CN112301101A - Crispr多靶标检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒。具体地,本发明提供了一种利用CRISPR方法快速检测多靶标的方法和试剂盒。具体地,本发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系,包含:(a)n种具有特定结构的向导RNA‑报告核酸复合探针;和(b)Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。使用本发明所提供的方法,可以同时、快速、准确地检测出同一样本体系中所含有的不同靶标核酸分子。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,本发明涉及CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒。
背景技术
利用Cas13或Cas12蛋白的CRISPR诊断方法被誉为下一代检测技术(分别称为SHERLOCK和HOLMES),因其同时兼具快速、灵敏、特异、简便和廉价的特点。Cas12和Cas13蛋白能用于核酸检测是基于它们旁路(或反式)切割的活力,即在人工设计的向导RNA的引导下,结合特定序列的核酸片段,随之切割单链核酸探针,从而产生可被检测的信号。Cas12和Cas13的差异在于,Cas13蛋白结合RNA标靶并切割RNA探针,而Cas12则结合DNA靶标并切割单链DNA探针。
从原理上来说,若使用Cas13来检测常规的DNA靶标,对靶标DNA进行扩增,并在此过程中引入T7等启动子序列;然后还需要进行体外转录以生成模板RNA,以便Cas13进行识别和结合。此外,在Cas13的检测过程中所使用的RNA报告探针存在较大风险被RNA酶降解,从而导致检测体系的背景信号值较高。相比之下,基于Cas12的检测方法由于无需体外转录也不需要RNA报告探针,因而更具优势。
在一个检测体系中同时检测多个存在靶标的方法和技术对于体外诊断的拓展应用非常重要。目前,基于Cas13蛋白已开发出一种多靶标检测的方法,其关键是利用不同物种来源的Cas13蛋白针对不同RNA报告探针的旁路切割活性不同的特点。然而,Cas12没有这方面特性的研究报导;因此,有必要开发一种全新的方法,利用Cas蛋白进行多靶标核酸的检测。
发明内容
本发明的目的就是提供一种基于CRISPR-Cas蛋白的多靶标检测方法和试剂盒。
在本发明的第一方面,提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系,所述检测体系包含:
(a)n种向导RNA-报告核酸复合探针,所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构,
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)
Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)
其中,
Z1为第一茎环结构区;
Z2为无或核酸连接区;
Z3为向导RNA区;
Z5为带可检测标记的单链待切割核酸,其中,所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下,呈现不同的检测状态从而被检测出;
其中,当靶标核酸不存在于所述检测体系时,Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区;而当靶标核酸存在于所述检测体系时,Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区;
Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区;
并且,n为n≥1的正整数;和
(b)Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。
在另一优选例中,所述的Cas蛋白选自下组:Cas12型、Cas13a型、Cas13b型、Cas14型、或其组合。
在另一优选例中,当Cas蛋白为Cas12型和/或Cas13a型和/或Cas14型时,所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia或Ib所示结构。
在另一优选例中,当Cas蛋白为Cas13b型时,所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ic或式Id所示结构。
在另一优选例中,所述的Cas12型选自下组:Cas12a、Cas12b、Cas12g、Cas12i、或其组合。
在另一优选例中,当靶标核酸不存在于所述检测体系时,所述的向导RNA-报告核酸复合探针为式IIa结构:
式中,
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5如上所述,
在另一优选例中,在式Ia、式IIa、式Ic的结构式、式Ib中的“Z1-Z2-Z3”和式Id中的“Z3-Z2-Z1”,为从5'至3'方向。
在另一优选例中,当靶标核酸不存在于所述检测体系时,所述的向导RNA-报告核酸复合探针为式IIc结构:
式中,
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5如上所述,
在另一优选例中,所述的互补配对的双链结构区包括Z3和Z5通过部分或全部互补配对所形成的双链结构区。
在另一优选例中,所述的互补配对的双链结构区为Z3和Z5通过全部互补配对所形成的双链结构区。
在另一优选例中,所述的Z1、Z2和Z3用于引导Cas蛋白结合于靶标核酸。
在另一优选例中,所述的Z1用于结合或锚定Cas蛋白。
