KR20240056849A - 바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 프로브 - Google Patents

바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 프로브 Download PDF

Info

Publication number
KR20240056849A
KR20240056849A KR1020220136002A KR20220136002A KR20240056849A KR 20240056849 A KR20240056849 A KR 20240056849A KR 1020220136002 A KR1020220136002 A KR 1020220136002A KR 20220136002 A KR20220136002 A KR 20220136002A KR 20240056849 A KR20240056849 A KR 20240056849A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pcr
seq
primer
producing cells
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
KR1020220136002A
Other languages
English (en)
Inventor
임시근
고운나
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
대한민국 (식품의약품안전처장)
Filing date
Publication date
Application filed by 성균관대학교산학협력단, 대한민국 (식품의약품안전처장) filed Critical 성균관대학교산학협력단
Publication of KR20240056849A publication Critical patent/KR20240056849A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

본 발명은 본 발명은 바이러스 생산 세포 검출에 사용할 수 있는 멀티플렉스 PCR 프라이머에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머를 실시간 PCR 및 디지털 PCR에 이용하여 특정한 표적 유전자들을 정량적으로 확인함으로써 검체 내에 바이러스 생산 세포가 존재하는지 여부를 신속하고 민감하게 검출할 수 있다. 또한 3개의 타겟을 정하여 다중증폭의 방식으로 검출하기 때문에 더욱더 정확한 검출이 이루어질 수 있으며, 세포치료제 완제품의 품질평가 방법으로 이용될 수 있다.

Description

바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 PCR 프라이머 및 프로브{Multiplex PCR primer and probe for detection of virus-producing cell}
본 발명은 바이러스 생산 세포 검출에 사용할 수 있는 멀티플렉스 PCR 프라이머 및 프로브에 관한 것이다.
세포치료제를 만들 때 바이러스 생산세포를 이용해 원하는 유전자를 대량으로 생산하며, 완제품에는 바이러스 생산세포가 들어가지 않게 필터링하는 과정을 거친다. 하지만 이때 바이러스 생산세포가 혼입되어 몸속에 함께 주입된다면 큰 문제가 되므로 이를 검출하는 것은 중요하다.
현재 세포를 검출하는 방법으로 STR(Short tandem repeat)를 표준 기술로 정하여 사용하고 있다. 이는 법과학 분야에서 개인 식별을 위해 이용되고 있는 기술이다. 하지만 이 방법에 이용되는 장비는 세포를 다루는 대부분의 실험실에서 보유하고 있지 않으며 민감도도 90% 정도로 낮은 편이다. 세포를 배양하는 중에 잘못된 표기로 세포가 뒤바뀌거나 혼입된 채로 배양이 지속되었을 경우에 STR 프로필로 구분이 가능하지만, 극미량이 혼입되었을 때 민감하게 검출하지 못한다는 단점이 있다. 또한 복수의 개인으로부터 유래한 세포 혼합물이 섞인 경우 구분이 가능하지만, 한 사람으로부터 유래된 세포인 경우 미분화 세포의 잔존 여부를 파악할 수 없다는 한계가 있다.
세포를 다루는 대부분의 실험실에서 세포의 분류 및 구분을 위해 FACS(Fluorescence activated cell sorting)를 많이 사용하고 있다. 이는 유동적으로 흐르는 세포를 통해 세포를 분류하고 세며 생체 지표를 탐지하는 것으로, 민감도가 99%정도로 알려져 있지만 실시간 PCR에 비해 많게는 100배까지 민감도가 떨어진다는 단점을 가지고 있다. 디지털 PCR은 실시간 PCR에 비해 훨씬 더 높은 민감도를 가지고 있으며, 절대적 정량이 가능하다는 장점이 있다.
세포치료제의 완제품에 혼입되어 있을 수 있는 극미량의 미분화 바이러스생산세포를 민감하게 검출하는 것은 환자의 안전과 직결된 문제이므로 매우 중요한 문제이며, 이를 효율적으로 검출할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허공보 제10-0440852호 (2002.11.18 공개)
본 발명자들은 세포치료제를 투여받는 환자들의 안전을 도모하기 위해 세포치료제 완제품 내의 바이러스 생산 세포를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 바이러스 생산 세포가 특이적으로 발현하는 유전자 gag, pol, VSVG, env의 다중 증폭에 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하는 경우, 바이러스 생산 세포를 효율적으로 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 2 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 조성물을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계 및 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 산물을 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 gag를 표적하는 프라이머 쌍, pol을 표적하는 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명자들은 세포치료제를 투여받는 환자들의 안전을 도모하기 위해 세포치료제 완제품 내의 바이러스 생산 세포를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 바이러스 생산 세포가 특이적으로 발현하는 유전자 gag, pol, VSVG, env의 다중 증폭에 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 이용하는 경우, 바이러스 생산 세포를 효율적으로 검출할 수 있음을 규명하였다.
gag란, 오르테르바이러스(Ortervirus)의 핵심 구조 단백질을 포함하는 다단백질이다. 외부로 노출된 외피가 아닌 내부 껍질을 구성하는 것으로 알려졌으며,　바이러스 형태의 모든 구조적 단위를 구성하고 성숙한 비리온을 위한 지지 프레임워크를 제공한다.
pol이란, 레트로바이러스의 pol 유전자에 의해 인코딩　단백질을 의미한다. 모든 레트로바이러스에 공통적인 이 효소는 바이러스　RNA를 이중 가닥　DNA　로 전사한다.
