CN106940305A - 基于微流控芯片的抗生素检测装置和检测方法 - Google Patents

基于微流控芯片的抗生素检测装置和检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种基于微流控芯片的抗生素检测装置和检测方法，该装置包括基材，该基材上形成有一分离通道、一缓冲液孔、2个样品储备孔和一检测孔，分离通道的一端分别通过微通道与所述缓冲液孔和2个样品储备孔连通，分离通道的另一端与所述检测孔连通，检测孔通过微通道连通于一废液孔，基材上靠近所述检测孔位置开设有微槽，微槽内设置有激发光源和荧光检测器，所述2个样品储备孔之间形成有进样电场，所述缓冲液孔和检测孔之间形成有分离电场，其中所述缓冲液孔一端为高压端，所述检测孔一端为低压端。本发明检测装置可克服传统抗生素检测仪器复杂、样品需求量大、应用领域窄、测试成本高等缺点，能够在线定性与定量检测抗生素。

Description

基于微流控芯片的抗生素检测装置和检测方法
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片分离检测技术，特别是涉及一种基于微流控芯片的抗生素检测装置和检测方法。
背景技术
自1941年青霉素的首次应用以来，已经有数千种抗生素被研制出来。中国是抗生素生产大国，也是使用大国，但长期以来全国范围内抗生素医院使用率远高于欧美发达国家。在动物饲养过程中抗生素具有杀菌活性强，毒副作用小等特点，在饲养过程中应用非常普遍。由于抗生素的残留会引发抗药性、过敏、人体菌落失衡等严重的安全问题，国际组织与各国食品安全管理部门均制订了相应食品中抗生素的最高限量指标。
近年来随着现代理化分析技术的发展，可以通过抗生素中的官能团发生的特殊反应或具有的一些理化性质，可以利用大型分析仪器进行检测，目前应用较为广泛的分析方法有：气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HLPC)、高效液相色谱-质谱联用(HLPC-MS)、高效毛细管电泳(HPCE)、微生物法、免疫分析测定、荧光检测器法等。借助分析仪器检测抗生素时需要复杂的样品前处理、衍生等过程，操作费时；微生物法适用于大量样品的筛选，适用于总量统计，不具有特异性；免疫分析法需要用到昂贵的抗体，可以筛选检测效率，但存在假阳性问题。荧光检测器法多采用激光诱导荧光检测器(LIF)，灵敏度可达到10-9mol/L～10-12mol/L，目前多采用直接荧光标记法，但在检测分析前需要衍生化，无法满足精确快速地完成检测。
微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有微型化、自动化、集成化、便捷和快速等优点，已在细胞生物学、分析化学、材料学、组织工程和微电子等众多领域得到了广泛的应用。然而，基于微流控芯片对抗生素残留的快速和在线检测系统，通过光信号的变化来获取待测抗生素的种类和浓度信息，目前在应用领域尚未有实质性的突破。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的抗生素检测装置和检测方法，可以快速定性定量检测多种抗生素。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本申请实施例公开了一种基于微流控芯片的抗生素检测装置，包括基材，该基材上形成有一分离通道、一缓冲液孔、2个样品储备孔和一检测孔，所述分离通道的一端分别通过微通道与所述缓冲液孔和2个样品储备孔连通，所述分离通道的另一端与所述检测孔连通，所述检测孔通过微通道连通于一废液孔，所述基材上靠近所述检测孔位置开设有微槽，所述微槽内设置有激发光源和荧光检测器，所述2个样品储备孔之间形成有进样电场，所述缓冲液孔和检测孔之间形成有分离电场，其中所述缓冲液孔一端为高压端，所述检测孔一端为低压端。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置中，所述基材包括上下键合的上芯片和下芯片，所述分离通道和微通道形成于所述上芯片和下芯片之间，所述缓冲液孔、样品储备孔、检测孔和废液孔上下贯穿所述上芯片，所述微槽包括上下贯穿所述上芯片的通孔、以及凹设于所述下芯片表面的凹槽，所述激发光源设置于所述凹槽内，所述荧光检测装置放置于所述通孔内。