CN114836521A - 一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，属于生物传感器技术领域。所述荧光生物传感器的组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链。该生物传感器检测范围宽至50μg/mL‑50 fg/mL，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。

Description

一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器。
背景技术
四环素在牛奶中根据食品安全国家标准(GB 31650-2019)允许的残留量为100 μg·kg-1，在蜂蜜中根据食品安全国家标准(GB 14963-2011)允许的残留量为20 μg·mL-1。目前用于检测四环素残留的传统方法有液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。传统检测方法需要大型仪器且耗时较长检测线较高等缺点。生物传感器方法主要有荧光适配体传感器、比色适配体传感器等；荧光适配体传感器荧光染料存在抗光漂白性差、荧光性能易受外界因素影响，比色适配体传感器金纳米粒子容易受到盐粒子的影响, 出现非特异性聚集变色现象表现出实验结果不稳定的现象；现有技术如高效液相色谱四环素检出限为0.125mg/kg，相对标准偏差在5%以内；荧光适配体传感器在最佳条件下, 四环素的检测线性范围为0.01~100 ng/mL, 检出限 (LOD) 为0.0062 ng/mL。
在四环素的检测中急需一种检测范围宽，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定的生物传感器。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器。本发明提供的生物传感器检测范围宽（50 μg/mL-50 fg /mL），检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，其组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；
所述的aptamer76链的碱基序列为：
5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’；
所述的trigger链的碱基序列为：5’-CACGTGGAGCTCGAATTCCGTACG-3’；
所述sgRNA的碱基序列为：
5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC CGU ACG GAA UUC GCU AGU CCG AGC UCC ACG UG-3'
所述FQ链的碱基序列为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
上述基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）二元复合物探针构建：所述二元复合物探针由aptamer76链与trigger链杂交而成；
（2）四环素与二元复合物探针反应：将步骤（1）所构建的二元复合物探针与四环素均匀混匀孵育；
（3）均相反应：将Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链、四环素与二元复合物探针的混合液加入到均相中，混合均匀后孵育；
（4）荧光仪检测化学发光强度。
上述荧光生物生物传感器的制备方法中所述步骤（1）中aptamer76链与trigger链的浓度比为1.5:1。
上述的荧光生物生物传感器在四环素检测中的应用。
本发明基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器的技术原理：
CRISPR-Cas14a能够识别ssDNA从而激活Cas14a的非特异性切割单链活性；在此发明中识别的ssDNA就是trigger链，切割的单链就是FQ链；aptamer76链是可以特异性识别四环素小分子的适配体，trigger链是根据碱基互补配对原则设计的与aptamer76链结合的ssDNA, 当小分子物质四环素（TC）存在时，四环素与aptamer76链特异性结合从而使得trigger链被释放，sgRNA能够识别trigger导致Cas14a的非特异性切割单链活性被激活，FQ链被切割，在483nm-525nm处能够观察到绿色荧光（图1）。
本发明的优点在于：
本发明提供一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的传感器，该生物传感器用于检测四环素，其检测范围宽至50 μg/mL-50 fg/mL，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。
附图说明:
图1本发明的技术路线图。
图 2为四环素样本(阳性样本）测定结果图。左图为：通过实时荧光PCR仪测定的四环素样本(阳性样本）的曲线图，右图为：此样本在蓝光切胶仪下拍摄的图片。
图3为UP水为样本(阴性样本）的测定结果图。左图为：通过实时荧光PCR仪测定的以UP水为样本(阴性样本）的曲线图，右图为：此样本在蓝光切胶仪下拍摄的图片。
图4为aptamer76链与trigger链的不同比例结合的核酸电泳图。1-6泳道对应表1中编号1-6的不同浓度比例。
图5为不同浓度的标准四环素水溶液测定结果图。上图为蓝光切胶仪下拍摄的图；下图为蓝光切胶仪下拍摄后用Image J处理的图。从左至右：十一个样品对应表2中1-11的不同样本。
图6为检测不同浓度的标准四环素水溶液2h后荧光终点值所做的柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。但本发明并不限于以下实施例。本发明采用的原料可在市场购得，或可用本领域已知的方法合成。
实施例1
一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，所述荧光生物传感器的组成包括：四环素特异性适配体aptamer76、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；
所述四环素特异性适配体aptamer76的碱基序列为：
5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’；
所述的trigger链的碱基序列为：5’-CACGTGGAGCTCGAATTCCGTACG-3’；
所述sgRNA的碱基序列为：
5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC CGU ACG GAA UUC GCU AGU CCG AGC UCC ACG UG-3'；
所述FQ链的碱基序列为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
实施例2 aptamer76与trigger的最佳结合比例探究
Step1：将aptamer76（10 μM）和trigger（10 μM）按不同浓度比例（见表1）混合后,加入8 μL 10×buffer A（NaCl 1 M ,Tris 0.5 M , MgCl2·6H2O 20 mM , CaCl2 10 mM ,KCl 5 mM）混合，UP水（18.25 ΩΜ）补足至80 μL。90℃、10min然后将其放在100 mL装满沸水的烧杯中缓慢冷却30 min使得aptamer76与trigger能够充分杂交，形成aptamer76-trigger二元复合物探针。