본 발명에서 용어 "검출"은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통해서 바이러스 생산 세포의 존재 여부를 감별하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 “프라이머 쌍”은 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 합쳐 동시에 지칭하는 용어이고, “프라이머 세트”는 상기 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상으로 구성된 다수의 프라이머 쌍 묶음을 지칭하는 용어로 사용하였다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 기존 방식의 PCR과 달리 한 번의 PCR 반응을 통해 gag 및 pol 유전자를 동시에 증폭할 수 있다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 다이머(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 `한다.
또한, 본 발명에서와 같이 2이상의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 PCR을 수행함으로써 대상 시료 내 2이상의 유전자를 1회에 확인하는 멀티플렉스 PCR 반응에서는, 프라이머 설계시 단독 PCR의 경우와 같은 조건이 더욱 엄격하게 요구된다. 반응조건의 설정에 있어서도 한 번에 PCR 하고자 하는 프라이머 모두에 대한 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로, 단독 PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구된다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 물질에 존재하는 핵산과 혼성화 되어 상기 표적 물질의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.
상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 구체적으로는 단일쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있고, 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.
상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.
상기 프라이머 세트는 표적 원료에 존재하는 특정 유전자에 혼성화될 수 있으며, 시료 내에 목적하는 원료가 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 중폭 되므로 상기 증폭된 산물(amplicon)을 통해 상기 원료의 존부를 판단할 수 있다.
또한 상기 프라이머 서열은 검출 가능한 신호를 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, TetrahedronLett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 VSVG를 표적하는 프라이머 쌍 또는 env를 표적하는 프라이머 쌍울 포함하는 것이다.
VSV-G란 다양한 숙주세포로의 감염, 초원심 분리에 의한 바이러스 농축 과정 동안 안정하게 유지될 수 있어 고역가의 바이러스 생산이 가능한 이점을 제공하는 VSV(Vesicular stomatitis virus)의 외투막 단백질이다. VSV-G 외투막 단백질은 감염률 증가를 위한 여러 종류의 레트로바이러스의 pseudotyping에 가장 많이 이용되고 있다.
Env란, env 유전자에 의해 인코딩되는 바이러스 외피를 형성하는 단백질이다. env　유전자의 발현은　레트로바이러스가 특정 세포 유형을 표적으로 하여 부착하고 표적　세포막에 침투할 수 있게 한다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 기존 방식의 PCR과 달리 한 번의 PCR 반응을 통해 gag, pol 및 VSVG 중 2 이상의 유전자 또는 gag, pol 및 env 중 2 이상의 유전자를 동시에 증폭할 수 있다. 바람직하게는, 렌티바이러스 생산 세포는 gag, pol 및 VSVG를 동시에 증폭할 수 있으며, 레트로바이러스 생산 세포는 gag, pol 및 env를 동시에 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 gag를 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 pol을 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 VSVG를 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 env를 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스 생산 세포 검출용 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스 생산 세포는 렌티 바이러스 생산 세포, 레트로 바이러스 생산 세포 또는 이들의 조합인 것이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 바이러스 생산 세포 검출용 조성물은 바이러스 생산 세포의 종류에 따라 포함하는 프라이머 쌍을 달리할 수 있다. 예를 들면, 렌티바이러스 생산 세포 검출용 조성물은 gag, pol 및 VSVG 프라이머 쌍을 포함하는 조성물일 수 있으며, 레트로바이러스 생산 세포는 gag, pol 및 env 프라이머 쌍을 포함하는 조성물일 수 있다.
렌티바이러스 생산 세포 검출용 조성물은, 검출의 높은 신뢰도를 확보하기 위해 순서대로 gag, pol 및 env 프라이머 쌍을 포함하는 조성물; gag 및 pol 프라이머 쌍을 포함하는 조성물; gag 및 VSVG 프라이머 쌍을 포함하는 조성물 또는 pol 및 VSVG 프라이머 쌍을 포함하는 조성물을 선택할 수 있다.
레트로바이러스 생산 세포 검출용 조성물은, 검출의 높은 신뢰도를 확보하기 위해 순서대로 gag, pol 및 env 프라이머쌍을 포함하는 조성물; pol 및 env 프라이머 쌍을 포함하는 조성물; gag 및 pol 프라이머 쌍을 포함하는 조성물 또는 gag 및 env 프라이머 쌍을 포함하는 조성물을 선택할 수 있다,
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 다음의 (a) 내지 (d) 중 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 바이러스 생산 세포 검출용 조성물을 제공한다:
(a) gag를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함한다;
(b) pol를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함한다;
(c) VSVG를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함한다; 및
(d) env를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함한다.
"프로브(probe)"란 실시간 PCR에 사용되는 형광물질을 포함한 뉴클레오타이드로, 5'말단에 형광물질인 repoter가 3'말단에 상쇄물질인 quencher가 결합되어 있다. DNA 폴리머레이즈가 DNA를 합성하기 시작면서 프로브에 있던 reporter와 quencher가 서로 떨어지게 되며 형광을 발현하게 된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 키트를 제공한다.
상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다.
본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 바이러스 생산 세포를 검출하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충 용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 검출용 키트는 RT-PCR 키트일 수 있다. 구체적으로, RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로 필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계 및 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 산물을 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 “중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 것으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.