在另一优选例中,所述向导RNA区通过与靶标核酸的互补配对,引导Cas蛋白结合于所述的靶标核酸。
在另一优选例中,Z3、Z4和Z5形成第二茎环结构区,其中,Z4为环区域(包括简单结构和复杂结构的环区域)。
在另一优选例中,所述的Z1基本上或全部由RNA构成。
在另一优选例中,所述的Z3基本上或全部由RNA构成。
在另一优选例中,所述向导RNA-报告核酸复合探针为单链。
在另一优选例中,所述Z1中的茎环结构为crRNA(或CRISPR RNA)茎环结构。
在另一优选例中,所述Z1的长度为10-300nt,较佳地为19-100nt,更佳地为19-91nt。
在另一优选例中,所述Z2是无或长度为0-20nt的核酸连接区。
在另一优选例中,所述体系中:
(i)n≥2,并且n为正整数;
(ii)所述的可检测标记为荧光基团,并且Z5带有荧光基团,而所述Z4和/或Z5中还带有淬灭基团,当且仅当所述的单链待切割核酸被切割时,可检测到荧光基团所发出的荧光信号;和/或
(iii)在所述的n种向导RNA-报告核酸复合探针中,所述的荧光基团两两不同,从而可被区分。
在另一优选例中,所述的可检测标记为荧光基团,并且Z5带有淬灭基团,而所述Z4和/或Z5中还带有荧光基团,当且仅当所述的单链待切割核酸被切割时,可检测到荧光基团所发出的荧光信号。
在另一优选例中,所述的可检测标记为荧光基团,其中,荧光基团位于Z5、Z4和Z3中任一区段,而淬灭基团位于Z5、Z4和Z3中任一区段,当且仅当所述的单链待切割核酸被切割时,可检测到荧光基团所发出的荧光信号。
在另一优选例中,所述荧光基团和淬灭基团不同时位于Z3。
在另一优选例中,所述Z3中包含可以引导所述Cas蛋白特异性结合靶标核酸分子的核酸序列。
在另一优选例中,所述Z3的长度为15-50nt,较佳地16-40nt,更佳地16-34nt。
在另一优选例中,所述Z1、Z2和Z3均是RNA核酸序列。
在另一优选例中,所述Z4为DNA和/或RNA核酸序列。
在另一优选例中,所述Z5为DNA单链核酸序列,或者RNA单链核酸序列,或同时具有RNA和DNA的核酸序列。
在另一优选例中,所述Z5含有基于天然碱基的核苷酸,或者含有基于天然碱基和非天然碱基的核苷酸。
在另一优选例中,所述的核苷酸包括核糖核酸、脱氧核糖核酸、肽核酸、或其组合。
在另一优选例中,所述的天然碱基选自下组:A、T、C、G、U、I。
在另一优选例中,所述Z5的长度为3-50nt,较佳地4-30nt,更佳地6-12nt。
在另一优选例中,所述Z5中所带的标记为荧光基团和淬灭基团。
在另一优选例中,且所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述Z5的5'端、3'端和/或中部。
在另一优选例中,在所述反应体系中,各向导RNA-报告核酸复合探针两两之间均带有不同的荧光基团和不同或相同的淬灭基团。
在另一优选例中,所述检测体系中还含有m种待检测的靶标核酸分子,其中,m为正整数,并且m≤n。
在另一优选例中,所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子:植物、动物、昆虫、微生物、病毒、或其组合。
在另一优选例中,所述的靶标核酸是人工合成或天然存在的核酸。
在另一优选例中,所述的靶标核酸包括野生型或突变型的核酸。
在另一优选例中,所述的靶标核酸分子为靶标DNA或RNA。
在另一优选例中,所述的靶标DNA包括未经逆转录的DNA或由RNA逆转录或扩增而获得的DNA(例如,cDNA等)。
在另一优选例中,所述的靶标RNA包括未经转录或由DNA转录而获得的RNA。
在另一优选例中,所述的检测包括:定性检测或定量检测。
在另一优选例中,所述的检测体系还含有(c)缓冲液。
在另一优选例中,所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。
在另一优选例中,所述的检测体系还含有用于核酸扩增反应的试剂。
在另一优选例中,所述的检测体系还含有:
(d1)用于扩增靶标DNA的聚合酶;
(d2)任选的用于反转录的反转录酶;
(d3)任选的用于转录的转录酶;
(d4)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs;
(d5)用于转录反应的NTPs。
在另一优选例中,所述的待检测的靶标核酸分子在所述待检测体系中的浓度为1×10-9nM至1×103nM;较佳地1×10-8nM至1×102nM。
在另一优选例中,所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1至1×1015拷贝/毫升,较佳地1至1010拷贝/毫升,更佳地1至105拷贝/毫升。
在另一优选例中,所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1至1000拷贝/毫升,较佳地1至100拷贝/毫升,更佳地1至10拷贝/毫升。
在另一优选例中,所述的检测体系中,每个向导RNA-报告核酸复合探针与对应的靶标核酸分子的摩尔比为1:1至1014:1,较佳地10:1至105:1,更佳地20:1至103:1。
在另一优选例中,所述Cas蛋白选自下组:Cas12a、Cas12b、Cas12g、Cas12i、Cas13a、Cas13b和Cas14。
在另一优选例中,所述的Cas12a蛋白选自下组:FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a。
在另一优选例中,所述Cas12a蛋白为LbCas12a或FnCas12a。
在另一优选例中,所述Cas12b蛋白选自下组:AaCas12b、AacCas12b、AbCas12b、AkCas12b、AmCas12b、BhCas12b、BsCas12b、EbCas12b和LsCas12b。
在另一优选例中,所述Cas12g蛋白为Cas12g1。
在另一优选例中,所述Cas12i蛋白为Cas12i1或Cas12i2。