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置中，所述缓冲液孔、检测孔和废液孔均位于所述分离通道的延伸方向上，所述2个样品储备孔对称位于所述分离通道的两侧。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置中，所述缓冲液孔、样品储备孔和检测孔分别通过白金电极引出与外部电源连接。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置中，所述基材的材质选自玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置中，所述分离通道的截面尺寸大于所述微通道的截面尺寸。
相应的，本申请还公开了一种基于微流控芯片的抗生素检测方法，包括：
(1)、冲洗分离通道和微通道；
(2)、在缓冲液孔加入缓冲液，待分离通道和微通道内全部运行缓冲液后，在样品储备孔、检测孔分别加入对应浓度的待检测样品、荧光染料，电源通过插在缓冲液孔、样品储备孔、检测孔内的电极与运行的缓冲液相连；
(3)、打开荧光检测器，对检测孔内荧光染料的荧光强度进行检测，记录检测所用的时间和检测过程中荧光强度的变化，由此可利用不同抗生素对应不同的荧光强度的变化进行定性检测，利用荧光强度与待测抗生素浓度的关系进行定量分析。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法中，
所述步骤(1)中，分别用去离子水、硫酸水溶液、氢氧化钠水溶液、pH为10的硼酸缓冲液各分离通道和微通道5分钟；
所述步骤(2)中，在电压可调的高压电源作用下，使分离通道的电场强度在100V/cm～400V/cm的可调范围内，调节样品储备孔两端电压为对应的高压端与接地端，电场强度为150V/cm，经过30s上样后，将样品储备孔两端电压调节为100V/cm，并调节缓冲液孔与检测孔为对应的高压端与接地端，电场强度为300V/cm。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法中，所述荧光染料为：2，7-二溴羟汞基荧光黄钠盐，荧光染料的浓度在1×10-5mol/L～1×10-2mol/L之间，所述激发光源的最大激发光为470nm与最大发射光为540nm。
优选的，在上述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法中，所述缓冲液的pH为10。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明微流控芯片的抗生素检测方法中，多种抗生素在电场驱动下由进样区向检测区迁移，不同抗生素的水合离子各自经过不同的迁移时间，到达检测区域后会对该区域内的荧光染料产生荧光熄灭作用，荧光检测器可以检测到荧光信号的减弱，整个分离检测过程可在180s内完成。这种微流控芯片抗生素检测方法可克服传统抗生素检测仪器复杂、样品需求量大、应用领域窄、测试成本高等缺点，能够在线定性与定量检测抗生素。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为本发明具体实施例中基于微流控芯片的抗生素检测装置的结构示意图；
图2所示为本发明具体实施例1中对氨苄西林的检测时荧光强度随时间的变化；
图3所示为本发明具体实施例2中同时对青霉素G、氨苄西林检测时荧光强度随时间的变化。
具体实施方式
结合图1所示，基于微流控芯片的抗生素检测装置，包括基材，该基材上形成有一分离通道101、一缓冲液孔102、2个样品储备孔103和一检测孔104，分离通道101的一端分别通过微通道105与缓冲液孔和2个样品储备孔连通，分离通道101的另一端与检测孔104连通，检测孔104通过微通道连通于一废液孔106，基材上靠近检测孔位置开设有微槽，微槽内设置有激发光源和荧光检测器，2个样品储备孔之间形成有进样电场，缓冲液孔和检测孔之间形成有分离电场，其中缓冲液孔一端为高压端，检测孔一端为低压端。
通过计算机辅助设计软件(CAD)设计和绘制微流控芯片的通道和图形，通过微加工技术在微流控芯片的基材表面制备CAD设计的微通道图形。
