CN101216427A

CN101216427A - 小而密低密度脂蛋白的微流控电泳分析方法

Info

Publication number: CN101216427A
Application number: CNA2008100325328A
Authority: CN
Inventors: 金庆辉; 汪骅; 王惠民; 廖锡昌; 赵建龙
Original assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Priority date: 2008-01-10
Filing date: 2008-01-10
Publication date: 2008-07-09

Abstract

本发明涉及了一种冠心病危险因子——小而密低密度脂蛋白sdLDL微流控芯片电泳分离的方法。其特征在于利用微流控分析结合激光诱导荧光检测技术，选择十二烷基硫酸钠作为阴离子表面活性剂同时修饰脂蛋白和芯片微通道表面，电泳进样和分离过程施加夹流电压，进行血清脂蛋白分离分析，lLDL、sdLDL和HDL在三分钟内得到高效分离。健康人血清样本中分离到lLDL和HDL两特征峰。冠心病患者血清中分离到lLDL、sdLDL和HDL三个峰。sdLDL三次重复性实验其出峰时间和峰面相对标准差分别为2.18％、2.94％。本发明为冠心病提供了一种简单、快速、高效的诊断方法。

Description

小而密低密度脂蛋白的微流控电泳分析方法

技术领域

本发明涉及一种冠心病危险因子——小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，所述的分析方法是基于微流控分析技术和激光诱导荧光检测技术的结合，分析血清脂蛋白亚型，可用于临床冠心病、动脉粥样硬化等疾病的预测、判断和疗效观察，属生化分析领域。

背景技术

脂蛋白是纳米大小的颗粒，根据超速离心法可将其主要分为三类：高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low denselipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein，VLDL)。临床、遗传学、流行病学的研究证实，血清中低密度脂蛋白与动脉粥样硬化性心脑血管疾病密切相关。血清低密度脂蛋白具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成，不同的LDL颗粒具有不同的大小、浮力、密度、化学组成、理化特性等。小而密的低密度脂蛋白(Small & Density LowDensity Lipoprotein，sdLDL)是“LDL亚组份”中密度高而颗粒小的一种亚型，近年来对sdLDL与冠心病的关系进行了深入的研究。大量的流行病学和病理学表明，sdLDL与冠心病直接相关，作为预测冠心病的指标，它比LDL-C更佳。sdLDL升高者，CHD及心肌梗塞(MI)的危险性分别是对照组的4.5及6.9倍。2002年全美胆固醇教育计划(NCEP，National Cholesterol EducationProgram Adult Treatment Panel III)认为sdLDL在动脉粥样硬化的发生中起重要作用，是冠心病的强危险因子，并推荐对这种脂蛋白进行检测。

目前国内外报道已从多个侧面对脂蛋白进行分析，但亟需解决的问题是LDL亚组分缺乏简易的分析方法，超速离心机较贵重，梯度电泳较繁琐，影响了该项目的普及。质子核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)光谱法分析脂蛋白亚型尚处于研究阶段，毛细管电泳是继高效液相色谱之后分析科学的一大进展，使单细胞，甚至单分子分析成为可能。有关研究使用CZE、CITP分离sdLDL，并结合临床进行了初步探讨，显示了此技术分析sdLDL的强大优势。但该方法分离LDL亚型需要不同的缓冲体系、不同的分离模式才能实现，至今还没有在临床上得到应用。

本发明拟将微流控分析与激光诱导荧光检测技术结合起来，建立一种快速、高效分离分析sdLDL的方法，也即提供一种冠心病危险因子的快速检测方法，用于临床上对冠心病的预测、判断及疗效观察。

发明内容

本发明目的在于提供一种小而密低密度脂蛋白的微流控电泳方法，所述的方法是基于微流控分析方法和激光诱导荧光检测方法的结合，针对血清脂蛋白进行快速分离和分析，从而建立起的一种快速、高效分析冠心病危险因子sdLDL的方法，用于临床上对冠心病、动脉粥样硬化等疾病的预测、判断及疗效观察。

具体的说本发明是通过血清标本标记、微流控芯片电泳、荧光检测以及结果分析等过程实现的。具体技术方案阐述如下：

1)电泳缓冲体系的选择：

缓冲液(Background electrolyte)pH 9.0，是由40mmol/l Tricine、40mmol/l甲基葡胺、0.03mmol/l十二烷基硫酸钠，其余为去离子水组成。