在另一优选例中,所述Cas13a蛋白选自下组:LshCas13a、LwaCas13a、LbaCas13a、LseCas13a、LbmCas13a、LbnCas13a、CamCas13a、CgaCas13a、Cga2Cas13a、PprCas13a、LweCas13a、Lwa2Cas13a、LbfCas13a、RcsCas13a、RcrCas13a、RcdCas13a和LbuCas13a。
在另一优选例中,所述Cas13b蛋白选自下组:BzoCas13b、PinCas13b、PbuCas13b、AspCas13b、PsmCas13b、RanCas13b、PauCas13b、PsaCas13b、Pin2Cas13b、CcaCas13b、PguCas13b、PspCas13b、PigCas13b和Pin3Cas13b。
在另一优选例中,所述Cas14蛋白选自下组:Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、Cas14h和Cas14u。
在另一优选例中,n为2-200之间的正整数;较佳地,n为2-100之间的正整数;更佳地,n为2-20之间的正整数;更佳地,n为2-10之间的正整数。
在本发明的第二方面,提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒,所述试剂盒包括:
i)第一容器以及位于第一容器内的n种具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构的向导RNA-报告核酸复合探针,
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)
Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)
其中,
Z1为第一茎环结构区;
Z2为无或核酸连接区;
Z3为向导RNA区;
Z5为带可检测标记的单链待切割核酸,其中,所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下,呈现不同的检测状态从而被检测出;
其中,当靶标核酸不存在于所述检测体系时,Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区;而当靶标核酸存在于所述检测体系时,Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区;
Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区;
并且,n为n≥1的正整数;
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白;
iii)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
在另一优选例中,所述的靶标核酸分子为靶标DNA和/或靶标RNA。
在另一优选例中,所述第一容器、第二容器和第三容器可以是相同容器或不同容器。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括:
iv)第四容器以及位于第四容器内的用于扩增靶标DNA的聚合酶;
v)任选的第五容器以及位于第五容器内的用于反转录的反转录酶和/或用于转录的转录酶;
vii)第六容器以及位于第六容器内的用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs和/或用于转录反应的NTPs。
在另一优选例中,所述检测用于同时检测两种或多种不同的靶标核酸分子。
在另一优选例中,所述的检测体系还含有用于核酸扩增反应的试剂。
在另一优选例中,所述第四容器、第五容器和第六容器可以是相同容器或不同容器。
在另一优选例中,所述第一容器至第六容器中的二个、多个或全部可以是相同容器或不同容器。
在本发明的第三方面,提供了检测样本中的靶标核酸分子的方法,包括以下步骤:
(i)提供如本发明第一方面所述的用于同时检测多种靶标核酸分子的检测体系,并且所述的检测体系还含有待检测的样本;和
(ii)检测所述检测体系中的向导RNA-报告核酸复合探针是否被Cas蛋白进行切割,所述的切割为针对单链核酸的旁路(或反式)切割;
其中,所述向导RNA-报告核酸复合探针被Cas蛋白切割,则表示所述样本中存在对应的靶标核酸分子;而所述向导RNA-报告核酸复合探针不被Cas蛋白切割,则表示所述样本中不存在对应的靶标核酸分子。
在另一优选例中,所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。
在另一优选例中,所述的待检测的样本是经过扩增而获得的样本。
在另一优选例中,所述核酸扩增的方法选自下组:PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2。
在另一优选例中,所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、或低温PCR。
在另一优选例中,在步骤(ii)中的检测包括荧光检测法。
在另一优选例中,所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计或者荧光定量PCR仪进行检测。
在另一优选例中,所述的方法是体外检测方法。
在另一优选例中,所述的样本是体外的或离体的样本。
在另一优选例中,所述的方法是非诊断性的和非治疗性的。
在另一优选例中,所述的方法是诊断性的。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了向导RNA-报告核酸复合探针示意图(式Ia)。图中,F表示荧光基团(或其他可检测标记),Q为淬灭基团(或其他用于淬灭F信号的淬灭官能团)。
