CN110860320A - 一种同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，包括多个反应池和一个分析物入口，所述分析物入口通过多个微通道分别单独连接到每个反应池；其中一个反应池中预加载单链DNA染料与空白缓冲溶液，其余反应池中均预加载单链DNA染料与抗生素核酸适配体。本发明的微流控芯片实现了检测平台的小型化，方便易用；本发明能够在10分钟内同时检测多种抗生素，且具有较低的检测限，快速灵敏，适用于饮用水中多种抗生素残留的同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素的检测领域，特别涉及一种同时检测饮用水中多种抗生素同时检测的微流控芯片及其应用。
背景技术
抗生素对病原微生物具有抑制或杀灭作用，是防治感染性疾病的重要药物。近年来,抗生素滥用造成的水体污染已经在欧美一些国家和我国均引起了关注，但目前的研究主要集中在水产养殖业、畜牧业造成的地表水、地下水和生活污水、医院废水、河流、水库的抗生素污染，对生活饮用水的抗生素残留检测方法则报道较少。我国是抗生素的生产和使用大国，抗生素滥用现象非常严重，而国内的自来水厂又缺乏相应的抗生素过滤装置，国家目前也未出台相关标准控制生活饮用水中抗生素的残留。因此,由抗生素残留引起的水环境污染事故时有发生。因此，开展饮用水中抗生素检测方法研究，可以了解辖区内各种水体中抗生素污染的种类和含量，为相关部门消除水体中抗生素污染提供依据，对保障辖区居民的生命健康，维护社会稳定和促进经济发展具有重要意义。
进入饮用水中的抗生素不仅种类繁多，且多以ng/L级的低浓度存在，目前，适用于生活用水中低含量抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法及液相色谱-串联质谱法等。这些方法虽然有效，但受制于使用条件高，成本高，无法用于水体中抗生素的快速筛查。生物传感器近年来因灵敏、快速、易于操作和微型化等优点在生物分析中受到广泛关注，是环境检测领域的热门技术。生物传感器常见的分子识别元件的生物材料有酶、微生物个体、细胞器、动植物组织、抗原和抗体等。这些生物材料虽然特异性强，但易受环境因子的影响，限制了生物传感检测技术的发展。核酸适配体由指数富集的配体系统进化技术筛选得到的能够与相应靶分子特异性紧密结合的一小段DNA或RNA分子，具有特异性强、筛选周期短、易合成、重复性和稳定性强等优点，是可代替酶、微生物、抗原和抗体等识别分子的新型绿色生物材料，为环境污染物生物传感检测提供了新的思路。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种多种抗生素同时检测的微流控芯片,可实现饮用水中多种抗生素残留的低成本灵敏快速检测，在 10min内同时检测出多种抗生素。
具体技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种多种抗生素同时检测的微流控芯片。
一种同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，包括多个反应池和一个分析物入口，所述分析物入口通过多个微通道分别连接到每个反应池；其中一个反应池中预加载单链DNA染料与空白缓冲溶液，其余反应池中均预加载单链DNA染料与抗生素核酸适配体。
优选的，所述反应池为六个；
所述的抗生素核酸适配体为五种，分别为：
卡那霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为 5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；
托普霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为 5’-GGGACTTGGTTTAGGTAATGAGTCCC-3’；
氯霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为5’-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’；
四环素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为 5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGA TCCGAGCTCCA CGTG-3’；
氨苄西林核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为 5’-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’；
五种抗生素核酸适配体分别预加载到五个不同的反应池中。
优选的，所述的单链DNA染料为QuantiFluor ssDNA系统。
单链DNA染料QuantiFluor ssDNA系统是Promega公司推出的,可灵敏地定量单链DNA。无抗生素存在时，单链DNA染料首先与抗生素的核酸适配体结合，产生较强的荧光信号，抗生素存在时，单链DNA染料被抗生素置换而形成更加稳定的核酸适配体-抗生素复合物，荧光降低。
优选的，所述的单链DNA染料与所述的抗生素核酸适配体的摩尔数之比为20:1。
优选的，所述的微流控芯片中使用的缓冲液为1×PBS(pH 7.0-7.4)。
优选的，所述微流控芯片为聚二甲基硅氧烷(PDMS)通过光刻工艺制成。
优选的，所述的分析物入口位于所述微流控芯片的中央；所述的反应池均布于所述分析物入口的四周。
优选的，所述的微流控芯片的反应平台为正方形，芯片尺寸为23×23×2 mm3；所述的反应池的内径为2mm，最大体积6μL；所述的微通道的尺寸为长5mm，宽0.2mm，高15μm；所述的分析物入口的内径为3mm，最大体积为15μL。