상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명에서 시료는 바이러스 생산 세포로부터 분리한 DNA, 분리한 mRNA를 기초로 제작한 cDNA일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 바이러스 생산 세포 검출 방법을 수행함에 있어, 당업자에게 자명한 시료 농도, dNTP 농도와 적합한 온도 등에서 반응을 수행할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 PCR 반응 용액 25 ㎕에 1 ㎕의 cDNA, PCR 완충 용액을 사용하는 것이 좋다.
PCR 반응 증폭 산물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 80 bp의 증폭 산물; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 91 bp의 증폭 산물; 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 126 bp의 증폭 산물인 것일 수 있다.
따라서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 80 bp의 PCR 산물이 증폭되거나; 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 91bp의 PCR 산물이 증폭되거나; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 126bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우 시료내 렌티 바이러스 생산 세포가 함유된 것으로 결정할 수 있다.
PCR 반응 증폭 산물은 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 107 bp의 증폭 산물; 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 105 bp의 증폭 산물; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 106 bp의 증폭 산물인 것일 수 있다.
또는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 107 bp의 PCR 산물이 증폭되거나; 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 105bp의 PCR 산물이 증폭되거나; 또는 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하여 106bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우 시료내 레트로 바이러스 생산 세포가 함유된 것으로 결정할 수 있다.
상기 PCR 산물 분석은 PCR 산물을 전기영동하여 산물의 크기를 비교하거나, PCR 산물이 증폭되는지 증폭되지 않는지를 확인하여 분석할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)인 것이다.
상기 “멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)”은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭하는 것으로, 본 발명에서는 한 번의 PCR 반응으로 대상 시료내 존재하는 gag, pol, VSVG 또는 env를 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 멀티플렉스 PCR은 다양한 시료를 한 번의 증폭 반응으로 확인할 수 있으므로 경제적이고, 시간이 절약될 수 있다. 멀티플렉스 PCR을 사용하면 기존 방식의 PCR과 달리 1회의 PCR 반응을 통해 하나 이상의 바이러스 생산 세포 특이적 유전자 각각을 동시에 증폭할 수 있으며, 하나 이상의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 PCR을 수행함으로써 대상 시료 내 1 종 이상의 유전자를 한 번에 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 실시간 PCR 또는 디지털 PCR인 것이다.
실시간 PCR(Real-time PCR)이란, 형광 물질을 이용하여 PCR 사이클마다 형광 물질의 증폭 정도를 확인하여 표적 DNA 증폭 정도를 확인할 수 있어 정량 검사로 활용되는 PCR 기법을 의미한다. 프라이머와 프로브를 사용하며, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머를 이용하고 프로브의 양 끝에 reporter와 quencher를 붙인다. 프로브가 DNA 서열에 붙어 있을 시에는 reporter가 형광을 나타내지 않지만, DNA가 합성되면서 reporter가 떨어지게 되면 형광을 발하게 되고, 이 형광 신호를 실시간으로 읽는 것이 실시간 PCR이다. 증폭 곡선을 실시간으로 보여주며, 증폭 곡선과 threshold가 만나는 지점을 Ct 값이라 한다. 즉, Ct값이 작을수록 빨리 증폭이 시작되는 것이므로, DNA 양은 많은 것이다. DNA를 정량하기 위해서, 정확한 농도를 알고 있는 표준 DNA를 실험에 함께 사용하여 표준 곡선을 그리고, 이 곡선에서 나온 Ct값을 바탕으로 타겟 DNA를 상대 정량 한다.
디지털 PCR이란, 실시간 PCR과 마찬가지로 프라이머와 프로브를 사용하여 DNA 증폭 정도를 확인할 수 있어 정량 검사로 활용되는 PCR 기법을 의미한다. 실시간 PCR이 증폭곡선으로 결과를 나타내고 상대 정량 방법을 이용하는 반면에, 디지털 PCR은 디지털 신호로 DNA 증폭 여부를 나타내는 절대 정량 방법을 취한다. 따라서 표준 곡선을 그리지 않아도 된다는 장점이 있다. 디지털 PCR을 예를 들어, nano plate 디지털 PCR 또는 droplet 디지털 PCR일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 프라이머 쌍을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
(b) 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 키트를 제공한다.
(d) 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계 및 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 산물을 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출 방법을 제공한다.
(e) 본 발명의 프라이머를 실시간 PCR 및 디지털 PCR에 이용하여 특정한 표적 유전자들을 정량적으로 확인함으로써 검체 내에 남아있을 수 있는 바이러스 생산 세포가 존재하는지 여부를 신속하고 민감하게 검출할 수 있다. 또한 3개의 타겟을 정하여 다중증폭의 방식으로 검출하기 때문에 더욱더 정확한 검출이 이루어질 수 있으며, 세포치료제 완제품의 품질평가 방법으로 이용될 수 있다.
도 1은 프라이머 농도별 일반 PCR 결과를 나타낸다. 각 밴드의 프라이머 및 그 농도는 다음과 같다. 1. gag1 (1μM) 2. gag2 (1μM) 3. pol1 (1μM) 4. pol2 (1μM) 5. VSVG1 (1μM) 6. VSVG2 (1μM) 7. gag1 (500nM) 8. gag2 (500nM) 9. pol1 (500nM) 10. pol2 (500nM) 11. VSVG1 (500nM) 12. VSVG2 (500nM))
도 2는 농도별 VSVG 결과를 나타낸다. 각 밴드의 프라이머 및 그 농도는 다음과 같다. 1. VSVG3 (1μM) 2. VSVG4 (1μM), 3. VSVG3 (500nM), 4. VSVG4 (500nM)
도 3의 (a)는 1μM 프라이머 gag1의 다이머(dimer) 형성 여부 검증 결과를 나타낸다. 도 3의 (b)는 1μM 프라이머 pol1의 dimer형성여부 검증 결과를 나타낸다.