图2显示了CRISPR多靶标检测结果。
其中,图2A显示了代表了8个不同样品的颜色;图2B是Green通道:检测FAM荧光,检测的靶标序列为DNMT1-3位点;图2C是Orange通道:检测ROX荧光,检测的靶标序列为sry位点)。
图3显示了另一种向导RNA-报告核酸复合探针示意图(式Ib)。图中,F表示荧光基团(或其他可检测标记),Q为淬灭基团(或其他用于淬灭F信号的淬灭官能团)。
图4显示了另一种向导RNA-报告核酸复合探针示意图(式Ic)。图中,F表示荧光基团(或其他可检测标记),Q为淬灭基团(或其他用于淬灭F信号的淬灭官能团)。
图5显示了另一种向导RNA-报告核酸复合探针示意图(式Id)。图中,F表示荧光基团(或其他可检测标记),Q为淬灭基团(或其他用于淬灭F信号的淬灭官能团)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,首次开发出一种基于CRISPR技术可以在同一检测体系中同时检测多个靶标核酸分子的方法。具体地,本发明人开发了一种向导RNA-报告核酸复合探针,所述探针中串联有RNA第一茎环结构区、向导RNA区、连接区以及带有荧光基团和淬灭基团的单链待切割核酸;在同一检测体系中,可含有多种不同的所述向导RNA-报告核酸复合探针,所针对的靶标核酸分子不同的各探针中,所带的荧光基团和淬灭基团也不相同。因此,可以根据检测出的不同的荧光信号,来区分被检测出的不同的靶标核酸分子。使用这种基于CRISPR技术的多靶标检测方法,可以同时、快速、准确地检测出同一样本体系中所含有的不同靶标核酸分子。在此基础上完成了本发明。
术语
术语“CRISPR”是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats),该序列是许多原核生物的免疫系统的部分。
术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白,它是CRISPR系统中的相关蛋白。
术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶,它是CRISPR系统分类中V-A型的酶。
术语“Cas12b”,“C2c1”可互换使用,是指sgRNA依赖的内切酶,它是CRISPR系统分类中V-B型的酶。
术语“Cas12c”,“C2c3”可互换使用,是指tracrRNA:crRNA(或sgRNA)依赖的内切酶,它是CRISPR系统分类中V-C型的酶。
术语“Cas12g”,是指tracrRNA:crRNA(或sgRNA)依赖的RNA酶,它是CRISPR系统分类中V-G型的酶。
术语“Cas12i”,是指crRNA依赖的核酸内切酶,它是CRISPR系统分类中V-I型的酶。
术语“Cas13a”,“C2c2”可互换使用,是指crRNA依赖的内切酶,它是CRISPR系统分类中VI-A型的酶。
术语“Cas13b”,是指crRNA依赖的内切酶,它是CRISPR系统分类中VI-B型的酶。
术语“Cas14”,是指tracrRNA:crRNA(或sgRNA)依赖的内切酶,它是CRISPR系统分类中V-F型的酶
术语“PCR”是指“聚合酶链式反应”,用于大量扩增目的DNA片段的一种方法。
向导RNA-报告核酸复合探针
如本文所用,术语“本发明的向导RNA-报告核酸复合探针”、“本发明的复合探针”、“本发明探针”可互换使用,指本发明所述的可用于检测靶标核酸分子的探针,包括具有Ia或Ib所示的向导RNA-报告核酸复合探针。应理解,该术语还包括所述复合探针中Z3和Z5之间形成配对、部分配对或不形成配对的各自不同形式。例如,式IIa为本发明式Ia复合探针中Z3和Z5形成配对的状态。
在本发明中,提供了一种结构新颖的向导RNA-报告核酸复合探针。一种代表性的复合探针具有如式Ia所示结构,
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)
式中,Z1、Z2、Z3、Z4和Z5如上所述。
另一种与式Ia类似的复合探针为式Ib结构,其中,Z1-Z2-Z3和Z5分别为两个独立的分子:
另一种与式Ia类似的复合探针为式Ic结构,
Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)
式中,Z1、Z2、Z3、Z4和Z5如上所述。
另一种与式Ia类似的复合探针为式Id结构,其中,Z1-Z2-Z3和Z5分别为两个独立的分子:
在本发明中,所述的式Ic或式Id结构的复合探针与Cas13b型的Cas蛋白配合使用。
在另一优选例中,所述Z5中所带的标记为荧光基团和淬灭基团,且所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和/或中部。
以Cas12型为例,一种代表性的向导RNA-报告核酸复合探针的结构如图1所示。在该复合探针中,在向导RNA的3'端加入了一段DNA的序列,并且在中间加入了淬灭基团(Q)、3'末端加入了荧光基团(F)。所述复合探针的序列既起到了向导RNA的作用,也起到了荧光探针的作用。
为了便于理解,以Cas12型为例,提供以下原理供参考。然而,应理解,本发明的保护范围不受该原理的限制。在本发明中,在没有靶标DNA的情况下,DNA的末端序列(Z5)与向导RNA的一部分序列碱基(Z3)互补配对,形成一个发夹结构。当存在特异的靶标序列时,本发明的复合探针与Cas12a蛋白结合并结合到靶标序列上,此时发夹结构(即Z3和Z5的配对结构会解开)会打开,同时激活Cas12a的旁路单链DNA切割活力,从而切割该复合探针的DNA部分(例如Z5),导致荧光基团与淬灭基团分开,进而使得淬灭基团失去淬灭功能而发出荧光。
在本发明中,即使在同一反应体系或检测体系中加入多种荧光探针时,由于初始状态没有游离的单链DNA,因此被其他靶标激活的Cas12旁路切割活力并不会将未结合靶标的复合探针切碎,也不会相互干扰。
