的MSI位点选自下组：
(Z7)chr2:147906719-147906938；
(Z2)chr11:106739898-106740117；
(Z3)chr16:18841298-18841518；
(Z4)chr17:19411505-19411722；
(Z5)chr20:62921533-62921750；
(Z6)chr2:47408320-47408461；
(Z1)chr3:30650236-30650508；
(Z8)chr6:142407071-142407290；
(Z9)chr14:93268657-93268877；
(Z10)chr20:47779916-47780134。
5.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述的MSI位点包括
(a)Z1、Z2、Z3、Z4、Z5或Z7、Z2、Z3、Z4、Z5位点；和
(b)除Z1、Z2、Z3、Z4、Z5或Z2、Z3、Z4、Z5、Z7的额外的MSI位点；
所述的额外的MSI位点选自下组：BAT-26、BAT-25、MONO-27、NR-21、NR-24、D5S346、D2S123、D17S250或其组合。
6.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述的MSI相关疾病为肿瘤或癌症；所述的肿瘤或癌症选自下组：结直肠癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、胃癌、小肠癌、宫颈癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胆囊癌、睾丸癌、前列腺癌、输卵管癌、外阴癌、肾上腺皮质癌、原发性腹腔肿瘤、胆管癌、乳腺癌、神经内分泌肿瘤、胸腺癌、甲状腺癌、小细胞肺癌或原发未知的肿瘤。
7.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒用于选自下组的检测：血清检测、血浆检测、细胞检测、组织样品检测。
8.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述的检测为数字PCR检测。
9.一种用于检测人微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)位点的试剂，其特征在于，所述位点为hg38染色体中的位点5，或其与选自hg38染色体中的位点2、3、4的组合；其中，所述试剂为(e)用于检测chr20位点5(SEQ ID NO.:5)MSI的第五引物对，其中第五引物对包括SEQ ID NO.:29和30所示的引物；
或其与选自下组引物对的组合：
(b)用于检测chr11位点2(SEQ ID NO.:2)MSI的第二引物对，其中第二引物对包括SEQID NO.:19和20所示的引物；
(c)用于检测chr16位点3(SEQ ID NO.:3)MSI的第三引物对，其中第三引物对包括SEQID NO.:23和24所示的引物；
(d)用于检测chr17位点4(SEQ ID NO.:4)MSI的第四引物对，其中第四引物对包括SEQID NO.:25和26所示的引物。
10.如权利要求9所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：
(b1)与第二引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：SEQ ID NO.:39所示的探针、SEQ ID NO.:40所示的探针、或其组合；
(c1)与第三引物对配合使用的第三探针，其中所述的第三探针选自下组：SEQ ID NO.:43所示的探针、SEQ ID NO.:44所示的探针、或其组合；
(d1)与第四引物对配合使用的第四探针，其中所述的第四探针选自下组：SEQ ID NO.:45所示的探针、SEQ ID NO.:46所示的探针、或其组合；或
(e1)与第五引物对配合使用的第五探针，其中所述的第五探针选自下组：SEQ ID NO.:49所示的探针、SEQ ID NO.:50所示的探针、或其组合。
11.如权利要求10所述的试剂，其特征在于，所述位点还包括选自hg38染色体中的位点1或位点7，其中，所述试剂选自下组：
(g)用于检测chr2位点7(SEQ ID NO.:7)MSI的第七引物对，其中第七引物对包括SEQID NO.:15和16所示的引物；或
(a)用于检测chr3位点1(SEQ ID NO.:1)MSI的第一引物对，其中第一引物对包括SEQID NO.:11和12所示的引物。
12.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的用于检测MSI的试剂。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的MSI位点为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5位点或Z7、Z2、Z3、Z4、Z5位点。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测来自肿瘤细胞、肿瘤组织或疑似肿瘤组织中人DNA样品中的MSI位点。
15.一种检测试剂的组合，所述的检测试剂组合包括用于检测人微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)位点的n种检测试剂，其中，所述的MSI位点为(Z5)chr20:62921533-62921750；或其与选自下组位点的组合：
(Z1)chr3:30650236-30650508；
(Z2)chr11:106739898-106740117；
(Z3)chr16:18841298-18841518；
(Z4)chr17:19411505-19411722；
(Z7)chr2:147906719-147906938；
并且n为2-6的正整数。
16.一种体外、非治疗非诊断的检测待测样本中MSI的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)提供一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有作为模板的待测样本、以及用于扩增的引物对，所述的引物对为(e)用于检测chr20位点5(SEQ IDNO.:5)MSI的第五引物对，其中第五引物对包括SEQ ID NO.:29和30所示的引物；
或其与选自下组引物对的组合：
(g)用于检测chr2位点7(SEQ ID NO.:7)MSI的第七引物对，其中第七引物对包括SEQID NO.:15和16所示的引物；
(b)用于检测chr11位点2(SEQ ID NO.:2)MSI的第二引物对，其中第二引物对包括SEQID NO.:19和20所示的引物；
(c)用于检测chr16位点3(SEQ ID NO.:3)MSI的第三引物对，其中第三引物对包括SEQID NO.:23和24所示的引物；
(d)用于检测chr17位点4(SEQ ID NO.:4)MSI的第四引物对，其中第四引物对包括SEQID NO.:25和26所示的引物；
(a)用于检测chr3位点1(SEQ ID NO.:1)MSI的第一引物对，其中第一引物对包括SEQID NO.:11和12所示的引物；
(S2)对步骤(S1)的所述PCR反应体系进行PCR反应，从而获得扩增产物；
(S3)对步骤(S2)中产生的扩增产物进行分析，从而获得所述待测样本MSI情况；其中，以检测的位点数P总＝5为例，
若样本中的MSI位点数PMSI≥2，则判定为高度不稳定(MSI-H)；
若样本中的MSI位点数PMSI＝1，则判定为低度不稳定(MSI-L)；
若样本中的MSI位点数PMSI＝0，则判定为稳定(MSS)。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，若检测的位点数P总≥5时，样本中的MSI位点数百分比为P(PMSI/P总)，
若P≥40％时，则判定为高度不稳定(MSI-H)；
若10≤P＜40％时，则判定为低度不稳定(MSI-L)；
若P＝0时，则判定为稳定(MSS)。
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