2)血清标本的准备和标记

受试者素食三天后，清晨空腹采血3ml，以3000r/min速率离心10min分离血清，所取血清标本4小时之内完成分离检测，或-70℃保存。血清样本(2μl)溶于8μl去离子水，然后用2μl 0.1g/l硝基苯并噁二唑-6-酰基鞘醇(NBDC₆-ceramide)(乙二醇∶甲醇为9∶1的混合液预先溶解)进行避光预染，1分钟后加入50μl缓冲液，作为电泳待测标本。

3)微流控芯片电泳

微流控芯片结构如图1所示。所述的芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，整个芯片大小为63.5mm×31.75mm，芯片微管道宽100μm，深约30μm，试样池1和试样废液池2之间管道为进样通道，缓冲液池3和缓冲液废液池4之间管道为分离通道。进样通道长28mm，有效分离长度(十字交叉进样口到检测点间的长度)为45mm，储液池的直径为2mm。

微流控芯片电泳仪器的激光激发波长为488nm，荧光采集滤光片的波长为500nm-580nm，荧光信号由光电倍增管收集后转换为电信号由计算机对信号进行采集和处理，系统可调输出电压为0～5000V，实验所得数据用Microsoft excel和Origin 8.0进行处理，转换为荧光强度与迁移时间的关系。

分析前，用1mol/L NaOH浸洗各池和通道1分钟，然后用去离子水浸洗2分钟。试样废液池2、缓冲液池3和缓冲液废液池4加入分离缓冲液后，试样池1中注入待测样本。进样阶段，试样池1+750v，试样废液池2接地，缓冲液池3+300v，缓冲液废液池4+450v，进样40秒后切换电压进入分离阶段。分离时，缓冲液废液池40v，缓冲液池3+3000v，试样池1和试样废液池2均施加+300v。运行温度为25℃。

4)结果判读

图谱和数据采用Excell，Origin7.5和SPASS11.5软件包处理。先由脂蛋白标准品做出标准电泳图谱，再选择临床标本进行比对分析，得到冠心病危险因子sdLDL的出峰时间、相对含量等参数。

本发明基于微流控分析结合激光诱导荧光检测技术，在3min内分离了血清低密度脂蛋白的两种亚型和高密度脂蛋白，弥补了血液生化常规分析方法不能对脂蛋白亚组份进行分析的不足。

本发明选择十二烷基硫酸钠(SDS)作为阴离子表面活性剂同时修饰脂蛋白和芯片微通道表面，电泳进样和分离过程施加夹流电压，进行血清脂蛋白分离分析，使大而轻低密度脂蛋白(1LDL)、小而密低密度脂蛋白(sdLDL)和高密度脂蛋白(HDL)在三分钟内得到高效分离。健康人血清样本中分离到1LDL和HDL两特征峰。冠心病患者血清中分离到三个峰为1LDL、sdLDL和HDL。sdLDL三次重复性实验其出峰时间和峰面相对标准差分别为2.18％、2.94％。本发明为冠心病提供了一种简单、快速、高效的诊断方法。

附图说明

图1微流控芯片示意图，A.微流控芯片示意图B.十字交叉进样口显微结构图；

图中：1.试样池 2.试样废液池 3.缓冲液池 4.缓冲液废液池；

图2脂蛋白标准品电泳图谱；

图3正常人标本脂蛋白电泳图谱；

图4冠心病患者标本脂蛋白电泳图谱。

具体实施方式

实施例1：标准品脂蛋白电泳分离

采用高密度脂蛋白和低密度脂蛋白标准品进行微流控芯片电泳分离分析。

缓冲体系：缓冲液pH9.0，由40mmol/l Tricine、40mmol/l甲基葡胺、0.03mmol/l十二烷基硫酸钠组成。

样本及标记：LDL为120μmol/l，HDL为60μmol/l)，2μl标准品溶于8μl去离子水，然后用2μl 0.1g/l脂蛋白特异性荧光染料NBD进行避光预染，1分钟后加入50μl缓冲液，作为电泳待测标本。

具体操作步骤：

1)用1mol/L NaOH浸洗各池和通道1分钟，然后用去离子水浸洗2分钟；

2)分别在试样废液池2、缓冲液池3和缓冲液废液池4中加入10μl分离缓冲液，在试样池1中加入10μl待测样本，将加好试剂的微流控芯片放入芯片电泳分析仪器中进行电泳；