Step2：将5μg/mL的标准四环素水溶液与aptamer76-trigger二元复合物探针按1:1的比例添加，37℃反应30 min；
Step3：Cas14a蛋白（0.4 μM）、sgRNA(0.1 μM)、FQ（0.8 μM）、buffer B、5 μL Step2中的被检反应液、DEPC水补足至25 μL 37℃反应2 h。
Step4：用实时荧光定量PCR仪观测2h内的实时荧光变化情况，使用蓝光切胶仪拍照观察，用Image J处理以至于获得一个更加清晰直观的实验结果。
图2为四环素样本(阳性样本）测定结果图； 左图为：通过实时荧光PCR仪测定的四环素样本(阳性样本）的曲线图，右图为此样本在蓝光切胶仪下拍摄的图片。图3为UP水为样本(阴性样本）的测定结果图；左图为：通过实时荧光PCR仪测定的以UP水为样本(阴性样本）的曲线图，右图为此样本在蓝光切胶仪下拍摄的图片。图4通过15%核酸PAGE电泳验证了aptamer76与trigger的最佳结合比例，在aptamer76：trigger=1.5:1时trigger完全被封闭住。
Figure 770345DEST_PATH_IMAGE001
实施例3检测灵敏性试验
Step1：将aptamer76（6 μL，10 μM）、trigger（4 μL，10 μM）混合（ 即aptamer76与trigger浓度比为1.5:1）, 加入8 μL 10×buffer A（NaCl 1 M ,Tris 0.5 M , MgCl2·6H2O 20 mM , CaCl2 10 mM , KCl 5 mM），UP水（18.25 ΩΜ）补足至80 μL。90℃、10min然后将其放在100 mL装满沸水的烧杯中缓慢冷却30 min使得aptamer76与trigger能够充分杂交，形成aptamer76-trigger二元复合物探针。
Step2：将不同浓度的标准四环素水溶液（表2）与aptamer76-trigger二元复合物探针按1:1的比例添加，37℃反应30 min；
Step3：Cas14a蛋白（0.4 μM）、sgRNA(0.1 μM)、FQ（0.8 μM）、buffer B、5 μL Step2中的被检反应液、DEPC水补足至25 μL 37℃反应2 h。
Step4：用实时荧光定量PCR仪观测2h内的实时荧光变化情况，使用蓝光切胶仪拍照观察，用Image J处理以至于获得一个更加清晰直观的实验结果。
图5为step4蓝光切胶仪下拍摄的灰度图，第十一个样品为对照组样品，通过蓝光切胶仪拍摄后用Image J处理可以清晰的看到从50μg/mL到50fg/mL的样品都能被检测出来。
图6为step3在实时荧光PCR仪上设置参数37℃反应2 h，每分钟拍摄一次荧光，2h后的荧光终点值所做的柱状图，通过此图我们可以知道此生物传感器检测范围在50 μg/mL-50 fg /mL之间，且在5 μg/mL-50 fg /mL表现出高度的灵敏性。
Figure 618084DEST_PATH_IMAGE002
实施例4一种基于CRISPR-Cas系统的检测四环素的传感器
其制备方法，包括以下步骤：
Step1：将aptamer76（6 μL，10 μM）、trigger（4 μL，10 μM）, 10×buffer A（8 μL，NaCl 1 M ,Tris 0.5 M , MgCl2·6H2O 20 mM , CaCl2 10 mM , KCl 5 mM）UP水（18.25ΩΜ）补足至80 μL。90℃、10min然后将其放在100 mL装满沸水的烧杯中缓慢冷却30 min使得aptamer76与trigger能够充分杂交，形成aptamer76-trigger二元复合物探针。
Step2：将标准四环素水溶液与aptamer76-trigger二元复合物探针按1:1的比例添加，37℃反应30 min；
Step3：Cas14a蛋白（0.4 μM）、sgRNA(0.1 μM)、FQ（0.8 μM）、buffer B、5 μL Step2中的被检反应液、DEPC水补足至25 μL 37℃反应2 h。
Step4：用实时荧光定量PCR仪观测2h内的实时荧光变化情况，使用蓝光切胶仪拍照观察，用Image J处理以至于获得一个更加清晰直观的实验结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学、长乐聚泉食品有限公司
<120> 一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> aptamer76 链
<400> 1
cgtacggaat tcgctagccc cccggcaggc cacggcttgg gttggtccca ctgcgcgtgg 60
atccgagctc cacgtg 76
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> trigger链
<400> 2
cacgtggagc tcgaattccg tacg 24
<210> 3
<211> 192
<212> RNA
<213> sgRNA
<400> 3
uucacugaua aaguggagaa ccgcuucacc aaaagcuguc ccuuagggga uuagaacuug 60
agugaaggug ggcugcuugc aucagccuaa ugucgagaag ugcuuucuuc ggaaaguaac 120
ccucgaaaca aauucauuug aaagaaugaa ggaaugcaac cguacggaau ucgcuagucc 180
gagcuccacg ug 192
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> FQ链
<400> 4
tttttttttt tt 12

Claims (4)

1.一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器的组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；
所述的aptamer76链的碱基序列为：
5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’；
所述的trigger链的碱基序列为：5’-CACGTGGAGCTCGAATTCCGTACG-3’；
所述sgRNA的碱基序列为：
5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC CGU ACG GAA UUC GCU AGU CCG AGC UCC ACG UG-3'；
所述FQ链的碱基序列为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
2.权利要求1所述基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）二元复合物探针的构建：所述二元复合物探针由aptamer76链与trigger链杂交而成；
（2）四环素与二元复合物探针反应：将步骤（1）所构建的二元复合物探针与四环素均匀混匀孵育；
（3）均相反应：将Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链、四环素与二元复合物探针的混合液加入到均相中，混合均匀后孵育；
（4）荧光仪检测化学发光强度。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中aptamer76链与trigger链的浓度比为1.5:1。
4.权利要求1所述基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器在四环素检测中的应用。
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