도 4는 제작한 프라이머의 렌티 바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 PCR 활용 가능성 검증 결과를 나타낸다. 도 4a는 gag, 도 4b는 pol, 도 4c는 VSVG, 도 4d는 gag-pol, 도 4e는 gag-VSVG, 도 4f는 pol-VSVG, 도 4g는 gag-pol-VSVG의 결과를 나타낸다. gag, pol, VSVG를 각각 1개씩, 2개씩, 3개씩 동시에 증폭했을 때 서로 영향을 주지 않음을 나타낸다.
도 5는 온도별 일반 PCR 결과를 나타낸다. 각 밴드의 프라이머 및 그 농도는 다음과 같다. 1. gag3 (59℃) 2. gag4 (59℃) 3. pol3 (59℃) 4. pol4 (59℃) 5. env1 (59℃) 6. env2 (59℃) 7. gag3 (60℃) 8. gag4 (60℃) 9. pol3 (60℃) 10. pol4 (60℃) 11. env1 (60℃) 12. env2 (60℃) 13. gag3 (62℃) 14. gag4 (62℃) 15. pol3 (62℃) 16. pol4 (62℃) 17. env1 (62℃) 18. env2 (62℃)
도 6은 58℃에서 농도별 일반 PCR 결과를 나타낸다. 각 밴드의 프라이머와 그 농도는 다음과 같다. 1. gag3 (500nM) 2. gag4 (500nM) 3. pol3 (500nM) 4. pol4 (500nM) 5. env1 (500nM) 6. env2 (500nM) 7. gag3 (1μM) 8. gag4 (1μM) 9. pol3 (1μM) 10. pol4 (1μM) 11. env1 (1μM) 12. env2 (1μM))
도 7은 SYBR Green으로 확인한 pol4 프라이머의 다이머(dimer) 형성 여부 검증 결과를 나타낸다.
도 8 은 제작한 프라이머의 레트로 바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 PCR 활용 가능성 검증 결과를 나타낸다. 도 8a는 gag, 도 8b는 pol, 도 8c는 env, 도 8d는 gag-pol, 도 8e는 gag-env, 도 8f는 pol-env, 도 8g는 gag-pol-env의 결과를 나타낸다. gag, pol, env를 각각 1개씩, 2개씩, 3개씩 동시에 증폭했을 때 서로 영향을 주지 않음을 나타낸다.
도 9는 렌티 바이러스 생산세포 기반 CAR-T 혼합 세포에서 gag, pol 및 VSVG 검출 능력 검증 결과 및 검출 한계 농도를 나타낸다. 도 9a는 gag, 도 9b는 pol, 도 9c는 VSVG의 검출 능력 검증 결과 및 검출 한계 농도를 나타낸다.
도 10은 희석 후 렌티 바이러스 생산세포 기반 CAR-T 혼합 세포에서 gag, pol 및 VSVG 검출 능력 검증 결과 및 검출 한계 농도를 나타낸다. 도 10a는 gag, 도 10b는 pol, 도 10c는 VSVG의 검출 능력 검증 결과 및 검출 한계 농도를 나타낸다.
도 11은 레트로 바이러스 생산세포 기반 CAR-T 혼합 세포에서 gag, pol 및 env 검출 능력 검증 결과 및 검출 한계 농도를 나타낸다. 도 11a는 gag, 도 11b는 pol, 도 11c는 env의 검출 능력 검증 결과 및 검출 한계 농도를 나타낸다.
도 12는 렌티 바이러스 생산세포 기반 CAR-T 혼합 세포에서의 디지털 PCR 결과를 나타낸다. 도 12a는 gag, 도 12b는 pol, 도 12c는 VSVG의 디지털 PCR 결과를 나타낸다.
도 13는 레트로 바이러스 생산세포 기반 CAR-T 혼합 세포에서의 디지털 PCR 결과를 나타낸다. 도 13a는 gag, 도 13b는 pol, 도 13c는 env의 디지털 PCR 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 프라이머 제작
바이러스 생산 세포를 검출하기 위하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 각 프라이머는 Tm을 약 60℃로, 프로브는 프라이머보다 Tm을 약 8~10℃ 높게 디자인하였다. NCBI(National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 서열을 확인한 후, IDT(Intergrated DNA Technologies, https://sg.idtdna.com/pages)의 Oligo Analyzer Tool을 이용해 디자인하고 각 프라이머, 프로브의 이차구조, dimer 형성 여부 등을 확인하였다. 이후 NCBI의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 통해 타겟으로 하는 유전자 이외에 다른 유사한 서열이 있는지 검증하는 단계를 거쳤다.
렌티 바이러스 생산세포(293T)와 이를 기반으로 만들어진 CAR-T를 각각 1:1, 1:10, 1:1,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000의 비율로 혼합하여 실험에 이용하였다. 레트로 바이러스 생산세포(FLYRD18) 또한 렌티 바이러스 생산세포와 마찬가지의 비율로 레트로 바이러스 기반 CAR-T와 혼합하였다. 이때 positive control의 개념으로 CAR-T의 CAR를 함께 검출하였지만, 본 특허에서는 바이러스 생산세포에 해당하는 서열만을 타겟으로 한다.