本发明中微流控芯片的制备方法如下：
微流控芯片由PDMS通过标准的光刻工艺制成。每个芯片包含六个反应池和一个分析物入口。分析物入口位于芯片中心并通过六个微通道连接到各个反应池。
制备的时候，首先开孔制作六个反应池，并通过光刻工艺将六个微通道制作完成；分析物入口先不制作。
反应混合物预加载到芯片。具体为：单链DNA染料与空白缓冲溶液混合；单链DNA染料分别与五种抗生素核酸适配体中的一种混合，形成染料-核酸适配体复合物。单链DNA染料与空白缓冲溶液的混合液作为对照组加到一个反应池中，形成控制池；五种染料-核酸适配体复合物组作为测试组分别加到其余五个单独的反应池中。
将上述芯片置于真空中以抽干六个反应池中的溶液后，置于暗处和氮气气氛中保存。
样品测试前，使用开孔器制作芯片中央的分析物入口，使其开通，分析物入口开通后与所有的微流体通道连通。
本发明的另一个目的是提供上述微流控芯片饮用水抗生素检测中的应用。
优选的，应用于饮用水中卡那霉素、托普霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林的检测。
本发明中微流控芯片的使用方法如下：
分析物入口开通后，将分析物溶液加入分析物入口处，通过各个微通道迅速扩散进入每个反应池；若无抗生素存在，单链DNA染料与核酸适配体结合产生较强的荧光，若存在抗生素，特定的抗生素与相应的核酸适配体结合，此检测区的单链DNA染料被置换出来，荧光强度降低。5分钟后置于荧光显微镜下成像。
该方法快速，简单，灵敏度高，能够在10分钟内完成检测。
本发明的有益效果如下：
本发明的微流控芯片实现了检测平台的小型化，方便易用；本发明能够在10分钟内同时检测多种抗生素，且具有较低的检测限，快速灵敏，适用于饮用水中多种抗生素残留的同时检测。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片的俯视图；
图2为本发明实验原理图；
图1中:1、反应池；2、分析物入口；3、微通道。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中用到的其他试剂均为分析纯，直接使用。所有溶液均用超纯水 (电导率为18.2MΩ·cm)配制。
单链DNA染料为QuantiFluor ssDNA系统,购于Promega公司。作为本发明实施例中试验用材料卡那霉素、托普霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林的核酸适配体序列如下，由上海生工生物工程股份有限公司合成并经HPLC 纯化。
实施例1
一种同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，如图1所示，尺寸为23×23×2mm3，由聚二甲基硅氧烷(PDMS)通过标准的光刻工艺制成。每个芯片包含六个反应池和一个分析物入口。分析物入口位于芯片中心并通过六个微通道连接到各个反应池。反应池的内径为2mm，最大体积为6μL；微通道的尺寸为长5mm，宽0.2mm，高15μm；分析物入口的内径为3mm，最大体积为15μL。
其中一个反应池中预加载单链DNA染料与空白缓冲溶液，作为控制池；其余反应池中均预加载单链DNA染料与抗生素核酸适配体。所述的抗生素核酸适配体为5种，分别为：
卡那霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
托普霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
氯霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
四环素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
氨苄西林核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
5种抗生素核酸适配体分别预加载到5个不同的反应池中。
上述微流控芯片的制备方法如下：
制备的时候，首先开孔制作六个反应池，并通过光刻工艺将六个微通道制作完成；分析物入口先不制作。
反应混合物预加载到芯片。具体为：将ssDNA染色染料与空白缓冲溶液混合；将ssDNA染色染料分别与上述五种抗生素核酸适配体中的一种按照摩尔数之比为20:1(naptamer/ndye＝1:20)，形成染料-核酸适配体复合物。ssDNA 染色染料与空白缓冲溶液的混合液作为对照组加到一个反应池中，作为控制池；五种染料-核酸适配体复合物组作为测试组分别加到其余五个单独的反应池中。
将上述芯片置于真空中以抽干六个反应池中的溶液后，置于暗处和氮气气氛中保存。
样品测试前，使用开孔器制作芯片中央的分析物入口，使其开通，分析物入口开通后与所有的微流体通道连通。
实施例2
使用实施例1中制备的微流控芯片进行不同浓度的卡那霉素检测。
使用开孔器打开芯片中央的分析物入口，将20μL的不同浓度(5nM,50 nM,100nM,500nM和5μM)的卡那霉素溶液(1×PBS)分别加入各个芯片的分析物入口处，5分钟后置于荧光显微镜下成像。
结果表明，仅仅包含卡那霉素特异性核酸适配体的反应池其绿色荧光强度发生了降低(荧光降低原理见图2)，并且浓度越大，荧光降低程度越大。其余四个反应池和控制池的绿色荧光强度几乎没有发生可察觉的荧光强度改变。说明该方法可用于定量检测。
实施例3
使用实施例1中制备的微流控芯片进行单一浓度的卡那霉素检测。
使用开孔器打开芯片中央的分析物入口，将20μL的100nM的卡那霉素溶液(1×PBS)加入分析物入口处，5分钟后置于荧光显微镜下成像。
结果表明：仅仅包含卡那霉素特异性核酸适配体的反应池其绿色荧光强度发生了降低，其余四个反应池和控制池的绿色荧光强度几乎没有发生可察觉的荧光强度改变。说明该方法选择性好。
实施例4