基材包括上下键合的上芯片1和下芯片2，分离通道101和微通道105形成于上芯片1和下芯片2之间，缓冲液孔102、样品储备孔103、检测孔104和废液孔106上下贯穿上芯片，微槽包括上下贯穿上芯片的通孔107、以及凹设于下芯片表面的凹槽201，激发光源设置于凹槽内，荧光检测装置放置于通孔内。
上芯片1上的缓冲液孔102、样品储备孔103、检测孔104和废液孔106分别与下芯片2上的区域202、203、204和206对应，区域202、203、204和206分别构成缓冲液孔102、样品储备孔103、检测孔104和废液孔106的底部。
缓冲液孔102、检测孔104和废液孔106均位于分离通道101的延伸方向上，2个样品储备孔103对称位于分离通道101的两侧。
缓冲液孔102、样品储备孔103和检测孔104分别通过白金电极108引出与外部电源连接。
基材的材质选自玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷。
分离通道的截面尺寸优选大于微通道的截面尺寸。
在上述技术方案中，在外加电场的作用下，缓冲液中的多种抗生素可使用微流控芯片进行分离，并利用多种抗生素对荧光试剂的荧光熄灭作用定量分析，外加电场优选为直流高压电场，利用不同的抗生素在外加电场作用下的迁移速率微通道表面吸附程度的不同可以在短时间内进行分离。通过微流控芯片的分离作用及荧光熄灭法可检测的抗生素包括：氨苄西林、青霉素V、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢氨苄、羧苄青霉素之一或多种。
微流控芯片的抗生素检测方法通过监测荧光强度随时间的变化来完成：首先分别用去离子水、低浓度的硫酸水溶液、低浓度的氢氧化钠水溶液、pH为10的硼酸缓冲液各冲洗微流控芯片微通道5分钟，在微流控芯片各个缓冲液池加入缓冲液、待微流控芯片微通道内全部运行缓冲液后，在样品池、检测池分别加入对应浓度的待检测样品、荧光染料，高压电源通过插在缓冲液池、样品池、检测池内的白金电极与芯片内运行的缓冲液相连，在电压可调的高压电源作用下，使微流控芯片微通道内的电场强度(E)在100V/cm～400V/cm的可调范围内。调节样品池两端电压为对应的高压端与接地端，电场强度为150V/cm，经过30s上样后，将样品池两端电压调节为100V/cm，并调节缓冲液池与检测池为对应的高压端与接地端，电场强度为300V/cm。在上样的同时打开荧光检测器，对检测池内荧光染料的荧光强度进行检测，记录检测所用的时间和检测过程中荧光强度的变化，由此可利用不同抗生素对应不同的荧光强度的变化进行定性检测，利用荧光强度与待测抗生素浓度的关系进行定量分析。
在上述检测方法中，使用荧光熄灭法时可用的荧光染料为：2，7-二溴羟汞基荧光黄钠盐。荧光染料的浓度应在1×10-5mol/L～1×10-2mol/L之间，当需要使用不同的荧光染料时，需要选择与荧光染料最大激发光与最大发射光一致的光源与检测器，荧光检测时2，7-二溴羟汞基荧光黄钠盐最大激发光为470nm与最大发射光为540nm。
在上述检测方法中，缓冲液优选为硼酸缓冲液，缓冲液的pH为10。
本实施例的检测装置和检测方法，多种抗生素的分离检测可在180S内完成。这种微流控芯片抗生素检测方法可克服传统抗生素检测仪器复杂、样品需求量大、应用领域窄、测试成本高等缺点，能够在线定性与定量检测抗生素。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
在PMMA芯片微通道内用去离子水、低浓度的硫酸水溶液、低浓度的氢氧化钠水溶液、pH为10的硼酸缓冲液冲洗微流控芯片微通道各5分钟，以含有300μg/L的氨苄西林为待测物，pH为10的硼酸盐缓冲液作为电泳运行缓冲液，浓度为1×10-5mol/L的2，7-二溴羟汞基荧光黄钠盐作为荧光染料，在样品池两端施加150V/cm的电场，在30s完成上样，将样品池两端电压调节为100V/cm，并在缓冲液池两端施加300V/cm的电场，然后测定检测池荧光强度随时间的变化，发现检测池出的荧光强度在123s时有明显减弱，参图2所示。
实施例2