세포 혼합 조성
샘플 293T/FLYRD18 CAR-T
1:1 1x106cells 1x106cells
1:10 2x105cells 2x106cells
1:100 2x104cells
1:1k 2x103cells
1:10k 2x102cells
1:50k 40cells
1:100k 20cells
각 세포는 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)을 이용하여 DNA 추출후, QuantStudio Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 정량하였다. 293T는 0.5ng/μL, FLYRD18은 25ng/μL로 희석하여 2μL씩 실험에 이용하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 2 내지 표 4에 나타내었다.
바이러스 생산 세포 검출용 프라이머 후보 서열
target Primer name Forward/Reverse Sequence Length Tm Product size
gag gag1
 forward GGAAGTGACATAGCAGGAAC 20 60 80
Reverse CCTACTGGGATAGGTGGATTA 21 59.9
gag2 forward CATATAGTATGGGCAAGCAGG 21 60.1 88
Reverse CCAGTATTTGTCTACAGCCTT 21 59.8
gag3 forward CTATCGCCAGTTGCTCCTA 19 60.8 91
Reverse TTGGGCCCTTGTGTTATTCC 19 60.2
gag4 forward GTTCTCCTCTTCTGACCTTTAC 22 59.9 107
Reverse GCTGATGGGTGATGAGAAC 19 60
pol pol1 forward GAAACATGGTGGACAGAGT 19 59.4 118
Reverse CTGCTCCTACTATGGGTTCT 20 60.3
pol2 forward CCTTTGGATGGGTTATGAACT 21 60.2 91
Reverse TATGTCATTGACAGTCCAGC 20 59.7
pol3
 forward CCTTCCCAACCAAGAAAGA 19 59.9 105
Reverse CCCATTGTCAGTTCCCAATA 20 67.9
pol4
 forward ACTGTTGGACCAGGGAATA 19 60.3 106
Reverse ATCCTGGACAGGCCTATAA 19 59.6
VSVG VSVG1 forward GTAGCTGAGGGGACAGATAG 20 60.4 95
Reverse CTTTCCAAGCCCTGTCTTAT 20 59.7
VSVG2 forward GGAACAGGACCATGTACAAA 20 59.9 100
Reverse CTTCTGCTAGACTGCCATTT 20 60
VSVG3 forward CATTCCATCCGATCCTTCAC 20 60.2 126
Reverse ATCCGTCACAGTTGCATATC 20 60
VSVG4 forward AATGCCCAAGAGTCACAAG 19 60.1 92
Reverse GTCCATACCAGCGGAAATC 19 60
env env1 forward TCCAATTTTAGCCTTGCCC 19 60.5 106
Reverse GGAGTCTGCTAGGGAGTAG 19 68.5
env2 forward GTCTCCGTCACCCAGTAT 18 60 101
Reverse CGAGTCTACCTGGTCTTGTA 21 60.1
최종 선별된 렌티 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머, 프로브 서열
Target Primer
/Probe 		Sequence(5' -> 3') Length
(bp) 		Tm
(℃) 		Product size(bp)
gag Forward GGAAGTGACATAGCAGGAAC 20 60 80
Reverse CCTACTGGGATAGGTGGATTA 21 59.9
Probe [FAM]ACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGAC[BHQ1] 29 67.6
pol Forward CCTTTGGATGGGTTATGAACT 21 60.2 91
Reverse TATGTCATTGACAGTCCAGC 20 59.7
Probe [Cy5]CTGATAAATGGACAGTACAGC[BHQ2] 27 70
VSV-G Forward CATTCCATCCGATCCTTCAC 20 60.2 126
Reverse ATCCGTCACAGTTGCATATC 20 60
Probe [HEX]ACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCC[BHQ1] 23 68.4
최종 선별된 레트로 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머, 프로브 서열
Target Primer
/Probe 		Sequence(5' -> 3') Length
(bp) 		Tm
(℃) 		Product size(bp)
gag Forward GTTCTCCTCTTCTGACCTTTAC 22 59.9 107
Reverse GCTGATGGGTGATGAGAAC 19 60
Probe [FAM]AGGTAAACTGACAGCTCTG[MGB] 19 68.8
pol Forward CCTTCCCAACCAAGAAAGA 19 59.5 105
Reverse CCCATTGTCAGTTCCCAATA 20 67.9
Probe [Cy5]AGATCTTCCCCAGGTTCGGCATG[BHQ2] 23 59.7
env Forward TCCAATTTTAGCCTTGCCC 19 60.5 106
Reverse GGAGTCTGCTAGGGAGTAG 19 68.5
Probe [ROX]CCTCTTGCGATACCCACTCCCTCT[BHQ2] 24 59.7
실시예2: 프라이머의 멀티플렉스 PCR 활용 가능성 검증
2-1. 렌티 바이러스
일반 PCR과 실시간 PCR을 이용해 프라이머 및 프로브가 잘 디자인되었는지 확인하였다. 먼저 SimpliAmp Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific) 일반PCR을 이용하여 조건에 맞는 프라이머 세트를 선택하였다.
결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
농도를 달리하여 2개의 프라미어 세트 후보군 중에서 1차적으로 프라이머gag1, 프라이머 pol2를 선택하였다. 온도는 디자인할 때 이용한 60℃보다 2℃낮은 58℃를 선택하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 VSVG를 표적하는 프라이머 VSVG1 및 VSVG2의 경우 증폭이 잘 되지 않아, 새롭게 프라이머 VSVG3 및 VSVG4를 디자인하여 증폭을 수행하였으며, 도 2에 나타낸 바와 같이 프라이머 VSVG3의 증폭 결과가 우수하여 VSVG3을 선택하였으며 각 프라이머 농도는 1μM로 설정하였다.