本发明反应体系
在本发明中,提供了一种用于检测一种或多种(尤其是同时检测多种)靶标核酸分子的反应体系,所述反应体系包括:
(a)n种本发明的所述的向导RNA-报告核酸复合探针(优选地,n为2-500或2-200);和
(b)Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。
本发明所提供的检测体系,可检测m种待检测的靶标核酸分子,其中,m为正整数,并且m≤n。
在本发明中,所述的检测包括:定性检测或定量检测。
在本发明的另一个实施方式中,所述的检测体系还含有:
(d1)用于扩增靶标DNA的聚合酶;
(d2)任选的用于反转录的反转录酶;
(d3)任选的用于转录的转录酶;
(d4)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs;
(d5)用于转录反应的NTPs。
优选地,在本发明所提供的检测体系中,所述的待检测的靶标核酸分子在所述待检测体系中的浓度为1×10-9nM至1×103nM;较佳地1×10-8nM至1×102nM。
在另一优选例中,所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1至1×1015拷贝/毫升,较佳地1至1010拷贝/毫升,更佳地1至105拷贝/毫升。
在另一优选例中,所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1至1000拷贝/毫升,较佳地1至100拷贝/毫升,更佳地1至10拷贝/毫升。
在另一优选例中,所述的检测体系中,每个向导RNA-报告核酸复合探针与对应的靶标核酸分子的摩尔比为1:1至1014:1,较佳地10:1至105:1,更佳地20:1至103:1。
本发明试剂盒
在本发明中,提供了用于检测一种或多种(尤其是同时检测多种)靶标核酸分子的试剂盒,所述的试剂盒包括:
i)第一容器以及位于第一容器内的n种如本文所述的向导RNA-报告核酸复合探针(优选地,n为2-500或2-200的正整数);
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白;
iii)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
在一个优选的实施方式中,所述的检测体系还含有用于核酸扩增反应的试剂。即本发明的检测体系中,可对靶标核酸分子进行扩增,并对扩增的靶标核酸分子其进行检测,其具有信号放大的作用。
在本发明的一个实施方式中,所述第四容器、第五容器和第六容器可以是相同容器或不同容器。优选地,所述第一容器至第六容器中的二个、多个或全部可以是相同容器或不同容器。
多重检测
在本发明中,提供了一种同时检测样本中的多种靶标核酸分子的方法,包括以下步骤:
(i)提供本发明第一方面所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系,并且所述的检测体系还含有待检测的样本;和
(ii)检测所述检测体系中的向导RNA-报告核酸复合探针是否被Cas蛋白进行切割,所述的切割为旁路单链核酸的反式切割;
其中,所述向导RNA-报告核酸复合探针被Cas蛋白切割,则表示所述样本中存在对应的靶标核酸分子;而所述向导RNA-报告核酸复合探针不被Cas蛋白切割,则表示所述样本中不存在对应的靶标核酸分子。
在本发明中,所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本,还可包括未经转录的样本以及经过转录的样本。
在本发明的一个实施方式中,所述核酸扩增的方法选自下组:PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2。
在一个优选的实施方式中,所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、和/或低温PCR。
在本发明一个优选的实施方式中,在步骤(ii)中的检测包括荧光检测法。优选地,所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。
在本发明的一个实施方式中,所述的方法是体外检测方法。优选地,所述的样本是体外的或离体的样本。
在本发明的另一个实施方式中,所述的方法是非诊断性的和非治疗性的。
本发明的主要优点包括:
1)高效:本发明多靶标检测方法实现了在同一检测体系中,以极高的灵敏度检测出多种同时存在的靶标核酸分子,可以检测到10-17M浓度的核酸分子(如DNA)。
2)低成本:由于可以在很小的样本中同时检测多种靶标核酸分子,本发明方法可以极大地节约检测成本。实验中没有特殊的材料或酶,而且涉及到的材料、试剂等较少,可以进行微量化的测试分析
3)快速:在测试条件准备好的情况下,从拿到样品,到拿到检测结果只需约1小时。
4)多用途:可检测不同的核酸样本,包括DNA样本和RNA样本。
5)简单:没有特殊复杂的步骤,如果制成试剂盒以及设定好程序,只需简单的加入样品等操作。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:Cas12多靶标检测测试
1.向导RNA-报告核酸复合探针的结构
以Cas12a型为例,向导RNA-报告核酸复合探针的结构如图1所示。在本实施例中,设计并合成2种探针,序列如下:
表1示例性向导RNA-报告核酸复合探针序列
*BHQ1、BHQ2为淬灭基团;FAM和ROX分别为不同的荧光基团。
2.靶标DNA的获得
首先,需要对目的序列进行扩增,可以使用PCR或其他任何扩增方法,在本实施例中,使用等温LAMP扩增。