3)在试样池1中加+750v电压，试样废液池2接地，缓冲液池3和缓冲液废液池4分别加+300v和+450v电压进行样本进样，进样时间40秒，之后切换电源进入分离模式；

4)分离时，缓冲液废液池4接电源负极(即0v)，缓冲液池3加+3000v电压，试样池1和试样废液池2均施加+300v电压，进行电泳分离；

5)电泳结果和图谱由电脑进行显示、存储和分析。

结果判读：

图2为混合脂蛋白标准品的电泳图谱(出峰顺序依次为：1LDL，sdLDL，HDL)。小而密低密度脂蛋白颗粒相对于大颗粒低密度脂蛋白具有相同载脂蛋白，不同的质量，芯片电泳主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力，电泳时具有不同荷质比的脂蛋白颗粒在的电渗流的作用下实现分离。

实施例2：临床血清脂蛋白电泳分离

缓冲体系和微流控芯片电泳如实施例1所述。

标本及标记：健康体检者血清标本和冠心病患者血清标本，血清样本(2μl)溶于8μl去离子水，然后用2μl 0.1g/l脂蛋白特异性荧光染料NBD进行避光预染，1分钟后加入50μl缓冲液，作为电泳待测标本。

结果判读：图3为健康体检者血清脂蛋白典型电泳图谱，可见两基线分离的1LDL，HDL峰。图4为冠心病患者的典型电泳分离图谱，分离出1LDL、sdLDL和HDL三个峰。对一冠心病患者血清连续3次进样分析，重现性良好，sdLDL峰的迁移时间和峰面积的相对标准偏差RSD分别为2.18％，2.94％。

Claims

1.一种小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所述的分析方法是基于微流控分析方法与荧光检测方法的结合，对血清脂蛋白进行分离和分析，具体分析步骤是：

(a)电泳缓冲体系的选择：

所选择的缓冲液的pH9.0，是由40mmol/l Tricine、40mmol/l甲基葡胺、0.03mmol/l十二烷基硫酸钠，其余为去离子水组成；

(b)血清标本的准备和标记

受试者素食三天后，清晨空腹采血3ml，以3000r/min速率离心10min分离血清，所取血清标本4小时之内完成分离检测，或-70℃保存；2μl血清样本溶于8μl去离子水，然后用2μl 0.1g/l硝基苯并噁二唑-6-酰基鞘醇进行避光预染，1分钟后加入50μl缓冲液，作为电泳待测标本；

(c)微流控芯片电泳

所述的微流控芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，芯片微管道宽100μm，深为30μm，试样池(1)和试样废液池(2)之间管道为进样通道，缓冲液池(3)和缓冲液废液池(4)之间管道为分离通道；

分析前，用1mol/L NaOH浸洗各池和通道，然后用去离子水浸洗，试样废液池(2)、缓冲液池(3)和缓冲液废液池(4)加入分离缓冲液后，试样池(1)中注入待测样本，进样阶段，试样池(1)+750v，试样废液池(2)接地，缓冲液池(3)+300v，缓冲液废液池(4)+450v，进样40秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池(4)0v，缓冲液池(3)+3000v，试样池(1)和试样废液池(2)均施加+300v；

(d)结果判读

图谱和数据采用Excell，Origin7.5和SPASS11.5软件包处理，先由脂蛋白标准品做出标准电泳图谱，再选择临床标本进行比对分析，得到冠心病危险因子sdLDL的出峰时间、相对含量等参数。

2.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于缓冲液中十二烷基硫酸钠作为阴离子表面活性剂同时修饰脂蛋白和芯片微通道表面。

3.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所使用的微流控芯片的尺寸为63.5mm×31.75mm。

4.按权利要求1或3所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所述的微流芯片中的进样通道长28mm，十字交叉进口到检测点间的长度为45mm。

5.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于分析前用1mol/L NaOH浸洗各池和通道时间为1分钟，然后去离子水浸洗2分钟。

6.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所述的微流芯片的进行温度为25℃。

7.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于步骤c中分离阶段时间为3min。

8.按权利要求1或7所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于正常人血清样本中分离到大而轻低密度脂蛋白和高密度脂蛋白两个特征峰；冠心病患者血清中分离到大而轻低密度脂蛋白、小而密低密度脂蛋白和高密度脂蛋白三个特征峰。