使用实施例1中制备的微流控芯片进行真实的自来水样品中抗生素的多元检测。
自来水取自烟台当地实验室，与缓冲溶液(1×PBS)按体积比1：10混合后，加入标准卡那霉素、托普霉素、氯霉素、四环素和氨苄西林溶液,使每种抗生素的浓度达到100nM。
使用开孔器打开芯片中央的分析物入口，将20μL的上述试样加入分析物入口处，5分钟后置于荧光显微镜下成像。
结果表明，加载相应的染料-抗生素核酸适配体的反应池内的荧光发生显著降低。而控制池的绿色荧光强度无显著变化。说明该微流控传感芯片能够应用于自来水中抗生素的多元检测。
实施例5
使用实施例1中制备的微流控芯片进行真实的饮用矿泉水样品中抗生素的多元检测。
饮用矿泉水购自烟台当地超市，与缓冲溶液(1×PBS)按体积比1：10 混合后，加入标准卡那霉素、托普霉素、氯霉素、四环素和氨苄西林溶液, 使每种抗生素的浓度达到50nM。
使用开孔器打开芯片中央的分析物入口，将20μL的上述试样加入分析物入口处，5分钟后置于荧光显微镜下成像。
结果表明，加载相应的染料-抗生素核酸适配体的反应池内的荧光发生显著降低。而控制池的绿色荧光强度无显著变化。说明该微流控传感芯片能够应用于饮用矿泉水中抗生素的多元检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一种同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片及其应用
<141> 2019-11-12
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgggggttga ggctaagccg a 21
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gggacttggt ttaggtaatg agtccc 26
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag 40
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgtacggaat tcgctagccc cccggcaggc cacggcttgg gttggtccca ctgcgcgtgg 60
atccgagctc cacgtg 76
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcgggcggtt gtatagcgg 19
Claims (10)
1.一种同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，包括多个反应池和一个分析物入口，所述分析物入口通过多个微通道分别连接到每个反应池；其中一个反应池中预加载单链DNA染料与空白缓冲溶液，其余反应池中均预加载单链DNA染料与抗生素核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述反应池为六个；
所述的抗生素核酸适配体为五种，分别为：
卡那霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
托普霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
氯霉素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
四环素核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
氨苄西林核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
五种抗生素核酸适配体分别预加载到五个不同的反应池中。
3.根据权利要求2所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述的单链DNA染料为QuantiFluor ssDNA系统。
4.根据权利要求2所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述的单链DNA染料与所述的抗生素核酸适配体的摩尔数之比为20:1。
5.根据权利要求2所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述的微流控芯片中使用的缓冲液为1×PBS。
6.根据权利要求1所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片为聚二甲基硅氧烷通过光刻工艺制成。
7.根据权利要求1所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述的分析物入口位于所述微流控芯片的中央；所述的反应池均布于所述分析物入口的四周。
8.根据权利要求7所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片，其特征在于，所述的微流控芯片的尺寸为23×23×2mm3；所述的反应池的内径为2mm，最大体积6μL；所述的微通道的尺寸为长5mm，宽0.2mm，高15μm；所述的分析物入口的内径为3mm，最大体积为15μL。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的同时检测饮用水中多种抗生素残留的微流控芯片在饮用水抗生素检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，应用于饮用水中卡那霉素、托普霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林的检测。
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