重复实例1，以含有50μg/L的青霉素G、氨苄西林的混合液作为待测物，所得到的检测池荧光强度随时间的变化关系，发现检测池处的荧光强度在104s、119s时有明显减弱，分别对应为青霉素G、氨苄西林与2，7-二溴羟汞基荧光黄钠盐作用而使荧光强度减弱，参图3。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…...”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于微流控芯片的抗生素检测装置，其特征在于，包括基材，该基材上形成有一分离通道、一缓冲液孔、2个样品储备孔和一检测孔，所述分离通道的一端分别通过微通道与所述缓冲液孔和2个样品储备孔连通，所述分离通道的另一端与所述检测孔连通，所述检测孔通过微通道连通于一废液孔，所述基材上靠近所述检测孔位置开设有微槽，所述微槽内设置有激发光源和荧光检测器，所述2个样品储备孔之间形成有进样电场，所述缓冲液孔和检测孔之间形成有分离电场，其中所述缓冲液孔一端为高压端，所述检测孔一端为低压端。
2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置，其特征在于：所述基材包括上下键合的上芯片和下芯片，所述分离通道和微通道形成于所述上芯片和下芯片之间，所述缓冲液孔、样品储备孔、检测孔和废液孔上下贯穿所述上芯片，所述微槽包括上下贯穿所述上芯片的通孔、以及凹设于所述下芯片表面的凹槽，所述激发光源设置于所述凹槽内，所述荧光检测装置放置于所述通孔内。
3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置，其特征在于：所述缓冲液孔、检测孔和废液孔均位于所述分离通道的延伸方向上，所述2个样品储备孔对称位于所述分离通道的两侧。
4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置，其特征在于：所述缓冲液孔、样品储备孔和检测孔分别通过白金电极引出与外部电源连接。
5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置，其特征在于：所述基材的材质选自玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷。
6.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置，其特征在于：所述分离通道的截面尺寸大于所述微通道的截面尺寸。
7.权利要求1至6任一所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法，其特征在于，包括：
(1)、冲洗分离通道和微通道；
(2)、在缓冲液孔加入缓冲液，待分离通道和微通道内全部运行缓冲液后，在样品储备孔、检测孔分别加入对应浓度的待检测样品、荧光染料，电源通过插在缓冲液孔、样品储备孔、检测孔内的电极与运行的缓冲液相连；
(3)、打开荧光检测器，对检测孔内荧光染料的荧光强度进行检测，记录检测所用的时间和检测过程中荧光强度的变化，由此可利用不同抗生素对应不同的荧光强度的变化进行定性检测，利用荧光强度与待测抗生素浓度的关系进行定量分析。
8.根据权利要求7所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，分别用去离子水、硫酸水溶液、氢氧化钠水溶液、pH为10的硼酸缓冲液各分离通道和微通道5分钟；
所述步骤(2)中，在电压可调的高压电源作用下，使分离通道的电场强度在100V/cm～400V/cm的可调范围内，调节样品储备孔两端电压为对应的高压端与接地端，电场强度为150V/cm，经过30s上样后，将样品储备孔两端电压调节为100V/cm，并调节缓冲液孔与检测孔为对应的高压端与接地端，电场强度为300V/cm。
9.根据权利要求7所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法，其特征在于：所述荧光染料为：2，7-二溴羟汞基荧光黄钠盐，荧光染料的浓度在1×10-5mol/L～1×10-2mol/L之间，所述激发光源的最大激发光为470nm与最大发射光为540nm。
10.根据权利要求7所述的基于微流控芯片的抗生素检测装置的检测方法，其特征在于：所述缓冲液的pH为10。
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