렌티 바이러스 생산세포 검출용 일반 PCR mix
시약 Vol(μL)
Master Mix (2X) 10
Primer(5 or 10pmole) 4
DW 4
DNA 2
Total 20
2차적으로 다이머(dimer) 형성을 확인하였다. 일반PCR 결과 gag1의 경우 1μM에서 밴드가 선명했으나, SYBR Green(SensiFAST™ SYBR® Lo-ROX Kit, Bioline)으로 확인하였을 때 다이머(dimer)가 형성되는 것을 확인하여, 최종 농도는 500nM로 설정하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
프라이머 pol1의 경우 SYBR Green으로 시행했을 시 다이머(dimer)가 형성되는 것을 확인하여, 최종적으로 프라이머 pol2를 선택하였다. Dimer 형성은 QuantStdio 3 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific)을 통해 확인하였다.
최종적으로 바이오라드(Bio-Rad)사의 CFX96 Opus Real-Time PCR System을 이용하여 멀티플렉스 PCR 진행 시, 프라이머와 프로브간의 간섭이 없는지 확인하였다. 결과는 도 4 및 표 7에 나타내었다.
3개의 타겟을 하나씩 조합하여 Ct값에 영향이 없다는 것을 확인하였다.
최종 선별된 렌티 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머를 사용한 Target별 Ct 평균
Dye Target Tatget name Ct 평균
FAM gag gag 21.47
pol N/A
VSVG N/A
gag-pol 21.03
gag-VSVG 21.16
pol-VSVG N/A
gag-pol-VSVG 21.01
Cy5 pol gag N/A
pol 21.12
VSVG N/A
gag-pol 20.74
gag-VSVG N/A
pol-VSVG 20.8
gag-pol-VSVG 20.72
HEX VSVG gag N/A
pol N/A
VSVG 20.83
gag-pol N/A
gag-VSVG 20
pol-VSVG 20.37
gag-pol-VSVG 19.8
2-1. 레트로 바이러스
일반 PCR과 실시간 PCR을 이용해 프라이머 및 프로브가 잘 디자인되었는지 확인하였다. 먼저 SimpliAmp Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific) 일반PCR을 이용하여 조건에 맞는 프라이머 세트를 선택하기 위한 검증을 실시하였다.
결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.
농도, annealing 온도(58℃, 60℃, 62℃)를 달리하여 2개의 프라미어 세트 후보군 중에서 프라이머 gag4, pol3, env1을 선택하였다. 프라이머 농도는 500nM, 온도는 58℃를 선택하였다. 밴드의 색은 프라이머 pol3보다 pol4가 진하나, 일반PCR에서 확인할 수 없었던 다이머(dimer) 형성을 SYBR Green(SensiFAST™ SYBR® Lo-ROX Kit, Bioline)을 통해 확인하여 최종적으로 프라이머 pol3을 선택하였다. Dimer의 형성은 QuantStdio 3 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific)을 이용하였다.
레트로 바이러스 생산세포 검출용 일반 PCR mix
시약 Vol(μL)
Master Mix (2X) 10
Primer(5 or 10pmole) 4
DW 4
DNA 2
Total 20
그 이후 바이오라드(Bio-Rad)사의 CFX96 Opus Real-Time PCR System을 이용하여 multiplex 진행 시, 프라이머와 프로브간의 간섭이 없는지 확인하였다.
결과는 도7, 도8 및 표 10에 나타내었으며, 3개의 타겟을 하나씩 조합하여 Ct값에 영향이 없다는 것을 확인하였다.
최종 선별된 레트로 바이러스 생산세포 검출용 프라이머를 이용한 Target별 Ct 평균
Dye Target Tatget name Ct
FAM gag gag 26.11
pol N/A
env N/A
gag-pol 25.95
gag-env 25.8
pol-env N/A
gag-pol-env 25.94
Cy5 pol gag N/A
pol 25.55
env N/A
gag-pol 25.44
gag-env N/A
pol-env 25.65
gag-pol-env 25.58
ROX env gag N/A
pol N/A
env 25.94
gag-pol N/A
gag-env 25.95
pol-env 26.29
gag-pol-env 26.26
실시예3: 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR
3-1. 실시간 PCR
실시간 PCR의 시약 조성 조건 및 증폭 조건은 아래와 같다. 사용한 프라이머, 프로브의 농도는 10μM이며 총 20μL가 되도록 조성하였다. 사용한 마스터믹스는 바이오라인(Bioline)사의 SensiFAST™ Probe No-ROX kit이며, 장비는 바이오라드(Bio-Rad)사의 CFX96 Opus Real-Time PCR System을 이용하였다.
검출 한계는 positive control로 사용한 CAR를 기준으로 하여, CAR의 양의 표준편차보다 큰 평균값을 보인 혼합 비율까지로 설정하였다. 또한 일정 양만큼 감소하다가 다음의 큰 혼합 비율보다 더 낮은 혼합 비율에서 낮은 상대 정량 혹은 낮은 절대 정량 값을 보였을 때, 그때까지를 검출 한계로 설정하였다.
PCR에 사용한 시료의 조성 및 조건은 표 11, 표 12 및 표 13에 나타내었다.