LAMP扩增反应:将男性唾液95℃加热10min后,作为模板。每个反应体系总体积为20μL,分别加入两类引物,分别扩增常染色体上的基因DNMT1-3和男性Y染色体特有的基因sry(序列见引物表)。具体引物量是1.6μM的FIP与BIP、0.2μM的F3与B3、0.4μM的LoopF与LoopB,LAMP反应所用的试剂盒为WarmLAMP Kit(NEB)。LAMP反应程序为65℃40min。上述产物称为DNM和sry。
另外,还以结核分枝杆菌的基因组为模板扩增了IS6110-1片段,其扩增产物称为IS-1。
3、Cas12a反应
在20μL反应体系中,加入
加完之后,在荧光定量PCR仪中检测,采用恒温40℃的反应条件。
共8个样品,其他都一样,仅加入的模板不同,分别是1.ddH2O;2.DNM;3.IS-1;4.sry;5.DNM+IS-1;6.DNM+sry;7.IS-1+sry;8.DNM+IS-1+sry。
结果如图2所示,图2B是Green通道,即检测针对DNM靶标的FAM荧光,其中能检测到显著上升曲线的分别是2、5、6和8号样品;图2C是Orange通道,也就是检测针对sry靶标的ROX荧光,其中能检测到显著上升曲线的分别是4、6、7和8号样品。
以上结果表明,一旦所述检测体系中存在相应的靶标即可检测到对应的荧光信号,与预期的结果相符;反之,可以根据所检测到的荧光信号种类来判断某种靶标是否存在。
表2引物序列
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海吐露港生物科技有限公司
<120> CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒
<130> P2019-0923
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> RNA/DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaauuucuac uguuguagau cugauggucc augucuguua cucctctaac agac 54
<210> 2
<211> 55
<212> RNA/DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aauuucuacu guuguagauu cucugugcau ggccuguaau uuccttatta caggc 55
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaacgttc ccttagcact 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagggcag aactagtcc 19
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccacttga caggcgagta actgccactt attgggtcag c 41
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgtgttccc cagagtgact tagcagcttc ctcctcctt 39
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaaacatt aacgtactga tg 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttccttttat ttcccttcag c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctctgtgca tggcctgta 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacagtaaag gcaacgtcca 20
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcagctggga taccagtgga agtgcctcct ggaagaatgg 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctctagagc catcttgcgc ctgaagcgac ccatgaacgc 40
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcttactga agccgaaaaa tg 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgatcgcgag accacacgat g 21
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgccgccaac tacggt 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggcgctgga cgagat 16
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcatctggcc acctcgatgc cttacggtgc ccgcaaagt 39
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acggctgatg accaaactcg gcggctgtgg ccggatca 38
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcacggttca gggttagc 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aagcccgcag gaccacgatc 20
Claims (10)
1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系,其特征在于,所述检测体系包含:
(a)n种向导RNA-报告核酸复合探针,所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构,
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)
Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)
其中,
Z1为第一茎环结构区;
Z2为无或核酸连接区;
Z3为向导RNA区;
Z5为带可检测标记的单链待切割核酸,其中,所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下,呈现不同的检测状态从而被检测出;
其中,当靶标核酸不存在于所述检测体系时,Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区;而当靶标核酸存在于所述检测体系时,Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区;
Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区;
并且,n为n≥1的正整数;和
(b)Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。
2.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的Cas蛋白选自下组:Cas12型、Cas13a型、Cas13b型、Cas14型、或其组合。
3.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述体系中:
(i)n≥2,并且n为正整数;
(ii)所述的可检测标记为荧光基团,并且Z5带有荧光基团,而所述Z4和/或Z5中还带有淬灭基团,当且仅当所述的单链待切割核酸被切割时,可检测到荧光基团所发出的荧光信号;和/或
(iii)在所述的n种向导RNA-报告核酸复合探针中,所述的荧光基团两两不同,从而可被区分。
4.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述Z3中包含可以引导所述Cas蛋白特异性结合靶标核酸分子的核酸序列。
5.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述Z5为DNA单链核酸序列,或者RNA单链核酸序列,或同时具有RNA和DNA的核酸序列。
6.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的检测包括:定性检测或定量检测。
7.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
i)第一容器以及位于第一容器内的n种具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构的向导RNA-报告核酸复合探针,
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)
Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)
其中,
Z1为第一茎环结构区;
Z2为无或核酸连接区;
Z3为向导RNA区;
Z5为带可检测标记的单链待切割核酸,其中,所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下,呈现不同的检测状态从而被检测出;
其中,当靶标核酸不存在于所述检测体系时,Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区;而当靶标核酸存在于所述检测体系时,Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区;
Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区;
并且,n为n≥1的正整数;
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白,所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白;
iii)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:
iv)第四容器以及位于第四容器内的用于扩增靶标DNA的聚合酶;
v)任选的第五容器以及位于第五容器内的用于反转录的反转录酶和/或用于转录的转录酶;
vii)第六容器以及位于第六容器内的用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs和/或用于转录反应的NTPs。
9.一种检测样本中的靶标核酸分子的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(i)提供如权利要求2所述的用于同时检测多种靶标核酸分子的检测体系,并且所述的检测体系还含有待检测的样本;和
(ii)检测所述检测体系中的向导RNA-报告核酸复合探针是否被Cas蛋白进行切割,所述的切割为针对单链核酸的旁路(或反式)切割;
其中,所述向导RNA-报告核酸复合探针被Cas蛋白切割,则表示所述样本中存在对应的靶标核酸分子;而所述向导RNA-报告核酸复合探针不被Cas蛋白切割,则表示所述样本中不存在对应的靶标核酸分子。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的待检测的样本是经过扩增而获得的样本。
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