렌티 바이러스 생산세포 검출용 실시간 PCR mix
Reagent Vol(μL)
Master Mix (2X) 10
gag Primer(10pmole) 0.8
FAM Probe(10pmole) 0.1
pol Primer(10pmole) 0.8
Cy5 Probe(10pmole) 0.1
VSV-G Primer(10pmole) 0.8
ROX Probe(10pmole) 0.1
CAR Primer(10pmole) 0.8
HEX Probe(10pmole) 0.1
DW 4.4
DNA 2
Total 20
레트로 바이러스 생산세포 검출용 실시간 PCR mix
Reagent Vol(μL)
Master Mix (2X) 10
gag Primer(10pmole) 0.8
FAM Probe(10pmole) 0.1
pol Primer(10pmole) 0.8
Cy5 Probe(10pmole) 0.1
env Primer(10pmole) 0.8
ROX Probe(10pmole) 0.1
CAR Primer(10pmole) 0.8
HEX Probe(10pmole) 0.1
DW 4.4
DNA 2
Total 20
먼저 각 타겟이 잘 증폭되는지 확인하기 위해 혼합된 세포를 그대로 실시간 PCR로 검출하였다. 검출 한계 설정 시, 증폭되었어도 threshold를 넘지 않으면 증폭이 되지 않은 것으로 간주하였다. 렌티 바이러스의 경우 1:1000의 비율까지 검출이 된 것을 확인할 수 있었다. 하지만 디지털 PCR의 검출 상한이 최대 100,000 카피(copy)까지인 것을 고려하여 희석 후 다시 실험을 진행하였다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
결과는 도9 및 도 10에 나타내었다.
레트로 바이러스 생산세포의 경우, 여러 문헌에서 언급한 듯이 gag가 통합(integration)되었음을 알 수 있었다. 따라서 gag로는 검출 한계를 설정하지 못하고 pol과 env으로만 결정하였다. 각각 1:100까지인 것을 확인할 수 있었다. 이는 FACS에서 알려진 검출 한계에 비해 2 내지 4배 정도 민감한 것으로 판단된다.
3-2. 디지털 PCR
프라이머와 프로브 서열은 실시간 PCR과 동일하게 이용하였다. 두 종류의 디지털 PCR을 이용하였으며, 각 장비의 스펙과 용량에 맞추어 프로브의 형광과 프라이머, 프로브의 양을 달리하였다. 사용한 디지털 PCR은 Droplet 방식의 바이오라드(Bio-Rad)사의 QX200 digital PCR system(이하 Droplet 디지털 PCR)과 Nano plate 방식의 퀴아젠(QIAGEN)사의 QIAcuity digital PCR system(이하 Nano plate 디지털 PCR)이다. 장비에 이용되는 총 볼륨이 droplet 디지털 PCR은 20μL, nano plate 디지털 PCR은 40μL이나, 넣어준 DNA의 양은 같으므로, nano plate 디지털 PCR 결과의 농도에서 2배를 곱하여 보정한 후 결과를 분석하였다. 실험은 3반복하여 평균과 표준편차를 그래프로 나타내었다.
디지털 PCR에 사용한 시료의 조성 및 조건은 표 14, 표 15, 표 16 및 표 17에 나타내었다.
Target별 프로브 및 droplet 디지털 PCR 조성
시약 Vol(μL)
Master Mix (2X) 10
gag/VSV-G/env Primer(20pmole) 1.8
FAM Probe(10pmole) 0.5
CAR Primer(20pmole) 1.8
HEX Probe(10pmole) 0.5
DW 3.4
DNA 2
Total 20
렌티바이러스 nano plate 디지털 PCR 조성
시약 Vol(μL)
Master Mix 10
gag Primer(10pmole) 4.8
FAM Probe(10pmole) 1.2
pol Primer(10pmole) 4.8
Cy5 Probe(10pmole) 1.2
VSV-G Primer(10pmole) 4.8
ROX Probe(10pmole) 1.2
CAR Primer(10pmole) 4.8
HEX Probe(10pmole) 1.2
DW 4
DNA 2
Total 40
레트로바이러스 nano plate 디지털 PCR 조성
시약 Vol(μL)
Master Mix 10
gag Primer(10pmole) 4.8
FAM Probe(10pmole) 1.2
pol Primer(10pmole) 4.8
Cy5 Probe(10pmole) 1.2
env Primer(10pmole) 4.8
ROX Probe(10pmole) 1.2
CAR Primer(10pmole) 4.8
HEX Probe(10pmole) 1.2
DW 4
DNA 2
Total 40
실험 결과는 도12 및 도13에 나타내었다.
같은 양의 세포 혼합 샘플을 사용하였으나 렌티 바이러스의 경우 droplet 디지털 PCR에서는 포화(saturation)되어 정확한 copy수를 알 수 없었다. 본 실험의 목적은 미량의 혼입된 바이러스 생산세포를 검출하는 것이므로, 1:1, 1:10과 같은 낮은 희석 비율에서의 검출은 중요성이 떨어진다. 실험 결과, 모든 혼합 세포에서 1:100,000까지 검출된 것을 확인할 수 있었다.
레트로 바이러스 생산세포의 경우, 실시간 PCR 결과에서와 같이 gag는 통합된 것으로 나타났다. pol과 env의 경우, 1 카피(copy) 이내에서 큰 결과 차이는 없었으나, 설정한 기준대로 검출한계를 정하였을 때, droplet 디지털 PCR은 1:1,000, nano plate 디지털 PCR의 경우 1:100까지임을 알 수 있었다.
이 실험에서 예시로 사용된 레트로 바이러스 생산세포는 기존의 바이러스 생산세포에 gag, pol 등과 CAR를 형질전환(transfection) 시켜서 만든 것이 아닌, 바이러스 생산세포를 만들 때부터 gag, pol, env, CAR를 넣고 배양시킨 것이기 때문에 단순하게 검출한계를 설정하는 것에는 다소 무리가 있다. 하지만 해당 유전자를 검출하는 것에는 무리가 없음을 알 수 있다.
실시간 PCR과 디지털 PCR에서 모두 타겟으로 한 유전자들이 검출되었다. 디지털 PCR은 실시간 PCR에 비해 최신의 기술로, 더욱 더 높은 민감도를 가지고 있다. 본 실험 결과에 따르면 렌티 바이러스 생산세포 혼합 샘플에 대해서는 디지털 PCR이 100배 더 민감하게 타겟을 검출할 수 있음을 알 수 있었으며, 레트로 바이러스 생산세포 혼합 샘플에 대해서는 같거나 10배 정도 민감한 것을 알 수 있었다. 이는 기존의 FACS에 비해 렌티바이러스 생산세포에서는 2 내지 400 배 정도, 레트로바이러스 생산세포에서는 2 내지 40배 정도 민감한 것으로 판단된다.
위에서 언급하였듯이, 각 샘플에서 해당 서열들을 검출하는 것에는 무리가 없음을 알 수 있다. 따라서, 본 서열은 MLV, RD114를 기반으로 한 레트로 바이러스 생산세포의 검출에 사용 가능하다.
디지털 PCR을 보유한 실험실은 아직 극소수에 불과한 반면 실시간 PCR은 거의 대부분의 실험실에서 보유하고 있으므로, 실시간 PCR은 혼입 의심 시 1차적으로 간단하게 확인할 수 있는 방법이다. 따라서 더욱더 민감하게 혼입 혹은 잔류 의심 세포를 검출하고자 할 때는 디지털 PCR을 이용할 수 있다.

Claims (13)

  1. gag를 표적하는 프라이머 쌍, pol을 표적하는 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 VSVG를 표적하는 프라이머 쌍 또는 env를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 바이러스 생산 세포 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 gag를 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 pol을 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 프라이머 세트.
  5. 제2항에 있어서, 상기 VSVG를 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 프라이머 세트.
  6. 제2항에 있어서, 상기 env를 표적하는 프라이머 쌍은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 프라이머 세트.
  7. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스 생산 세포는 렌티 바이러스 생산 세포, 레트로 바이러스 생산 세포 또는 이들의 조합인 것인, 바이러스 생산 세포 검출용 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 다음의 (a) 내지 (d) 중 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 바이러스 생산 세포 검출용 조성물:
    (a) gag를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함함;
    (b) pol을 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함함;
    (c) VSVG를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함함; 및
    (d) env를 표적하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함함.
  10. 제7항의 조성물을 포함하는 바이러스 생산 세포 검출용 키트.
  11. 제1항의 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계 및 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 산물을 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 생산 세포 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)인 것인, 바이러스 생산 세포 검출 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 실시간 PCR 또는 디지털 PCR인 것인, 바이러스 생산 세포 검출 방법.
KR1020220136002A 2022-10-20 바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 프로브 KR20240056849A (ko)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240056849A true KR20240056849A (ko) 2024-05-02

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210332448A1 (en) Compositions and methods for quantifying integration of recombinant vector nucleic acid
WO2019149107A1 (zh) 一种实时荧光定量pcr检测rcl的试剂和方法
US20100184015A1 (en) Method for detection of xmrv
CN109844137A (zh) 用于鉴定嵌合产物的条形码化环状文库构建
JP3909010B2 (ja) 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ
US20170283856A1 (en) Lytic composition and application thereof, kit, method for preparing nucleic acid by utilizing lytic composition, and nucleic acid analysis method
CN112301101A (zh) Crispr多靶标检测方法及其试剂盒
EP3214181B1 (en) Oligonucleotides, set of oligonucleotides, htlv-i/htlv-ii infection diagnostic and discrimination kit, polynucleotide suitable as reference target for designing primers and probes for the detection and differentiation of htlv-i and htlv-ii, amplicon and method for detecting at least one htlv target
Wang et al. A ligation/recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of SARS-CoV− 2
US8304527B2 (en) Kit for high throughput mutation screening methods
KR101901749B1 (ko) 실시간 핵산 또는 단백질 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법
EP4180538A1 (en) Composition for determining false positives by using specific artificial nucleotide sequence and method for determining false positives by using same
CN113186257A (zh) 一种基于液态芯片技术的pcr扩增后恒温杂交方法
AU2006226873B2 (en) Nucleic acid detection
KR20240056849A (ko) 바이러스 생산 세포 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 프로브
EP3447145B1 (en) Target nucleic acid sequence detection method using multiple amplification nested signal amplification
CN114134208B (zh) 荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法
WO2014027663A1 (ja) ウシ白血病ウイルス検出用プライマーセット、及びその利用
CN108998535B (zh) 一种kras基因多重突变位点检测试剂盒
Timmer et al. The polymerase chain reaction
CN114875116B (zh) 一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用
KR20240056848A (ko) 미분화 유도만능줄기세포 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 프로브
WO2023087290A1 (en) Methods for nucleic acid detection
CN116694816A (zh) SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法
CN116497092A (zh) 一种高特异性快速核酸检测方法及其应用